miR155转基因小鼠中前B细胞增殖和淋巴母细胞性白血病/高度淋巴瘤

摘要

一种转基因非人动物，如小鼠，具有包括一个核酸构建体的基因组，该核酸构建体具有能指导在动物的B细胞中表达的至少一个转录调节序列，其中该转录调节序列与编码miR155基因产物的核酸可操作连接。一种测试试剂在治疗或预防淋巴组织增生疾病中的治疗功效的方法包括评估该试剂对转基因非人动物的影响。

说明书

政府支持

本发明完全或者部分得到美国政府财政补贴的支持。政府享有本 发明的某些权利。

发明背景

急性白血病是一种骨髓和血液的快速进行性恶性疾病，其导致未 成熟的，无功能的细胞，所谓的胚细胞，在髓和血液中的累积。胚细 胞在髓中的累积可阻断正常血细胞的发育。结果，没有产生足够数量 的红细胞，白细胞和血小板。当疾病是由于髓淋巴细胞祖细胞而引起 的时，它导致急性淋巴母细胞性白血病(ALL)，而当疾病是由于髓细胞 样祖细胞引起的时，它导致急性髓性白血病(AML)。

ALL是一种快速进行性癌症，其开始于髓淋巴细胞的恶变。ALL 是最常见的儿童期白血病类型，而且在所有的年龄组中每年有3,000 例新病例。转化的，目前恶性的，细胞增殖并在髓中累积为白血病淋 巴母细胞。淋巴母细胞阻断髓中正常血细胞的形成，其导致不足的红 细胞，白细胞和血小板产生。

高度淋巴瘤，也称为侵袭性淋巴瘤，包括淋巴瘤的几个亚型，其 如果不治疗就会相对快速地进展。这些亚型包括，例如，AIDS相关的 淋巴瘤，退行性变化的大细胞淋巴瘤，伯基特氏淋巴瘤，弥散性大细 胞淋巴瘤，免疫母细胞淋巴瘤，淋巴母细胞性淋巴瘤和小的未裂解细 胞淋巴瘤。相较于弥散性大B细胞淋巴瘤，高度淋巴瘤表现更具侵袭 性，需要更强烈的化疗，而且更常发生于儿童中。因为快速分裂的细 胞对抗癌剂更敏感，而且由于年轻患者通常没有其他的健康问题，所 以这些淋巴瘤中的一些显示对治疗的显著应答。急性淋巴母细胞性白 血病和高度淋巴瘤是儿童中最常见的白血病和淋巴瘤。这些疾病，绝 大部分，是多克隆的，这表明仅仅少数遗传变化就足以诱导恶性肿瘤。

微小RNA(miRNA)表示一类新的丰富的小RNA，其按照与靶的互 补程度，通过结合靶向的mRNA，和阻断它们的翻译或者启动它们的降 解，在转录后水平上发挥重要的调节作用。自从它们1993年在 Caenorhabditis elegans中的发现(Lee，R.等，Cell 75：843-854 (1993))，许多报道表明，在大的蛋白阵列的转录后调节中这些微小的 分子具有非常不同的作用，从细胞增殖和分化到脂类代谢(Nairz，K.， 等，Dev.Biol.291：314-324(2006)；Chen，J.F.，等，Nat.Genet. 38：228-233(2006)；Naguibneva，I.，等，Nat.Cell Biol. 8：278-284(2006)；Esau，C.，等，Cell Metab.3：87-98(2006)；和 Gauthier，B.R.，等，Nat.Med.12：36-18(2006))。

人和小鼠中造血系的miRNA分布图显示miRNA在造血发育过程中 差异表达，这表明在造血分化中可能的作用(Chen，C.Z.，等， Science 303：83-86(2004)；Chen，C.Z.，等，Semin.Immunol. 77：155-165(2005)；和Ramkissoon，S.H.，等，Leuk.Res. 30：643-647(2006))。我们已经证实了miR-15a和miR-16-1在68％ 的慢性淋巴细胞性白血病(CLL)病例中缺失或下调(Calin，G.A.，等， Proc.Natl Acad Sci.USA 99：15524-15529(2002)；和Calin，G.A.， 等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 101：1155-11760(2004))，而且miRNA 基因经常位于与癌症相关的脆性位点和基因组区域(Calin，G.A.， 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：2999-3004(2004))。miR155 和BIC(它的宿主基因)转录物已经显示在人B细胞淋巴瘤，特别是 弥散性大B细胞淋巴瘤(Eis，P.S.，等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 102：3627-3632(2005))，霍奇金淋巴瘤(Kluvier，J.，等，J. Pathol 207：243-249(2006))，和某些类型的伯基特淋巴瘤(潜伏 类型III埃-巴二氏病毒阳性伯基特淋巴瘤)(Kluvier，J.，等， Genes Chromosomes Cancer 45：147-153(2006))中累积。

目前，急需产生动物模型，其可用于筛选和鉴定候选试剂，该候 选试剂具有治疗淋巴组织增生疾病，如B细胞恶性肿瘤(例如，B细 胞白血病，B细胞淋巴瘤)的治疗潜能。

发明概述

本发明是基于携带miR155转基因的转基因小鼠，其表达靶向B 细胞(例如，使用Ig重链-Eμ增强子)，最初显示白血病前期前B 细胞增殖，在脾和骨髓中显著，而且以后逐渐形成B细胞恶性肿瘤的 发现。过表达miR155的转基因小鼠逐渐形成与人淋巴组织增生疾病类 似的淋巴组织增生疾病，从而这强烈暗示miR155涉及这些疾病的起始 和/或进展。Eμ-mmu-miR155转基因小鼠可用于设计新的治疗方法来 治疗人中的不同形式的淋巴组织增生疾病，如B细胞恶性肿瘤(例如， 急性淋巴母细胞性白血病，高度淋巴瘤)。

因此，在一个方面，这里提供了用于淋巴组织增生疾病的新的 动物模型。具体地，根据一个方面，提供了用于B细胞恶性肿瘤(例 如，白血病(如，急性淋巴母细胞性白血病)，淋巴瘤(例如，高度 淋巴瘤)，和赘生物的动物模型。

在一个实施方案中，这里提供了一种转基因的非人动物(例如， 小鼠)，其基因组包括含有至少一个转录调节序列的核酸构建体，该 转录调节序列能指导在动物的B细胞中的表达，并与编码miR155基因 产物的核酸可操作连接。在一个特定的实施方案中，miR155基因产物 包括与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2具有至少90％序列同一性的核 苷酸序列。在另一个实施方案中，miR155基因产物包括SEQ ID NO：1 的核苷酸序列。仍然在另一个实施方案中，miR155基因产物包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

根据一个实施方案，所述的至少一个转录调节序列可以是能指导 在动物的B细胞中表达的任何序列。在一个实施方案中，该转录调节 序列包括V_H启动子(例如，来源于小鼠的V_H启动子)。在另一个实施 方案中，该转录调节序列包括Ig重链-Eμ增强子(例如，来源于小 鼠的Ig重链-Eμ增强子)。在一个相关的实施方案中，该核酸构建 体包括β-球蛋白基因(例如，来源于人或其他哺乳动物物种的β-球 蛋白基因)的3’UTR和聚腺苷酸序列。

这里还提供了转基因的非人动物，其基因组包括含有V_H启动子和 Ig重链-Eμ增强子的核酸构建体，该V_H启动子和Ig重链-Eμ增强 子与编码含有SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的miR155基因产物的 核酸可操作连接。在一个特定的实施方案中，转基因非人动物的基因 组包括含有V_H启动子和Ig重链-Eμ增强子的核酸构建体，该V_H启动 子和Ig重链-Eμ增强子与编码含有与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2 具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的miR155基因产物的核酸可操 作连接。

在一个特定的实施方案中，相对于合适对照动物中的该群体，转 基因非人动物在脾，骨髓或脾和骨髓二者中具有扩大的 B2201ow/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^--淋巴样细胞群体。在一个相 关的实施方案中，转基因非人动物显示淋巴组织增生疾病。在某个实 施方案中，淋巴组织增生疾病是B细胞恶性肿瘤(例如，B细胞白血 病，比如，急性淋巴母细胞性白血病；B细胞淋巴瘤，B细胞赘生物)。 在一个另外的实施方案中，B细胞恶性肿瘤显示人急性淋巴母细胞性 白血病，人淋巴母细胞性淋巴瘤或其组合的特征。在又一个实施方案 中，淋巴组织增生疾病是白血病前期状况(例如，前B细胞增殖)。在 另外的实施方案中，转基因非人动物显示增大的腹部，脾肿大，骨髓 取代，淋巴细胞减少，或其组合。

这里还提供了测试试剂在治疗或预防受试者中的淋巴组织增生 疾病的治疗功效的方法。根据一个实施方案，该方法包括施用试剂给 转基因的非人动物(例如，小鼠)，其基因组包括含有至少一个转录 调节序列(例如，V_H启动子，Ig重链-Eμ增强子，其组合)的核酸 构建体，该转录调节序列能指导在动物的B细胞中的表达，其中该转 录调节序列与编码含有与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2具有至少 90％序列同一性的核苷酸序列的miR155基因产物的核酸可操作连接。 在一个特定的实施方案中，miR155基因产物包括SEQ ID NO：1的核苷 酸序列。在另一个实施方案中，miR155基因产物包括SEQ ID NO：2的 核苷酸序列。

试剂已经施用给转基因动物以后，将转基因动物中淋巴组织增生 疾病的一种或多种症状和/或征象与没有施用该试剂的相同基因型的 对照动物进行比较。如果相对于对照动物，该试剂抑制，阻止和/或减 轻已经施用该试剂的转基因动物中淋巴组织增生疾病的一种或多种症 状和/或征象，那么认为该试剂在治疗或预防淋巴组织增生疾病中具有 治疗功效。在某个实施方案中，所述的淋巴组织增生疾病的一种或多 种症状和/或征象选自：扩大的B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-淋巴样细胞群体，增大的腹部，脾肿大，骨髓取代，淋巴细胞 减少和其组合。

在另一个实施方案中，这里提供了一种确定试剂是否影响受试者 中的淋巴组织增生疾病的方法(例如，影响一种或多种症状和/或征象 的可检测性和/或出现率的差异)。该方法包括施用试剂给这里描述的 转基因非人动物，并将转基因动物中淋巴组织增生疾病的一种或多种 症状和/或征象与相同基因型的对照动物的进行比较，其中对照动物没 有施用该试剂。相对于对照动物，检测转基因动物中淋巴组织增生疾 病的一种或多种症状和/或征象的可检测性和/或出现率的差异是该试 剂影响淋巴组织增生疾病的指示。

在一个实施方案中，淋巴组织增生疾病是B细胞恶性肿瘤。在一 个特定的实施方案中，B细胞恶性肿瘤选自急性淋巴母细胞性白血病， B细胞淋巴瘤(例如，高度淋巴瘤)，B细胞赘生物和其组合。B细胞 恶性肿瘤可显示人急性淋巴母细胞性白血病，人淋巴母细胞性淋巴瘤 或两者的特性。在另一个实施方案中，淋巴组织增生疾病是白血病前 期状况，如特征为前B细胞增殖的状况。

本发明的这些以及其他的重要方面从下列详细说明中将变得更 显而易见。

附图简述

本专利或申请文件包含至少一幅以颜色制作的附图。带有颜色附 图的本专利或专利申请出版物的拷贝经请求并支付必要的费用由专利 局提供。

图1的示意图描述了注射到怀孕的C57/B6和FVB/N雌性小鼠 的卵细胞的雄原核中的miR155转基因构建体。通过将mmu-miR155 基因插入到V_H启动子Eμ增强子下游的EcoRV与SalI位点之间，来制 备miR155转基因构建体。

