胸腺素α1单独地或与PTX3或更昔洛韦联合在治疗巨细胞病毒感染中的用途

摘要

本发明涉及胸腺素α1与长五聚蛋白PTX3或更昔洛韦联合在制备一种预防或治疗病毒性疾病和/或抑制病毒活化的药物中的用途。

说明书

本文描述的发明涉及胸腺素α1(Tα1)单独地或与长五聚蛋白 (pentraxin)PTX3(PTX3)或一种其功能衍生物或者更昔洛韦 (Ganciclovir)联合地在制备一种预防或治疗病毒性疾病和/或抑制 病毒活化的药物中的用途，其中所述病毒选自疱疹病毒，如巨细胞病 毒(CMV)；流感病毒，如H1N1、H3N2、H5N1或H5N7病毒；副黏液病 毒(paramixovirus)，如麻疹；呼吸道合胞病毒；冠状病毒，如SARS； HIV病毒；肝炎病毒；或轮状病毒。

人类巨细胞病毒(HCMV)是一种在约50％的总人口中常见的疱疹 病毒。患有HIV的人中，约90％携带HCMV。在普通人群中，病毒通常 在最初感染后潜伏在身体的组织中。然而，它可排出至口、尿液和生 殖道中，作为其他人的感染源。如果免疫系统由于任何原因受损，HCMV 感染会导致继发的、更为严重的感染。

大约5％的由垂直传播染上HCMV的婴儿有严重的先天缺陷。这些 先天缺陷可包括脑损害、生长不足、失明和其它缺陷。这种情况通常 发生在母亲在妊娠期间第一次被HCMV感染。

在普通成年人群体中，HCMV潜伏着，但是可能与冠状动脉疾病的 发生有关。HCMV感染与动脉斑和动脉粥样硬化的发生有关。

对于免疫系统衰弱的人，HCMV能引发严重问题。

这在患有AIDS的人或者进行免疫抑制治疗的患者中是非常普遍 的问题。HCMV感染了75～100％的HIV阳性患者。与HCMV相关的最常 见并发症包括脉络膜视网膜炎；胃肠道感染，包括肝炎、食管炎、结 肠炎、胃炎和胰腺炎；神经受累，包括脑炎和多发性神经根炎；肺部 受累和附睾炎。

患有常见癌症的人或者经历器官或骨髓移植的人通常受到感染。 感染可以是由于第一次暴露于HCMV或者是HCMV恢复活力的结果。在 移植和癌症患者中，HCMV经常引发肺炎或一种导致腹泻的胃肠感染， 这可能引起死亡。此外，对于实体器官移植受体而言，HCMV促使慢性 同种异体移植物机能障碍的发生。HCMV疾病与肺移植受体的闭塞性细 支气管炎的发生之间的关系已被清楚证实。另外，HCMV是众多可导致 同种异体移植物损伤的危险因素之一。病毒直接侵入同种异体移植物 (allograph)可能在肝脏或肾脏移植患者中引发HCMV肝炎。除由HCMV 引起的直接综合征，这种病毒感染会增加真菌和其它随机感染的危险， 如卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)肺炎和EB(Epstein-Barr) 病毒相关的移植后淋巴组织增生病。

多数人在他们成年前已被HCMV感染。接受一次输血或器官移植的 任何人都有一次HCMV感染的危险。

而且，免疫系统弱的人和未出生的儿童存在患严重疾病的危险。

目前用抗病毒药剂，如更昔洛韦、膦甲酸和西多福韦(cidofovir) 治疗免疫系统弱的人中的活性HCMV。

流感病毒引起流感，流感是一种感染人类呼吸道(鼻，咽喉和肺) 的传染性疾病。流行性感冒通常突然发生，并且可能包括下述症状： 发烧、头痛、不适(生病和乏力的感觉，这种感觉可能会非常严重)、 咳嗽、喉咙痛、鼻塞和身体疼痛。

副粘病毒在人类中引起多种不同的临床疾病，这些包括麻疹病毒； 具有腮腺炎，睾丸炎和脑炎症状的腮腺炎病毒；以及为呼吸道病原体 的副流感病毒。

在婴儿和1岁以下儿童中，呼吸道合胞病毒(RSV)是细支气管炎 和肺炎的最常见原因。该疾病最常见地开始于发热、流鼻涕、咳嗽， 有时出现喘鸣。RSV还会终生引起反复感染，通常伴随有中度至重度 的类似于感冒的症状；然而，严重的下呼吸道疾病可发生在任何年龄， 尤其在老年人或者那些心脏、肺或免疫系统受损者中。

