制备盐酸1(10)β－环氧－13－二甲基氨基－5,7α,6,11β(H)－愈创木－3(4)－烯－6,12－内酯,一种冻干的抗肿瘤制品“阿格拉滨”的方法

摘要

本发明涉及一种制备1(10)β－环氧－13－二甲基氨基－5，7α，6，11β(H)－愈创木－3(4)－烯－6，12－内酯盐酸盐的冻干抗肿瘤制品的方法，该制品具有射线增敏和免疫调节活性，该方法包括提取天然原始材料地方性植物无毛蒿，将获得的树脂分离成各组分，用得到的工业级阿格拉滨合成二甲基氨基阿格拉滨盐酸盐，并对其进行后续纯化、干燥和冻干。在该方法中，用液体二氧化碳作为提取剂在150±2×10

说明书

本发明涉及从天然原始材料制备新型医药制品，即抗肿瘤制品“阿格拉滨 (arglabin)”的技术，其可用于恶性肿瘤的化疗和扩大免疫调节制品的范围。

从1(10)β-环氧-5，7α，6β(H)-愈创木-3(4)，11(13)-二烯-6，12-内酯 (olide)(2)(地方性植物无毛蒿(Artemisia glabella Kar.et Kir)获得)合成的倍 半萜内酯阿格拉滨衍生物，1(10)β-环氧-13-二甲基氨基-5，7α，6，11β(H)-愈创 木-3(4)-烯-6，12-内酯盐酸盐(1)用作抗肿瘤制品。

从天然原始材料制备1(10)β-环氧-13-二甲基氨基-愈创木-3(4)-烯-6，12- 内酯盐酸盐冻干抗肿瘤制品“阿格拉滨”的方法(哈萨克斯坦共和国专利号 10913，cl.A61K 31/343，31/336，A61P 35/00，15.03.2004)是已知的。该方 法包括提取天然原始材料(地方性植物无毛蒿(Artemisia glabella Kar.et Kir) 的地上部分)，从无价值产物中纯化总提取物质(树脂)，通过柱色谱方法将树脂 分成各组分从而获得工业级阿格拉滨，通过进一步重结晶、胺化和氢氯化产生 二甲基氨基衍生物。

该方法的基本缺点是加工持续时间太长。

与本发明方法最接近的是从天然原始材料(利用地方性植物-无毛蒿的花 篮(flower baskets)和叶片)制备具有抗肿瘤和免疫调节活性的冻干阿格拉滨的 方法。(哈萨克斯坦共和国的初级专利(preliminary patent)号5277，c1.C07D 307/93，A61K 31/365，15.10.1997)。在提取器中利用溶剂，例如氯仿处理 最初干燥研磨的天然原始材料，然后用水-醇混合物处理从无价值产物中纯 化提取的物质(树脂)。实施硅胶柱色谱方法72小时将纯化阶段获得的树脂 分成各组分。用苯洗脱时分离含阿格拉滨的组分。蒸发苯，得到工业级阿 格拉滨，再经重结晶、胺化和氢氯化获得二甲基氨基衍生物。合成的持续 时间是48小时。

用二甲胺实施胺化得到含有氨基阿格拉滨的溶液。用氯化氢对氨基阿格拉 滨的醇溶液鼓泡，从而产生工业级二甲基氨基阿格拉滨盐酸盐。随后经重结晶、 干燥和冻干纯化获得的产物。

采用氯仿提取天然原始材料的方法有以下缺点：

-氯仿是昂贵而有毒的溶剂；

-提取的持续时间是6-8小时；

-采用柱色谱方法分离树脂耗时(72小时)，并且所用的洗脱剂苯也是毒性 溶剂；

-合成二甲基氨基衍生物的持续时间是约48小时。

本发明目的是开发依据天然倍半萜内酯(1)制备抗肿瘤制品的方法，该方 法不使用毒性试剂并显著降低了处理的持续时间。

所述工业结果是提供制备1(10)β-环氧-13-二甲基氨基-5，7α，6，11β(H)-愈 创木-3(4)-烯-6，12-内酯盐酸盐(具有射线增敏和免疫调节活性的冻干抗肿瘤 制品)的方法，包括提取天然原始材料(地方性植物无毛蒿)，将得到的树脂分离 成各组分从而获得工业级阿格拉滨，从阿格拉滨制备合成二甲基氨基阿格拉滨 盐酸盐，随后将其纯化、干燥并冻干；其中在150±2×10⁵Pa压力和60℃± 0.5的温度下用液体二氧化碳作为提取剂(extragent)进行提取，通过制备型液 相色谱方法应用反相C₁₈柱将树脂分离成各组分，合成二甲基氨基阿格拉滨盐 酸盐时将工业级阿格拉滨以重量比1:10溶解于乙腈，并且以1:1.62的摩尔比 加入二甲基氨基甲酸二甲铵(dimethylammonium dimethylcarbamat)。