图2A的Southern印迹描述了具有C57BL/6背景的7个miR155 转基因(1，3，5，6，7，10与14道)和8个野生型(2，4，8，9， 11，12，13与15道)小鼠的基因型。

图2B的Southern印迹描述了具有FVB/N背景的8个miR155转 基因(1，3，5，7，9，11，13与15道)和7个野生型(2，4，6，8， 10，12与14道)小鼠的基因型。

图3的对总RNA的Northern印迹描述了使用mmu-miR155成 熟序列作为探针，胸腺依赖性细胞中成熟miR155的表达，该胸腺依赖 性细胞分离自15个转基因系中的6个系的3周龄小鼠的脾。脾细胞中 成熟miR155最高表达水平的5个转基因系(1，2，5，8和9)，选作 进一步培养和分析。一个转基因系不表达转基因(3道)。野生型对 照缺乏转基因表达(4，6与7道)。

图4A的图片显示了相对于野生型小鼠，在6月龄时，由于临床 上明显的脾肿大，而具有显著增大的腹部的转基因小鼠(左边)。

图4B的图片描述了图4A中所示的小鼠的脾。转基因小鼠的脾 (左边)，由于白血病/淋巴瘤细胞的膨胀而增大。

图5A的显微照片描述了以200X放大倍数，3周龄转基因小鼠 脾的苏木精/曙红(H & E)染色切片(小鼠50；建立者10)。切片 显示非典型的淋巴增殖压缩了白髓。

图5B的显微照片描述了以100X放大倍数，来自6月龄的转基 因小鼠的脾的H & E-染色切片。脾的总体结构正在被非典型的淋巴 样增殖取代。只有少数胚的淋巴滤泡保留，其由于增殖而大小极大地 缩小和压缩。

图5C的显微照片描述了以200X放大倍数，来自6月龄的转基 因小鼠的脾的H & E-染色切片。由于成淋巴细胞的增殖，脾结构已 经几乎被完全磨灭。2个小的压缩淋巴滤泡的残余物是可见的。

图5D的显微照片描述了以400X放大倍数，来自6月龄转基因 小鼠(建立者8)的骨髓的H & E-染色切片，其显示了骨髓中成淋 巴细胞的增殖，其导致造血中心的取代。

图5E的显微照片描述了以200X放大倍数，正常脾的H & E- 染色切片。

图5F的显微照片描述了以200X放大倍数，来自3周龄转基因 小鼠(72号小鼠)的脾的切片。切片已经用Ki67染色，并显示脾中 增加的淋巴样增殖。

图6的显微照片以400X放大倍数，描述了3周龄转基因小鼠(50 号小鼠)的脾切片中非典型的淋巴样增殖，其已经用IgM进行免疫组 织化学染色。IgM存在于增殖的胸腺依赖性细胞的细胞质(cIgM)中， 作为转基因小鼠中的褐色核周晕，而野生型胸腺依赖性细胞是强褐色， 但是由于sIgM与cIgM的存在，没有明显的细胞核。

图7A的流式细胞术分析分布图描述了来自两个不同的建立者系 (建立者8与10)的转基因小鼠的脾中，胸腺依赖性细胞的 B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-群体的膨胀。显示了3周龄(74 号转基因小鼠，建立者8(74TG；左上方)和68号野生型小鼠(68WT； 右上方))和7周龄(156号转基因小鼠，建立者10(156TG；左下 方)和157号野生型小鼠(157WT；右下方))的两个转基因小鼠与两 个野生型小鼠的门控脾细胞。比较左上四分之一的图片，选通B220⁺IgM群体，显示了相对于野生型，转基因脾中前体B细胞数目的增加。

图7B的流式细胞术分析分布图描述了来自建立者8的转基因小 鼠的骨髓中，胸腺依赖性细胞的B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-群体的膨胀。显示了6月龄的一个转基因和一个野生 型小鼠(8号转基因小鼠，(8TG；左边)和24号野生型小鼠(24WT； 右边)的门控骨髓白细胞。比较两个图的右上四分之一，表明相对于 野生型小鼠，转基因小鼠骨髓的B200⁺IgM⁺门控成熟B细胞群体的减 少。

图8A的图描述了B220-PE表达，如通过流式细胞术分析， 对7周龄野生型小鼠no.223(223WT)的B220⁺-门控脾细胞所评估 的。

图8B的图描述了CD10-FITC表达，如通过流式细胞术分析， 对7周龄野生型小鼠no.223(223WT)的B220⁺-门控脾细胞所评估 的。

图8C的图描述了B220-PE表达，如通过流式细胞术分析，对 7周龄转基因小鼠no.222(222TG)的B220⁺-门控脾细胞所评估的， 其表明相对于野生型小鼠，转基因小鼠中B220^low群体的显著增加(介 于B220^-与B220⁺的两个峰值之间)。

图8D的图描述了CD10-FITC表达，如通过流式细胞术分析， 对7周龄转基因小鼠no.222(222TG)的B220⁺-门控脾细胞所评估 的，表明相对于野生型小鼠，仅仅在转基因小鼠中的B220⁺-门控群 体中CD10⁺群体的百分比增加，这证明B220^low增生，至少部分地，是 由于CD10⁺群体的增加。

图8E的图描述了B220-PE表达，如通过流式细胞术分析，对 7周龄转基因小鼠no.221(221TG)的B220⁺-门控脾细胞所评估的， 其表明相对于野生型小鼠，转基因小鼠中B220^low群体的显著增加(介 于B220^-与B220⁺的两个峰值之间)。

图8F的图描述了CD10-FITC表达，如通过流式细胞术分析， 对7周龄转基因小鼠no.221(221TG)的B220⁺-门控脾细胞所评估 的，表明相对于野生型小鼠，仅仅在转基因小鼠中的B220⁺-门控群 体中CD10⁺群体的百分比增加，这证明B220^low增生，至少部分地，是 由于CD10⁺群体的增加。

图9是分离自转基因脾的淋巴样细胞的染色体组型，分析其染 色体的缺失，易位和倒位，以及中期的数目。箭头表示9号染色体中 的异常，其通过粗的额外条带的存在而鉴定。

图10是对从3到6周龄之间的5只转基因(TG)与4只野生型(WT) 小鼠的脾细胞提取的DNA进行的Southern印迹。使用JH4探针和不同 的消化酶进行了Southern印迹杂交，如在道顶部所标明的(StuI， BglII，BamHI，与HindIII)。高分子量的粗条带对应于种系。相对于 野生型，转基因动物中没有重排的条带。

发明详述

下面是本发明的特定实施方案的描述。

如这里例示和描述的，过表达微小RNA，即miR155的转基因小 鼠，逐渐形成淋巴组织增生疾病，其类似于人类中急性淋巴母细胞性 白血病和高度淋巴瘤。这里提供的结果强烈地表明miR155和/或其他 基因(例如，在癌症中激活的基因(例如，信号转导基因))的致癌 表达涉及B细胞恶性肿瘤的起始和/或进展。因此，这里提供了一种动 物模型，其可用于研究B细胞恶性肿瘤和其他淋巴组织增生疾病的起 始和进展的机制。这种动物模型也可用于鉴定，开发和测试可用于治 疗或预防淋巴组织增生疾病的新的治疗剂。

在一个实施方案中，这里提供了一种转基因动物，其基因组包括 含有至少一个转录调节序列的核酸构建体或转基因，该转录调节序列 能指导在B细胞中的表达，其中该转录调节序列与编码miR155基因产 物的核酸序列可操作连接。术语“转基因”指通过人为干预，如通过 这里描述的方法，引入到非人动物的一个或多个细胞中的核酸序列。 引入的遗传信息可以是受体所属的动物物种外源的，仅仅是特定的单 独受体外源的，或者是受体已经具有的遗传信息。在后面的情况中， 相较于天然的内源基因，引入的遗传信息可以差异表达。

转基因非人动物具有包括核酸构建体/转基因的基因组，其能表 达miR155基因产物。因为miR基因产物，(这里也称为微小RNA，miR 和miRNA)没有翻译成蛋白，所以术语“miR基因产物”不包括蛋白。 未处理的miR基因转录物也称为“miR前体”，而且一般包括长度大 约为70-100个核苷酸的RNA转录物。可通过天然的处理途径(例如， 使用完整细胞或细胞裂解物)，或通过合成处理途径(例如，使用分 离的处理酶，如分离的切酶，Argonaut或RNA酶III(如大肠杆菌RNA 酶III))，将miR前体加工成活性的19-25个核苷酸的RNA分子。 这种活性的19-25个核苷酸的RNA分子也称为“加工的”miR基因 转录物或“成熟”miRNA。当这里通过名称提及微小RNA时，该名称相 应于前体和成熟形式，除非另有说明。

如这里使用的，“miR155基因产物”指来自miR155基因的未加 工的(例如，前体)或加工的(例如，成熟)RNA转录物，如，但是 不局限于，来自小鼠(小家鼠)的miR155基因。来自小鼠的前体miR155 基因产物通过下面的核苷酸序列表示：5′- CUGUUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGUUUUGGCCUCUGACUGACUCCUACCUGUUAGCAU UAACAG-3′(SEQ ID NO：1)，而加工的，或成熟的，小鼠miR155基因 产物通过下面的核苷酸序列表示：5′-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGG-3′ (SEQ ID NO：2；GenBank登录号AJ459767)。

在某些实施方案中，miR155基因产物包括与SEQ ID NO：1和/或 SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少 85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％的序列同一性的核苷酸 序列。在一个特定的实施方案中，miR155基因产物包括SEQ ID NO：1 的核苷酸序列具有100％同一性的核苷酸序列。在另一个实施方案中， miR155基因产物包括与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有100％同一性的 核苷酸序列。

可以通过公知的方法，例如，使用数学算法，来进行两个序列的 实际比较。Karlin等中描述了这种数学算法的一个优选的，非限制性 的例子(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877(1993))。这 种算法被并入如Schaffer等(Nucleic Acids Res.，29：2994-3005 (2001))所述的BLASTN和BLASTX程序(2.2版本)中。当利用BLAST 和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序的缺省参数(例如，BLASTN； 可获自NCBI的因特网站点)。在一个实施方案中，检索的数据库是非 冗余(NR)数据库，并且序列比较的参数可以设置为：无筛选程序；期 望值为10；字长为3；矩阵是BLOSUM62；和缺口值具有11的存在 (Existence)和1的延伸(Extension)。

用于序列比较的数学算法的另一个非限制性例子是Myers和 Miller，CABIOS(1989)的算法。这种算法结合到ALIGN程序(2.0版 本)中，其是GCG(Accelrys，San Diego，California)序列比对 软件包的部分。当利用ALIGN程序用于比较氨基酸序列时，可以使用 PAM120权残基表，缺口长度罚分12，和缺口罚分4。用于序列分析的 另外的算法是本领域已知的，而且包括Torellis和Robotti (Comput.Appl.Biosci.，10：3-5，1994)中描述的ADVANCE和ADAM； 和Pearson和Lipman中描述的FASTA(Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 85：2444-2448，1988)。

在另一个实施方案中，可使用GCG软件包中的GAP程序 (Accelrys，San Diego，California)，使用Blossom 63矩阵或PAM250 矩阵，和缺口权12，10，8，6或4，以及长度权2，3，或4，得到 两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个实施方案中，可使用 GCG软件包中的GAP程序(Accelrys，San Diego，California)，使 用缺口权50和长度权3，得到两个核酸序列之间的同一性百分数。

根据一个方面，转基因非人动物具有包括一种核酸构建体的基因 组，该核酸构建体中编码miR155基因产物的核酸序列与能指导在动物 的B细胞中表达的至少一个转录调节序列可操作连接。术语“转录调 节序列”根据它的本领域公认的含义使用。它意图指任何DNA序列， 依靠它的序列，其能导致连接的基因在特定的细胞中被上调或者下调。 在启动子的情况中，启动子一般邻近编码区。然而，在增强子的情况 中，增强子可以在离编码区一定距离处发挥功能，以便在增强子与编 码区之间存在干预DNA序列。为了指导遗传信息的表达，其可包括编 码特定蛋白的DNA序列(或“编码区”)，目标编码区可以功能性方 式与至少一个转录调节序列连接。转录调节序列可用于增强，降低， 调节基因表达，或指定基因表达于某些组织或某些发育阶段。该转录 调节序列不必是天然存在的序列。

