区分牛病原性和非病原性分枝杆菌感染的试剂盒及方法

摘要

本发明属于免疫检测领域。本发明涉及用于区分牛病原性与非病原性分枝杆菌感染的检测试剂和方法。所述检测试剂包括作为特异性刺激原的重组融合蛋白rE6－M63－H70，该重组融合蛋白能够有效刺激体外培养的致敏外周血淋巴细胞高水平释放γ－干扰素(IFN－γ)。利用所述检测试剂rE6－M63－H70重组融合蛋白作为刺激原建立的牛IFN－γ释放试验克服了血清学检测方法和以PPD为刺激原的IFN－γ释放试验的不足，具有很高的灵敏度和特异性，可区分牛病原性分枝杆菌(如牛分支杆菌)感染和非病原性分支杆菌(如禽分枝杆菌或非致病性分枝杆菌)感染，甚至能区分牛病原性分枝杆菌感染与BCG免疫，因此可有效用于临床中牛病原性分枝杆菌的感染的检测。

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域。本发明涉及用于区分牛病原性和非病原性分枝杆菌感染的试剂盒及方法。

背景技术

牛结核病是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)和结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)引起的一种人畜共患慢性消耗性传染病，人和动物交叉感染造成该病广泛流行，因此具有非常重要的公共卫生意义。世界卫生组织(WHO)指出：“在存在牛结核病的国家，人类始终受到威胁，除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的。”目前，一些较发达国家和地区，如美国、澳大利亚和北欧等已基本消灭了牛结核病。但牛结核病在我国依然是最常见的多发性疾病之一，1985年和1987年两次全国奶牛抽样调查结果显示，牛结核病的患病率分别达5.83％和5.43％。近年来，随着个体养牛户的增加，结核病的阳性检出率正逐年上升。目前我国一些省区牛结核病的发病率已达9％，甚至更高。

目前，牛结核病的世界动物卫生组织(OIE)法定检验方法为牛分枝杆菌纯化蛋白衍生物(purified protein derivatives，PPD)皮内变态反应试验(GB/T 18646)，该试验存在主观性强、耗时、耗力、短时间内不能进行重复检测、特异性差、近期受感染牛体敏感性很低等方面的缺点。

为了提高牛分枝杆菌检测的特异性，国内外学者开始利用基因重组技术，重组表达了牛分枝杆菌的多种蛋白，例如，6kDa早期分泌性抗原性靶(The early secreted antigenic target 6kuprotein ESAT-6)、MPB64、MPB70、MPB63、热休克蛋白65(Heat shockprotein 65，HSP65)、抗原85B(antigen 85B，Ag85B)、10kDa的培养滤液抗原(10kDa culture filtrate antigen，CFP10)等。然后，用这些重组蛋白中的一种或者多种混合(又称“鸡尾酒法”)作为包被抗原进行酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测，通过检测牛血清中相应的抗体水平对牛分枝杆菌感染作出血清学诊断，该方法虽然一定程度上提高了检测的特异性，但其敏感性不够理想。

90年代后期国外发展起来的以PPD为抗原的γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)释放试验明显提高了牛结核病诊断的灵敏性，其原理为：致敏的外周血淋巴细胞在体外培养过程中，通过特异抗原(如PPD)刺激后被活化，从而高水平表达并分泌IFN-γ，通过相应的技术手段对培养上清中IFN-γ的释放水平进行检测(如ELISA)从而判断其是否感染，其结果与淋巴细胞增生试验具有很好的相关性。该方法避免了对机体的侵入性实验，可以短时间内多次重复实验，同时也摒弃了结核菌素试验中操作和判断上的主观性，因此具有非常广泛的应用前景，目前国外已将该类牛结核病诊断试剂盒商品化。但由于PPD包含的抗原成分复杂，其中部分抗原在结核分枝杆菌和牛分枝杆菌这类牛病原性分枝杆菌以及禽分枝杆菌与非致病性环境分枝杆菌等牛非病原性分枝杆菌中均广泛存在，致使其检测特异性较差，同时有研究表明，PPD也不能有效区分牛分枝杆菌感染和BCG免疫，在实际使用过程中常常出现假阳性。

