动脉硬化预防剂、血管内膜增厚抑制剂以及血管内皮功能改善剂

摘要

本发明提供具有可改善血管内皮相关功能、预防与血管内皮功能相关的各种疾病、或者具有抑制血管内膜增厚的作用、有望具有动脉硬化预防等作用、安全性优异、具有改善血管内皮功能和抑制血管内膜增厚的至少一种作用的药剂；以及动脉硬化预防剂。本发明的药剂含有(a)Xaa Pro Pro、或(b)含Xaa Pro Pro的动物乳酪蛋白的水解物或其浓缩物、或(c)通过属于瑞士乳杆菌种的菌株使含有乳蛋白质的原料发酵得到的含Ile Pro Pro和/或Val Pro Pro的发酵物作为有效成分。

说明书

技术领域

本发明涉及显示抑制血管内膜增厚作用或改善血管内皮功能作用、有望具有抗动脉硬化作用的动脉硬化预防剂，血管内膜增厚抑制剂、血管内皮功能改善剂以及显示上述作用的功能性食品。

背景技术

心肌梗死或脑梗塞等动脉硬化性疾病与癌并列显示出占有了日本人疾病死因的最大比例。动脉硬化的危险因子有：高血脂、高血压、糖尿病、吸烟、肥胖、高尿酸血症、衰老、应激等，上述危险因子互相相关，引起血管病变。因此，即使单个的危险因子的程度是轻度，它们的重叠，则危险度相加性、协同性增加。

以往，人们发现了很多发酵乳、乳酸菌或乳的酶解物的生理功能。例如专利文献1和2中记载了降低胆固醇的作用，专利文献3和非专利文献1中记载了降血压作用，专利文献4中记载了抗应激作用，并且专利文献5中记载：将动物乳酪蛋白水解至平均链长按照氨基酸残基数为2.1以下而得到的含有游离氨基酸和肽的酪蛋白水解物，其具有血管紧张素I转换酶抑制活性或降血压作用。即，这些文献中记载了关于使动脉硬化的各种危险因子降低的认识。

一方面，只使上述之一的危险因子的作用降低，并不至于预防动脉硬化的发病。例如非专利文献2或3中记载：血液中胆固醇浓度与动脉硬化发病并不相关；非专利文献4中记载：即使抑制高血压状态，动脉硬化程度也未见变化；非专利文献5中记载：即使给予血管紧张素I转换酶抑制剂(依那普利)，也未见动脉硬化抑制作用。

因此，上述专利文献5记载的特定的酪蛋白水解物即使可以认识到可降低动脉硬化的个别危险因子，由此也无法证明该特定的水解物具有抗动脉硬化作用。

动脉主要由外膜、和进行血管的扩张、收缩的具有平滑肌层的中膜、以及与血液直接接触且具有可对上述中膜的平滑肌层发出指令的内皮细胞层的内膜构成。近年来了解到，该内膜的内皮细胞掌管血液的纤溶和凝固、血管的扩张和收缩、炎症的抑制和发展、血管的增生和萎缩等血管功能相关的各种指令，可以认为该内皮功能与以动脉硬化为代表的各种疾病有关。因此，通过改善血管内皮功能，有望预防动脉硬化等。

动脉硬化是动脉壁增厚、失去弹性的病态，其中，粥样动脉硬化是以动脉的内膜下的斑点状增厚(粥样)为特征的、显示使血流减少或中途断绝的症状的动脉硬化。近年来，上述症状的主要原因有：血管内皮细胞的损伤或功能降低。

因此，通过抑制血管内膜的增厚，有望获得粥样动脉硬化发病的缓和、预防作用。

对于人类，以无创性条件对上述血管内皮功能进行诊断测定的方法例如如非专利文献6所示，已知有体积描记法。该体积描记法是利用将动脉的血流暂时阻断时内皮细胞所产生和释放的血管扩张物质的量增加、血流量暂时性增加，由血管扩张性测定内皮细胞功能的方法，如果内皮细胞功能受损伤，则血管扩张物质的释放量降低，因此血流量也降低。