冠状病毒感染多种哺乳动物和鸟类。在人类中，冠状病毒引起包 括严重急性呼吸系统综合征(SARS)在内的呼吸道感染，肠感染以及 神经综合征。成年人感染较为少见，而再感染终生可能发生。

人体免疫缺陷病毒(HIV)是一种逆转录病毒。在逆转录病毒颗粒 中的遗传信息由RNA编码。一旦进入宿主细胞，该RNA由病毒酶逆转 录酶复制到DNA中。病毒遗传信息的cDNA拷贝能整合到宿主细胞的细 胞核中的染色体上。这种原病毒在恢复活力并产生更多感染性的逆转 录病毒颗粒之前能够潜伏多次细胞分裂。

病毒性肝炎是任何类型的由病毒感染引起的肝脏炎症。目前识别 的引起肝脏疾病的三种最常见病毒是甲肝、乙肝以及非甲非乙型肝炎 (也称丙肝)。还识别了几种其它类型：丁肝、戊肝以及最近才识别 的庚肝。怀疑第七种类型(己肝)存在但还未得到证实。

轮状病毒是儿童严重腹泻的最常见的原因，导致美国每年约 55,000名儿童住院治疗以及全球每年超过600,000名儿童死亡。

胸腺素α1是一种在医学领域众所周知的化合物。

这种化合物是存在于胸腺提取物的一种酸性肽，在一些体外和体 内测定中表现出免疫调节性能(1972；Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.69，1800-1803)。

前文所述的胸腺素α1的用途是已知的。

对预先接种了人类非小细胞肺癌(“NSCLC”)细胞的裸小鼠皮下 注射胸腺素α1明显地缩小了肿瘤体积。

胸腺素α1还减少了具有甲基胆蒽诱导的纤维肉瘤小鼠中的肺转 移，并且用胸腺素α1治疗的BALB/c小鼠中局部肉瘤生长以及淋巴肉 瘤细胞的肝和肺转移明显地减少。

PTX3是一种表达于多种细胞类型的蛋白质(Bottazzi etal.， J.Biol.Chem，1997；272；32817-32823)，尤其是暴露于炎性细胞 因子白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)之后的单核 吞噬细胞和内皮细胞。

这种蛋白质由两个结构域组成，一个与任何已知分子没有相关性 的N末端，以及一个与短五聚蛋白(如C-反应蛋白(CRP))相似的C 末端。发现了人类PTX3(hPTX3)与动物PTX3之间有较大的相似性。

PTX3基因位于小鼠3号染色体上，与人类3q区域(q24-28)相 似的区域中，与已被证实的在3q25区域上hPTX3的位置一致。此外， 小鼠PTX3(mPTX3)(Introna，M.，et、al.：Blood，87(1996)； 1862-1872)在组织、位置和序列上与hPTX3非常相似(Breviario， F.，etal.：J.Biol.Chem，267.22190，1992)。

更具体而言，人类基因和小鼠基因在该序列之间的同一性程度为 82％，如考虑到保守性替换可达到92％。

hPTX3序列和mPTX3序列之间的高度相似性是五聚蛋白在进化过 程中的高度保守性的一种表现(Adv.Immunol.34：141，1983)。

关于五聚蛋白的综述，参见H.Gewurz等人，“Current Opinion in Immunology”，1995，7.54-64。

前文所述的长五聚蛋白PTX3的用途是已知的。

国际专利申请WO99/32516描述了长五聚蛋白PTX3在治疗传染性 (真菌、细菌、原生动物或病毒)，炎性或肿瘤疾病中的用途。 WO99/32516中从未提到PTX3会对治疗HCMV或流感病毒有益。

WO02/38169描述了长五聚蛋白PTX3在制备用于治疗与生长因子 FGF-2的异常活化相关的疾病的药物中的用途。

WO02/36151描述了长五聚蛋白PTX3在自身免疫疾病的治疗中的 用途。

WO03/011326描述了长五聚蛋白PTX3在女性不育症的治疗中的用 途。

WO2005060997描述了长五聚蛋白PTX3的抑制剂在制备用于预防 和治疗自身免疫疾病以及骨和软骨退行性疾病的药物中的用途。

Blood，1January 2006，Volume 107，Number 1中描述了PTX3 在炎症条件和自身反应性细胞的活化下限制组织损伤。

更昔洛韦是医学领域中众所周知的抗病毒药物。它用于治疗那些 免疫系统功能不全的人中由巨细胞病毒感染引起的感染。这包括患有 获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的患者。更昔洛韦也用于帮助那些接 受过器官或骨髓移植的患者和那些人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的晚 期患者预防CMV感染。