因此，亟需开发一种能同时提高检测的特异性和敏感性的检测试剂和方法，既能克服血清学检测方法敏感度不高的缺陷，又较PPD刺激IFN-γ释放试验具有更高的特异性。

本发明通过大量实验，用多基因串联重组表达的融合蛋白替代PPD，作为IFN-γ释放试验的刺激原，提高了实验特异性的同时，也大大克服了单一抗原或“多抗原鸡尾酒”血清学检测敏感度不高的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供用于区分牛病原性和非病原性分支杆菌感染试剂及方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：体外培养致敏的外周血淋巴细胞，在体外培养过程中用特异抗原刺激将其活化，从而高水平释放IFN-γ，然后通过技术手段(如ELISA)检测培养上清中IFN-γ，根据IFN-γ释放水平的变化，判断是否感染牛分枝杆菌。ESAT-6家族蛋白是分枝杆菌的一种早期分泌性抗原，主要分布于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中，而卡介苗(Bacille Calmette-Guerin vaccine，BCG)和大部分非致病性环境分枝杆菌缺失该基因。ESAT-6具有多个T/B细胞表位，不仅能诱导有效的免疫记忆，而且还能激发免疫记忆细胞早期高效表达IFN-γ，这使得通过IFN-γ检测进行结核病的早期诊断成为可能。MPB63是结核分枝杆菌培养滤液中的一种主要分泌蛋白，其表达量在分泌蛋白中居第三位，且与感染结核分枝杆菌的豚鼠阳性血清产生强烈的免疫反应，是结核分枝杆菌的主要保护性抗原。HSP是一类在应激状态下诱导产生的高度保守的蛋白质家族，不仅能作为分子伴侣，还能作为危险信号来诱发机体的免疫应答。在很多抗感染和抗肿瘤免疫反应中，HSP既能活化抗原递呈细胞(antigen-presenting cell，APC)，诱导细胞因子的释放，也能发挥免疫佐剂和细胞因子样作用。因此，本发明中将ESAT-6、MPB63和HSP70的串联表达的重组融合蛋白(即rE6-M63-H70)作为特异性刺激原，刺激体外培养致敏的外周血淋巴细胞高水平释放IFN-γ，取得了很好的效果。

一方面，本发明提供了一种用于区分牛病原性和非病原性分支杆菌感染的试剂，该试剂包括用作刺激原的重组融合蛋白，该重组融合蛋白能够有效刺激体外培养的致敏外周血淋巴细胞高水平释放IFN-γ。

在本发明的具体实施方案中，所述的重组融合蛋白的氨基酸序列包含选自SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在本发明的一个优选实施方案中，所述重组融合蛋白具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供了一种用于区分牛病原性和非病原性分支杆菌感染的方法，该方法包括下列步骤：

(a)使用本发明所述的重组融合蛋白作为特异性刺激原，与待检牛抗凝全血共孵育；

(b)孵育后，吸取上层血浆作为待检样品；

(c)检测待检样品中牛IFN-γ释放水平，与阴性刺激原的刺激效果进行比较，从而判定待检牛是否感染了牛分枝杆菌；

其中所述的特异性刺激原为一种分离纯化的重组融合蛋白，其氨基酸序列包括SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。

