检测Ia型糖原累积病的基因芯片

摘要

一种生物技术领域的检测Ia型糖原累积病的基因芯片，该芯片包括片基以及固定在片基上的探针，其中探针为SEQ ID NO.1－48所示的核苷酸序列。本发明的诊断芯片操作步骤简单，检测特异性高，稳定性好，从样本抽提到得到扫描结果可在一个工作日内完成，成本低，适用于临床患者基因突变检测、产前诊断和正常人杂合子携带者检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的基因芯片，具体是一种检测Ia型糖原累积病的基因芯片。

背景技术

遗传性代谢病(inherited metabolic disorders)是因维持机体正常代谢所必需的某些由多肽和(或)蛋白组成的酶、受体、载体及膜泵生物合成发生遗传缺陷及编码这类多肽(蛋白)的基因发生突变而导致的疾病。大多为单基因病，属常染色体隐性遗传。随着人们对此类疾病认识的加深及实验分析技术的发展，这类疾病的诊断率明显上升，目前已达上万种。此类疾病种类繁多，涉及到糖类、氨基酸、脂类等的代谢紊乱，临床症状多种多样，目前临床诊断主要依靠于生化检查及氨基酸、有机酸分析等，只有少数医院和研究机构可以对其中的某些疾病进行基因诊断。而患者出现血液或尿液生化改变时往往已经严重影响了其生存质量，所以常规的诊断方法无法对遗传代谢病进行早期诊断和产前诊断。

糖原累积病(glyeogen storage disease，GSD)Ia型是先天性遗传代谢病的一种，属常染色体隐性遗传，活产儿的患病率为1/100000。由于缺乏葡萄糖—6—磷酸酶(G6Pase)而使糖原无法正常分解为葡萄糖，从而造成严重的低血糖，肝脾肿大和生长落后。编码G6Pase的G6PC基因被定位于17q2.1，长约12.5kb，包含5个外显子。GSDIa属于可治性的遗传疾病，早期诊断和治疗是影响预后的关键。

经对现有技术的文献检索发现，

(1)Kan YW在《Lancet》1978年第2期910-912页发表的《Antenataldiagnosis of sickle-cell anaemia by DNA analysis of amniotic-fluid cells》(对羊水细胞DNA分析来进行镰状细胞贫血的产前诊断)一文最先提出用PCR-RFLP(聚合酶链反应-限制性片段长度多态性)的方法来进行基因诊断，该方法利用多种限制性内切酶对基因扩增产物进行酶切，不同的基因序列会产生不同的电泳图谱，但该方法只能应用于突变改变了某一酶切位点时。此后，对PCR-RFLP方法进行改进后形成了PCR-AIRS，即在突变位点引入酶切位点，Haliassos A在《Nucleic Acids Reaseach》1989年第17期第8093-8099页发表题为《Detection of minority point mutations by modified PCR technique：a new approach for a sensitive diagnosis of tumor-progression markers》(用改良的PCR技术进行点突变的检测：敏感诊断肿瘤进展标记物的新方法)一文，文章使用PCR-AIRS方法进行基因突变检测，但此方法多态信息受到限制性内切酶种类和数量的限制，还可能产生碱基错配而引起检测错误，且与RFLP一样存在技术步骤繁琐、工作量大、成本高、对样品质量要求高等问题，所以其应用受到了一定的限制；

(2)Orita M在1989年第8期《Proc Natl Acad Sci USA》2766-2770页发表的《Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresisas single-stand conformation polymorphisms》(单链构象多态性凝胶电泳检测人类DNA多态性)一文，文中提及应用PCR-SSCP(聚合酶链反应-单链构象多态性)基因检测，该方法是在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，单链DNA分子依据其碱基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变也将影响其构象而导致在凝胶上的移动速度改变，从而检测出基因突变。此法简单快速，但只能检测到突变的存在，并不能明确突变的部位和方式，还需通过序列分析来确定；