现在，意外地发现了胸腺素α1，单独地或与长五聚蛋白PTX3或 更昔洛韦联合可用于制备抑制病毒活化和/或预防或治疗病毒性疾病 的药物。

因此本发明的目的之一是有效量的胸腺素α1，单独地或与长五聚 蛋白PTX3或更昔洛韦联合在制备一种用于在哺乳类受试者中抑制病 毒疾病活化的药物中的用途；所述病毒疾病选自疱疹病毒，如巨细胞 病毒(CMV)；流感病毒，如H1N1，H3N2，H5N1或H5N7病毒；副黏液 米哥病毒，如麻疹；呼吸道合胞病毒；冠状病毒，如SARS；HIV病毒； 肝炎病毒；或轮状病毒疾病。

本发明的另一目的是有效量的胸腺素α1，单独地或与长五聚蛋白 PTX3或更昔洛韦联合在制备一种用于在哺乳类受试者中预防和/或治 疗病毒疾病的药物中的用途；所述病毒疾病选自疱疹病毒，如巨细胞 病毒(CMV)；流感病毒，如H1N1，H3N2，H5N1或H5N7病毒；副黏液 病毒，如麻疹；呼吸道合胞病毒；冠状病毒，如SARS；HIV病毒；肝 炎病毒；或轮状病毒。

本发明的另一目的是有效量的胸腺素α1，单独地或与长五聚蛋白 PTX3或更昔洛韦联合在制备一种用于治疗巨细胞病毒诱导的综合征 的药物中的用途，

其中：所述综合征为CMV单核细胞增多症；

      所述综合征与免疫受损宿主有关；

      所述免疫受损宿主患有AIDS；

      所述免疫受损宿主是器官移植受体。

本发明的另一目的是有效量的胸腺素α1，单独地或与长五聚蛋白 PTX3或更昔洛韦联合在制备一种用于治疗流感诱导的综合征的药物 中的用途，其中所述综合征是由病毒引起的，所述病毒选自H1N1， H3N2，H5N1或H5N7病毒。

下述非限制性实施例说明了本发明。

附图说明：

图1：Tα1在体内阻止MCMV感染

BALB/c(图1a)和C57BL6(图1b)小鼠分别用1×10⁵或5×10⁵PFU 的MCMV感染。感染后的不同时间(图1a)或一周后(图1b)在取出 的组织上用标准空斑试验测定MEF细胞病毒滴度，以log10(平均值 ±标准误差，SE)表示。感染当天开始施用胸腺素α1(200μg/kg给 药7或14天)和GCV(40mg/kg每周三次给药)。对照接受乱序肽 (scrambled peptide)。结果表示4个独立的实验。条状表示标准误 差。*P<0.05，经治疗的和未治疗的小鼠之间的病毒载量。

图2：Tα1提高MCMV感染中的NK细胞活性

来自MCMV感染的未治疗的(-)或用200μg/kg胸腺素α1治疗一 周的(+)BALB/c小鼠脾脏的全部的(图2a，图2b)或NK(图2c) 细胞的表型分析；无表示未感染小鼠。数字表示感染一周后FACS分析 中的阳性细胞百分比。柱状图表示4个独立实验中的一个。(图2d) 如上处理的小鼠中，细胞毒素活性(通过针对YAC-1靶标的标准51Cr- 释放试验)和由ELISPOT分析法得到的产生IFN的NK细胞频率。条状 表示标准误差。*P<0.05，感染的对未感染的小鼠；**P<0.05，胸腺素 α1治疗的对未治疗的感染小鼠。所示结果来自5个独立的实验。

图3：在pDC中，胸腺素α1促进病毒的复制，IRF7活化以及细 胞因子生成

(图3a)用MCMV感染的BALB/c小鼠的骨髓产生CD11b+DC或pDC， 用光学显微镜评估其形态并用MCMV gB转录物表达的实时PCR评估病 毒的复制(两者都在48小时)，或用抗-IRF7的免疫印迹法评估IRF7 的核表达(2小时后)。细胞在感染前于37℃下暴露于(+)或未暴 露于(-)50μg/ml胸腺素α12小时。-表示未感染细胞。所示结 果表示3个实验中的一个代表性实验。