因此，在这里描述的一个实施方案中，编码miR155的序列与指 导在B细胞中表达的转录调节序列可操作连接，以产生重组构建体或 转基因。该转录调节序列可以是能指导在B细胞中表达的任何序列。 适合的转录调节序列的例子包括，但不限于，V_H启动子，Ig重链-Eμ 增强子及其组合。在一个特定的实施方案中，转录调节序列是小鼠的 转录调节序列或来源于小鼠的转录调节序列。

如果核酸分子包括含有转录调节信息的核苷酸序列，而且这样的 序列与编码微小RNA的核苷酸序列可操作连接，则该核酸分子被认为 是“能表达”微小RNA或“能指导微小RNA的表达”。可操作连接是 这样的连接，其中试图表达的调节核酸序列与核酸序列以容许基因表 达的方式连接。

一般来说，基因表达所需的调节区包括，但不限于，转录调节序 列(例如，启动子区域，增强子区域)，以及当转录成RNA时，有助 于基因转录物稳定的DNA序列。

术语“启动子”根据它本领域公认的含义使用。它意图指通常基 因或操纵子的编码序列上游的DNA区域，其结合RNA聚合酶并指导该 酶以正确转录起始位点。如果启动子能影响DNA序列的转录，则该启 动子区域与DNA序列可操作连接。

术语“增强子”根据它本领域公认的含义使用。它意图指在真核 生物和某些真核病毒中发现的序列，当位于离研究的基因高达几千个 碱基处时(以任一方向)，其能增强基因的转录。当位于所讨论的基 因的5’侧(上游)时，这些序列通常充当增强子。然而，当位于基 因的3’侧(下游)时，一些增强子是活性的。有时，没有(已知的) 启动子时，增强子元件能激活从基因的转录。

所述的核酸构建体还可包括促进构建体和/或从该构建体表达的 基因产物的表达和/或稳定性的序列。在一个特定的实施方案中，该核 酸构建体包括β-球蛋白基因(例如，小鼠β-球蛋白基因)的3’UTR 和聚腺苷酸序列。促进构建体和/或从该构建体表达的基因产物的表达 和/或稳定性的其他序列是本领域已知的，而且包含于这里。

术语“转基因非人动物”这里用于包括所有的脊椎动物，除了人 之外。在一个实施方案中，转基因的非人动物是哺乳动物类。这种转 基因的非人动物包括，例如，转基因猪，转基因老鼠，转基因兔，转 基因牛，转基因山羊，及其他转基因动物种类，特别是哺乳动物。另 外，啮齿类动物家族的其他成员，例如，老鼠，和豚鼠，以及非人类 的灵长类动物，如黑猩猩，可用于实施这里描述的实施方案。在一个 特定的实施方案中，转基因非人动物是小鼠。这里描述的转基因非人 动物包括处于所有发育阶段的受试者动物，包括胚胎和胎儿阶段。

“转基因动物”是包含一个或多个带有遗传信息的细胞的动物， 该遗传信息直接或间接地通过考虑的遗传操作在亚细胞水平接受，如 通过显微注射或用重组病毒感染。引入的核酸分子可以掺入到染色体 内，或者它可以是染色体外复制DNA。这里描述的适合的转基因动物 包括，但不限于，其中引入遗传信息到生殖系细胞中，从而赋予传递 该信息给后代的能力的那些动物。如果这种后代实际上具有一些或者 全部该信息，那么它们也是转基因动物。

为了产生转基因动物，本领域已知的用于引入重组构建体或转基 因到胚胎中的任何方法，如，例如，显微注射，使用细胞枪，转染， 脂质体融合，电穿孔，等等，可以使用。在一个特定的实施方案中， 用于生产转基因动物的方法是显微注射，其包括注射DNA分子到受精 卵的雄原核中(参见，例如，美国专利4,870,009；5,550,316； 4,736,866；和4,873,191)。最初在小鼠中开发用于引入重组构建 体/转基因到哺乳动物和它们的生殖细胞中方法。这种方法随后用于较 大的动物，包括家畜类(参见，例如，PCT公开号WO 88/00239，WO 90/05188和WO 92/11757)。显微注射DNA到接合子的细胞质中也可 用于产生转基因动物。

用于评估引入的转基因以及它的表达存在的方法是很容易获得 的，而且是本领域公知的。这种方法包括，但不限于，DNA(Southern) 杂交以检测外源DNA，聚合酶链反应(PCR)，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 和印迹以检测DNA，RNA或蛋白。

本实施方案不局限于任何一种动物，而是提供用于任何合适的非 人脊椎动物。例如，如这里描述和例示的，可以产生转基因小鼠。其 他非限制性的例子包括，例如，这里描述的其他非人哺乳动物，如豚 鼠，兔，猪，绵羊，等等。通过显微注射产生转基因动物的成功率在 小鼠中是最高的，其中大约25％的受精小鼠卵，该受精小鼠卵中已经 注射DNA，而且其已经被移植到雌性中，将发育成转基因小鼠。用兔， 猪，绵羊和牛获得了较低的成功率。

在一个特定的实施方案中，相对于合适对照动物中的该群体，这 里描述的转基因非人动物在脾，骨髓或脾和骨髓二者中显示扩大的 B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-淋巴样细胞群体。如这里使用 的，术语“扩大的B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-细胞群体” 或“B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-细胞的增加”，指相较于 对照动物，相对于其他的淋巴样细胞亚型，显示B220^low/CD19^low/CD10^low/ IgM^-/TCR^-/CD43^-细胞的数目和/或B220^low/CD19^low/CD10^low/ IgM^-/TCR^-/CD43^-细胞的比例增加的淋巴样细胞群体。

在另一个实施方案中，这里描述的转基因非人动物显示淋巴组织 增生疾病。“淋巴组织增生”指其属于，或特征在于，淋巴网状内皮 细胞系统细胞的增生；该术语一般用于指一群恶性赘生物。“淋巴网 状内皮细胞”指淋巴样和网状内皮系统的细胞或组织。“淋巴组织增 生不适”(或“淋巴组织增生疾病”或“淋巴组织增生障碍”)指由 与共同的会分化成几种细胞的任何一种的，原始淋巴网状内皮细胞相 关的细胞引起的一群恶性赘生物之一，该淋巴组织增生疾病包括，尤 其是，淋巴细胞，组织细胞，和单核细胞性白血病，多发性骨髓瘤， 浆细胞瘤，淋巴肉芽肿病，所有的淋巴细胞性淋巴瘤，和与单株丙种 球蛋白病相关的免疫分泌疾病。如这里使用的，“淋巴组织增生疾病”， “淋巴组织增生障碍”或“淋巴组织增生不适”也可指一种生理状态， 其中相对于正常或对照动物，淋巴网状内皮细胞系统的增生，倍增和/ 或累积改变，但是受影响的动物却不必然地显示如上所述的赘生物之 一的症状。如这里使用的，“白血病前期”状况指在白血病的明显症 状发展之前的这种淋巴组织增生疾病。

在某个实施方案中，淋巴组织增生疾病是B细胞恶性肿瘤(例如， B细胞白血病(比如，急性淋巴母细胞性白血病)；B细胞淋巴瘤(例 如，高级的淋巴瘤)，B细胞赘生物)。在一个另外的实施方案中，B 细胞恶性肿瘤显示人急性淋巴母细胞性白血病，人淋巴母细胞性淋巴 瘤或其组合的特征。在又一个实施方案中，淋巴组织增生疾病是白血 病前期状况(例如，前B细胞增殖)。在另外的实施方案中，转基因非 人动物显示增大的腹部，脾肿大，骨髓取代，淋巴细胞减少，或其组 合。

在另一个实施方案中，存在这里描述的一种方法，其将转基因非 人动物用作实验模型，用于研究淋巴组织增生疾病(例如，B细胞恶 性肿瘤(如，白血病(例如，急性淋巴母细胞性白血病)，淋巴瘤(如， 高度淋巴瘤)，和赘生物))，和测试可能的致癌剂和治疗剂。

在另一个方面，这里描述了一种测试试剂在治疗或预防受试者中 的淋巴组织增生疾病的治疗功效的方法。根据一个实施方案，该方法 包括施用该试剂给这里描述的转基因非人动物(例如，小鼠)。在一 个实施方案中，转基因非人动物具有包括一个核酸构建体的基因组， 该核酸构建体含有能指导在动物的B细胞中表达的至少一个转录调节 序列(例如，V_H启动子，Ig重链-Eμ增强子，其组合)，其中该转录 调节序列与编码miR155基因产物的核酸可操作连接。在一个特定的实 施方案中，该转录调节序列与这样的核苷酸序列可操作连接，该核苷 酸序列与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2具有至少90％序列同一性。 在另一个实施方案中，miR155基因产物包括SEQ ID NO：1的核苷酸序 列。在另一个实施方案中，miR155基因产物包括SEQ ID NO：2的核苷 酸序列。

试剂已经施用给转基因动物以后，将转基因动物中淋巴组织增生 疾病的一种或多种症状和/或征象与没有施用该试剂的相同基因型的 对照动物进行比较。如果相对于对照动物，该试剂抑制，阻止和/或减 轻已经施用该试剂的转基因动物中淋巴组织增生疾病的一种或多种症 状和/或征象，那么认为该试剂在治疗或预防淋巴组织增生疾病中具有 治疗功效。在某个实施方案中，淋巴组织增生疾病的一种或多种症状 和/或征象选自：扩大的B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-淋巴 样细胞群体，增大的腹部，脾肿大，骨髓取代，淋巴细胞减少和其组 合。

适于测试试剂的治疗功效的淋巴组织增生疾病包括，例如，这里 描述的那些疾病。在一个实施方案中，淋巴组织增生疾病是B细胞恶 性肿瘤。在一个特定的实施方案中，B细胞恶性肿瘤选自急性淋巴母 细胞性白血病，B细胞淋巴瘤(例如，高度淋巴瘤)，B细胞赘生物和 其组合。B细胞恶性肿瘤可显示人急性淋巴母细胞性白血病，人淋巴 母细胞性淋巴瘤或两者的特性。在另一个实施方案中，淋巴组织增生 疾病是白血病前期状况，如特征为前B细胞增殖的状况。

如这里描述的，这里提供了在B细胞中表达miR155的转基因非 人动物。在一个实施方案中，提供了一种转基因动物，其基因组包括 含有至少一个转录调节序列的核酸构建体或转基因，该转录调节序列 能指导在B细胞中的表达，其中该转录调节序列与编码miR155的核酸 序列可操作连接。在一个特定的实施方案中，转基因包括编码miR155 的DNA序列，其已经置于V_H启动子和/或Ig重链-Eμ增强子的转录 调控下。在这种动物中，mir155的表达针对未成熟的和成熟的B细胞。 在一个实施方案中，转基因动物是小鼠，其发展扩大的 B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-淋巴样细胞群体。

在另一个实施方案中，来自显示淋巴组织增生的转基因动物的白 血球，可以转移到第二种动物(其可以是非转基因动物)，从而在第 二种“受体”动物中诱导淋巴组织增生疾病的快速发病。

根据另一个实施方案，可根据这里描述的一个或多个方面，通过 测定动物中这种药征的抗淋巴组织增生活性来测试用于预防和/或治 疗淋巴组织增生疾病的可能的治疗药征或试剂。可通过测定抑制，预 防，和/或破坏根据一个实施方案产生的转基因动物显示的和/或根据 另一个实施方案产生的“受体”动物中淋巴组织增生疾病的一种或多 种症状或征象的可能的治疗药征能力来评估这种活性。

