鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌的引物序列及其方法

摘要

本发明公开了一种鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌的引物序列及其方法，包括两组引物，第一组引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO：1所述的碱基序列，第一组引物的反向引物具有序列表中SEQ ID NO：2所述的碱基序列；第二组引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO：3所述的碱基序列，第二组引物的反向引物具有序列表中SEQ ID NO：4所述的碱基序列。本发明引物序列特异性高，能够用于快速鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌的引物序列及其方法。

背景技术

赤霉病是小麦生产上重要的一种流行性病害。该病害主要分布在长江中下游冬麦区和东北春麦区，长江上游和华南冬麦区也常发生。该病害发生后一般减产10-20％，严重时达80-90％。它的危害严重影响小麦的产量和质量，同时病菌产生的一系列真菌毒素可引起人畜中毒。

在我国，亚洲镰孢菌(Fusarium asiaticum)和禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)是小麦赤霉病的主要致病菌。亚洲镰孢菌主要分布在我国南方地区，而禾谷镰孢菌主要分布在北方地区。这两个小种非常相近，根据多个基因序列差异对亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌的鉴定较麻烦，利用已报道引物对GzTri7/f1和GzTri7/r1进行PCR扩增(Zhang et al.，2007，M ycological Research，967-975)，不能给出扩增产物或得到161-bp产物为亚洲镰孢菌，得到172～326-bp产物为禾谷镰孢菌，该对引物无法区分亚洲镰孢菌和其它病菌真菌。因此，需要重新建立一套新的体系，即能快速检测，又能准确鉴定这两个不同的小种。该体系的建立将对两个小种的快速检测、分布研究及小麦赤霉病的防治具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌的引物序列，该引物特异性高，利用该引物序列能快速、准确地鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌。

一种鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌的引物序列，包括两组引物，第一组引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO：1所述的碱基序列，第一组引物的反向引物具有序列表中SEQ ID NO：2所述的碱基序列；第二组引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO：3所述的碱基序列，第二组引物的反向引物具有序列表中SEQ ID NO：4所述的碱基序列。

已有研究可知，亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌在遗传背景上存在较大差异，通过对3个亚洲镰孢菌菌株(Fa1，Fa2，Fa3)和3个禾谷镰孢菌菌株(Fg1，Fg2，Fg3)的cyp51A基因测序发现，如图1所示，亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌的菌株间共存在69处核苷酸差异，其中16个核苷酸引起氨基酸变化。

根据两个菌系cyp51A基因序列的差异，我们设计了上述两组引物。第一组引物的正向引物3’末端碱基T与亚洲镰孢菌菌株的特异碱基T配对，第一组引物的反向引物3’末端碱基G和倒数第二个碱基T分别与亚洲镰孢菌菌株特异碱基CA配对。同理，第二组引物的正向引物3’末端碱基T与禾谷镰孢菌(菌株的特异碱基T配对，第二组引物的反向引物3’末端碱基A和倒数第二个碱基C分别与禾谷镰孢菌菌株特异碱基TG配对。

利用第一组引物对亚洲镰孢菌菌株的DNA进行扩增可以得到292-bp的片断，利用第二组引物对禾谷镰孢菌菌株的DNA进行扩增可以得到352-bp的片断，利用任何一组引物对其它真菌的DNA进行扩增，不能扩增出任何产物。

本发明还提供一种应用上述引物鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌的方法，包括以下步骤：

a、提取待检测菌的DNA；

b、以待检测菌的DNA为模板，使用第一组引物和第二组引物进行PCR扩增；

c、PCR产物经凝胶电泳后用EB进行显色，当凝胶上显现292-bp DNA条带时，说明待检测菌为亚洲镰孢菌。当凝胶上显现352-bp DNA条带时，说明待检测菌为禾谷镰孢菌。当凝胶上未显现条带时，则说明待检测菌为其它病菌真菌。

本发明提供的两组引物和方法能快速鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌，检测引物具有很高特异性，且整个PCR和电泳过程仅需2h。因此，本发明的引物和检测方法可用来快速、准确、全面检测引起小麦赤霉病的主要病原菌。

附图说明

图1为本发明引物的序列图；

图2为引物特异性检测中各菌株DNA扩增后的凝胶电泳图；

图3为检测不同地方子囊壳DNA扩增后的凝胶电泳图。

具体实施方式

所选用的菌株

尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、燕麦镰孢菌(F.avenaceum)、锐顶镰孢菌(F.acuminatum)、半裸镰孢菌(F.semitectum)、串珠镰孢菌(F.subglutinans)、黄色镰孢菌(F.culmorum)以及5个亚洲镰孢菌(Fusariumasiaticum)菌株(Fa1，Fa2，Fa3，Fa4，Fa5)和5个禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)菌株(Fg1，Fg2，Fg3，Fg4，Fg5)。