用抗-醛缩酶(作为阴性对照)抗体的印迹法检验细胞核的分离 (Nuclear fractionation)。

箭头指示一个可诱导的条带。泳道1，未感染细胞；泳道2，MCMV 感染的；泳道3，胸腺素α1治疗的；泳道4，MCMV+胸腺素α1治疗 的。(图3b)如上处理的DC亚型的细胞因子产量(pg/ml)。条状表 示标准误差。*P<0.05，MCMV感染DC对未感染的DC中细胞因子产量； **P<0.05，胸腺素α1治疗的对未治疗的DC；(图3c)在MCMV感染 期间小鼠中的细胞因子产量；来自用MCMV感染并用胸腺素α1或GCV 治疗一周的小鼠的脾细胞的培养上清液中的细胞因子水平(pg/ml)。 *P<0.05，治疗的对未治疗的小鼠。ND，未进行。

图4：Tα1活化TLR9/MyD88-依赖途径

用5×10⁵PFU的MCMV感染并用200μg/kg Tα1治疗一周的C57BL6 型、TLR4-/-型.TLR9-/-型和MyD88-/-型小鼠的病毒载量(图4a)和 细胞因子产量(图4b)。感染和治疗后一周在取出的感染组织上用标 准空斑试验测定MEF细胞病毒滴度，以log10表示。用ELISA分析测 定脾细胞培养上清液中的细胞因子(pg/ml)水平。条状表示标准误差。 *P<0.05，Tα1治疗的对未治疗的小鼠。结果代表3个独立的实验。

图5：胸腺素α1与GCV联合是有效的。

BALB/c或C57BL6小鼠分别用10⁵或5×10⁵PFU的MCMV感染。感 染后7天在取出的肺部组织上用标准空斑试验测定MEF细胞病毒滴度， 以log10表示。感染当天开始施用Tα1(200μg/kg/日，一周)和/ 或GCV(40mg/kg，每周三次)。用ELISA分析测定脾细胞(7天)培 养上清液中的细胞因子(pg/ml)水平。条状表示标准误差。*P<0.05， 治疗的对未治疗的小鼠。结果代表3个独立的实验。

图6：Tα1与PTX3联合在鼠科巨细胞病毒感染中是有效的

近交系C57BL6和BALB/c小鼠腹膜内(i.p.)注射1×10⁵(BALB/c) 或5×10⁵(C57BL6)空斑形成单位(PFU)的MCMV。治疗后一天在取 出的组织上用标准空斑试验测定MEF细胞病毒滴度。如下进行治疗： 感染当天开始每天施用Tα1(200mg/kg/ip)和PTX3(1mg/k/ip) (SIGMA-Tau，Pomezia，Rome，Italy)，连续7天。对照接受乱序肽。 来自未感染动物的所有器官没有病毒。病毒滴度以log10(平均值± 标准误差，SE)表示。

实施例1

材料和方法

小鼠：野生型(WT)近交系C57BL6和BALB/c小鼠，8至12周龄， 购于Charles River Breeding Laboratories(Calco，Italy)。多 对纯合TLR9-(TLR9-/-)、TLR4-(TLR4-/-)和MyD88-(MyD88-/-) -缺陷小鼠(在C57BL6基础上)，在意大利佩鲁贾的佩鲁贾大学(the University of Perugia，Perugia，Italy)的繁殖实验室在特定无 病原体条件下饲养。实验是按照实验动物委员会(the institutional animal committee)批准的规程，并且依照欧共体理事会指令 (European Economic Community Council Directive)和实验动物 管理及使用指南(institutional animal care and useguidelines) 进行的。