在本发明的一个实施方案中，使用的ELISA检测待检血浆样品中的牛IFN-γ释放水平。一个具体实施方案中，所述ELISA测定包括下列步骤：①用ELISA包被缓冲液将IFN-γ单抗稀释至蛋白质含量为10μg/ml，每孔酶标板加入100μl，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(PBST)洗板3次，每次3min。②每孔酶标板先加入50μl样品稀释液，再加入50μl待检样品(同时做空白对照，阴性对照及阳性对照孔)至含有样品稀释液的孔中，混匀，封板，37℃孵育1h。③用洗涤缓冲液洗板3次，每次3min。④各反应孔中加入100μl新鲜配制的辣根过氧化物酶标记兔抗牛二抗，37℃孵育1h。⑤用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min。⑥各反应孔中加入100μl新鲜配制的底物溶液，37℃，避光孵育30min(从加入底物至第一个孔中时开始计时)。⑦各反应孔中加入50μl终止液，轻轻摇动混匀。按照与加入底物相同的顺序、相同的速度加入终止液，终止后5min内读出OD_450nm值，以620-650nm作为参照波长。

当重组融合蛋白刺激后的待检血浆样品OD_450nm值-阴性刺激原刺激后的待检血浆样品的OD_450mm值≥0.1，判为阳性，反之，则判为阴性。

本发明的优点

本发明的牛分枝杆菌检测试剂盒及方法克服了牛分枝杆菌血清学检测方法和以PPD为刺激原的IFN-γ释放试验的不足，具有很强的特异性和敏感性，可区分牛病原性分枝杆菌感染和禽分枝杆菌或非致病性分枝杆菌等非病原性分枝杆菌感染，甚至能区分牛病原性分枝杆菌的感染与BCG免疫，因此可用于牛结核病的临床检测。

附图说明

图1：ESAT-6、MPB63和HSP70基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中图1(a)为ESAT-6基因PCR产物，图1(b)为MPB63基因PCR产物，图1(c)为HSP70基因PCR产物。

图2：图示的是重组融合蛋白rE6-M63-H70的电泳结果。M为蛋白质分子量标准；1为pET-32a(+)空载体对照；2为pET-E6-M63-H70诱导后产物；3为纯化后的rE6-M63-H70重组融合蛋白。

图3：图示的是rE6-M63-H70重组融合蛋白的western-blot实验结果，其中M为蛋白质分子质量标准；1为rE6-M63-H70重组融合蛋白的Western-blot检测结果。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。

实施例

实施例1重组质粒pET-E6-M63-H70的构建

1.1 牛分枝杆菌基因组DNA的提取

参照细菌基因组DNA小量快速提取试剂盒(购自北京博大泰克基因技术有限责任公司)说明书所述方法进行。

1.2 引物的设计

根据GenBank中牛分枝杆菌基因组DNA(登录号为BX248333)的ESAT-6、MPB63和HSP70基因序列设计特异性引物，引物由上海生工生物技术有限公司合成，序列见表1(下划线处为酶切位点，阴影处为Linker)。

表1 PCR引物名称、序列及扩增产物的大小

1.3 目的基因的PCR扩增与产物回收

以牛分枝杆菌基因组DNA为模板，分别用LA Taq DNA聚合酶分别扩增ESAT-6、MPB63和HSP70基因，具体反应体系如下：

灭菌去离子水         26.5μL

10x LAPCR buffer       5μL

2.5mM dNTP             8μL

LATaq(5U/μL)           0.5μL

正向引物(10pmol/μL)    3μL

反向引物(10pmol/μL)    3μL

DNA模板                4μL

ESAT-6扩增循环参数为：95℃预变性5min，95℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸25s，25个循环，72℃再延伸10min。MPB63扩增循环参数为：95℃预变性5min，95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环，72℃再延伸10min。HSP70扩增循环参数为：95℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min45s，25个循环，72℃再延伸10min。PCR扩增产物电泳检测，结果见图1，其中牛分枝杆菌ESAT-6、MPB63和HSP70基因产物分别约为300bp(含Linker)、500bp(含Linker)和1878bp，与预期大小一致。

用PCR产物回收试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)分别回收纯化上述PCR产物，然后将ESAT-6、MPB63和HSP70分别连接入pEASY-T1载体(购自北京全式金生物技术有限公司)，获得相应的重组质粒，分别命名为pEASY-T-E6、pEASY-T-M63和pEASY-T-H70。