可以测试各种治疗药征或试剂，如蛋白(例如，抗体)，肽，肽 模拟物，小的有机分子，核酸等等，预防和/或治疗淋巴组织增生疾病。 根据这里描述的方法，可以逐一地筛选试剂，或者同时测试一种或多 种试剂。在测试化合物的混合物时，通过这里描述的处理选择的化合 物，可以使用适合的方法分离(视情况而定)和鉴定(例如，测序， 色谱法)。也可以根据这些方法确定测试样品中一种或多种化合物的 存在。

可以例如，通过筛选分子文库或集合，如，国家癌症研究所的化 学药品贮藏处，在测定抑制和/或预防这里描述的转基因动物显示的淋 巴组织增生疾病的一种或多种症状或征象的分析中，鉴定预防和/或治 疗淋巴组织增生疾病的试剂。可以测试文库，如通过组合的化学合成 或其他方法生产的化合物(例如，有机化合物，重组或合成肽，“类 肽”，核酸)的组合文库(参见，例如，Zuckerman，R.N.等，J.Med. Chem.，37：2678-2685(1994)和其中引用的参考文献；也参见， Ohlmeyer，M.H.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10922-10926 (1993)和De Witt，S.H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6909-6913(1993)，relating to tagged compounds；Rutter，W.J. 等U.S.Patent No.5,010,175；Huebner，V.D.等，U.S.Patent No. 5,182,366；和Geysen，H.M.，美国专利号4,833,092)。其中通过层 析法，从携带独特标签的文库筛选化合物，鉴定单个化合物是可能的。

可以根据已知的方法另外配制鉴定的治疗药征，以产生药学上可 接受的组合物。治疗药征或包含这种治疗药征的组合物可以各种标准 方式施用给受试者(例如，转基因动物)。例如，试剂可以使用各种 途径给药，包括，例如，口服，饮食，局部，经皮肤，直肠，肠胃外 (例如，静脉内，动脉内，肌内，皮下，皮内注射)，和吸入(例如， 支气管内，鼻内，口服吸入，鼻内滴剂)。给药可以是如表明的局部 的或全身的。给药的优选模式可以根据待施用的抗体或抗原结合片段， 和被治疗的特定不适(例如，疾病)而改变，但是，口服或肠胃外给 药一般是优选的。

试剂可以肠胃外给药如，例如，通过静脉内，肌内，鞘内或皮下 注射。肠胃外给药可以通过将试剂掺入到溶液或悬浮液中来实现。这 种溶液或混悬液也可包括无菌稀释剂，如注射用水，盐溶液，抑菌盐 水(包含大约0.9％mg/ml苯甲醇的盐水)，磷酸缓冲盐溶液(这里称 为PBS)，Hank′s溶液，Ringer′s-乳酸盐，固定油类，聚乙二醇， 甘油，丙二醇，及其他合成的溶剂。肠胃外制剂还可包括抗菌剂(例 如，苯甲醇，对羟基苯甲酸甲酯)，抗氧化剂(例如，抗坏血酸，亚 硫酸氢钠)，和螯合剂(例如，EDTA)。缓冲液如醋酸盐，柠檬酸盐和 磷酸盐和用于调节张力的试剂如氯化钠和葡萄糖，也可添加。肠胃外 制剂可以封装到安瓿，一次性注射器，或由玻璃或塑料制成的多次剂 量小瓶中。

实施例

实施例1：产生Eμ-mmu-miR155转基因小鼠

材料和方法

转基因小鼠：

通过PCR，从129SvJ小鼠(The Jackson Laboratory)，扩增 包含miR155的前体序列的318-bp片段，并克隆到pBSVE6BK(pEμ) 质粒的EcoRV和SalT位点，该质粒包含用于Ig重链的Eμ增强子， V_H启动子，和人β-球蛋白基因的3’UTR和聚腺苷酸(图1)，而且 以前已经用于在Eμ-TCL1转基因小鼠中逐渐形成慢性淋巴细胞性白 血病(Bichi，R.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：6955-6960 (2002))。转基因，其通过用BssHII和PvuI切割该构建体分离，注射 到怀孕的FVB/N和C57/B6小鼠的受精卵细胞的雄原核中。通过 Southern印迹分析，其对用BamHI消化的尾部提取的DNA进行，使用 设计用于靶向Eμ增强子序列的探针(图2A，2B)来筛选幼鼠中转基因 的存在。鉴定转基因建立者，并饲养成年龄相当的野生型小鼠。转基 因半合子小鼠出生，进行研究，并与它们的野生型对应物相比较。通 过对尾部提取的DNA进行的PCR，对小鼠进行基因分型(数据未显示)。

Northern印迹分析：

脾离解在两个磨砂显微镜载玻片之间，并在磷酸盐缓冲盐水(PBS) 中洗涤裂解物，通过用氯化铵(NH₄Cl)低渗裂解使红细胞耗竭，离心， 并在PBS中重悬。用TRIzol试剂(GIBCO，Invitrogen)提取总RNA， 在SDS/PAGE中点样和变性，并在Hybond N⁺膜(Amersham Pharmacia) 中印迹。该膜与包含成熟的mmu-miR155序列的反义物的γ-³²P放射性 探针杂交，孵育过夜，洗涤，并暴露于感光成像仪筛选(Molecular Dynamics)。使用Typhoon图像处理系统(Amersham Biosciences)对 图像进行处理(图3)。

结果

产生转基因小鼠，其中mmu-miR155(小鼠miR155)表达在V_H启 动子-Ig重链Eμ增强子调控下，其在B细胞发育的晚期前B细胞阶 段变得有活性。通过Southern印迹杂交鉴定了15只转基因建立者(图 2A，2B)，C57BL/B6背景上7只(指定为F1-F7)，FVB/N背景上8只 (指定为F8-F15)。将这些建立者饲养成相同品系的野生型小鼠，以 产生15个独立的转基因系。

对从转基因和野生型脾提取的总RNA进行实时PCR(数据未显示) 和Northern印迹分析(图3)，显示在5个转基因小鼠的建立者系中 高水平的miR155表达。1个转基因系完全缺乏表达，而所有其他的建 立者系都表达转基因。如以前报道的，野生型小鼠在脾细胞中不表达 成熟的miR155(Monticelli，S.，等，Genome Biol.6：R71(2005))。

实施例2：Eμ-mmu-miR 155转基因小鼠的表型表征揭示了脾 和骨髓中前B细胞的增生，其导致B细胞恶性肿瘤

材料和方法

体测定：

杀死以后对小鼠称重，解剖它们的脾，测量和称重。

白细胞(WBC)和涂布标本：

从小鼠的眼球后血管抽取血液，涂布到磨砂显微镜载玻片上并用 Giemsa染色或者离心，在PBS中洗涤，并用氯化铵处理。细胞用细胞 -脉冲室计数。

流式细胞术分析：

通过低渗裂解(0.165M NH₄Cl)除去脾细胞或骨髓细胞的单细 胞混悬液的成熟红细胞，并用下列配合抗体染色：抗-B220-PE，抗- IgM-FITC，抗-TCR-PE cy5，抗-CD5-PE，和抗-CD-43-FITC。所有 的抗体都获自BD PharMingen。在Becton Dickinson FACSCalibur上 进行流式细胞术，使用Mac软件的Becton Dickinson FACS CONVERT 1.0 对数据进行分析。

组织学和免疫组织化学：

从宰后检验的小鼠分离脾，股骨和胸骨，并固定于10％缓冲的福 尔马林中，包埋于石蜡中，然后切成4微米的切片。切片用苏木精/ 曙红按照标准方案染色。对于脱蜡步骤，切片于55℃加热1小时，通 过分级乙醇系列和蒸馏水再水化，浸于PBS中，然后37℃用溶于Tris 缓冲液中的0.1％胰蛋白酶溶液处理30分钟。用10％正常血清阻断内源 过氧化物酶。将CD43，B220，和VpreB1(CD179a)抗体(BD PharMingen) 用作第一抗体。第二抗体和二氨基联苯胺按照制造商的指导添加。

结果

相对于野生型小鼠的脾，转基因小鼠的身体和脾都增大了(图4A， 4B)，而且转基因小鼠的脾重量/体重比例比野生型小鼠的比例大3 到4倍(表1)。有趣地，该比例没有随着年龄改变很多。

表1.转基因和野生型小鼠的脾和身体测量。

 

小鼠系(建立者)年龄，周BW，^*grSW，^**mgWI，^***mg/gr72tg8322.682109.2569wt8823.90903.7674tg8323.9827011.2568wt8324.54602.448gt82438.33809.9224wtN/A2426.51003.7750tg10321.72009.2149wt10320.4803.92148wt8626.972408.89149wt8625.91003.86156tg10623.4428011.94157wt10623.911004.18220wt8723.131205.2221tg8722.3726011.6222tg8721.6725011.5223wt8722.441205.2

^*BW，以克(gr)计体重；^**SW，以毫克(mg)计的脾重量；^***WI， 以毫克每克(mg/g)计的重量指数(转基因与野生型重量的比例)；tg， 转基因小鼠；wt，野生型小鼠。

3月龄转基因小鼠的白血球计数(WBC)是每ml外周血10 X 10⁶±1 X 10⁶，相较于正常的，年龄相当的小鼠为每ml外周血40 X 10⁶±1.5 X 10⁶。相较于野生型年龄相当的小鼠，值没有变化，其为每ml 外周血40 X 10⁶±1.5 X 10⁶，6月龄转基因小鼠的WBC甚至更低，其 值为每ml外周血6 X 10⁶±0.5 X 10⁶。

3周龄转基因小鼠的脾的组织病理学(苏木精/伊红染液)，特 征为侵入和扩大红髓的一致的非典型淋巴样群体。胚滤泡不受影响， 而且存在许多次级造血中心(图5A)。组织学地，6月龄小鼠存在大 大增加的恶性淋巴样群体，其具有显著的非典型和再结晶形态，红髓 的血管通道增加，而且逐渐取代白髓。胚滤泡数目减少，而且脾的总 体结构被淋巴样增生破坏(图5B)。组织学类似的淋巴样群体存在于 6月龄小鼠的骨髓中。增生抗原，Ki67的表达，显示转基因小鼠中显 著的淋巴样增生(图5D)，其在野生型小鼠中没有观察到。

转基因脾中淋巴样增生的免疫组织化学分析，显示非典型扩大的 胸腺依赖性细胞是B220和VpreB1(CD179a)低阳性的，不过CD43是 阴性的(数据未显示)。转基因小鼠脾的石蜡包埋切片的IgM染色， 显示增殖胸腺依赖性细胞的细胞质中μ链的存在(图6)。相反，流 式细胞术分析没有鉴定到这些细胞表面上IgM的表达，其表明扩大的 淋巴样细胞表达细胞质的μ链，但是不表达表面IgM。

对来自3，6，或7周龄或6龄的转基因和野生型小鼠的脾和骨 髓的WBC的单细胞混悬液，进行的流式细胞术分析，显示相较于它们 的野生型对应物，转基因小鼠中脾和骨髓中B220^low/CD19^low/CD10^low/ IgM^-/TCR^-/CD43^-淋巴样细胞的数目都增加。这种表型与在人急性淋巴 母细胞性白血病或淋巴母细胞性淋巴瘤中观察到的增殖胸腺依赖性细 胞的表型类似。这些发现表明，相较于在野生型小鼠的脾中仅仅 1.65％，3周龄转基因小鼠的脾中B220^low/CD19^low/CD10^low/ IgM^-/TCR^-/CD43^-淋巴样群体，是总的门控淋巴样群体的9％(对1只转 基因小鼠和1只野生型小鼠进行评价)。6周龄时，这些百分数在转 基因小鼠的脾中变成6.6±1.4％，7周龄小鼠为4.7±0.3％，而在野生 型脾中保持没有变化(分析的两种转基因小鼠来自两个不同的建立者 系和两个野生型小鼠)。