(3)DNA测序是最直接最准确的方法，1987年商品化的自动DNA测序仪问世，测序速度得到提高，但是价格比较昂贵。人类基因组计划的完成就有赖于自动的DNA测序，例如Lander ES在2001年第6822期《Nature》860-921页发表的名为《Initial sequencing and analysis of the human genome》(对人类基因组的初步测序及分析)的文章。

总之，现有的检测方法存在操作复杂，花费时间长，成本较高，难以自动化和高通量分析等问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测Ia型糖原累积病的基因芯片。本发明的诊断芯片操作步骤简单，检测特异性高，稳定性好，时间短，成本低，适用于临床患者基因突变检测和正常人杂合子携带者检测。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明涉及一种检测Ia型糖原累积病的基因芯片，包括片基以及固定在片基上的探针，其中探针为SEQ ID NO.1-48所示的核苷酸序列。

所述片基为载玻片、硅片、膜、高分子材料中的一种。

所述探针具体为：

SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列第648个碱基是否发生突变，由G→T；

SEQ ID NO.4-6所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列第248个碱基是否发生突变，由G→A；

SEQ ID NO.7-9所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列第262个碱基是否发生突变，G缺失；

SEQ ID NO.10-12所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列第310个碱基是否发生突变，由C→T；

SEQ ID NO.13-15所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列第508个碱基是否发生突变，由C→T；

SEQ ID NO.16-18所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列第279个碱基是否发生突变，由C→A；

SEQ ID NO.19-21所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列第1022个碱基是否发生突变，由T→A；

SEQ ID NO.22-24所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列第209个碱基是否发生突变，由G→A；

SEQ ID NO.25-27所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列第792个碱基是否发生突变，由C→A；

SEQ ID NO.28-30所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列第518个碱基是否发生突变，由T→C；

SEQ ID NO.31-33所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列第479个碱基是否发生突变，由G→A；

SEQ ID NO.34-36所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列第674个碱基是否发生突变，由T→C；

SEQ ID NO.37-39所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列第965个碱基是否发生突变，T缺失；

SEQ ID NO.40-42所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列第976个碱基是否发生突变，由T→C；

SEQ ID NO.43-45所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列第814个碱基是否发生突变，由G→T；

SEQ ID NO.46-48所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列第1097个碱基是否发生突变，由T→C。

本发明的基因芯片采用基于连接酶检测反应与通用芯片技术相结合的分型方法，针对人群中GSDIa病人的16个热点突变位点，每个位点设计3条特异性探针，两条位于突变位点5’端，分别带有野生型碱基和突变型碱基，一条位于突变位点3’端，称为common探针，末端携带荧光基团。只有当位点两端的探针序列均与模板完全配对，连接酶才会将两条探针连接起来，如果存在错配碱基，连接反应则不能进行。因此，只有与模板基因型相同的5’端探针才能和common探针连接在一起，从而发出荧光信号。芯片片基上固定有Zip探针，5’端特异性探针末端具有与Zip探针序列互补的cZip序列，所以当LDR反应后的产物与芯片杂交时，cZip序列就引导反应产物与Zip探针杂交，在芯片的特定位置可以检测到荧光信号，从而分析模板的基因型。

本发明具有如下的有益效果：本发明的诊断芯片操作步骤简单，只需要进行一次多重PCR反应和连接酶反应，杂交扫描即可；检测特异性高，稳定性好，该芯片可正确区分各个位点的纯合子和杂合子，多次试验重复性高；时间短，从样本抽提到得到扫描结果可在一个工作日内完成；采用通用芯片技术，片基也可通用于其他芯片，有效降低了成本，适用于临床患者基因突变检测、产前诊断和正常人杂合子携带者检测。

附图说明

图1为用激光共聚焦微阵列扫描仪对杂交后的基因芯片进行扫描的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解为：这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York ColdSpring Harbor Laboratory出版社1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