专利文献1：日本特开2003-306436号公报

专利文献2：日本特开2002-65203号公报

专利文献3：日本特开2005-52090号公报

专利文献4：日本特开平10-45610号公报

专利文献5：国际公开2005-102542号小册子

非专利文献1：American Jornal of Clinical Nutrition 64(1996)767～771页

非专利文献2：食の科学257(1999)20～25页

非专利文献3：Atherosclerosis 151(2000)501～508页

非专利文献4：Circulation 104(2001)2391～2394页

非专利文献5：International Journal of Cardiology 81(2001)107～115页

非专利文献6：The American Journal of Cardiology 87(2001)121～125页

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的课题在于提供：可改善与血管内皮相关的功能、有望获得血管内皮功能相关的各种疾病、例如动脉硬化的预防等作用、显示可缓和并预防血管内膜增厚的作用、有望预防粥样动脉硬化的、安全性优异的、具有改善血管内皮功能和抑制血管内膜增厚的至少一种作用的药剂和动脉硬化预防剂。

本发明的另一课题在于提供：可日常生活中连续使用、安全性优异、具有改善血管内皮功能和抑制血管内膜增厚的至少一种作用的功能性食品。

解决课题的手段

根据本发明，提供含有含Xaa Pro Pro的动物乳酪蛋白的水解物或其浓缩物作为有效成分、具有改善血管内皮功能和抑制血管内膜增厚的至少一种作用的药剂。

根据本发明，还提供含有Xaa Pro Pro作为有效成分、具有改善血管内皮功能和抑制血管内膜增厚的至少一种作用的药剂。

根据本发明，进一步提供含有通过属于瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)种的菌株使含有乳蛋白质的原料进行发酵而得到的、含IlePro Pro和/或Val Pro Pro的发酵物作为有效成分、具有改善血管内皮功能和抑制血管内膜增厚的至少一种作用的药剂。

而且，根据本发明，还提供含有上述任意一种药剂作为有效成分的动脉硬化预防剂。

根据本发明，还提供含有含Xaa Pro Pro的动物乳酪蛋白的水解物或其浓缩物作为有效成分、具有改善血管内皮功能和抑制血管内膜增厚的至少一种作用的功能性食品。

根据本发明，进一步提供含有Xaa Pro Pro作为有效成分、具有改善血管内皮功能和抑制血管内膜增厚的至少一种作用的功能性食品。

并且，根据本发明，还提供含有通过属于瑞士乳杆菌种的菌株使含有乳蛋白质的原料发酵而得到的、含Ile Pro Pro和/或Val Pro Pro的发酵物作为有效成分、具有改善血管内皮功能和抑制血管内膜增厚的至少一种作用的功能性食品。

根据本发明，还提供含Xaa Pro Pro的动物乳酪蛋白的水解物或其浓缩物、Xaa Pro Pro、或通过属于瑞士乳杆菌种的菌株使含有乳蛋白质的原料发酵而得到的含Ile Pro Pro和/或Val Pro Pro的发酵物在制备具有改善血管内皮功能和抑制血管内膜增厚的至少一种作用的药剂或功能性食品中的应用。

本发明进一步提供含Xaa Pro Pro的动物乳酪蛋白的水解物或其浓缩物、Xaa Pro Pro、或通过属于瑞士乳杆菌种的菌株使含有乳蛋白质的原料发酵而得到的含Ile Pro Pro和/或Val Pro Pro的发酵物在制备动脉硬化预防剂中的应用。

并且，根据本发明，还提供改善或抑制改善血管内皮功能和抑制血管内膜增厚的至少一种的方法，该方法是将含Xaa Pro Pro的动物乳酪蛋白的水解物或其浓缩物、Xaa Pro Pro、或通过属于瑞士乳杆菌种的菌株使含有乳蛋白质的原料发酵而得到的含Ile Pro Pro和/或ValPro Pro的发酵物给予动物。