在6月龄转基因小鼠的骨髓中，我们发现相较于野生型，如通过 B220^low/IgM^-表达限定的前B细胞群体增加(图7和8)。B220^low/IgM -细胞群体的正向散射分析显示，这些细胞将大的海蕾细胞(数据未显 示)。

根据流式细胞术，组织学和免疫组织化学分析，推断前B细胞增 殖，限定为B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-，存在于转基因小 鼠的脾和骨髓中，而且在3周龄是已经是可检测的。这种增生最终导 致脾肿大，骨髓取代，和显著的淋巴细胞减少，常常与高级B细胞恶 性肿瘤相关的特征。相较于野生型对照，其全部都是健康的(11只野 生型小鼠中的11只)，与该特征一致，所有的转基因小鼠在6月龄都 发展高级B细胞赘生物(7只转基因小鼠的7只)。显著地，没有过 表达miR155的转基因小鼠系也是正常的。

实施例3：Eμ-mmu-miR155转基因小鼠的细胞遗传学分析

材料和方法

细胞遗传学：

股骨骨髓用RPMI培养基1640/20％ FBS冲洗，并收集到带有1％ 肝素的5ml RPMI培养基1640/20％ FBS中。细胞生长，并使用标准的 细胞学技术，评价染色体的缺失，移位，倒位和中期的数目。

Ig重链重排：

使用下列寡核苷酸引物，通过扩增小鼠基因组DNA的Ig重链区 域的JH4片段中序列，设计探针：正向，5′-TGAAGGATCTGCCAG AACTGAA-3′(SEQ ID NO：3)，和反向，5′-TGCAATGCTCAGAAAACTCCAT-3′ (SEQ ID NO：4)。

转基因和野生型小鼠的脾离解到处于PBS中的磨砂显微镜载玻 片之间，用氯化铵处理以裂解红血球，离心，并重悬于PBS中。从脾 的白血球提取DNA，并用EcoRI，StuI，BglII，BamHI和HindIII消 化。消化的DNA印迹到Hybond N⁺膜上，用JH4探针杂交，该探针用γ -³²p放射性标记，然后暴露于感光图像仪筛选，并使用Typhoon扫描 仪进行处理。

结果

相较于来自正常同窝仔畜的脾，脾细胞的染色体组型的细胞遗传 研究，没有鉴定到来自转基因小鼠的脾中一致的染色体异常。但是，偶 然观察到一些基因组的改变(图9；参见箭头)。这些结果表明，扩 大的前B细胞群体是二倍体和细胞遗传学拟似正常的。

为了检测克隆性，使用多酶消化酶，对来自3到6周龄之间的小 鼠的脾细胞DNA进行Southern印迹分析，以评价V(D)J重排。相对于 野生型小鼠，没有检测到转基因小鼠中重排条带的存在(图10)，除 了1只转基因小鼠外，其在用每种不同的限制性内切酶进行Southern 印迹上具有一致的重排条带(数据未显示)。这些数据表明，该龄的 小鼠中B细胞群体大部分是多克隆的，至少直到6周龄。因为大部分 恶性肿瘤是多克隆的，这种发现表明miR155可能是癌症中激活的信号 转导途径的下游靶。

有趣地，已经在实体瘤中观察到miR155的过表达，如乳房和结 肠癌，以及肺癌，其中miR155的过表达是差的预后的指示(Volinia，S.， 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：2257-2261(2006))。

实施例4：微阵列表达分布图揭示了VpreB1 mRNA和其他靶的上 调

材料和方法

RNA分离：

根据制造商的指导，用TRIzol试剂(Invitrogen)进行总的RNA 分离。

miRNA表达分布图：

如所述的在miRNA微阵列芯片上进行RNA标记和杂交(Liu，C.G.， 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：9740-9744)。简要地，使用5’ 生物素末端标记的随机八聚物寡核苷酸引物，通过逆转录，用生物素 对来自每种样品的5μg总RNA进行标记。在miRNA微阵列芯片(Ohio State University，Ver.2.0)上进行生物素标记的cDNA的杂交，该 芯片含有800个miRNA探针，包括245个人和200个小鼠miRNA基因， 一式四份。使用Axon扫描仪4000B(Axon Instruments，Union City， CA)，通过结合链霉亲和素-Alexa647缀合物与生物素，检测杂交信号。 通过GENEPIX 6.0软件(Axon Instruments)对图像进行定量。

mRNA表达分布图：

使用GeneChip小鼠基因组4302.0阵列(Affymetrix)，其包含 用于超过45,000个表征的基因和表达的序列标签的探针组。根据 Affymetrix方案，进行样本标记和处理，GeneChip杂交，以及扫描。 简要地，使用SuperScript Choice System(Invitrogen)，其添加 T7RNA聚合酶启动子位点到3’-末端(Genset，La Jolla，CA)，从 总RNA合成双链cDNA。使用BioArray T7 RNA聚合酶标记试剂盒(Enzo Diagnostics)，从cDNA体外产生生物素化的cRNA并扩增。使用RNeasy 微型试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)，纯化cRNA以后，20μg的cRNA 于94℃破碎35min。大约12.5μg的破碎cRNA用于250μl杂交混合 物中，该混合物含有鲱鱼-精子DNA(0.1mg/ml；Promega)，加 上细菌和噬菌体cRNA对照(1.5pM BioB，5pM BioC，25pM BioD， 和100pM Cre)用作杂交效率的内部对照。混合物的等分试样(200μ 1)，在GeneChip杂交烘箱640(Affymetrix)中，于45℃与阵列杂 交18小时。洗涤每个阵列，并用链霉亲和素-藻红蛋白(Invitrogen) 染色，用生物素化的抗链霉亲和素抗体(Vector Laboratories)，在 GeneChip Fluidics Station 450(Affymetrix)上扩增。阵列用 GeneArray G7扫描仪(Affymetrix)扫描，以获得图像和信号强度。

结果

对从5只转基因小鼠的脾的白血球提取的总RNA，进行微阵列分 析，其包括不表达miR155转基因的1只小鼠，和6只野生型同窝仔畜 对应物的白血球。分析显示，相对于野生型同窝对照小鼠(数据未显 示)，在过表达miR155的转基因小鼠中，miR155，miR194，miR224， miR217和miR151的表达增加10到20倍(表3)，miR146和miR138 的表达减少2到3倍。使用Affymetrix微阵列芯片，研究相同组的转 基因小鼠中mRNA的差异表达，并与同窝仔畜对照中的mRNA表达进行 比较。Affymetrix微阵列数据的统计分析显示，在miR155过表达小 鼠中，200个增生相关的基因上调，而50个基因下调(表3)。显著 地，VpreB1 mRNA是上调的，当前B细胞增殖发生时，期望其存在。 这些数据补充了来自流式细胞术分析和免疫组织化学的数据。

表2.根据微阵列的预测分析(PAM)，miR155转基因/野生型小 鼠分类的Affymetrix微阵列数据。

 

名称 探针组ID 基因称谓 mir155 分数Wt分数 1456609_at1456609_atRIKEN cDNA 1810006K23基因0.8041^*-0.57441452324_at1452324_at浆细胞瘤变体易位10.4468^*-0.31921449452_a_at1449452_a_at糖蛋白2(酶原颗粒膜) 0.3377^*-0.24121459923_at1459923_at脑表达的，X-连锁的60.319^*-0.22791449222_at1449222_atEB病毒诱导的基因30.31^*-0.22141424437_s_at1424437_s_atATP-结合表达盒，亚家族G(WHITE)， 成员40.2723^*-0.19451425784_a_at1425784_a_at嗅介蛋白10.2717^*-0.19411436827_at1436827_at基因模型944，(NCBI)0.2537^*-0.18121425677_a_at1425677_a_at锚蛋白1，红色的0.2513^*-0.17951417636_at1417636_at溶质载体家族6(神经递质转运蛋白， 甘氨酸)成员9 0.2476^*-0.17691441054_at1441054_at载脂蛋白L，20.233^*-0.16641458642_at1458642_at杀伤细胞凝集素样受体家族E，成员1 0.2307^*-0.16481448558_a_at1448558_a_at磷酯酶A2，IVA组， (细胞溶质的，钙依赖的)0.2157^*-0.1541418601_at1418601_at醛脱氢酶家族1，亚家族A7 0.2136^*-0.15261458667_at1458667_atRIKEN cDNA4930519N13基因0.2084^*-0.14881436443_a_at1436443_a_at含KDEL(Lys-Aso-Glu-Leu)的1 0.2073^*-0.14811416740_at1416740_at前胶原，类型V，α10.2025^*-0.14471422663_at1422663_at起点识别复合体，亚基1-样 (酿酒酵母)0.2019^*-0.14421433892_at1433892_at精子相关抗原50.1988^*-0.1421435660_at1435660_at类似于RIKEN cDNA 5830484A20 0.1979^*-0.14131454622_at1454622_at溶质载体家族38，成员50.1847^*-0.1321426802_at1426802_at隔蛋白80.1821^*-0.131449869_at1449869_at前B淋巴细胞基团1(VperB1)0.1798^*-0.12841426015_s_at1426015_s_at天冬氨酸-β-羟化酶0.1768^*-0.12631418710_at1418710_atCD59a抗原0.1697^*-0.12121437244_at1437244_at生长停止特异性2样30.1662^*-0.11871429830_a_at1429830_a_atCD59a抗原0.1651^*-0.1181422524_at1422524_atATP-结合表达盒，亚家族B(MDR/TAP)， 成员60.1604^*-0.11451435287_at1435287_at内收蛋白2(β)0.158^*-0.11291436984_at1436984_atabl-相互作用物20.1554^*-0.1111453226_at1453226_atRIKEN cDNA 3000004C01基因0.1467^*-0.10481429146_at1429146_atRIKEN cDNA 662040IM08基因0.139^*-0.0993

 

1454630_at1454630_atcDNA序列BC0340540.1385^*-0.0991429089_s_at1429089_s_atRIKEN cDNA 2900026A02基因0.138^*-0.09861455980_a_at1455980_a_at生长停滞特异性2样30.1375^*-0.09821427677_a_at1427677_a_at含SRY-框的基因60.1363^*-0.09741419031_at1419031_at脂肪酸去饱和酶20.1338^*-0.09561422016_a_at1422016_a_at着丝粒自身抗原H0.1309^*-0.09351420176_x_at1420176_x_at免疫球蛋白λ样多肽1 0.1305^*-0.09321434501_at1434501_at---0.1246^*-0.0891419665_a_at1419665_a_at核内蛋白10.123^*-0.08781446391_at1446391_at突触核蛋白，α0.1203^*-0.08591419421_at1419421_at锚蛋白1，类红细胞0.1181^*-0.08441452458_s_at1452458_s_at肽基脯氨酰异构酶(亲环蛋白)样5 0.1163^*-0.08311417939_at1417939_atRAD51相关蛋白10.1149^*-0.08211436725_at1436725_atRIKEN cDNA E130306D19基因0.1104^*-0.07891437187_at1437187_atE2F转录因子70.1103^*-0.07881453004_at1453004_atRIKEN cDNA 3110004L20基因0.1062^*-0.07581428105_at1428105_atTPX2，微管相关蛋白同系物 (光滑爪蟾)0.1049^*-0.07491448926_at1448926_at同源异型框A50.1047^*-0.07481437370_at1437370_atShugoshin样2(裂殖酵母)0.1046^*-0.07471430999_a_at1430999_a_at短卷曲螺旋蛋白0.1038^*-0.07421454757_s_at1454757_s_atDNA区段，Chr12，ERATO Doi647，表 达的0.1018^*-0.07271418026_at1418026_at核酸外切酶10.1016^*-0.07261435148_at1435148_atATP酶，Na+/K+转运，β2多肽 0.1012^*-0.07231434553_at1434553_atRIKEN cDNA 4930577M16基因0.1009^*-0.07211422967_a_at1422967_a_at转铁蛋白受体0.1008^*-0.0721434479_at1434479_at表达的序列AI4133310.1001^*-0.07151431893_a_at1431893_a_at反-异戊烯转移酶0.0994^*-0.0711447655_x_at1447655_x_at含SRY-框的基因60.0959^*-0.06851434789_at1434789_at含DEP域1B0.095^*-0.06781421957_a_at1421957_a_at磷酸胞苷酰转移酶1，胆碱，α同工型 0.0946^*-0.06761455228_at1455228_atWolf-Hirschhorn综合征候选物1(人) 0.0937^*-0.06691435663_at1435663_at雌激素受体1(α)0.093^*-0.06641429058_at1429058_atRIKEN cDNA 1110004B13基因0.0925^*-0.06611424229_at1424229_at双特异性酪氨酸-(Y)-磷酸化调节激酶3 0.0919^*-0.06571422930_at1422930_at细胞间粘附分子4， Landsteiner-Wiener血型0.0917^*-0.06551452591_a_at1452591_a_atRIKEN cDNA 2410018G20基因0.0905^*-0.06461453416_at1453416_at生长停滞特异性2样30.0886^*-0.06331433908_a_at1433908_a_at皮层肌动蛋白0.0874*-0.0624

