运用实时荧光PCR技术鉴定剪股颖粒线虫的方法

摘要

本发明公开了一种运用实时荧光PCR技术鉴定剪股颖粒线虫(Anguina agrostis)的方法，利用剪股颖粒线虫特异性DNA序列，用生物信息学方法设计特异性引物和特异性探针，探针的5'端标记报告荧光基团，3'端标记淬灭荧光基团，应用荧光PCR法扩增剪股颖粒线虫靶基因，通过探针在反应过程中荧光信号的变化鉴定样品中是否含有剪股颖粒线虫。本发明不受虫龄和虫体数量的影响，较形态学和形态测量学鉴定方法更为快速、准确；操作简单，可标准化，解决了快速鉴定剪股颖粒线虫的标准方法的问题，大大节约了检测时间，加快了口岸草种的验放速度，促进了进出口贸易，节约了货物因长期在货场存放而产生的费用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物学鉴定技术，具体地说涉及一种线虫分子生物学鉴定技术，即运用实时荧光PCR反应来鉴定粒线虫，特别是剪股颖粒线虫的技术。

背景技术

剪股颖粒线虫(Anguinaagrostis)，是垫刃目(Tylenchida)、垫刃亚目(Tylenchina)、垫刃总科(Tylenchoidea)、粒线虫科(Anguinidae)、粒线虫属(Anguina)中一种重要的植物线虫，是牧草上重要的有害生物。其寄主植物主要包括剪股颖属(Agrostisspp.)、拂子茅属(Calamagrostis spp.)、苔草属(Carex spp.)、鸭茅属(Dactylis spp.)、画眉草属(Eragrostis spp.)、羊茅属(Festuca spp.)、大麦属(Hordeum spp.)、黑麦草属(Lolium spp.)、梯牧草属(Phleum spp.)、早熟禾属(Poa spp.)、碱茅属(Puccinelliaspp.)、鼠尾粟属(Sporobolus spp.)、三毛草属(Trisetum spp.)等，主要为害寄主植物的花序，致使病株的种子和地上部产量下降。特别是在广泛种植剪股颖等牧草的地区，对生产构成严重的威胁。此外，剪股颖粒线虫还是拉氏杆菌的介体，它们协同作用在寄主颖果上形成的黄色虫瘿对动物有高度毒性，可导致牛、马、羊等动物的神经紊乱，动物误食后中毒，甚至晕倒，最后抽搐死亡。

剪股颖粒线虫经我国专家进行风险分析后认为是危害十分严重的线虫，被列为中国进境植物检疫性线虫。1997年国家动植物检疫局发布了《关于对剪股颖粒线虫实施检疫措施的通知》，要求我国各进出境口岸加强对进境植物种子的审批和检疫。此后，我国深圳、广州、天津等口岸多次从进境草籽中截获剪股颖粒线虫，对整批货物进行了退货处理，引起了国内外贸易商及检验检疫部门的高度关注。美国等国家的动植物检疫部门要求出口商避免将含有剪股颖粒线虫的草籽输往中国。

鉴定剪股颖粒线虫是我国出入境检验检疫的一项重要工作，但是目前我国尚没有剪股颖粒线虫鉴定的标准方法，传统的形态学和形态测量学鉴定方法是主要基于线虫成虫的形态学特征和形体测量数据，鉴定时间较长；且只有发现成虫时，并结合寄主植物、分布区域等因素才能准确鉴定，但是日常口岸进出口草籽检疫中通常只能发现剪股颖粒线虫的幼虫，因此准确鉴定剪股颖粒线虫非常困难。国内研究的PCR扩增测序法以及本实验室研究的PCR-RFLP法、多重PCR法，虽然也可以准确鉴定剪股颖粒线虫，但是上述两种方法都要有PCR扩增、凝胶电泳和凝胶成像过程，程序复杂，鉴定时间较长。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，为解决快速鉴定剪股颖粒线虫的标准方法的问题而提供了一种运用实时荧光PCR技术鉴定剪股颖粒线虫的方法。

本发明的技术方案是提供一种运用实时荧光PCR技术鉴定剪股颖粒线虫的方法，包括以下步骤：

(1)设计并合成TaqMan探针序列，制备标准品质粒；

(2)制备待测样品的DNA模板；

(3)对待测样品DNA模板进行荧光PCR检测；

(4)对标准品质粒进行荧光PCR检测，与步骤(3)结果进行阳性对照，得到检测结果。

步骤(1)所述设计并合成TaqMan探针序列包括以下步骤：

A、制备标准品的DNA模板；

B、进行PCR扩增，回收扩增产物，测序，根据扩增后基因序列和引物序列设计并合成TaqMan探针。

步骤B所述PCR扩增条件为：(1)94℃，3分钟；(2)30个循环，其中每个循环包括94℃ 30秒、56℃ 30秒和72℃ 30秒三个步骤；(3)72℃ 5分钟。