病毒，感染和治疗：用BALB/c小鼠制备Smith株MCMV唾液腺提 取物储液，并在BALB/c小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞 (J.Gen.Virol.2002；83：2983-2993)上用标准空斑试验滴定。小 鼠腹膜内(i.p.)注射1×10⁵(BALB/c)或5×10⁵(C57BL6)空斑形 成单位(PFU)的MCMV。在不同时间在取出的组织上用标准空斑试验 测定MEF细胞病毒滴度。如下进行治疗：提供的胸腺素α1和乱序多 肽(两者都来自SciClone Pharmaceuticals，San Mateo，CA)，是 经纯化(内毒素水平<0.03pg/ml，用标准鲎溶解物测定法)消毒、冻 干、乙酰化的多肽。其序列如下： Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys- Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-O(Tα1) 和 Ac-Ala-Lys-Ser-Asp-Val-Lys-Ala-Glu-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Asp- Thr-Thr-Glu-Leu-Asp-Glu-Lys-Val-Glu-Val-Lys-Ala-Asn-Glu-OH (乱序肽)。在无菌水中重构冻干粉末，感染当天开始每天施用200 μg/kg/i.p.，连续7或14天。感染后6小时开始，每隔一天，一周 三次40mg/kg/i.p.施用更昔洛韦(GCV)(Cymevene；来自Recordati， Milan，Italy)。对照只给予乱序肽或其稀释液。

DC亚型增殖：通过在Iscove改良培养基中培养10⁶/ml的BALB/c 骨髓细胞来获得DC，该培养基包含有10％过滤的牛血清、50μM的2- 巯基乙醇、丙酮酸钠(1mM)、2mM的L-谷氨酰胺、HEPES(10mM) 和50μg/ml的庆大霉素，在150U/ml鼠rGM-CSF(Sigma)和75U/ml 的rIL-4(R&D Systems)存在的情况下培养7天以获得CD11b+DC或 在200ng/ml的FLT3-L(Immunex Corporation，Seattle，WA)存在 的情况下培养9天以获得pDC。分别向CD11b+DC或pDC添加1μg/ml 的LPS或2μg/ml的胞嘧啶硫代磷酰-鸟嘌呤-寡脱氧核苷酸(CpG-B ODN 1668)(Coley Pharmaceutical Group，Wellesley，MA)再培 养24小时以达到最后成熟(Blood 2003；102：3807-344；3814)。 根据CD11c的高表达识别CD11b+DC，其明显由CD8a+DC和CD11b+ DC组成。pDC被定义为CD11c低、Ly6C+、CD8a+/-细胞。使用高分辨 率显微镜彩色照相机AxioVision，使用AxioCam软件Rel.3.1(Carl ZeissS.p.A.，Milano，Italy)拍摄照片。

流式细胞术分析：用抗-CD16/32(2.4G2)抗体阻断FcRs后，用 装有CELLQuest TM软件的FACScan流式细胞荧光计(Becton Dickinson，Mountain View，CA)分析细胞的抗原表达。用不相关Ab 对细胞进行对照染色，以获得背景荧光值。Ab来自PharMingen。

空斑试验：在生长为亚汇合并用连续稀释的病毒样品于37℃(10) 培养2小时的细胞上进行空斑试验。未感染动物的所有器官没有病毒。 病毒滴度以log10(表示±标准误差，SE)表示。

病毒复制的抑制：用无血清的DMEM稀释的50μg/ml胸腺素α1 于37℃预先培养DC(10⁶/孔)2小时，然后加入10⁵PFU的MCMV。48 小时后测定感染性。

NK细胞细胞毒素活性：用DX5微珠(Miltenyi Biotec)从脾脏 纯化得到的NK细胞，被定义为NK1.1+CD3-细胞。在51Cr-标识的 YAC-1淋巴瘤细胞上，评估NK细胞溶解活性(Blood，2005；106： 4397-4406)。

IRF7的免疫印迹分析：DC被暴露于2至50μg/ml胸腺素α1或 10⁵PFU的MCMV(单独地或联合地)。用NE-PER细胞核和细胞质提取 试剂(Pierce，CelbioS.r.l.，Milan，Italy)制备核提取物，核提 取物的蛋白浓度用BCA-200蛋白测定试剂盒(Pierce)按照产品说明 书进行测定。通过使用兔抗-IRF7(H246)抗体和牛抗-兔-辣根过氧化 物酶(Santa Cruz Biotechnology)的蛋白质印迹分析测定IRF7在 核中的含量。用Amersham和Kodak Biomax胶片使用ECL蛋白质印迹 分析系统进行显影。