为使利用“弗赖克斯公司(Flavex)”(德国)的仪器分离阿格拉滨的制备技 术获得批准，在本发明方法设定的提取条件下提取600kg天然原始材料。结果 显示CO₂-提取物中的阿格拉滨含量比已知方法获得的氯仿提取物中高两倍。 从CO₂-提取物中分离阿格拉滨的成本较低，因为溶剂更经济。CO₂-提取方法 有助于从天然原始材料选择性提取阿格拉滨，同时废料中的残留阿格拉滨含量 自然降低。

选择阿格拉滨的最佳分离条件的实验结果见表1。其显示，在150×10⁵Pa 压力和60℃温度下CO₂-提取物中的阿格拉滨含量达到最高为28.5％，提取时 间是75分钟。充入CO₂是100kg/小时。

CO₂-提取后，通过高效液相色谱(HPLC)方法测定提取物中的阿格拉滨含 量。在下述条件下，用装有紫外检测器的惠普安捷仑1100系列(HEWLETT PACKARD Agilent 1100 Series)的液相色谱(装置)进行分析：

-分析柱填充有吸收剂Zorbax CB-C₁₈4.6×150mm，粒径5μm；

-流动相组成为乙腈:水＝50:50；

-检测波长为204nm；

-柱温为室温；

-流动相流速为0.75ml/分钟；

-引入测定的体积为20μl。

表1.CO₂-提取物中的阿格拉滨含量依赖于提取条件

小心搅拌将精确量(exact shot)的CO₂-提取物研究样品溶解于10ml流动相 中。将获得的溶液定量转移至25ml容积的容量瓶中，将溶液体积调节至刻度 并搅拌。

用孔径为0.45μm的膜过滤器过滤得到的溶液。以上述条件对20μl滤液 和真实阿格拉滨样品的溶液进行色谱处理。

通过利用外标的比较方法，用以下公式测定以百分比计的阿格拉滨含量 (X)：

$X=\frac{S_1·m_o·25·100}{S_o·m_1·25},$

其中

S₁-测试溶液色谱图上阿格拉滨峰面积的平均值；

S₀-真实样品溶液色谱图上阿格拉滨峰面积的平均值；

m_o-真实样品中的阿格拉滨量(shot)，g；

m₁-CO₂-提取物量，g；

25-稀释度。

表2显示了地方性植物的CO₂-提取试验中和废料中阿格拉滨含量的数据。

显示了所进行实验的结果，以下方案时记录到第一分离器中的最大产率： 150×10⁵Pa压力和60℃温度。因此，与已知氯仿提取相比，靶物质产率增 加，提取时间大大降低。

70℃，用1:2比例的水-醇混合物处理，10-15℃在冷却器中沉淀滤液24 小时从脂质组分、蛋白质物质和叶绿素中纯化得到的CO₂-提取物。过滤处理 的混合物，然后收集在不同容器中，滤器上的残留物经1:2比例的水-醇处理3 次，合并滤液并蒸发至1/5起始体积。向蒸发的滤液中以1:1的比例加入乙酸 乙酯，将得到的溶液转移至分离器中并搅拌5分钟，然后完整分离各层。分离 各层；用乙酸乙酯提取下部水层3次。合并乙酸乙酯提取相，蒸发至干。对于 浓缩提取物，纯化提取物的产率是73.3％。

表2.通过HPLC方法测定CO₂-提取后样品中阿格拉滨的含量

将纯化的提取物转移至用制备型液相色谱设备“超纯-350(Super Pure- 350)”选择各物质的制备型色谱平台。

用不连续的装置，借助恒溶剂系统(isocritical system)(1:1比例的乙腈- 水)在反相C₁₈柱上进行色谱分级。工作压力范围从50×10⁵到最高320× 10⁵Pa，温度从5℃到最高80℃，系统中共溶剂(co-solvent)的流速从20到 最高350ml/分钟，柱内径为10sm。借助制备型液相色谱设备“超纯-350” 获得工业级阿格拉滨纯度为99％。

