人乳头状瘤病毒感染基因扩增荧光检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种具有与HPV DNA互补的核甘酸序列的探针和引物，其中探针选自SEQ ID Nos：1～13，引物选自SEQ ID Nos：14～39；还公开了一种包括上述探针和引物的高危人乳头瘤病毒感染的核酸扩增荧光鉴定试剂盒。本发明的高危人乳头瘤病毒感染的核酸扩增荧光鉴定试剂盒包含了13种高危人乳头瘤病毒亚型，能同时在3小时内完成抽提80～100份临床样本DNA及检测，灵敏度及特异性高，价格低廉，容易被广大患者所接受，易于普及推广。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有与人乳头状瘤病毒HPV DNA互补的核苷酸序列的探针、引物，和含有该探针、引物的人乳头状瘤病毒感染基因扩增荧光检测试剂盒。

背景技术

人乳头状瘤病毒(HPV)与宫颈癌关系密切，HPV可分为高危型和低危型两种，临床证明95～99.7％的宫颈癌病例和高危型HPV病毒感染有关，HPV感染使患宫颈癌的相对危险性增加250倍。HPV的存在就预示着疾病的存在，提早诊断HPV感染，对清除女性生殖道的持续感染，防止其向宫颈癌演变有着重要的意义，

传统上，宫颈涂片检测是群体筛查的常规手段，但由于这方法只以观察作为诊断基础，受取材、涂片制作质量、阅片技术影响，其准确率低，假阳性高，重复性差，得到的结果及分析漏诊率可达30％。分子诊断技术可以大致分为两种，一种是不需要扩增DNA分子，直接利用核酸探针通过杂交捕捉到靶分子进行检测，这种方法的缺点是灵敏度低，一般要用放射性元素³²P标记才能达到检测目的；另一种是需要对分子进行扩增，又可以进一步分为两类：(1)目的分子(靶分子)扩增，即对目的分子(靶分子)基因进行扩增检验(如PCR法)；(2)信号扩增，一般用核酸作为探针以杂交反应捕获病毒DNA，再进行信号扩增检测。

与传统的细胞抹片检查相比，PCR检测的优势显而易见，其灵敏度高，可检测极微量的HPV DNA。近年来又发展了一种新型的PCR检测方法，即实时荧光PCR检测方法。过去采用常规PCR技术检测HPV感染虽然快速、简便，但存在两个较大的缺陷：①在对扩增产物进行后处理的过程中，如操作不慎，则易污染造成假阳性。②只能定性，不能定量，不能观察HPV负荷与宫颈病变的关系，因而限制了其在临床工作中的应用。实时荧光PCR技术在常规PCR基础上添加了一条标记了2个荧光基因的荧光双标记探针。一个标记在探针的5′端，称为荧光报告基团，另一个标记在探针的3′端，称为荧光抑制基团。两者构成能量传递结构，即5′端荧光基团所发出的荧光可被3′端荧光基团吸收或抑制。实时荧光PCR技术把基因扩增、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，并通过微机控制，实现了对PCR扩增产物进行实时动态检测和自动分析结果。此方法检测宫颈HPV感染，具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点，既适用于大规模筛查也适用于临床日常工作中采用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种探针，具有与HPV DNA互补的核甘酸序列，其中探针选自SEQ ID Nos：1～13，在每个探针的核甘酸序列范围内的任意15～28个碱基都可作为探针序列。

 

序列号HPV型序列SEQ NO1165′-gac aac tga tct cta ctg tta tga gca att-3′SEQ NO2185′-tat tct ttg cag caa ggg aac atg gca tac-3′

 

SEQ NO3315′-att gaa cta caa atg atg ttg gaa aca tta-3′SEQ NO4335′-gtt agc atc aaa gac caa agc att tca agt-3′SEQ NO5355′-gga acc cga ggc aac tga cct ata ctg tta-3′SEQ NO6395′-atg gca cta gaa agt gtt gca caa act gaa-3′SEQ NO7455′-tgg aaa atg caa tac tat tta cag caa ggg-3′SEQ NO8515′-cca gaa aga cgg gct gga cag gct acg tgt-3′SEQ NO9525′-gcc tgc caa gct att gaa cta caattg gca-3′SEQ NO10565′-gga tga agt aga cca ttt gca gga gcg gcc-3′SEQ NO11585′-taa agc gtt tca agt aat tga act gca aat-3′SEQ NO12595′-gtc aaa ccg tac ttc cac tgt aat gcc ctg-3′SEQ NO13685′-att atg cag cac gag aac gtg gta tgc ata-3′