1.4 重组质粒的构建与鉴定

pEASY-T-E6经EcoR I、Sac I双酶切后获得ESAT-6片段，pEASY-T-M63经Sac I、Sal I双酶切后获得MPB63片段，pEASY-T-H70经BamH I、Hind III双酶切后获得HSP70片段，按照设定目标将2组3个基因片段依次定向克隆到pUC18载体中，再经EcoR I、Hind III双酶切，回收目的片段，克隆到pET-32a(+)载体中，获得相应的重组质粒，命名为pET-E6-M63-H70。

pET-E6-M63-H70经EcoR I、Hind III双酶切获得了约2700bp片段，经DNA测序，该融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2牛分枝杆菌重组融合蛋白rE6-M63-H70的表达及纯化

2.1 重组融合蛋白的诱导表达、纯化、SDS-PAGE及Western-blot分析

将实施例1制备的重组质粒pET-E6-M63-H70转化至BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落接种至200mL含终浓度25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床培养至OD600＝0.7，加入终浓度为1mM的IPTG，30℃，160rpm摇床诱导培养10h，9000rpm离心10min收集菌体，菌体用60mL PBS(pH7.4)重悬，冰浴超声破碎菌体，破碎后混合物经12000rpm，4℃离心30min后取上清，按His Link^TM Protein Purification Resin(购自北京泽平科技有限责任公司)操作手册纯化重组融合蛋白。纯化产物经8％ SDS-PAGE电泳后，以BIO-RAD系统电转移至NC膜上，经5％脱脂奶粉封闭后，依次加入1:100稀释的牛结核病阳性血清37℃孵育1h，经充分洗涤后加入1:500稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗牛二抗(购自北京索莱宝科技有限公司)37℃孵育1h，充分洗涤，再按照增强型HRP-DAB底物显色试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)说明书显色，并观察结果。

SDS-PAGE电泳结果显示pET-E6-M63-H70表达的重组融合蛋白rE6-M63-H70大小约为116Ku(含pET-32a(+)载体的标签蛋白)，与预期大小一致，且目的蛋白均为可溶性表达。用His Link^TM Protein Purification Resin及蛋白纯化柱(购自北京泽平科技有限责任公司)纯化重组融合蛋白并进行SDS-PAGE分析，结果见图2。Western-blot分析结果显示，表达的重组融合蛋白可与牛结核病阳性牛血清产生特异性反应，见图3。纯化产物使用透析袋在透析外液(200mM Tris-Cl，pH8.0)中透析24h以除去咪唑，最后用PEG20000包埋透析袋浓缩蛋白，并使用蛋白定量试剂盒(BCA法)(购自SINOPCR公司)进行蛋白定量。rE6-M63-H70重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例3牛分枝杆菌检测方法的建立

3.1 待检牛全血的采集及培养

①无菌条件下采集待检牛肝素抗凝全血5ml，室温(22±5℃)运送到实验室并在采血后8h内进行培养。②将抗凝血加入到24孔组织培养板，1.5ml/孔，每头待检牛2孔，再分别无菌加入50μl Tris-Cl(100mM，pH8.0，作为阴性对照刺激原)、50μl含rE6-M63-H70的溶液(20μg)至相应孔中，充分混匀，37℃ CO₂培养箱中孵育24h。③孵育后，小心吸取400μl的上层血浆，转入1.5ml离心管中(血浆可在2-8℃贮存7天，-20℃可贮存几个月)，每管吸取50μl血浆作为待检样品用于牛IFN-γ释放水平的ELISA检测。