采用制备型液相色谱方法，应用反相C₁₈柱可用3小时分离各组分，而在 已知方法中，通过柱色谱方法分离需要72小时。此外，本发明方法不包括在 柱色谱处理时使用毒性溶剂苯。

合成1(10)β-环氧-13-二甲基氨基-5，7α，6，11β(H)-愈创木-3(4)-烯-6，12-内 酯盐酸盐(1)以进一步获得水溶形式的内酯二甲基氨基衍生物盐酸盐。将初 始物质，倍半萜内酯阿格拉滨(2)以1:10的重量比溶解于乙腈中。然后在乙 腈溶液中滴加二甲基氨基甲酸二甲铵并搅拌10分钟，初始物质与二甲基氨 基甲酸二甲铵的摩尔比为1:1.62。初始物质完全转化后(25分钟期间)，用 旋转蒸发仪蒸发乙腈和二甲基氨基甲酸二甲铵残留物。

该过程结束时，在反应混合物中以1:2的比例加入乙酸乙酯，冷却至温度 5-15℃。在12-15℃±0.3(反应开始时)缓慢搅拌进行气态氯化氢(HCl)的鼓 泡过程，在16-18℃±0.5完成反应。反应的最佳持续时间是15分钟。pH 达到5.2-5.5±0.05时中断气体加入。该过程结束时，将反应混合物转移至容 积21的旋转蒸发仪烧瓶中，蒸发过量乙酸乙酯和氯化氢至糖浆状。向获得的 溶液中加入预先冷却至10℃的无水(absolute)乙酸乙酯(99.9％)，剧烈振荡后有 白色晶体沉淀。将含晶体块的烧瓶在12-15℃冷却器中维持1小时。通过滤器 硕塔(Shotta)滤出沉淀的晶体，用冷却的乙酸乙酯冲洗同一滤器。乙酸乙酯重结 晶后，40-70℃用旋转蒸发仪干燥滤出的晶体1小时。在40-50℃温度，5-10mm 汞柱压力下真空干燥晶体直至重量丧失不超过0.5％。得到的产物是白色晶 体粉末状的二甲基氨基阿格拉滨盐酸盐(1)，产率为90％。

在本发明方法中，二甲基氨基阿格拉滨盐酸盐合成期间利用二甲基氨基甲 酸二甲铵而不是已知方法中使用的二甲胺能将合成阶段持续时间从48小时降 低至3小时。

利用二甲基氨基阿格拉滨盐酸盐物质(1)制备冻干医药形式。

终产物(物质)溶解于注射用水，其比例为：2g干物质/100ml水。通过以 下方法冻干获得的2％溶液。利用过滤装置“萨托里斯(Sartorius)”依次经孔径 0.45μm、0.2μm的无菌小盒(capsule)“萨托布莱恩(Sartobran)”将溶液过滤 入相应的无菌玻璃容器中。借助自动装置“罗斯(Rose)-2”将得到的滤液倒入2 ml安瓿中，用冷冻干燥机LZ-45干燥。将注入安瓿的溶液安置在筒状体上。 用无菌羊皮纸覆盖各筒状体并置于低温工作台“德布里(Debri)”(荷兰)中，-40 ℃冷冻不少于12小时。冷冻过程后，将带有安瓿的筒状体放在升华器架子上 并置于升华器LZ-45的真空沸腾器(vacuum boiler)中以进行升华干燥过程。将 架子浸入升华器的沸腾器后1小时内，连接真空泵，进一步获得所需真空值(不 低于5-6MPa)，干燥过程开始后约2小时内，开始预加热升华器架子。以升华 干燥每一小时5℃将架子逐渐从0℃加热至最高+55℃。对于从0℃到最多-30 ℃的零下温度以10℃(增幅)增加。将产品从零下温度增加至正温在干燥的第12- 第13小时进行。产物的最终温度不应超过+50、+52℃。干燥持续时间是24小 时。