本发明的另一个目的在于提供一种引物，具有与HPV DNA互补的核苷酸序列，其中引物选自SEQ ID Nos：14～39，在每条引物的核甘酸序列范围内的任意20～25个碱基都可作为引物序列。每一种引物的核苷酸排列顺序如下：

本发明探针的3′采用荧光标记，荧光标记可以是：FAM，VIC，JOE，HEX，TET，Cy3。

本发明探针的5′采用荧光标记，荧光标记可以是：TAMARA，MGB。

本发明的主要目的在于提供一种高危人乳头瘤病毒感染的核酸扩增荧光鉴定试剂盒，包括：

(1)不同HPV型别的核苷酸探针，其中探针至少是一个选自SEQ IDNos：1～13；

(2)各种引物，用于扩增临床样本中的DNA序列，该引物选自SEQID Nos：14～39；

(3)常规的扩增试剂；

(4)常规的DNA裂解试剂；

(5)质量控制对照品。

迄今为止国内外已有多种HPV检测试剂盒面市，国内所用HPV检测试剂盒大部分是利用PCR检测法(其中包括实时荧光PCR方法)，通过HPV特异或者其各分型的特异性引物进行PCR扩增后，琼脂糖电泳或荧光定量得到最终结果，而这些试剂盒多只用于对高危型HPV-16、18，低危型HPV6、11的HPV病毒检测，对于其他类型HPV病毒的检测并没有涉及，而本发明的高危人乳头瘤病毒(HPV)感染的核酸扩增(PCR)荧光鉴定试剂盒包含13种高危人乳头瘤病毒(HPV)亚型，能同时在3小时内完成抽提80～100份临床样本DNA及检测，灵敏度及特异性高，价格低廉，容易被广大患者所接受，因此易于普及推广。

附图说明

以下是附图的说明，便于理解上述发明的目的和具体特征。

图一是13种高危型HPV模板在ABI7000上的检测结果(200拷贝/型/反应)，从下到上红色箭头1～13分别代表HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68亚型的扩增曲线。

图二是HPV58、HPV56、HPV52、HPV18、HPV16经PCR扩增后电泳检测图，其中M、N、1、2、3、4、5分别代表分子量标记、阴性对照、HPV58、56、52、18和16亚型。

图三是HPV45、HPV68经PCR扩增后的电泳检测图，其中M、1、2分别代表分子量标记、HPV45和HPV68亚型。

图四是HPV31、HPV59、HPV51经PCR扩增后的电泳检测图，其中1、2、3、M分别代表HPV31、HPV59、HPV51和分子量标记物。

图五是HPV33，HPV35、HPV39经PCR扩增后电泳检测图，其中M、N、1、2、3分别代表分子量标记、阴性对照、HPV33、35和39。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行详细的说明。

本发明人通过分析临床样品的DNA，分别制备具有与13种高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID Nos：1～13的探针及SEQ ID Nos：14～39的引物，来检测HPV感染和鉴定HPV高危型。

本发明提供的高危人乳头瘤病毒(HPV)感染的核酸扩增(PCR)荧光鉴定试剂盒包括上述探针和引物，DNA聚合酶，还包括PCR MIX，后者包括除模板以外的所有PCR反应所需试剂，以及用于阳性对照的HPV53质粒和阴性对照的超纯水。

本发明试剂盒使用步骤如下：

[样品提取]

(1)采集样本种类：

女性宫颈口脱落细胞

(2)采集方法：

采样前用棉拭子将宫颈口过多的分泌物轻轻擦拭干净，然后更换棉拭子，用细胞保存液浸润的棉拭子或毛刷紧贴宫颈口粘膜，稍用力转动几周，以取得宫颈脱落细胞，将取样后的棉拭子或毛刷放入备有1毫升细胞保存液的样品管中，充分漂洗后，将棉拭子或毛刷贴壁挤干丢弃。

(3)保存方法：

采集的样品在2～8℃保存不应超过24小时，-20℃保存不超过三个月，-70℃可长期保存，避免反复冻融样本。

[操作步骤]

1 样品处理(在样品处理区进行)

1.1 取出待测样本、HPV53质粒和超纯水，置于室温解冻，并振荡混匀。

1.2 取500ul待测样本，13000rpm离心10分钟，小心吸弃上清，保留沉淀。

1.3 向沉淀物中加入50ul DNA裂解液，振荡混匀。

1.4 100℃沸水浴/干浴10分钟，13000rpm离心10分钟，保留上清备用(上清中为释放的DNA，如果当天不使用，于-20℃保存)。

注：阳性对照无需处理，可直接用于PCR扩增。

2 扩增试剂准备(在PCR前准备区进行)