实时RT-PCR定量MCMV mRNA：一种高灵敏度的RT-PCR测定法用 于扩增来自于总细胞RNA(51)的MCMV糖蛋白B(gB)DNA的356bp 片段。cDNA的合成和PCR如所述进行操作(Blood 2003；102：3807-344 3814)。合成的DNA寡核苷酸引物选自MCMV gB基因的公开序列(17)。 该正向引物是基于编号2416-2443的cDNA：5’ -AAG-CAG-CAC-ATC-CGC-ACC-CTG-AGC-GCC-3’，而反向是基于编号 2745-2772：5’-CCA-GGC-GCT-CCC-GGC-GGC-CCG-CTC-TCG-3’。循环 条件是95℃下初始变性3分钟，接着是95℃1分钟，50℃1分钟和 72℃20秒的循环，最后72℃延伸10分钟。依照产品说明书对每个样 品的管家β-肌动蛋白基因进行PCR扩增(Applied Biosystems)以控 制样品加载和提供样品间的标准化。

ELISA和ELISPOT分析定量细胞因子：通过ELISA(R&D Systems and PBL，Biomedical Lab，Milan，Italy)测定有丝分裂原刺激的脾细 胞(用10μg/ml ConA刺激48小时)或MCMV-脉冲的DC(24小时) 培养上清液中的细胞因子水平。这些试验的检测范围(pg/ml)是：对 于IL-12p70，<16；对于IFN-，<10；对于IL-10，<3以及对于IFN-a， <10。产生IFN的NK细胞通过对纯化的NK(Virus Res.2003；98： 17-46725)的ELISPOT分析来计数。结果表示为每10⁵个细胞中产生 细胞因子的细胞的平均数(±SE)，用连续2倍稀释的细胞重复计算。

统计分析：学生t检验用于测定实验组数值的显著性(显著性定 义为P<0.05)。存活数据使用Mann-Whitney U检验分析。体内组由6 个动物组成。除非有另外说明，数据为平均值±SE。

结果

胸腺素α1阻止MCMV感染：评估了胸腺素α1给药对敏感(BALB/c) 或抗性(C57BL6)小鼠的急性初期MCMV感染的影响。小鼠用亚致死剂 量的MCMV感染，并用胸腺素α1或GCV治疗，在感染后不同周用标准 空斑试验滴定法测定脾、肺、肝和唾液腺的滴度载量。在敏感小鼠(图 1a)内脏器官中，MCMV复制达到的滴度高于抗性小鼠(图1b)，尤其 是在感染的早期阶段。胸腺素α1以200μg/kg施用7天，在敏感和 抗性小鼠中，都显著地减少了不同内脏器官中的病毒载量，而乱序肽 却不能。该效果与GCV的效果相似，且用胸腺素α1施用14天的效果 更好。抗性小鼠中，胸腺素α1的效果在唾液腺和肝中尤其明显(图 1b)。胸腺素α1也显著地减少用较高PFU(未显示数据)感染的BALB/c 小鼠中的病毒载量。这些结果说明了胸腺素α1对MCMV感染发挥了治 疗作用。

在MCMV感染中胸腺素α1恢复NK的反应性并促进细胞因子产生： Ly49H NK细胞通过不同机制在MCMV感染的控制中起关键作用，包括 CD8a+DC的相互调节(4)。评估了胸腺素α1对MCMV感染小鼠的脾脏 中的NK细胞的扩充和功能活性的影响。图2显示用胸腺素α1治疗一 周，扩充了NK1.1+NK细胞(图2b)，而没有影响CD4+或CD8+T细胞 的扩充(图2a)。如活化标记CD69(图2c)增加的表达所显示的， NK细胞被完全活化。产生IFN的细胞的频率和离体纯化的脾脏NK细 胞的细胞毒素活性，在胸腺素α1的治疗后也都显著地升高(图2d)。