 

1419595_a_at1419595_a_atγ-谷氨酰水解酶0.0872^*-0.06231421654_a_at1421654_a_at核纤层蛋白A0.0867^*-0.0621417323_at1417323_atRIKEN cDNA 5430413I02基因0.085^*-0.06071450992_a_at1450992_a_at髓细胞样嗜亲性病毒整合位点1 0.0832^*-0.05941435773_at1435773_atRIKEN cDNA 4930547N16基因0.0829^*-0.05921438711_at1438711_at---0.0829^*-0.05921429701_at1429701_atRIKEN cDNA 2410003J06基因0.0827^*-0.05911433582_at1433582_atRIKEN cDNA 1190002N15基因0.0823^*-0.05881460192_at1460192_at氧固醇结合蛋白样1A0.0817^*-0.05841443870_at1443870_atATP结合盒，亚家族C (CFTR/MRP)，成员40.0814^*-0.05811456020_at1456020_atSH3域和tetratricopeptide重复2 0.0813^*-0.05811451664_x_at1451664_x_at杀伤细胞凝集素样受体亚家族A，成员 12///杀伤细胞凝集素样受体亚家族A，成 员4///杀伤细胞凝集素样受体亚家族A，成 员7///杀伤细胞凝集素样受体亚家族A，成 员20///杀伤细胞凝集素样受体亚家族A， 成员18 0.0812^*-0.0581421975_a_at1421975_a_at内收蛋白2(β)0.0805^*-0.05751423124_x_at1423124_x_atRAD54样(酿酒酵母)0.0789^*-0.05631417749_a_at1417749_a_at紧密连接蛋白10.0779^*-0.05571425145_at1425145_at白细胞介素1受体样10.0768^*-0.05491424722_at1424722_atRIKEN cDNA 1300017J02基因0.0762^*-0.05441455409_at1455409_at螺旋体同源物1(果蝇)0.0739^*-0.05281453067_at1453067_atRIKEN cDNA 2610040C18基因0.0734^*-0.05241430839_at1430839_atRIKEN cDNA 9430076G02基因0.0713^*-0.05091434577_at1434577_atcDNA序列BC0520400.0704^*-0.05031457306_at1457306_at聚合酶(DNA指导的)，ε3(p17亚基) 0.0699^*-0.04991429734_at1429734_atRIKEN cDNA 4632434I11基因0.0695^*-0.04961449060_at1449060_at驱动蛋白家族成员2C0.0684^*-0.04891424223_at1424223_atRIKEN cDNA 1700020C11基因0.0676^*-0.04831428372_at1428372_at肿瘤发生抑制50.0667^*-0.04761436124_at1436124_at磷酸盐胞苷酰转移酶1，胆碱，β同工型 0.0663^*-0.04741417656_at1417656_at成髓细胞血症致癌基因样20.0661^*-0.04721436922_at1436922_at---0.0657^*-0.0471455009_at1455009_at羧肽酶D0.065^*-0.04641434826_at1434826_at表达的序列AI2567750.064^*-0.04571455746_at1455746_at驱动蛋白家族成员13A0.0628^*-0.04491419087_s_at1419087_s_at剪接因子3a，亚基10.0616^*-0.0441418919_at1418919_atshugoshin样1(裂殖酵母)0.0611^*-0.0436

 

1433596_at1433596_atDnaJ(Hsp40)同源物，亚家族C，成员6 0.061^*-0.04361430538_at1430538_atRIKENcDNA 2210013O21基因0.0605^*-0.04321454193_at1454193_atRIKEN cDNA 5430401H09基因0.0605^*-0.04321450380_at1450380_at室管膜素相关蛋白2(斑马鱼) 0.06^*-0.04281434322_at1434322_atRIKEN cDNA A930021H16基因0.0596^*-0.04261438650_x_at1438650_x_at间隙连接膜通道蛋白α1 0.0593^*-0.04241451914_a_at1451914_a_at内收蛋白2(β)0.0574^*-0.0411436584_at1436584_atSprouty同源物2(果蝇)0.0555^*-0.03961455012_s_at1455012_s_at三联基序蛋白370.0551^*-0.03941452026_a_at1452026_a_at磷酯酶A2，XIIA类0.0524^*-0.03741451257_at1451257_at酰基辅酶A合成酶长链家族成员6 0.0521^*-0.03721435792_at1435792_atSp100-rs的组分0.0513^*-0.03661435029_at1435029_atRIKEN cDNA B230120H23基因0.0492^*-0.03511434630_at1434630_at锚蛋白重复结构域280.0491^*-0.03511426801_at1426801_at隔蛋白80.0483^*-0.03451436936_s_at1436936_s_at灭活的X特异性转录物0.0458^*-0.03271418069_at1418069_at载脂蛋白C-II0.0456^*-0.03261425837_a_at1425837_a_atCCR4碳分解代谢物阻抑4样 (酿酒酵母)0.0456^*-0.03261441757_at1441757_atRIKEN cDNA 1190002F15基因0.0454^*-0.03251422906_at1422906_atATP结合盒，亚家族G(WHITE)，成 员20.045^*-0.03221454858_x_at1454858_x_atRIKEN cDNA 3300001H21基因0.045^*-0.03211443673_x_at1443673_x_at---0.0449^*-0.0321417587_at1417587_at永久同源物(果蝇)0.0447^*-0.03191456022_at1456022_at同源结构域相互作用蛋白激酶2 0.0445^*-0.03181438202_at1438202_atRIKEN cDNA C920005C14基因0.0439^*-0.03141453836_a_at1453836_a_at单酸甘油酯脂肪酶0.0434^*-0.0311422966_a_at1422966_a_at转铁蛋白受体0.0431^*-0.03081439208_at1439208_at限制点激酶1同源物，(裂殖酵母) 0.0423^*-0.03021422944_a_at1422944_a_at透明同源物3(果蝇)0.0417^*-0.02981419412_at1419412_at趋化因子(C基序)配体10.0414^*-0.02961435378_at1435378_atRIKEN cDNA 2210020M01基因0.0414^*-0.02961422788_at1422788_at溶质载体家族43，成员30.0413^*-0.02951452763_at1452763_atPrader-Willi/Angelman综合征1中非印 迹同源物(人) 0.0413^*-0.02951428369_s_at1428369_s_atRho GTP酶激活蛋白210.0409^*-0.02921453107_s_at1453107_s_at果蝇forkhead框M1///脑磷酯结合蛋白 ///RIKEN cDNA 0.0404^*-0.0288

 

4933413G19基因1418219_at1418219_at白细胞介素150.0379^*-0.0271448834_at1448834_at果蝇forkhead框M10.0372^*-0.02661435054_at1435054_at必需减数分裂核酸内切酶同源物1 (裂殖酵母)0.0371^*-0.02651434586_a_at1434586_a_at磷脂酰丝氨酸合成酶20.0367^*-0.02621418929_at1418929_at雌激素相关受体β样10.0366^*-0.02611451469_at1451469_atRIKEN cDNA B430108F07基因0.0363^*-0.02591428104_at1428104_atTPX2，微管相关蛋白同源物 (光滑爪蟾)0.0339^*-0.02421427262_at1427262_at灭活的X特异性转录物0.0337^*-0.02411431012_a_at1431012_a_at过氧化物酶体Δ3，Δ2-烯酰辅酶A异构酶 0.0336^*-0.0241434850_at1434850_at假设蛋白D030034H080.033^*-0.02361441520_at1441520_at钙调蛋白结合蛋白10.0329^*-0.02351423344_at1423344_at促红细胞生成素受体0.0328^*-0.02341434557_at1434557_at亨廷顿蛋白相互作用蛋白10.0325^*-0.02321424863_a_at1424863_a_at同源结构域相互作用蛋白激酶2 0.0321^*-0.02291457670_s_at1457670_s_at核纤层蛋白A0.0316^*-0.02261451417_at1451417_at乳房癌10.0305^*-0.02181428952_at1428952_at蛋白质二硫键异构酶相关2 0.0303^*-0.02171449514_at1449514_atG蛋白偶联受体激酶50.0296^*-0.02111416273_at1416273_at肿瘤坏死因子，α-诱导的蛋白2 0.0292^*-0.02091460223_a_at1460223_a_at红细胞蛋白带4.90.0292^*-0.02081423902_s_at1423902_s_atRho鸟嘌呤核苷交换因子(GEF)12 0.0291^*-0.02081417404_at1417404_atELOVL家族成员6， 长链脂肪酸的延伸(酵母) 0.0289^*-0.02061420712_a_at1420712_a_athepsin0.0273^*-0.01951452924_at1452924_atRIKEN cDNA 2310007D09基因0.0273^*-0.01951429059_s_at1429059_s_atRIKEN cDNA 1110004B13基因0.0272^*-0.01941435784_at1435784_at自噬相关9样1(酵母)0.0264^*-0.01891449648_s_at1449648_s_atRNA聚合酶1-10.0264^*-0.01881460551_at1460551_atRAN，癌基因家族成员RAS0.0259^*-0.01851439091_at1439091_at范科尼贫血，互补群D2 0.0249^*-0.01781457851_at1457851_at---0.0245^*-0.01751416575_at1416575_at细胞分裂周期45同源物(酿酒酵母)样 0.0234^*-0.01671422922_at1422922_atRecQ蛋白样40.0234^*-0.01671456510_x_at1456510_x_atUbiE-YGHL1融合蛋白0.0231^*-0.01651448871_at1448871_at促分裂原激活蛋白激酶130.0226^*-0.01611450495_a_at1450495_a_at杀伤细胞凝集素样受体亚家族K，成员10.0225^*-0.0161

 