2.1 从试剂盒中取出HR-HPV PCR MIX、DNA聚合酶，室温融化并混合均匀后，8000rpm离心10秒。

2.2 按照下表配制扩增试剂：

每人份反应总体积为：18ul HR-HPV PCR MIX+2ul处理好的样品DNA；每次反应HR-HPV PCR MIX总体积＝18(HR-HPV PCR MIX)×PCR反应管管数n(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)。

2.3 将配制好的扩增试剂充分混匀，8,000rpm离心10秒，向设定的n个PCR反应管中分别加入18ul，转移到样品处理区。

3 加样(在样本处理区进行)

3.1 在对应的PCR反应管中分别加入2ul处理好的样品DNA、阴性对照、阳性对照，盖紧管盖，稍做离心。

3.2 转移到检测区，放入相应的荧光PCR检测仪内，记录样品摆放顺序。

(4)PCR扩增(在检测区进行)

4.1 循环条件设置

95℃         10min      1个循环

94℃         10sec

55℃         30sec

94℃         10sec

58℃         30sec

使用博日Line-Gene荧光定量PCR仪时循环程序设置如下：

反应体系设为20ul。

4.2 仪器检测通道选择

选定报告荧光，ABI7000选FAM为报告荧光，淬灭荧光为None，Passive Reference选择none，博日Line-Gene荧光定量PCR仪的报告荧光为第一通道。

[结果判定]

1 阈值的设定

1.1 在ABI7000上进行结果分析时基线的确定为：取3～10个循环的荧光信号；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值＝0.0为准。

1.2 在博日荧光定量PCR仪上进行结果分析时零点调整为：取3～10个循环的荧光信号，基线和阈值的确定阈值线(0.1<阈值线<1)刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值＝0.0为准。增益值为70。

2 质控对照

2.1 阴性对照CT值均应显示为Undet。

2.2 阳性对照CT值≤26。

3 结果判断

3.1 样品的CT值显示为Undet判断为阴性。

3.2 样品的CT值≤33，判断为阳性；若为33<CT值<35的样本建议重做，重做结果CT值<35者为阳性，否则为阴性。

[本发明试剂盒诊断结果统计]

表一：临床考核试验病例的分布

表二：本发明试剂盒检测结果的一致性与符合率

表三：本发明试剂盒检测结果统计

表四：本发明试剂盒检测结果性能评估

上述实施例操作过程仅需大约3小时，操作简单，且可以同时完成多份临床样本DNA及检测。从上述诊断结果统计表来看，本发明试剂盒检测的灵敏度及特异性高，分别达到94％和87％，对疾病的诊断起到了快速、准确的效果，完全满足临床应用的要求。

序列表

<110>潮州凯普生物化学有限公司

<120>人乳头状瘤病毒感染基因扩增荧光检测试剂盒

<160>39

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV16探针

<400>1

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV18探针

<400>2

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV31探针

<400>3

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV33探针

<400>4

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV35探针

<400>5

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV39探针

<400>6

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV45探针

<400>7

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV51探针

<400>8

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV52探针

<400>9

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV56探针

<400>10

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV58探针

<400>11

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV59探针

<400>12

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV68探针

<400>13

<210>14

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV16引物1

<400>14

<210>15

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV16引物2

<400>15

<210>16

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV18引物1

<400>16

<210>17

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV18引物2

<400>17

<210>18

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV31引物1

<400>18

<210>19

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV31引物2

<400>19

<210>20

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV33引物1

<400>20

<210>21

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV33引物2

<400>21

<210>22

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV35引物1

<400>22

<210>23

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV35引物2

<400>23

<210>24

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV39引物1

<400>24

<210>25

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV39引物2

<400>25

<210>26

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV45引物1

<400>26

<210>27

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV45引物2

<400>27

<210>28

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV51引物1

<400>28

<210>29

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV51引物2

<400>29

<210>30

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV52引物1

<400>30

<210>31

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV52引物2

<400>31

<210>32

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV56引物1

<400>32

<210>33

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV56引物2

<400>33

<210>34

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV58引物1

<400>34

<210>35

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV58引物2

<400>35

<210>36

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV59引物1

<400>36

<210>37

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV59引物2

<400>37

<210>38

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV68引物1

<400>38

<210>39

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV68引物2

<400>39