胸腺素α1在pDC中促进病毒感染，IRF7活化以及细胞因子产生： 由于MCMV感染中NK细胞的早期活化由IFN-a/β和IL-12介导，其中 IFN-a/β促进NK细胞的细胞毒性和增殖，IL-12诱导IFN-产生 (Nat.Immunol.2001；2：1144-1150；An.J.Immunol.1996；156： 1138-1142)，因此评价了在胸腺素α1存在下由暴露于MCMV的DC亚 型产生的细胞因子的模式。MCMV的急性感染在敏感BALB/c小鼠中诱 导一个瞬时的，但完全的免疫抑制，这能够联系到CD11b+DC的感染 (Nat.Immunol.2001；2：1077-1084)。CD11b+DC在体外和体内都 有利于增殖性MCMV感染(Nat.Immunol.2001；2：1077-1084)，而 MCMV在pDC中不复制(J.Exp.Med.2003；197：885-898； J.Exp.Med.2002；195：517-528)。来自未感染小鼠的骨髓-衍生的 CD11b+DC或pDC亚型，直接用于评估在不同DC亚型中胸腺素α1对细 胞因子产生和病毒复制的影响。与先前的研究一致(Nat. Immunol.2001；2：1077-1084；Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 2004；101： 3516-3521)，MCMV在CD11b+DC中复制，却不在pDC中复制。有趣地 是，胸腺素α1在CD11b+DC中不影响病毒的复制，但是在pDC中居然 能促进病毒的复制(图3a)。已知HCMV诱导一个协同的细胞抗病毒 应答以产生干扰素，其包括IRF3和IRF7的暂时活化，并导致这些因 子在细胞核中的累聚。由于IRF7是pDC中抗病毒类型1的IFN产生的 主要调节子，因此用抗-IRF7抗体免疫印迹测量了暴露于病毒和/或胸 腺素α1的两种DC亚型中的核IRF7表达水平。在暴露于病毒或胸腺 素α1(单独或联合)的pDC中，注意到IRF7的易位，而在CD11b+DC 中没有(图3a)。也评价了IRF3的磷酸化作用和易位，发现IRF3在 单独地暴露于病毒或暴露于病毒与胸腺素α1的联合的CD11b+DC中被 活化，但是在pDC中未发现(未显示数据)。在细胞因子产生方面， 在病毒应答中，两种DC亚型都产生IFN-a和IL-12p70，如已公知的， 但是pDC多于CD11b+DC。然而，用胸腺素α1对pDC的预处理大大地 增加了IFN-a的产量，但是不影响IL-12p70的产量。非常有趣地是， 胸腺素α1轻微地促进由CD11b+DC产生的IFN-a(图3b)。这些数据 说明胸腺素α1促进pDC中IRF7-依赖抗病毒程序。为了使体外细胞因 子产生的模式与发生在体内的情况相联系，测量了来自用MCMV感染并 用胸腺素α1治疗过的BALB/c小鼠的脾细胞的培养上清液中的 IL-12p70、IFN-a、IFN-和IL-10产量。发现用胸腺素α1治疗显著地 增加了IFN-a和IFN-产量，尤其在感染的第一周。IL-12p70也在治疗 后略微增加，此后下降。这些效果与用GCV获得的效果相当。有趣的 是，胸腺素α1也显著地增加IL-10产量(图3c)。总之，这些数据 表明胸腺素α1在对MCMV的应答中有利于IFN-a/IFN209.-依赖的途 径的活化。

胸腺素α1活化TLR9/MyD88依赖的途径：有效的抗MCMV免疫监 视需要功能性TLR信号，尤其TLR9/MyD88信号途径对IRF7依赖的抗 病毒程序(27)和快速MCMV清除起决定性作用，但是TLR2、TLR3和 TLR4似乎没有起到显著作用(J.Immunol.2005；175：6723-6732)。 为了评估TLR在胸腺素α1对感染的影响中的作用，用MCMV感染TLR- 缺陷型小鼠，用胸腺素α1治疗，接着病毒复制。与公开的数据一致 (J.Immunol.2005；175：6723-6732)，TLR9-/-，尤其是MyD88-/- 小鼠比C57BL6小鼠更易感染MCMV，TLR4缺陷并没有显著影响小鼠的 抵抗力(图4a)。胸腺素α1在C57BL6和TLR4-/-小鼠中是有效的， 但在TLR9-/-和MyD88-/-小鼠中完全无效，该结果显示了TLR9/MyD88 依赖的信号参与胸腺素α1的抗病毒活化。再次表明，胸腺素α1的功 效直接与IFN-α产生有关，且比与IL-12p70和IFN的关联大，其水 平在来自于C57BL6和TLR4-/-小鼠的脾细胞的上清液中显著地增加， 而在TLR9-/-或MyD88-/-小鼠中却没有(图4b)。

实施例2

胸腺素α1与GCV联合是有协同作用的。

使用实施例1描述的方法，评估了胸腺素α1与GCV联合是否起 作用。为了这个目的，敏感或抗性小鼠用MCMV感染，同时用GCV和/ 或胸腺素α1治疗一周，并评估了病毒滴度和细胞因子产生的模式。 获得的初步结果显示这种联合在减少任一类型小鼠肺中的病毒滴度方 面是有协同作用的，且能促进IFN-和IFN-.T的产生。