1442000_at1442000_at类似于新蛋白0.0222^*-0.01581452098_at1452098_atCTF18，染色体传递保真因子18同源物 (酿酒酵母) 0.0219^*-0.01561453049_at1453049_atRTKEN cDNA 662040IM08基因0.0217^*-0.01551434864_at1434864_atPrader-Willi/Angelman综合征1中非印迹 同源物(人) 0.0212^*-0.01521460495_s_at1460495_s_at蛋白酶，丝氨酸，250.021^*-0.0151453181_x_at1453181_x_at磷脂scramblasel0.0209^*-0.01491420330_at1420330_atC-型凝集素结构域家族4，成员e 0.0208^*-0.01491438011_at1438011_at磷酸胞苷酰转移酶1，胆碱，α同工型 0.0205^*-0.01461450344_a_at1450344_a_at前列腺E受体3(EP3亚型) 0.0204^*-0.01461424895_at1424895_atG-蛋白信号调制器2 (AGS3-样，线虫)0.0201^*-0.01441426543_x_at1426543_x_atRIKEN cDNA2310067E08基因:0.0193^*-0.01381423878_at1423878_at血型糖蛋白C0.0186^*-0.01331427263_at1427263_at灭活的X特异性转录物0.0186^*-0.01331434150_a_at1434150_a_atRIKEN cDNA3300001H21基因：/// UbiE-YGHL1融合蛋白0.0185^*-0.01321453681_at1453681_atATP酶抑制因子10.0181^*-0.0131450556_at1450556_at膜收缩蛋白β10.0175^*-0.01251434554_at1434554_at三联基序蛋白370.0174^*-0.01241448529_at1448529_at血栓调节蛋白0.0173^*-0.01231429404_at1429404_atRIKEN cDNA2010317E24基因0.0168^*-0.0121432886_at1432886_atRIKEN cDNA5730488B01基因0.0162^*-0.01161435325_at1435325_at泛素特异性蛋白酶460.016^*-0.01141434587_x_at1434587_x_at磷脂酰丝氨酸合成酶20.0157^*-0.01121418003_at1418003_atRIKEN cDNA1190002H23基因0.0156^*-0.01111434310_at1434310_at骨形态发生蛋白受体，II型 (丝氨酸/苏氨酸激酶)0.0147^*-0.01051435035_at1435035_at含RNA(鸟嘌呤-9-)甲基转移酶 结构域的20.0144^*-0.01031424413_at1424413_at阿片样物质生长因子受体样10.014^*-0.011436872_at1436872_at转化，含酸性卷曲螺旋蛋白3 0.0133^*-0.00951417878_at1417878_atE2F转录因子10.013^*-0.00931428433_at1428433_at同源结构域相互作用蛋白激酶2 0.0125^*-0.00891429642_at1429642_atAN1，泛素样，同源物(光滑爪蟾) 0.0122^*-0.00871435786_at1435786_atKelch样12(果蝇)0.0119^*-0.00851428391_at1428391_atRAB3A相互作用蛋白(Rab结合蛋白3) 样10.0118^*-0.0085

 

1451596_a_at1451596_a_at鞘氨醇激酶10.0117^*-0.00841422619_at1422619_at磷脂酸磷酸酶2a0.0111^*-0.00791449708_s_at1449708_s_at限制点激酶1同源物(裂殖酵母) 0.0106^*-0.00761429294_at1429294_at甲状腺激素受体相互作用物13 0.0105^*-0.00751450862_at1450862_atRAD54样(酿酒酵母)0.0103^*-0.00741433695_at1433695_atRIKEN cDNA 1500041B16基因0.0097^*-0.00691451083_s_at1451083_s_at丙氨酰-tRNA合成酶0.0097^*-0.00691422620_s_at1422620_s_at磷脂酸磷酸酶2a0.0094^*-0.00671457722_at1457722_atRIKEN cDNA A630024B12基因0.0091^*-0.00651455405_at1455405_at脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸 磷酸酶相互作用蛋白20.009^*-0.00641460010_a_at1460010_a_at磷脂酰丝氨酸合成酶20.0089^*-0.00631424412_at1424412_at阿片样物质生长因子受体样10.0083^*-0.00591456475_s_at1456475_s_at蛋白激酶，cAMP依赖性调节，IIβ型 0.0082^*-0.00581449714_at1449714_atRIKEN cDNA 5730472N09基因0.0077^*-0.00551434645_at1434645_atRIKEN cDNA C530008M17基因0.0069^*-0.0051425157_x_at1425157_x_atRIKEN cDNA 1300010A20基因0.0067^*-0.00481432273_a_at1432273_a_at达菲血型0.0063^*-0.00451417037_at1417037_at起点识别复合体亚基6样(酿酒酵母) 0.0062^*-0.00441428402_at1428402_at锌指，含CCHC结构域的3 0.0062^*-0.00441416130_at1416130_at朊病毒蛋白0.0061^*-0.00431455218_at1455218_atRIKEN cDNA 6330503K22基因0.0056^*-0.0041452166_a_at1452166_a_at角蛋白复合物，酸性基团100.0049^*-0.00351437992_x_at1437992_x_at间隙连接膜通道蛋白α1 0.0037^*-0.00261449015_at1449015_at抵抗素样α0.0033^*-0.00231428713_s_at1428713_s_atRIKEN cDNA 4833427B12基因0.0032^*-0.00231427105_at1427105_atRIKEN cDNA 2610510J17基因0.0031^*-0.00221426541_a_at1426541_a_atRIKEN cDNA 2310067E08基因0.0028^*-0.0021424293_s_at1424293_s_atRIKEN cDNA 2610319K07基因0.0024^*-0.00171423724_at1423724_atZW10相互作用物0.002^*-0.00141451609_at1451609_atRIKEN cDNA1300010A20基因0.0018^*-0.00131417902_at1417902_at溶质载体家族19(硫胺转运蛋白)， 成员20.0016^*-0.00121424292_at1424292_at含DEP结构域的1a0.0015^*-0.00111455983_at1455983_at细胞分裂周期相关20.0015^*-0.00111448211_at1448211_atATP酶，H+转运，溶酶体的， V0亚基E同工型20.0013^*-9.00E- 041453769_at1453769_atRIKEN cDNA 2610318C08基因0.0012^*-9.00E- 041417892_a_at1417892_a_atSirtuin3(沉默交配型信息调节2，同源物) 3(酿酒酵母)6.00E-04^*-4.00E- 04

 

1428195_at1428195_atRIKEN cDNA 4631427C17基因-1.00E-04 #1.00E-041450932_s_at1450932_s_at胞质分裂9的奉献者-3.00E-04 #2.00E-041417652_a_at1417652_a_at微管蛋白辅因子a-4.00E-04 #3.00E-041455210_at1455210_at锌指和同源异型框蛋白2 -0.0014#0.0011419103_a_at1419103_a_at含自水解酶结构域的6-0.0015#0.0011441975_at1441975_at酸性磷酸酶，前列腺-0.0017#0.00121419119_at1419119_at造血细胞信号传感器-0.0019#0.00131449508_at1449508_at白介素27受体α-0.0025#0.00181445711_at1445711_at表达的序列BB163080-0.0029#0.0021426044_a_at1426044_a_at蛋白激酶C，θ-0.0036#0.00261424903_at1424903_atJumonji，富含AT的相互作用结构域ID (Rbp2样)-0.0037#0.00271416035_at1416035_at----0.0045#0.00321460260_s_at1460260_s_at亲核蛋白(核转运蛋白)α1-0.0046#0.00331439956_at1439956_at成人雄性主动脉和静脉cDNA，RIKEN全 长富集文库，克隆：A530049N04 产物：未知EST，全部插入序列 -0.0048#0.00341416406_at1416406_at星形细胞中富含的磷蛋白15 -0.0051#0.00361419548_at1419548_at亲核蛋白(核转运蛋白)α1-0.0054#0.00391437756_at1437756_atGTP酶，IMAP家族成员9-0.0056#0.0041436067_at1436067_at含锌指和BTB结构域的10 -0.0058#0.00421450710_at1450710_atjumonji，富含AT相互作用结构域2 -0.0061#0.00441433955_at1433955_at含布罗莫结构域和WD重复结构域的1 -0.0067#0.00481439343_at1439343_at3天婴儿胸腺cDNA，RIKEN全长富集文 库，克隆：A630050A01 产物：未分类，全部插入序列 -0.0073#0.00521426771_at1426771_at表达的序列AI316828-0.0079#0.00571419722_at1419722_at蛋白酶，丝氨酸19(neuropsin)-0.0085#0.00611419810_x_at1419810_x_atRho GTP酶活化蛋白9-0.0099#0.00711452322_a_at1452322_a_at含布罗莫结构域和WD重复结构域的1 -0.0106#0.00761446835_at1446835_at----0.011#0.00781417371_at1417371_atpellino 1-0.0111#0.00791436353_at1436353_atRIKEN cDNA A230046K03基因-0.0114#0.00821420685_at1420685_atGRB2相关的接头蛋白2-0.0115#0.0082

 

1456440_s_at1456440_s_at转录座位-0.0117#0.00841454742_at1454742_atRasGEF域家族，成员1B-0.0122#0.00871450024_at1450024_at融合同源物的阻抑基因(果蝇) -0.0125#0.0091433953_at1433953_at锌指蛋白277-0.0135#0.00961417210_at1417210_at真核翻译起始因子2，亚基3，结构基因Y 连锁的 -0.0137#0.00981444828_at1444828_at蛋白质磷酸酶2，调节亚基B(B56)， 同工型-0.0139#0.00991447502_at1447502_at----0.014#0.011422445_at1422445_at整联蛋白的α6-0.0148#0.01061453244_at1453244_atRIKEN cDNA 5830416P10基因-0.0157#0.01121426725_s_at1426725_s_atE26鸟类白血病致癌基因1，5′结构域 -0.0175#0.01251438577_at1438577_at转录座位-0.018#0.01291452077_at1452077_atDEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)框 多肽3，γ-连锁的-0.02#0.01431416007_at1416007_at富含特定AT序列结合蛋白1 -0.0203#0.01451426438_at1426438atDEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)框 多肽3，γ-连锁的-0.021#0.0151422122_at1422122_atFc受体，IgE，低亲和力II，α多肽 -0.0213#0.01521434260_at1434260_atFCH和双SH3结构域2-0.0215#0.01531417816_s_at1417816_s_at肿瘤差异表达1-0.0222#0.01581427532_at1427532_atT细胞受体相关跨膜接头1 -0.0222#0.01591454947_a_at1454947_a_atcDNA序列BC002236-0.0224#0.0161418235_at1418235_at自噬相关5样(酵母)-0.0243#0.01731418353_at1418353_atCD5抗原-0.0258#0.01841450262_at1450262_atCar样细胞因子1-0.026#0.01861455165_at1455165_at转录座位-0.0268#0.01911439595_at1439595_atT细胞受体α链-0.0272#0.01941426620_at1426620_at碳水化合物磺基转移酶10-0.0278#0.01981454745_at1454745_atRho GTP酶活化蛋白29-0.029#0.02071439719_at1439719_atRIKEN cDNA E430004N04基因-0.0292#0.02081435374_at1435374_at转录座位-0.0302#0.02161456678_at1456678_atRIKEN cDNA 1700091G21基因-0.0306#0.02181423176_at1423176_atErbB-2.1的传感器-0.0348#0.02491424374_at1424374_atGTP酶，IMAP家族成员4-0.0355#0.02531446614_at1446614_at二酰基甘油激酶ζ-0.0359#0.02571448862_at1448862_at细胞间粘附分子2-0.0365#0.02611439036_a_at1439036_a_atATP酶，Na+/K+转运，β1多肽 -0.0375#0.02681442023_at1442023_atRIKEN cDNA A530030E21基因-0.0376#0.02691436182_at1436182_at富含特定AT序列结合蛋白1-0.0385#0.0275

 