步骤一，片基处理及点样

将玻片用双蒸水洗净，在碱液中浸泡过夜，取出后用双蒸水清洗3遍，再于体积分数为1％的HCl中浸泡30分钟，清洗后置于玻片缸中待用。将清洁后的玻片经过4-氨丁基三乙氧基硅烷溶液氨基化处理，再经苯异硫氰酸酯溶液进行异硫氢基化处理，用氮气吹干后，放于4℃避光保存；

芯片Zip探针是随机组合的长度为24bp的寡核苷酸片段，将这些寡核苷酸序列利用NCBI网站上的BLAST功能与目的基因组序列进行同源性比较，选择其中同源性程度最低的一组作为Zip探针序列。位点特异性探针长度不等，需保证其Tm值基本保持一致，以确保后续反应的均一性；

将合成好的Zip探针溶解于点样液中，将探针溶液转移到对应的96孔板内，使用GMS417点样仪，运行相应程序将探针点到活化好的片基上，置于37℃，90％湿度的恒温恒湿箱中过夜，使探针与玻片充分交联。固定好的片基在氨水中封闭反应的活性基团，可以储存于4℃以备下步杂交实验用。

步骤二，样品准备

准备全血样品，用苯酚-氯仿法抽提全血中的基因组DNA。

步骤三，突变检测位点的选择

需要进行检测的16个突变位点涵盖了95％以上的GSDIa病人，突变位点及探针核心序列如表1，

表1

 

5’端wild探针5’端mut探针3’端common探针648G>TTTCTCATTACCTTCTTCCTGTTCTCATTACCTTCTTCCTTAGCTTCGCCATCGGATTTTA248G>AAGGATTCTCTTTGGACAGCGAGGATTCTCTTTGGACAGCACTGGTGGGTTTTGGATACTG262delGCAGCGTCCATACTGGTGGGCAGCGTCCATACTGGTGGTTTTGGATACTGACTACT310C>TCTTCCGTGCCCCTGATAAAGCCTTCCGTGCCCCTGATAAAGTAGTTCCCTGTAACCTG508C>TCTGAATGTCTGTCTGTCACCTGAATGTCTGTCTGTCATGAATCTACCTTGCTGCT279C>AGGGTTTTGGATACTGACTACGGGTTTTGGATACTGACTAATACAGCAACACTTCCG

 

1022T>AGCATCCGTCAGTGTCATGCATCCGTCAGTGTCAACCCCTACTGCCTCG209G>ATAGCTGTGATTGGAGACTGTAGCTGTGATTGGAGACTAGCTCAACCTCGTCTTTAAG792C>ACCAGCCTCCTCAAGAACCCAGCCTCCTCAAGAAACTGGGCACGCTCT518T>CGTCTGTCACGAATCTACCTGTCTGTCACGAATCTACCCTGCTGCTCATTTTCCTC479G>AATTTGTGGTTGGGATTCTGATTTTGTGGTTGGGATTCTAGGCTGTGCAGCTGAATG674T>CCGCCATCGGATTTTATCTCGCCATCGGATTTTATCCGCTGCTCAAGGGACTGG965delTCCCAAGTCGAGCTGGTCTTCCCAAGTCGAGCTGGTCTCTACGTCTTGTCCTTCT976T>CCTGGTCTTCTACGTCTTGTCTGGTCTTCTACGTCTTGCCCTTCTGCAAGAGTGC814G>TGCACGCTCTTTGGCCTGGGCACGCTCTTTGGCCTGTGGCTGGCTCTCAACTCC1097T>CGATGTGGAGTCTTCGGTGTTTGATGTGGAGTCTTCGGTGTTCAAAGTCAACAACCATGC

突变形式中的“del”表示缺失突变，如262delG表示SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列中第262位碱基缺失；“>”表示置换突变，如648G>T表示SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列中第648位碱基由G突变为T。依次类推，以上16种突变所代表的位置是在SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列中：