步骤B所述扩增后基因序列如SEQ ID NO：1所示，即

gtttgcctac cggttgttta cggccgtctt atcatgtctt ggctattgtagacgtatctg atggctgttt tcacaccgac tgcatgtgg

步骤B所述引物序列为：

引物序列一5’-CCACATGCAGTCGGTGTGAA-3；

引物序列二5’-GTTTGCCTACCGGTTGTTTACG-3’。

步骤B所述探针序列为：

5’FAM-TCATGTCTTGGCTATTGTAGACGTATCTGA-TAMRA3’。

步骤(3)或步骤(4)所述PCR检测的PCR反应体系中各组分构成比例如下：

成分              浓度                  加样量

DNA样品                                 1μL；

PCR buffer        10倍                  1μL；

MgCl2             25mM                  0.5μL；

dNTP              10mM                  0.2μL；

引物序列一         20μmol/L               0.2μL；

引物序列二        20μmol/L               0.2μL；

探针序列          20μmol/L               0.1μL；

Taq酶             5U/μl                  0.1μL；

双蒸水                                   6.7μL；

总体积                                   10μL；

其中DNA样品为标准品质粒或待测样品的DNA模板。

步骤(3)或步骤(4)所述PCR检测扩增程序为：

(1)94℃   3分钟；

(2)94℃   10秒；

(3)60℃   30秒；

(4)回到程序(2)，重复45次。

运用实时探针荧光PCR技术(TaqMan探针法)鉴定剪股颖粒线虫包括：使用该方法鉴定剪股颖粒线虫所使用的引物、探针及扩增的产物序列以及与之配套的荧光PCR反应体系和荧光PCR扩增条件。

在本发明中，步骤(1)设计出剪股颖粒线虫特异性的两条引物序列和一条探针序列以及与之配套的荧光PCR反应条件后，以后在使用过程中通过探针在反应过程中荧光信号的变化鉴定样品中是否含有剪股颖粒线虫即可，不必再每次检测时重复PCR扩增、凝胶电泳和凝胶成像过程。

与现有技术相比，本发明的技术优势在于能够提高检测的速度和灵敏度以及特异性，其有益效果是：(1)提供了一种快速实时的剪股颖粒线虫检测方法，填补了通过实时荧光PCR技术鉴定剪股颖粒线虫的空白，具备建立相关检测标准化技术基础；(2)本发明的实施可以加快口岸检验检疫机关对进出口草籽的检疫速度，加快口岸验放速度，减少货物在货存场存放的时间和费用；可以提高我口岸检验检疫机关的检测水平，提高我检验检疫机关在国际贸易中的地位和形象；可以促进国外商人和检疫机关加强对华输出草籽的线虫检疫工作，避免将含有剪股颖粒线虫的草籽进入中国。

附图说明

图1 美国俄勒冈州进口的剪股颖草籽(Bent grass)中截获的虫瘿

图2 本实验室保留的20世纪70年代小麦粒线虫(Anguina tritici)虫瘿

图3 2001年5月20日从南非进口的画眉草籽中截获的虫瘿

图4 扩增曲线图

图5 扩增曲线图

具体实施方式

(1)设计并合成TaqMan探针序列，制备标准品质粒

线虫材料  剪股颖粒线虫(Anguina agrostis)来自2000年12月从美国俄勒冈州进口的剪股颖草籽(Bent grass)中截获的虫瘿，虫瘿成雪茄状，黑褐色，大小约是正常种子的2倍，见附图1，该批虫瘿经水浸泡分离到大量活体幼虫；小麦粒线虫(Anguina tritici)来自20世纪70年代本实验室保留的虫瘿，虫瘿比健康小麦粒短而粗，近球形，最初油绿色，后期变为黄褐色至黑褐色，顶部有小钩，见附图2；切开虫瘿，内含白色丝状物的线虫。维氏粒线虫(Anguinawevelli)来自2001年5月20日从南非进口的画眉草籽中截获的虫瘿。虫瘿成橄榄状，黑褐色，大小约是正常种子的2倍，见附图3，该批虫瘿经水浸泡分离到大量活体幼虫；马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)为本实验室保留的活虫样品；河北廊坊甘薯茎线虫(Ditylenchus sp.)从河北省廊坊地区病薯中分离出的茎线虫。