根据熔点、IR-光谱、HPLC-分析确定制品的真实性。

从以上数据可以看出，本发明方法在对应于标准GMP的条件下进行，即：

-液体二氧化碳是无毒提取剂；

-通过制备型液相色谱设备“超纯-350”应用反相C₁₈柱分离各物质；

-在合成阶段，改变使用二甲基氨基甲酸二甲铵。

研究了制备物质1(10)β-环氧-13-二甲基氨基-5，7α，6，11β(H)-愈创木 -3(4)-烯-6，12-内酯盐酸盐(1)对11种实验性肿瘤(细胞)株的抗肿瘤活性。

以下交织肿瘤(interweave tumor)的(细胞)株对腹膜内和肿瘤内引入最大 耐受剂量(MTD)的阿格拉滨敏感：大鼠的肺癌、欧里希(Ehrlich)实体瘤、乳 腺癌Ca-755、肉瘤37、淋巴细胞性白血病P-388、淋巴细胞性白血病L -1210、肉瘤M-I、沃克(Walker)癌肉瘤、肝脏的蜂窝状粘液癌PC-1。

阿格拉滨还显示对耐受丙螺铵(prospidine)、柔红霉素(rubomicine)和溶 肉瘤素(sarcolyzine)的交织肿瘤有效。

“冻干的阿格拉滨”制品确能影响转移形成的最初阶段，即降低它们发生 的可能性。

阿格拉滨能优化结缔组织中的氧化还原过程和代谢。

测定阿格拉滨免疫调节活性，其取决于制品的剂量并显示主要影响免疫力 的T-细胞部分。

阿格拉滨具有纠正抑制细胞的免疫抑制作用的特性。

阿格拉滨显示是RAS-癌蛋白的竞争性抑制剂，能降低RAS-基因表达和 ATP含量并引起肿瘤细胞凋亡。

该制品在生物体中的保留时间参数足够高(几乎22小时)。阿格拉滨快速 穿过中心隔室(central camera)(血液)进入外周组织。在第一小时中，该制品在 脾脏和肺中的浓度最高，3小时时其也在肝脏和骨骼肌中收集到。

尽可能高的耐受剂量的制品不影响外周血和骨组织的形态学结构，不破坏 肝脏、肾脏、心血管系统、呼吸、外周神经系统的功能状态。

静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下注射引入时，该制品不导致局部刺激作用。 未见过敏和发热特性。阿格拉滨也没有胚胎毒性、致畸和诱变特性。

对53位III-IV期11个部位恶性进程(malignant process)的患者进行冻干 阿格拉滨的一期临床研究。引入的单位剂量是240到最高480mg/天。静脉内 引入2％水溶液的制品。目前，对于腹水和胸膜炎的患者，将2％溶液以480mg 剂量(生理盐溶液配制)引入腔室。

推荐剂量的制品显示没有毒性，对造血作用不产生抑制作用，不破坏内部、 外周神经系统的功能。

对IV期11个部位肿瘤过程(肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、直肠癌、食道 癌、卵巢癌、胰腺癌、下颌骨下唾液腺的癌症、淋巴肉瘤，等)的72位患者进 行制品的II期临床检验。

II期临床检验获得如下结果：

-32(44.4％)位患者的肿瘤部分消退；

-12(16.7％)位患者的进程稳定；

-28(38.9％)位患者的进程发展。

通过世界卫生组织(WHO)和国际抗癌症联盟(International Anticancerogenic Union)推荐的标准评估制品单一化疗(monochemotherapy)的 客观作用。初始癌症是肝癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌时阿格拉滨化疗的结果最 佳。

在通过随机方法产生的三组中治疗弥散性乳腺癌患者：

I组-阿格拉滨单化疗(15位患者)；

II组-联用阿格拉滨与CMF方案(15位患者)

III组-CMF方案化疗(15位患者)-对照。

阿格拉滨平均单剂量是240mg，总剂量是4.8g。

在II组(阿格拉滨+CMF)中特定消退(particulate regression)参数高并且 该疾病过程稳定。

研究了弥散性乳腺癌患者的存活率(根据E.Kaplan-P.Meier计算)。

只接受冻干阿格拉滨的患者组中，6个月存活率等于57.8％，年存活率是 3.9％。存活率中值是6.3个月。在只接受CMF方案的综合化学疗法的患者中， 所述参数相应为72.0％和17.3％，存活率中值为7.6个月。在联用阿格拉滨 与CMF方案综合化学疗法的患者中观察到参数较高，6个月存活率为100％， 年存活率是39.1％。存活率中值是10.9个月(P<0.05)。