第648个碱基是否发生突变，由G→T；

第248个碱基是否发生突变，由G→A；

第262个碱基是否发生突变，G缺失；

第310个碱基是否发生突变，由C→T；

第508个碱基是否发生突变，由C→T；

第279个碱基是否发生突变，由C→A；

第1022个碱基是否发生突变，由T→A；

第209个碱基是否发生突变，由G→A；

第674个碱基是否发生突变，由T→C；

第792个碱基是否发生突变，由C→A；

第518个碱基是否发生突变，由T→C；

第479个碱基是否发生突变，由G→A；

第976个碱基是否发生突变，由T→C；

第965个碱基是否发生突变，T缺失；

第814个碱基是否发生突变，由G→T；

第1097个碱基是否发生突变，由T→C。

步骤四，多重PCR扩增

分别以各样本的基因组DNA为模板，进行多重PCR。上述16个突变位点分布于4个外显子上，四重PCR在一个反应管中进行。四重PCR反应成分(25μl体系)：20ng基因组DNA，10mM Tris-HCl，50mM KCl，3.0mM MgCl₂，200μM dNTP，0.6μM各引物，2.5U Taq DNA聚合酶。反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火45s，68℃延伸2min，循环30次，68℃ 10min。反应完成后在反应混合液中加入1μl蛋白酶K，70℃反应10min，随后94℃ 20min灭活蛋白酶K；四重PCR反应的引物如表2所示，

表2

 

扩增位点上游引物下游引物209G>A5’-TCTGCTGACATCTTCCT-3’5’-GCCTCTTTTCTTGCTGA-3’248G>A，262delG，310C>T，279C>A5’-GCATTCATTCAGTAACCC-3’5’-TCCACTCAGCTTCTGTCT-3’508C>T，518T>C，479G>A5’-GCCAGGCTCCAACATTT-3’5’-GGAGAGAAACGGAATGG-3’648G>T，1022T>A，792C>A，976T>C，674T>C，965delT，1097T>C，814G>T5’-CTTCCTATCTCTCACAG-3’5’-TCACTTGCTCCAAATACC-3’

步骤五，连接反应

蛋白酶K消化后的扩增产物，立刻进行LDR反应。在反应液中依次加入10×Taqligase buffer 2μl，探针混合液1μl，各探针浓度均为1μM，Taq DNAligase 0.25μl，补水至总体积20μl；反应条件为94℃变性30s，65℃退火4min，循环40次。

步骤六，杂交

向20μl LDR反应液中加入15μl双蒸水和35μl 2×杂交液，混匀后于95℃加热变性5min，迅速放于冰上冷却，离心待用。将杂交框粘贴于点样区域，吸取65μl杂交液添加到杂交框中，封闭好置于65℃杂交箱中杂交1小时。杂交结束后，去掉杂交框，将芯片分别放于0.3×SSC/0.1％SDS和0.06×SSC中各洗脱1min，离心甩干。

步骤七，扫描与分析

杂交后的芯片用激光共聚焦微阵列扫描仪进行扫描，得到的图象用软件进行分析。最终获得各个样本点的荧光信号强度值和背景值，扣除背景影响后得到该点的AMSI值(absolute median signal intensities)。扫描结果如图1所述：1，2列信号代表648G>T位点的突变型和野生型，3-32列依次表示另外15个位点的突变型和野生型。每个位点的野生型和突变型均进行4个点重复。33列为阴性对照，34列为阳性对照。根据同一位点野生型和突变型探针点的绝对信号强度比值，确定基因型。

本实施例操作步骤简单，只需要进行一次多重PCR反应和连接酶反应，杂交扫描即可；检测特异性高，稳定性好，经前期试验该芯片可正确区分各个位点的纯合子和杂合子，多次试验重复性高；时间短，从样本抽提到得到扫描结果可在一个工作日内完成；采用通用芯片技术，片基也可通用于其他芯片，有效降低了成本。

序列表

<110>上海交通大学医学院附属新华医院，上海交通大学

<120>检测Ia型糖原累积病的基因芯片

<160>49

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

<210>2

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<210>49

<211>1074

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)…(1269)

<400>49