上述菌株均为常见的植物病原真菌，是本发明所需的试验材料，对菌株没有特异性要求，可以通过常规的分离纯化方法得到。

提取DNA

用接种针从PDA平板上刮取菌丝(100mg)，置于1.5-mL Eppendorf管中，加500μL DNA提取裂解液(200mM Tris-HCl，50mM EDTA，20mMNaCl，1％SDS，pH 8.0)，用电钻驱动玻棒充分研磨，振荡混匀，室温静置10min；13200r/min4℃，离心5min；取上清液约400μL于新的1.5-mLEppendorf管中，加750μL无水乙醇，混和混匀，13200r/min 4℃，离心5min，弃上清；沉淀用70％乙醇洗涤，室温放置干燥5-10min，溶于30μL无菌水中，-20℃保存备用。

上述的6种真菌以及待检测的亚洲镰孢菌菌株和禾谷镰孢菌菌株的DNA均采用上述方法提取。

引物合成

如图1所示，根据3个亚洲镰孢菌菌株和3个禾谷镰孢菌菌株中cyp51A基因序列，设计了2对引物Fa-F/Fa-R和Fg-F/Fg-R。

上述引物的具体序列以及与序列表中序列对应关系如下表所示：

 

引物名称    序列序列表中        的序列号Fa-F5’-CAGCTTCCTCGAAGACCT-3’SEQ ID NO.1Fa-R5’-GGACCGTAAATTTCTTCAGTG3’SEQ ID NO.2Fg-F5’-TATCCCTTATGGGTCTTGGT-3’SEQ ID NO.3Fg-R5’-GGACCGTAAACTTCTTCTGCA-3’SEQ ID NO.4

上述序列可以通过常规方法合成，也可以委托专业生物试剂公司合成，本发明的引物由上海博彩合成。

引物特异性验证

以上述提取的8种真菌的DNA为模板，用Fa-F/Fa-R和Fa-F/Fa-R两组引物进行PCR反应，每次反应均包含一个阴性对照(用无菌水代替DNA模板)。

25μL反应体系：1μL DNA模板(约0.4ng)，引物各0.2μmol 1^-1，dNTP 0.2μmol 1^-1，MgCl₂ 2mmol 1^-1，1×缓冲液(北京东胜公司生产)，聚合酶1.5U个单位，双蒸水补足至25μL。

反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用1.5％的琼脂糖在1×TAE缓冲液中电泳后，用EB显色拍照。

如图3所示，5个禾谷镰孢菌菌株(Fg1，Fg2，Fg3，Fg4，Fg5)均能扩增到352-bp的条带，5个亚洲镰孢菌菌株(Fa1，Fa2，Fa3，Fa4，Fa5)均能扩增到292-bp的条带，其它病原真菌都没有扩增到任何条带。由此可见，上述两组引物的特异性很高，适合鉴定亚洲镰孢菌菌株和禾谷镰孢菌。

检测不同地区亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌的分布

从江苏省海安市A(大公镇)、江苏省海安市B(海安镇)、江苏省靖江市和河南省漯河市的小麦地中收集子囊壳(每块地约100mg)。将子囊壳置于1.5-mL Eppendorf管中，加入100μl DNA提取缓冲液(1-2％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，200mM Tris-HCl，50mM EDTA，200mM NaCl，1％ SDS和ddH₂O，pH8.0)，用尖头玻棒安装在常用的电工手电转上研磨1min，再向离心管中加入400μl的提取缓冲液蜗旋混匀后，室温静置10min；将上述混合液4℃，15，000rpm条件下离心5min，再将上清液转移到另一离心管中，然后加入750μl无水乙醇，混匀后4℃，15,000rpm条件下离心2min，弃上清；将沉淀的DNA用70％乙醇洗涤，室温干燥后溶于50μl无菌水，即为提取的DNA；将上述的DNA溶液用UNIQ-10柱式PCR产物回收试剂盒(上海生工生产)过柱纯化。

利用Fa-F/Fa-R和Fa-F/Fa-R两组引物对上述田间样品提取的DNA进行PCR扩增，反应设阴性对照，PCR反应体系同上所述。如图3所示，江苏海安市大公镇和海安镇及江苏靖江市的子囊壳DNA经PCR扩增后得到292-bp片段，说明这三个地方只存在小种亚洲镰孢菌，河南省漯河市子囊壳DNA经PCR扩增后得到352-bp和292-bp两种片段，说明该地区同时存在亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌两个小种。

SEQUENCELISTING

<110>浙江大学

<120>鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌的引物序列及其方法

<130>

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<170>PatentIn version 3.3

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<212>DNA

<213>亚洲镰孢菌(Fusarium asiaticum)

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<213>亚洲镰孢菌(Fusarium asiaticum)

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