实验方法：用挑针从剪股颖粒线虫样品中逐一挑取活体幼虫若干条，放入去离子水中洗涤3次，备用。在洁净的载玻片上加2μl去离子水，挑入一条经过洗涤的线虫，用解剖刀将线虫切成3段，吸入200μl的Eppendorf管中，再用6μl去离子水洗涤解剖刀和载玻片后，将洗涤的水吸入同一个Eppendorf管中；加入1.0μl 10倍PCR缓冲液、1.0μl蛋白酶K后放入超低温冰箱中—70℃低温冷冻20min。将冷冻后的线虫取出，迅速放入PCR仪或水浴锅中，65℃条件下保温1～2hr，接着将Eppendorf管置于PCR仪或水浴锅中，95℃条件下保温10min，使蛋白酶K失去活性。制成10μl的DNA模板。

采用50μl的PCR反应体系，该体系中包括：8μl DNA模板，5μl 10倍PCR缓冲液；4μl 25mmol/L MgCl2；2μl 2.5mmol/LdNTP；1μl引物序列1，浓度为20pmol/μl；1μl引物序列2，浓度为20pmol/μl；0.4μl Taq酶，5U/μl；28.6μl去离子水。使用型号为PTC-200的DNA Engine进行扩增。PCR反应条件为：(1)94℃ 3分钟；(2)共30个循环，其中每个循环包括94℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 30秒三个步骤；(3)72℃ 5分钟。该PCR反应产物经电泳检测可见得到唯一的DNA条带。将获得的PCR产物回收，测序验证，证明得到的产物是特异性产物。

根据基因序列、引物，并兼顾特异性要求，设计并合成TaqMan探针序列如下：5’-TCATGTCTTGGCTATTGTAGACGTATCTGA-3’，该探针5’端标记FAM荧光报告基团，3’端连接TAMRA淬灭荧光基团。

同时将获得的PCR产物回收构建标准品质粒。

(2)制备待测样品的DNA模板；

取待测样品中的虫体，用挑针从样品中逐一挑取活体幼虫若干条，放入去离子水中洗涤3次，备用。在洁净的载玻片上加2μl去离子水，挑入一条经过洗涤的线虫，用解剖刀将线虫切成3段，吸入200μl的Eppendorf管中，再用6μl去离子水洗涤解剖刀和载玻片后，将洗涤水吸入同一个Eppendorf管中；加入1.0μl 10倍PCR缓冲液、1.0μl蛋白酶K后放入超低温冰箱中—70℃低温冷冻20min。将冷冻后的线虫取出，迅速放入PCR仪或水浴锅中，65℃条件下保温1～2hr，接着将Eppendorf管置于PCR仪或水浴锅中，95℃条件下保温10min，使蛋白酶K失去活性。制成10μl的DNA模板。

(3)对待测样品DNA模板进行荧光PCR检测；

对样品DNA模板进行荧光PCR检测，PCR反应体系中各组分构成比例如下：

成分               浓度              加样量

DNA样品                              1μL

PCR buffer         10倍              1μL

MgCl2              25mM              0.5μL

dNTP               10mM              0.2μL

引物序列一          20μmol/L          0.2μL

引物序列二         20μmol/L           0.2μL

TaqMan探针序列     20μmol/L           0.1μL

Taq酶              5U/μl              0.1μL

双蒸水                                6.7μL

总体积                                10μL

与之配套的荧光PCR扩增程序为

(1)94℃   3分钟；

(2)94℃   10秒；

(3)60℃   30秒；

(4)回到程序(2)，重复45次

然后进行对标准品质粒进行荧光PCR检测，与步骤(3)结果进行阳性对照，得到检测结果。

下面结合具体实施例来进一步说明本发明。

实施例1

取某待测样品中的虫体，用挑针从样品中逐一挑取活体幼虫若干条，放入去离子水中洗涤3次，备用。在洁净的载玻片上加2μl去离子水，挑入一条经过洗涤的线虫，用解剖刀将线虫切成3段，吸入200μl的Eppendorf管中，再用6μl去离子水洗涤解剖刀和载玻片后，将水吸入同一个Eppendorf管中；加入1.0μl 10倍PCR缓冲液、1.0μl蛋白酶K后放入超低温冰箱中—70℃低温冷冻20min。将冷冻后的线虫取出，迅速放入PCR仪或水浴锅中，65℃条件下保温1～2hr，接着将Eppendorf管置于PCR仪或水浴锅中，95℃条件下保温10min，使蛋白酶K失去活性。制成10μl的DNA模板。