1443703_at1443703_at转录座位-0.0385#0.02751422562_at1422562_at与糖尿病相关的Ras-0.0396#0.02831454893_at1454893_atRIKEN cDNA 1110013L07基因-0.0402#0.02871427831_s_at1427831_s_at锌指蛋白260-0.0404#0.02891452163_at1452163_atE26鸟白血病致癌基因1，5′结构域 -0.0417#0.02981421570_at1421570_at白介素9受体-0.0431#0.03081442998_at1442998_at胞嘧啶核苷5′-三磷酸合成酶2-0.0437#0.03121426452_a_at1426452_a_atRAB30，RAS致癌基因家族成员 -0.0473#0.03381431980_a_at1431980_a_at砷(+3氧化态)甲基转移酶 -0.0478#0.03411456205_x_at1456205_x_at微管蛋白辅因子a-0.048#0.03431441041_at1441041_atRIKEN cDNA 2810407L07基因-0.0491#0.03511427418_a_at1427418_a_at低氧可诱导因子1，α亚基 -0.0492#0.03511456502_at1456502_at双特异性酪氨酸-(Y)-磷酸化调节激酶2 -0.0502#0.03581432229_a_at1432229_a_at染色体结构域蛋白，Y染色体样2 -0.0516#0.03681453726_s_at1453726_s_atRIKEN cDNA 2810407CO2基因-0.0517#0.03691440343_at1440343_at核糖体蛋白S6激酶，多肽5 -0.0519#0.0371435584_at1435584_at表达的序列AI662791-0.0522#0.03731419481_at1419481_at选择蛋白，淋巴细胞-0.0524#0.03741437907_a_at1437907_a_at微管蛋白辅因子a-0.0532#0.0381419192_at1419192_at白介素4诱导的1-0.0554#0.03951424936_a_at1424936_a_at动力蛋白，纤毛轴，重链8-0.0562#0.04021448931_at1448931_at组织凝血活酶II(凝血酶)受体样2 -0.0571#0.04081423890_x_at1423890_x_atATP酶，Na+/k+转运，β1多肽 -0.0582#0.04151458432_at1458432_at酪氨酸激酶接头蛋白的2-非催化区域 -0.0588#0.0421440217_at1440217_at类似于假定蛋白FLJ39743 -0.0593#0.04241440647_at1440647_at信号诱导的增生相关1样1 -0.0596#0.04261440284_at1440284_at转录座位-0.0598#0.04271457691_at1457691_at转录座位-0.0614#0.04391455256_at1455256_atTRAF2和NCK相互作用激酶-0.0625#0.04471421628_at1421628_at白介素18受体1-0.0635#0.04541442045_at1442045_at16天婴儿胸腺cDNA， RIKEN全长富集文库， 克隆：A130046K23 产物：未知EST，全部插入序列 -0.0635#0.0453

 

1452737_at1452737_atRIKEN cDNA 2810008M24基因-0.0673#0.04811419480_at1419480_at选择蛋白，淋巴细胞-0.0683#0.04881459632_at1459632_at富含半胱氨酸的运动神经元-0.0722#0.05161427359_at1427359_atRIKEN cDNA A630082K20基因-0.0757#0.05411426640_s_at1426640_s_attribbles同源物2(果蝇)-0.0783#0.05591435754_at1435754_atDNA 片段Chr6，Brigham & Women’s Genetics 1452表达的 -0.0791#0.05651460204_at1460204_at细胞质酪氨酸激酶Dscr28C相关的(果蝇) -0.0803#0.05741454897_at1454897_atRIKEN cDNA 6330509M05基因-0.0804#0.05741449520_at1449520_at表达序列AI428795-0.0813#0.0581421622_a_at1421622_a_atRap鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)4 -0.0841#0.06011425245_a_at1425245_a_atG蛋白信号的调节子11-0.0842#0.06021416008_at1416008_at富含特定AT序列结合蛋白1 -0.0847#0.06051452009_at1452009_atRIKEN cDNA 9130422G05基因-0.0861#0.06151445141_at1445141_atκB激酶β的抑制子-0.0875#0.06251431169_at1431169_atRIKEN cDNA D230012E17基因-0.0878#0.06271443192_at1443192_atRIKEN cDNA E430004N04基因-0.0882#0.0631428834_at1428834_at双特异性磷酸酶4-0.091#0.0651423989_at1423989_atRIKEN cDNA 2210010N04基因-0.0914#0.06531443573_at1443573_at聚(ADP-核糖)聚合酶家族，成员1 -0.0916#0.06541450061_at1450061_at外胚层神经皮层1-0.0959#0.06851452503_a_at1452503_a_at含布罗莫结构域和WD重复结构域的1 -0.0969#0.06921451313_a_at1451313_a_atRIKEN cDNA 1110067D22基因-0.1008#0.0721437253_at1437253_atRIKEN cDNA A630054L15基因-0.1009#0.0721428726_at1428726_at含THUMP结构域的2-0.1017#0.07271451622_at1451622_at含LMBR1结合域的1-0.103#0.07361435456_at1435456_at表达的序列AI428795-0.1035#0.07391444181_at1444181_atGTP酶，IMAP家族成员5-0.1036#0.0741418762_at1418762_at衰变加速因子1-0.1059#0.07571423297_at1423297_at内收蛋白3(γ)-0.1071#0.07651425518_at1425518_atRap鸟嘌呤核苷酸交换因子 (GEF)4-0.1071#0.07651427322_at1427322_at含布罗莫结构域和WD重复结构域的1 -0.1084#0.07751426158_at1426158_atT细胞受体，变体13-0.1126#0.08041416129_at1416129_atRIKEN cDNA 1300002F13基因-0.1139#0.08141426550_at1426550_atSID1跨膜家族成员1 -0.1143#0.08171428510_at1428510_atlatrophilin1-0.1187#0.08481456520_at1456520_atRIKEN cDNA 9530033F24基因-0.1202#0.08591419212_at1419212_atIcos配体-0.126#0.091437540_at1437540_at----0.1261#0.0901

 

1429969_at1429969_atRIKEN cDNA 4833403J16基因-0.13#0.09291459722_at1459722_at含锌指、SWIM结构域的6 -0.13#0.09281449642_at1449642_atEB病毒诱导基因2-0.1319#0.09421444283_at1444283_atGTP酶，IMAP家族成员7-0.1324#0.09451434333_a_at1434333_a_at蛋白激酶D2-0.1329#0.09491453119_at1453119_at含OUT结合域的1-0.1339#0.09571421852_at1421852_at钾通道亚家族K成员5 -0.1385#0.0991425186_at1425186_at含LMBR1结构域的1-0.1443#0.1031433977_at1433977_at硫酸类肝素(葡萄糖胺)3-O- 磺基转移酶3B1-0.1462#0.10441436491_at1436491_atRIKEN cDNA 5830431A10基因-0.1518#0.10841460242_at1460242_at衰变加速因子1-0.1524#0.10881445277_at1445277_at16天婴儿胸腺cDNA，RIKEN全长富集文 库，克隆：A130006J10产物：未知EST， 全部插入序列 -0.1527#0.10911418497_at1418497_at成纤维细胞生长因子13-0.1588#0.11341455425_at1455425_at表达序列BB001228-0.1632#0.11661418998_at1418998_at犬尿氨酸3-单加氢酶(犬尿氨酸3-羟化酶) -0.1673#0.11951452167_at1452167_atRIKEN cDNA2 810407C02基因-0.1698#0.12131442266_at1442266_at表达序列AI662175-0.1713#0.12231439843_at1439843_at钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV -0.1732#0.12371427752_a_at1427752_a_atT细胞受体β，变体13///类似于 TCRBV7S1///类似于TCRBV7S1 -0.1805#0.12891451253_at1451253_at包含PX结构域的丝氨酸/苏氨酸激酶 -0.1819#0.12991428669_at1428669_at脑表达的髓细胞组织增生致癌基因 -0.1862#0.1331434967_at1434967_at含锌指，SWIM结构域的6 -0.1869#0.13351422231_a_at1422231_a_at肿瘤坏死因子受体超家族，成员25 -0.1906#0.13611428914_at1428914_atRIKEN cDNA 2310014D11基因-0.1917#0.13691434175_s_at1434175_s_atRIKEN cDNA 2210010N04基因-0.2013#0.14381416268_at1416268_atE26鸟白血病致癌基因2，3′域 -0.203#0.1451436851_at1436851_at蛋白激酶N1-0.2037#0.14551438862_at1438862_atRIKEN cDNA A630005104基因-0.2078#0.14841448107_x_at1448107_x_at激肽释放酶6-0.2085#0.1491424062_at1424062_at泛素缀合酶E2D， UBC4/5同源物(酵母)-0.2114#0.1511444003_at1444003_at肺可诱导的中和相关的C3HC4RING域 蛋白-0.2133#0.1524

 

1428267_at1428267_atDEAH(Asp-Glu-Ala-His)框 多肽40-0.2217#0.15841443906_at1443906_at衰变加速因子1-0.2229#0.15921420583_a_at1420583_a_atRAR相关的孤儿基因受体-0.2261#0.16151420965_a_at1420965_a_at外胚层神经皮层1-0.2282#0.1631446244_at1446244_atDNA区段，Chr6，Brigham& Women′s Genetics 1452表达的-0.2305#0.16471440900_at1440900_at成人胸腺cDNA，RIKEN全长富集文库， 克隆：5830404C02产物：未知EST，全部 插入序列 -0.2324#0.1661416958_at1416958_at核受体亚家族1，D组，成员2 -0.2348#0.16771425832_a_at1425832_a_at趋化因子(C-X-C基序)受体6-0.2391#0.17081447792_x_at1447792_x_at成人胸腺cDNA，RIKEN全长富集文库， 克隆：5830404C02产物：未知EST，全部 插入序列 -0.2451#0.17511429443at1429443_atcopine IV-0.2472#0.17661455555_at1455555_at表达序列AV071699-0.251#0.17931415837_at1415837_at激肽释放酶6-0.2687#0.19191453568_at1453568_atRIKEN cDNA2310032F03基因-0.2765#0.19751452815_at1452815_at嘌呤能受体P2Y G蛋白偶联的10 -0.2789#0.19921446412_at1446412_at含WW结构域的氧化还原酶 -0.2819#0.20141448575_at1448575_at白介素7受体-0.2862#0.20441431050_at1431050_at核糖体蛋白S6激酶多肽5 -0.291#0.20781448576_at1448576_at白介素7受体-0.3125#0.22321422812_at1422812_at趋化因子(C-X-C基序)受体6-0.314#0.22431437356_at1437356_atEB病毒诱导基因2-0.322#0.231448613_at1448613_at脑外基质蛋白1-0.3377#0.24121433779_at1433779_at癌症易感候选者4-0.4293#0.3066

mir155mRNA标记：^*表明在小鼠mir155中过表达的基因，#表明 下表达的基因。分数是PAM分数(Tibshirani，R.J.，Hastie，T.J.， Narasimhan，B.，和Chu，G.(2002)，＂Diagnosis of multiple cancer types by shrunken centroids of gene expression，＂ Proceedings of the National Academy of Sciences，99， 6567-6572)。“nearest shrunken centroids”的PAM方法，鉴定了 最好表征mir155转基因的基因的亚类。PAM分数不是倍数变化。

表3.根据微阵列预测分析的(PAM)分类，Affymetrix微阵列数 据描述了在mir155转基因小鼠中显著过表达的微小RNA的标记(5只 转基因小鼠和6只野生型小鼠)。

名称                       miR155分数                wt分数

mmu-mir-151-prec           3.9218^*                  -2.2411

mmu-mir-217-precNo2        3.1565^*                  -1.8037 mmu-mir-224-precformer175No1 1.9286^*                  -1.1021

mmu-mir-194-prec           1.6021^*                  -0.9155

mmu-mir-201-prec           1.5653^*                  -0.8945

mmu-mir-155-prec           1.4967^*                  -0.8553

mmu-mir-218-2-precNo2      0.939^*                   -0.5365

mmu-mir-182-prec           0.4886^*                  -0.2792

mir155微小RNA标记：^*表明在Eμ-mmu-miR155转基因小鼠 中显著过表达的微小RNA。

这里引用的所有出版物的相关教导，其没有明确地引入作为参 考，都以其全部内容引入这里作为参考。同时本发明尤其参考其优选 实施方案说明和描述，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发 明进行形式和细节的各种改变，而不背离附加的权利要求所包含的本 发明的范围。