实施例3

胸腺素α1与PTX3联合是有协同作用的：

使用实施例1描述的方法，评估了胸腺素α1与PTX3联合是否起 作用。

为了这个目的，敏感(BALB/c)或抗性(C57BL6)小鼠用MCMV 感染，同时用PTX3和/或胸腺素α1治疗一周，评估了肺中病毒滴度。 结果(图6)证实任一药剂单独减少任一类型小鼠肺中的病毒滴度。 而且，在敏感或抗性小鼠中，活性成分的联合在限制病毒复制方面和 IFN-a和IFN-g，IL-12p70和IFN-g的产生方面，令人惊讶地显示出 未预料到的协同作用。

本发明欲提供一种给待治疗病毒性疾病(或抑制病毒活化)的患 者配药或为配药使用的治疗包，该治疗包含有一个或多个单元剂量， 每个单元剂量包含一定量的胸腺素α1，以及任选地一定量的长五聚蛋 白PTX3或更昔洛韦，使得周期性施用一个或多个所述单元剂量对治疗 如HCMV是有效的；以及一个完整的药用容器，所述容器还含有或包含 标签，所述标签说明胸腺素α1，以及任选地长五聚蛋白PTX3或更昔 洛韦用于治疗例如HCMV患者。

另外，本发明欲提供一个制造的产品，其包含包装材料和包含于 所述包装材料中的胸腺素α1，以及任选地长五聚蛋白PTX3或更昔洛 韦，其中，长五聚蛋白PTX3对于治疗HCMV上是治疗有效的，其中包 装材料包含有标签，所述标签说明了长五聚蛋白PTX3可用于治疗 HCMV。

根据本发明，胸腺素α1和任选地长五聚蛋白PTX3或更昔洛韦， 可以分开的形式或整体剂型施用，所述整体剂型包含活性成分和任选 地药学上可接受的稀释剂或赋形剂。

根据本发明，当胸腺素α1和长五聚蛋白PTX3或更昔洛韦以分开 的形式施用时(也就是2次不同的给药)，所述活性成分可以连续给 药(即在同一时刻)或按照上述标签中的建议表依次给药。

根据本发明的用法，术语“治疗”或“治疗”具有它们通常的意 思，包括预防、阻止、减轻、抑制、改善、停止、限制、减慢或逆转 病毒疾病严重性的发展、活化或复发。

根据本发明记载的用法，术语“有效量”是指一定量的能达到预 期结果的化合物。例如，为治疗病毒性疾病施用的有效量的胸腺素α1， 以及任选地长五聚蛋白PTX3或更昔洛韦，是为预防、阻止、减轻、改 善、停止、限制、减慢或逆转所述病毒性疾病严重性的发展或复发所 需要的量，每日施用剂量根据受试者体重、年龄和患者的总体状况， 由主治医师进行判断。

本发明也包括使用药学制剂的方法，其包含，作为活性成分的胸 腺素α1，以及任选地长五聚蛋白PTX3或更昔洛韦，与药物载体结合。 技术人员应该知道这些制剂和它们的制造，参见，例如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，(16th ed.1980)。

这些制剂优选以活性成分的单元剂型配制。术语“单元剂型”是 指对人类对象而言适合作为整体剂型的物理分离单元，每个单元包含 预定量的胸腺素α1，以及任选地长五聚蛋白PTX3或更昔洛韦，与适 合的药物赋形剂结合，预计产生想要的治疗效果。

胸腺素α1，以及任选地长五聚蛋白PTX3或更昔洛韦，能够以与 药学上可接受的载体或赋形剂结合的药物组合物形式施用，其比例和 性能由所选载体和/或赋形剂中化合物的溶解度和化学性质、所选择的 用药途径和标准药学实践决定。

药物组合物用制药领域中众所周知的方法制备，参见，例如， REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，(16th ed.1980)。

载体或赋形剂可以是固态、半固态或液态材料，其能作为活性成 分的载体或介质来使用。适合的载体或赋形剂在本技术领域中是公知 的。药物组合物可适用于口服、吸入、注射或局部使用，可以以片剂、 胶囊、气雾剂、吸入剂、栓剂、溶液、悬浮液、脂质体等形式施用于 患者。