对样品DNA模板进行荧光PCR检测，PCR反应体系中各组分构成比例如下：

成分             浓度             加样量

DNA样品                            1μL

PCR buffer       10倍             1μL

MgCl2            25mM             0.5μL

dNTP             10mM             0.2μL

引物序列一       20μmol/L          0.2μL

引物序列二       20μmol/L          0.2μL

TaqMan探针序列   20μmol/L          0.1μL

Taq酶5U/μl                         0.1μL

双蒸水                             6.7μL

总体积                     10μL。

与之配套的荧光PCR扩增程序为：

(1)94℃   3分

(2)94℃   10秒

(3)60℃   30秒

(4)回到第2步，重复45次。

同样的将1μL报告质粒即标准品质粒也进行荧光PCR检测，以证明检测的有效性。检测质粒所使用的PCR反应体系中各组分构成比例如下：

成分                浓度               加样量

报告质粒                               1μL

PCR buffer          10倍               1μL

MgCl2               25mM               0.5μL

dNTP                10mM               0.2μL

引物序列一           20μmol/L           0.2μL

引物序列二          20μmol/L           0.2μL

TaqMan探针序列      20μmol/L           0.1μL

Taq酶               5U/μl              0.1μL

双蒸水                                 6.7μL

总体积                                 10μL。

与之配套的荧光PCR扩增程序和本实施例中待测样品检测的程序相同。

检测结果为：样品扩增结果经仪器自动分析，可以发现明显的扩增曲线，如图4中曲线1所示，图4中横坐标为cycle Number，纵坐标为Fluorescence(F1)。检测结果表明该样品中含有剪股颖粒线虫。报告质粒扩增结果经仪器自动分析，可以发现明显的扩增曲线，如图4中曲线1p所示。检测结果表明这次检测的阳性参照是有效的。

同时使用常规的形态方法和PCR方法进行检测，三天后得到结果证明样品中的线虫为剪股颖粒线虫。

实施例2

取某待测样品中的虫体，虫体DNA模板制备方法同实施例1。

对样品DNA模板进行荧光PCR检测，其PCR反应体系中各组分构成比例和荧光PCR扩增程序同实施例1。同样的将1μL报告质粒也进行荧光PCR检测，以证明检测的有效性。检测质粒所使用的PCR反应体系中各组分构成比例和PCR扩增程序和本实施中样品检测的程序同实施例1。

检测结果为样品扩增结果经仪器自动分析，可以发现明显的扩增曲线，如图4中曲线2所示。检测结果表明该样品中含有剪股颖粒线虫。报告质粒扩增结果经仪器自动分析，可以发现明显的扩增曲线，如图4中曲线2p所示。检测结果表明这次检测的阳性参照是有效的。

同时使用常规的形态方法和PCR方法进行检测，三天后得到结果证明样品中的线虫为剪股颖粒线虫。

实施例3

取某待测样品中的虫体，虫体DNA模板制备方法同实施例1。

对样品DNA模板进行荧光PCR检测，其PCR反应体系中各组分构成比例和荧光PCR扩增程序同实施例1。同样的将1μL报告质粒也进行荧光PCR检测，以证明检测的有效性。检测质粒所使用的PCR反应体系中各组分构成比例和PCR扩增程序和本实施中样品检测的程序同实施例1。

检测结果为样品扩增结果经仪器自动分析，未发现扩增曲线。检测结果表明该样品中不含有剪股颖粒线虫。报告质粒扩增结果经仪器自动分析，可以发现明显的扩增曲线，如图5中曲线1所示，图5中横坐标为cycle Number，纵坐标为Fluorescence(F1)。检测结果表明这次检测的阳性参照是有效的。

同时使用常规的形态方法和PCR方法进行检测，三天后得到结果证明样品中不含有剪股颖粒线虫，其虫体为马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)。

实施例4

取某待测样品中的虫体，虫体DNA模板制备方法同实施例1。

对样品DNA模板进行荧光PCR检测，其PCR反应体系中各组分构成比例和荧光PCR扩增程序同实施例1。同样的将1μL报告质粒也进行荧光PCR检测，以证明检测的有效性。检测质粒所使用的PCR反应体系中各组分构成比例和PCR扩增程序和本实施中样品检测的程序同实施例1。

检测结果为样品扩增结果经仪器自动分析，未发现扩增曲线。检测结果表明该样品中不含有剪股颖粒线虫。报告质粒扩增结果经仪器自动分析，可以发现明显的扩增曲线，如图5中曲线2所示。检测结果表明这次检测的阳性参照是有效的。

同时使用常规的形态方法和PCR方法进行检测，三天后得到结果证明样品中不含有剪股颖粒线虫，其虫体为小麦粒线虫(Anguinatritici)。

根据上述实施例证明，本发明所描述的实时荧光PCR检测剪股颖粒线虫的方法具有特异性，能够从样品中快速准确的检测剪股颖粒线虫。

SEQUENCE LISTING

<110>华南农业大学：天津出入境检验检疫局动植食分中心

<120>运用实时荧光PCR技术鉴定剪股颖粒线虫的方法

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>89

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1