一种增强骨髓间充质干细胞移植后存活率的处理方法

摘要

本发明提供了一种增强骨髓间充质干细胞移植后存活率的处理方法，所述方法包括：将经传代培养稳定的骨髓间充质干细胞置于Hsp90浓度0.1～20μmol/L的细胞培养基中，缺氧培养24～36小时，获得处理后的骨髓间充质干细胞用于细胞移植。本发明的有益效果主要体现在：通过Hsp90预处理，可有效提高骨髓间充质干细胞的抗细胞凋亡能力，能提高骨髓间充质干细胞移植修复组织损伤的疗效。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种增强骨髓间充质干细胞移植后存活率的处理方法，以提高细胞移植修复组织损伤的效能。。

(二)背景技术

热休克蛋白(heat shock protein，Hsp)是一类在生物进化过程中高度保守并广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质。热休克蛋白是一个多基因家族，其中不同基因的产物在细胞中的表达、功能和定位都有不同。热休克蛋白在机体内作为分子伴侣，参与维持蛋白的正常折叠以形成蛋白的正常结构，并在调节蛋白合成与降解的平衡及蛋白定位中起着重要的作用。当细胞受到环境的各种刺激时，细胞内热休克蛋白的表达增加，能快速短暂地保护细胞对抗内源性应激的进攻，增强细胞的修复功能以及提高细胞对应激的耐受程度。

热休克蛋白90(Hsp90)是细胞内最活跃的分子伴侣蛋白之一，影响着细胞内许多信号转导蛋白的正常功能发挥。研究发现，Hsp90对肿瘤发生发展起着重要作用，已成为治疗肿瘤的新靶位。热休克蛋白通常被认为是细胞生存因子，在细胞凋亡发生过程中，Hsp90可以通过阻止procaspase-9与Apaf-1凋亡体的结合而抑制凋亡的发生。这些发现提示分子伴侣的作用就像是个分界点，它引导感受到外界应激作用的细胞的走向生存或是死亡。在细胞发生凋亡前，Hsp90允许细胞暂时休整，并动员细胞本身的能力对应激诱导的损伤进行修复，这个作用有点类似于细胞周期中的检测点。

细胞移植治疗修复组织损伤是目前新兴的医疗领域热点。细胞疗法是对传统医学的一种补充手段，为某些难治性疾病的治疗提供新的希望。干细胞是一种能自我复制无限增殖，在特定的诱导条件下向同胚层或其他胚层细胞分化的祖细胞。大量基础实验发现，骨髓干细胞移植能改善心肌梗死后心功能，延缓心室重构。通过20个临床研究荟萃分析，显示骨髓来源的干细胞移植能提高左室射血分数3.66％(95％CI为1.93％～5.40％，P＜0.001)。有研究发现，细胞移植后4小时存活的细胞仅占20％，但在24小时后细胞存活不到10％，细胞移植7天后存活的细胞少之又少。通过优化细胞种类、移植途径、移植时间等方法能改善干细胞移植的疗效，此外还可以通过提高移植细胞抗凋亡能力和改善移植微环境来获取最大限度的细胞移植效能。目前已有的技术包括缺氧预处理，药物预处理和基因转染等。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种增强骨髓间充质干细胞移植后存活率的预处理方法，以提高细胞移植修复组织损伤的效能。

本发明采用的技术方案是：

一种增强骨髓间充质干细胞移植后存活率的处理方法，所述方法包括：将经传代培养稳定的骨髓间充质干细胞置于Hsp90浓度0.1～20μmol/L的细胞培养基中，缺氧培养24～36小时，获得处理后的骨髓间充质干细胞用于细胞移植。所述细胞培养基为常规用于骨髓间充质干细胞体外培养的培养基，并且不添加血清，如低糖DMEM液体培养基等，培养温度为常规适用于骨髓间充质干细胞的培养温度，只是本发明在培养基中添加了Hsp90，其添加浓度为0.1～20μmol/L，优选1～10μmol/L，最优选为10μmol/L；所述缺氧培养是指在没有氧气存在下进行培养，通常可在氮气、二氧化碳或者氮气与二氧化碳混合气的氛围下进行培养。所述传代培养按常规方法在常规氧浓度(即常氧培养)条件下进行，通常的，所述常氧培养为：在CO₂体积浓度5％、O₂体积浓度95％的混合气体中培养。