治疗后，在放疗结束时和外科手术前，在第一组和第二组(P<0.001)中观 察到肿瘤体积确实比第三组患者减小很多。第一和第二组中III-IV度肿瘤的病 理形态学相应为64±9.8％和50±0.2％，而第三组为37±9.5％。

测定了存活率的累积参数(根据E.Kaplan-P.Meier计算)。第一和第三组 患者中3年存活率看来一样，分别为23.9±7.8％和24.4±7.8％，而第二组为 45.2±9.1％。

研究非回归存活率(non-recurrent survival rate)时观察到相同情况。因此， 在第一和第三组中，3年存活率相应为5.2±4.1％和5.2±4.1％，第二组为32.5 ±8.6％。

第一和第三组中存活率中值相同(3±0.03年)，第二组中所述参数确实高 于(7.4±0.2年)前述两组。

对具有弥散形式肿瘤并对化学品产生抗性的34位不可治愈和虚弱患者 (Karnovskiy指数为60-70％)联用“冻干阿格拉滨”和化疗时，有44％获得阳 性效应。这些结果证明了“冻干阿格拉滨”的化学敏感活性。“冻干阿格拉滨” 是在其它类型的标准抗肿瘤治疗不适用时虚弱且不可治愈患者可选择的一种 制品。

将55位初期肝癌患者分成3组进行研究：

1组(对照)-接受综合化学疗法(26位患者)。

2组-静脉内接受5mg/kg体重(185mg/m²)的单剂量冻干阿格拉滨，20-21 天(17位患者)。

3组-静脉内接受5mg/kg体重(185mg/m²)的冻干阿格拉滨与600mg/m²的氟尿嘧啶，18天(12位患者)。

通过WHO标准测定化疗的效力。通过精算法(acturial method)计算存活 率。

在接受标准药物的综合化学疗法和只接受冻干阿格拉滨的第一和第二组 患者中的年存活率分别为32.2％和32.3％。在第三组中，存活率确实超过前两 组的参数，其为55.1％(P<0.05)。

测定存活率中值还显示第三组中较高(15.3个月)，而在第一和第二组中分 别为7.85和8.45个月。

给基本上具有T3N1MO阶段的45位肺癌患者引入冻干阿格拉滨，其中6 位患者在接受试验开胸术后，21位是初期患者，24位是给药后化疗和放疗之 前的重复患者。对所有患者进行诊断的组织学确认：16位患者为表皮样癌，12 位患者为小细胞癌，10位患者为腺癌和7位患者为单纯癌。

I.基础组：第1-第20天给予冻干阿格拉滨，第1、4、8、11天给予25mg 甲氨蝶呤，第1、5、9天给予1.0g环磷酰胺(15患者)。

II.对照组1：第1-第20天给予240mg冻干阿格拉滨(15位患者)。

III.对照组2：第1、4、8、11天给予25mg甲氨蝶呤，第1、5、9天给 予1.0g环磷酰胺(15患者)。

对部分患者实施“冻干阿格拉滨”化疗时，总体状态改善、咳嗽和乳腺疼 痛减轻是显著的(基本上在1点评估)。治疗结束时，大多数患者的疾病过程稳 定。第一对照组的两位患者疾病进展显著。

第一治疗过程结束1个月后，该部分患者反复看医生。在对照检查时，继 续测定几乎所有患者的疾病过程稳定。

测定了“冻干阿格拉滨”制品作为放疗和化学-放射治疗的射线增敏剂在 20位局部乳腺癌(topical mamma cancer)患者中的效力。在研究组中20位患者 有19位(95.5％)实现肿瘤的完全和特定消退，其中4位(20.0％)观察到完全肿 瘤再吸收。在对照组中，客观抗肿瘤效应(objective antitumor effect)是70％。 为在手术材料的组织学研究中更客观地评估“冻干阿格拉滨”治疗，测定了肿 瘤和转移改变淋巴结的医学病理形态学程度。研究组中11位(55％)患者和对照 组中4位(20％)患者确定为3度医学病理形态学(癌症的各种退化修饰细胞、坏 死、纤维化)。14位(70％)接受“冻干阿格拉滨”的患者中依据形态学标准的完 全的所述抗肿瘤效应显著，比对照组(20％)高3.5倍。在放疗之日，放疗前15 分钟静脉内引入5mg/kg的单剂量“冻干阿格拉滨”没有副作用并为患者良好 耐受。