3.2 牛IFN-γ的ELISA检测

按照牛IFN-γ检测试剂盒(购自北京测迪公司)说明书进行，具体步骤如下：①用ELISA包被缓冲液将IFN-γ单抗稀释至蛋白质含量为10μg/ml，100μl/孔，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(PBST)洗板3次，每次3min。②各孔中加入样品稀释液，50μl/孔，再加入50μl待检样品(同时做空白对照，阴性对照及阳性对照孔)至含有样品稀释液的孔中，混匀，封板，37℃孵育1h。③用洗涤缓冲液洗板3次，每次3min。④各反应孔中加入100μl新鲜配制的辣根过氧化物酶标记兔抗牛二抗，37℃孵育1h。⑤用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min。⑥各反应孔中加入100μl新鲜配制的底物溶液，37℃，避光孵育30min(从加入底物至第一个孔中时开始计时)。⑦各反应孔中加入50μl终止液，轻轻摇动混匀。按照与加入底物相同的顺序、相同的速度加入终止液，终止后5min内读出OD_450nm值，以620-650nm作为参照波长。

3.3 结果判定

判定结果前必须检查阳性对照和阴性对照的OD值，当牛IFN-γ阴性对照<0.130、牛IFN-γ阳性对照>0.700时检测结果有效，如重组融合蛋白刺激后的血浆样品OD_450nn值-阴性对照刺激原刺激后的血浆样品OD_450nm值≥0.1，判为阳性，反之，则判为阴性。

实施例4rE6-M63-H70重组融合蛋白作为刺激原的牛分枝杆菌感染检测方法的特异性和敏感性试验

4.1 待检荷斯坦奶牛的选取

选取PPD皮试试验阳性荷斯坦奶牛15头，阴性荷斯坦奶牛10头，BCG免疫荷斯坦奶牛5头。

4.2 待检荷斯坦奶牛全血的采集及培养

同实施例3中的3.1部分，用rE6-M63-H70重组融合蛋白作为刺激原。

4.3 牛IFN-γ的ELISA检测

同实施例3中的3.2部分。

4.4 检测结果

以实施例3的3.3部分中的标准进行结果判定，结果见表2，并用BOVIGAM^TM牛分枝杆菌IFN-γ检测试剂盒进行复核，确认阳性牛剖检后取肺部病灶提取DNA进行PCR鉴定，鉴定结果表明25头非免疫荷斯坦奶牛中有6头感染了牛分枝杆菌，6头感染了禽分枝杆菌，其余均为阴性健康牛。参照以下公式计算该发明的特异性及敏感性，特异性计算公式为：特敏感性计算公式为：敏感性结果显示：使用rE6-M63-H70重组融合蛋白作为刺激原的牛IFN-γ释放试验(简称rE6-M63-H70-IFN-γ方法)的检测特异性达91.6％，敏感性达83.3％。其中，6头鉴定为禽分枝杆菌感染牛经rE6-M63-H70-IFN-γ方法检测结果均为阴性，证明这种诊断方法可准确区分牛病原性的牛分枝杆菌感染与和牛非病原性的禽分枝杆菌感染；5头BCG免疫牛中，经rE6-M63-H70-IFN-γ方法检测结果判断4头为阴性1头为弱阳性，表明这种检测方法基本能有效区分牛分枝杆菌感染与BCG免疫。

综上所述，该方法能有效区分牛病原性和非病原性分枝杆菌感染，具有很好的应用前景。

表2 rE6-M63-H70重组融合蛋白作为刺激原的牛IFN-γ释放试验(rE6-M63-H70-IFN-γ方法)结果

a经BOVIGAM^TM牛分枝杆菌IFN-γ检测试剂盒及剖检后取肺部病灶提取DNA进行PCR鉴定后确定为感染了牛致病性的牛分枝杆菌的阳性荷斯坦奶牛。

b阴性健康荷斯坦奶牛、BCG免疫荷斯坦奶牛以及感染了牛非致病性的禽分枝杆菌的荷斯坦奶牛。

序列表

<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120>区分牛病原性和非病原性分枝杆菌感染的试剂盒及方法

<130>

<160>2

<170>Patent In version 3.4

<210>1

<211>2727

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>基因

<222>(1)..(2727)

<400>1

<210>2

<211>908

<212>PRT

<213>人工重组

<220>

<221>融合蛋白

<222>(1)..(908)

<400>2