本申请发明人发现，在细胞移植术前，Hsp90预处理能激发细胞内源性保护机制，通过细胞内多条信号传导通路，增强细胞抗凋亡能力。研究发现，Hsp90预处理(培养基中终浓度为0.1～20μmol/L，其中以10μmol/L时作用最强)能提高骨髓间充质干细胞内Akt和ERK磷酸化水平，降低SPAK/JNK磷酸化水平，从而降低骨髓间充质干细胞内前凋亡蛋白例如bax的表达，诱导细胞表达抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-xl，降低凋亡执行蛋白Caspase-3的表达。Hsp90预处理尚能促进细胞合成和分泌一氧化氮(Nitricoxide，NO)，减少缺氧无血清诱导的细胞凋亡，Hsp90预处理的细胞移植到急性心肌梗死局部能提高移植细胞的存活率，改善心功能，增强细胞移植的效能。

具体的，所述方法如下：将继代第3代的骨髓间充质干细胞于37℃下在Hsp90浓度10μmol/L的低糖DMEM培养基中缺氧培养24小时，获得处理后的骨髓间充质干细胞用于细胞移植。

Hsp90包括四个亚单位：Hsp90α、Hsp90β、GRP94、Hsp75/TRAP1。本发明中，所述Hsp90优选为Hsp90α(GenBank登录号为：CR381646.8)。

所述缺氧培养是指在缺氧条件下进行培养，具体的，所述缺氧培养为：在CO₂体积浓度5％、N₂体积浓度95％的混合气体中培养。

具体的，所述方法如下：将继代第3代的骨髓间充质干细胞于37℃下、在CO₂体积浓度5％、N₂体积浓度95％的混合气体中，于Hsp90α浓度10μmol/L的低糖DMEM培养基中培养24小时，获得处理后的骨髓间充质干细胞用于细胞移植。

本发明的有益效果主要体现在：通过Hsp90预处理，可有效提高骨髓间充质干细胞的抗细胞凋亡能力，能提高骨髓间充质干细胞移植修复组织损伤的疗效。

(四)附图说明

图1为Hsp90预处理能减少缺氧无血清诱导的细胞凋亡示意图：

图2为Hsp90预处理能减少缺氧无血清诱导的凋亡率示意图；

图3为Hsp90预处理能促进细胞合成和分泌一氧化氮(NO)示意图；

图4为Hsp90预处理通过激活细胞内Akt和ERK信号通路，降低SPAK/JNK磷酸化水平，从而降低细胞内前凋亡蛋白bax表达，诱导细胞表达抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-xl，降低凋亡执行蛋白Caspase-3表达的示意图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1.无菌条件下从合适的健康志愿者(排除造血系统疾患)(王某某，25岁，来自杭州，本人同意将骨髓捐献供研究使用)的髂后上棘抽取骨髓液50mL，放置于预先添加4000IU肝素的无菌玻璃瓶中，充分混匀避免骨髓液凝固，移至层流室生物安全柜进行下一步操作。

2.将等量低糖DMEM培养基(购自美国GIBCO公司)(添加100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)加入放置骨髓液的无菌玻璃瓶中稀释骨髓液，用无菌移液器充分吹散骨髓细胞。

3.按照密度梯度分离法分离骨髓单个核细胞。在50mL无菌离心管中加入20mL淋巴细胞分离液(密度是1.077±0.001g/mL，购自上海恒信化学试剂有限公司)，将20mL骨髓液轻轻叠加在淋巴细胞分离液表面。在高速低温离心机中(Heraeus D-37520，购自德国Thermo Electron公司)以4℃条件下900g离心25分钟。离心完毕后，细胞分层，从下至下，可见培养基、白膜层、淋巴分离液和红细胞层。用1mL无菌移液器收集中间白膜层细胞于另一50mL离心管中，然后加入20mL低糖DMEM培养基(购自美国GIBCO公司)，漂洗细胞表面残留淋巴分离液。于4℃条件下900g离心10分钟，弃上清，收集骨髓单个核细胞。以含10％(v/v)胎牛血清(购自美国GIBCO公司)的低糖DMEM培养基重悬沉淀细胞，按2×10⁵/cm²细胞密度接种至75cm²生长面积的细胞培养瓶(购自美国Corning公司)，放置于37℃，含5％CO₂(空气体积浓度95％)和饱和湿度的细胞培养箱(Forma3111，购自美国Thermo Fisher公司)中，静置48小时后首次换液，以去除不贴壁细胞。此后每4～5天换液一次，长满80％～90％以上传代。

4.以含10％胎牛血清低糖DMEM培养基进行原代和继代细胞培养，放置于37℃、一定湿度的含5％CO₂的混合气体(空气体积浓度95％)中常氧培养，根据骨髓间充质干细胞贴壁生长的特性，每4～5天更换细胞培养基，去除非贴壁细胞，不断纯化人骨髓间充质干细胞。继代第3代时细胞可进行形态学、流式细胞学等细胞鉴定。