因此，冻干阿格拉滨具有所述增敏作用，确实提高了初期肿瘤和转移改变 淋巴结的客观消退频率和所述医学病理形态学(III-IV度)的频率。

应用“冻干阿格拉滨”制品的18位乳腺癌妇女在放疗前后干扰素(IFN)状 态和细胞因子分布的动力学研究证实其能恢复以下细胞因子的合成机制： IFN-γI1(白介素)-2、抗炎性细胞因子I1-4、TNF(肿瘤坏死因子)-α、I1-1β。

“冻干阿格拉滨”制品治疗后，检测的患者中以下情况显著：

1.所有患者中产生的IFN自发降低。

2.平均40％的患者产生IFN-α和IFN-γ的能力升至正常。

3.44％和11％患者分别对IFN-α和IFN-γ制品增敏。

4.30-40％病例对免疫调节制品(瑞德斯汀(ridostine)、赛克洛费隆 (cycloferon)和阿米仙(amicsine))的敏感性增加，40-50％病例对研究的“冻干 阿格拉滨”制品的敏感性增加。

还显示，在用包括“冻干阿格拉滨”制品在内治疗的呈阳性临床效应的所 有患者中观察到基因IFN-γ和I1-2(50％)表达或只有I1-2(50％)表达。因此， 在其他患者中只在27％和73％病例中观察到所述细胞因子的基因活性。已 知这些细胞因子由Th1-淋巴细胞产生，抑制Th1活性和IFN-γ或I1-2的产 生减少会导致更严重的疾病进程。根据这些参数，应用“冻干阿格拉滨” 治疗是有效的。

观察到，应用“冻干阿格拉滨”制品治疗呈阳性临床效应时，在60％患者 中测定到mRNA I1-12-细胞因子(参与Th1-型免疫应答)，其频率比其它患者高 两倍。

所进行的研究还显示，几乎所有治疗后的检测患者中测定到mRNA I1-1β。 因此，分别在70％和60％呈阳性临床效应的患者和在80％和70％稳定状态的 患者中观察到活性mRNA I1-6和I1-8。

同时，借助研究IFN状态和评估细胞因子基因的表达，它们的mRNA在 相同乳腺癌患者中的合成水平决定血液血清中和血细胞培养时的细胞因子含 量(酶多重免疫测定方法)。

用冻干阿格拉滨治疗后，在20-40％的检测妇女中观察到所研究的细胞因 子(在血液血清中测定到)数量正常或趋向正常。因此，10-30％患者中血液血清 的细胞因子含量增加也可证明免疫系统细胞得到活化。

在临床检验“冻干阿格拉滨”制品期间研究乳腺癌患者的干扰素系统和细 胞因子状态获得的数据证明所研究的制品在给定患者组中的免疫调节活性高。

制备抗肿瘤制品“阿格拉滨”的本发明方法的优点在于：

-存在工业原始材料基础；地方性植物(无毛蒿)在面积为5.6公顷的哈萨 克斯坦卡拉干达药物工厂(Karaganda pharmaceutical factory，Kazakhstan， Karaganda)的指导农场(pilot farm)培育，每年有6.0吨干物质以供后续加工。 到2010年，计划将原始材料年产量增加至40吨/年。

-应用无污染技术，用无毒提取剂液体二氧化碳从天然原始材料中提取靶 物质-倍半萜内酯1(10)β-环氧-5，7α，6β(H)-愈创木-3(4)，11(13)-二烯-6，12-内酯 (2)，该技术因不用毒性溶剂氯仿进行提取而符合GMP标准；

-对于空气干燥的原始材料，利用液体二氧化碳提取靶物质的产率比氯仿 提取高两倍；

-本发明方法明显降低处理持续时间：提取时间减少两倍(从6小时到3 小时)，色谱分级减少36倍(从72小时到3小时)，合成阶段减少16倍(从48 小时到3小时)；

-应用反相C18柱，采用制备型液相色谱设备“超纯-350”分离和纯化各 物质，因而可以不用毒性溶剂苯；

-利用二甲基氨基甲酸二甲铵而不是二甲胺合成物质1(10)β-环氧-13-二 甲基氨基-5，7α，6，11β(H)-愈创木-3(4)-烯-6，12-内酯盐酸盐(1)；

-临床检验的结果显示通过本发明方法得到的抗肿瘤制品“阿格拉滨”的 射线增敏、免疫调节活性高。