5.将正常氧浓度下培养的继代第3代人骨髓间充质干细胞更换含一定浓度的人重组Hsp90α(美国assay designs公司，Cat#SPP-776)的低糖DMEM培养基(培养基中Hsp90α终浓度为0.1～10μmol/L)，继续于37℃、一定湿度的含5％(v/v)CO₂和95％(v/v)N₂的混合气体中进行缺氧培养培养处理。缺氧处理在一个能精确调控氧浓度的ProOx-C-chamber系统(购自美国Biospherix，Redfield公司)中进行，设定氧浓度为不大于0.5％，缺氧时间为24小时。缺氧处理结束后进行免疫染色、流式细胞学检测、培养上清液比色法和免疫印迹法检测细胞凋亡及其相关蛋白。

6.免疫荧光Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况：加入Hoechst33258(美国Molecular probe公司)染料于细胞培养液中，避光孵育15分钟。弃除细胞培养基，以磷酸盐缓冲液PBS(1000mL蒸馏水中含8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，PH 7.2-7.6)冲洗3遍后，于荧光倒置显微镜(放大400倍，德国Zeiss公司)摄片观察细胞核内凋亡小体，实验结果见图1，在荧光倒置显微镜下观察Hoechest染色的细胞(400倍放大)，左图显示在缺氧-缺血清培养24小时后，细胞核染色体断裂，出现凋亡小体(蓝色亮点)。右图显示Hsp90共培养24小时的细胞在缺氧-缺血清环境下细胞核凋亡小体不明显；

7.流式细胞学检测细胞表面Annexin-V的表达率反映细胞凋亡率：根据Annexin-V试剂盒(美国BD Biosciences公司)操作说明书进行。以冰PBS缓冲液漂洗细胞两遍后加入结合缓冲液，将细胞密度调整至1×10⁶个/ml。取100ul细胞悬液(1×10⁵个细胞)移至5ml离心管，加入5ulAnnexin-V和5ul PI。充分混合后常温避光孵育15分钟。每个离心管中加入400ul结合缓冲液，一小时内在流式细胞仪下读数。该步骤反复3遍以上，获取每组样本的细胞凋亡率，实验结果见图2。

8.比色法检测细胞培养上清液NO水平：收集细胞培养上清液，应用NO试剂盒(美国MERCK-Calbiochem公司)检测细胞分泌NO水平。测定方法按试剂盒操作说明书进行，绘制标准曲线，根据酶标仪读取的OD值获得相应的NO产量，实验结果见图3。

9.免疫印迹法检测细胞内Akt、ERK、SAPK/JNK信号通路蛋白及凋亡相关蛋白bax、bcl-2、bcl-xL和caspase-3的表达改变。

收集的细胞用RIPA buffer(50mM HEPES，pH 7.3，1％sodiumdeoxycholate，1％Triton X-100，0.1％SDS，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM Na₃VO₄，1mM NaF)裂解后，14,000g离心30min，收集上清液冻存于-80℃备用。BCA法(Bicinchoninic Acid Assay，购自美国Sigma公司)测定蛋白浓度。40μg蛋白样品在6～15％SDS-PAGE梯度胶用Hoefer Mini-Gel system(Amersham Biosciences，购自美国Piscataway公司)电泳分离，用Hoefer Transfer Tank(Amersham Biosciences，美国Piscataway公司)将蛋白转移至PVDF膜(购自美国BioRad公司)上，膜置于缓冲液[Tris缓冲盐溶液，含0.1％Tween-20(TBS-T)，7％牛奶，pH 7.6]室温下封闭2h，加入相应一抗(1∶1000，购自美国Cell Signaling公司)于4℃条件下孵育过夜，小鼠抗β-actin(1∶1000，购自美国SantaCruz Biotechnology公司)作为蛋白上样对照；膜用0.5％TBS-T洗涤后室温下与结合碱性磷酸酶的抗兔IgG或抗小鼠IgG抗体(购自美国Promega公司)孵育2小时，最后TBS-T及TBS洗涤后用BCIP/NBT溶液显色(购自美国Sigma公司)，扫描后用CS 8.0软件分析信号，实验结果见图4。

结论：Hsp90预处理能通过激活细胞内Akt和ERK信号通路，抑制细胞内SAPK/JNK通路，抑制细胞内前凋亡蛋白bax表达降低，抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-xl表达增高，降低凋亡执行蛋白Caspase-3的表达，同时提高细胞合成NO。实验结果显示，Hsp90在10umol/L时预处理抗细胞凋亡的作用最强。Hsp90预处理能提高细胞在缺血缺氧的心肌微环境中抗凋亡能力，提高移植细胞的存活率，从而可增强细胞移植的疗效。