根据本发明，还提供动脉硬化的预防方法，该方法是将含Xaa ProPro的动物乳酪蛋白的水解物或其浓缩物、Xaa Pro Pro、或通过属于瑞士乳杆菌种的菌株使含有乳蛋白质的原料发酵而得到的含Ile ProPro和/或Val Pro Pro的发酵物给予动物。

发明效果

本发明的具有改善血管内皮功能和抑制血管内膜增厚的至少一种作用的药剂或功能性食品含有特定的酪蛋白水解物或其浓缩物、Xaa Pro Pro、或者含Ile Pro Pro和/或Val Pro Pro的特定发酵物或XaaPro Pro作为有效成分，因此安全性优异，特别是作为功能性食品时，可以日常连续使用。因此，有望改善血管内皮功能有关的慢性高血压，或抑制动脉硬化、血管内膜增增厚，特别是抑制衰老、生活方式等导致的血管内皮细胞功能低下或损伤导致的粥样形成，缓和并预防粥样动脉硬化的发病。

本发明的动脉硬化预防剂含有本发明的上述药剂作为有效成分，因此，有望获得动脉硬化的预防作用。

附图简述

图1是表示实施例2～1和比较例2中进行的抑制血管内膜增厚的效果的确认试验结果的图表。

实施发明的最佳方式

以下，进一步详细说明本发明。

本发明的具有改善血管内皮功能和抑制血管内膜增厚的至少一种作用的药剂或功能性食品含有(a)Xaa Pro Pro(以下称为(a)成分)或(b)含Xaa Pro Pro的动物乳酪蛋白的水解物或其浓缩物(以下称为(b)成分)、(c)通过属于瑞士乳杆菌种的菌株使含有乳蛋白质的原料发酵而得到的含Ile Pro Pro和/或Val Pro Pro的发酵物(以下称为(c)成分)作为有效成分。即，(b)和(c)成分包含(a)成分，(a)成分、特别是Ile Pro Pro和/或ValProPro作为有效成分有效，这可通过后述的实施例等来理解。

优选(a)或(b)成分的Xaa Pro Pro含有Ile Pro Pro和/或Val Pro Pro。进一步优选(b)成分含有Xaa Pro。

相对于(b)成分中的肽和游离氨基酸的总量，(b)成分中所含的XaaPro Pro的含有比例通常为1％(重量)以上，优选1～5％(重量)。通过使该含有比例为1％(重量)以上，有望获得更高的作用。另外，相对于成分中的肽和游离氨基酸总量，(b)成分中所含的Ile Pro Pro或Val ProPro的含有比例可分别单独为0.3％(重量)以上，Ile Pro Pro和Val ProPro的总量为0.3％(重量)以上，则有望获得高的效果。并且，Ile Pro Pro和Val Pro Pro分别含有0.3％(重量)以上时可获得更高的效果。

相对于(b)成分中的肽和游离氨基酸总量，(b)成分中所含的XaaPro的含有比例通常为5％(重量)以上，优选5～25％(重量)。通过使该含有比例为5％(重量)以上，有望获得更高的作用。

如果(c)成分中所含的Ile Pro Pro和/或Val Pro Pro的含有比例换算成100g发酵物的冻干物为10mg以上、优选15mg以上，则有望获得所需效果。

(b)成分中的Xaa Pro Pro和Xaa Pro的Xaa可以是任意的氨基酸。例如Xaa Pro Pro可以是Ser Pro Pro、Leu Pro Pro、Ile Pro Pro、Val ProPro，Xaa Pro例如有：Ile Pro、Glu Pro、Arg Pro、Gln Pro、Met Pro、Tyr Pro。(b)成分优选含有上述例举的Xaa Pro Pro的至少1种或2种以上，并且，还优选为含上述例举的Xaa Pro的1种或2种以上的酪蛋白水解物。

(b)或(c)成分中除肽以外还可以含有游离氨基酸，并且，除上述肽和游离氨基酸之外，例如可以含有市售的动物乳酪蛋白、乳蛋白质中通常含有的脂肪、灰分、碳水化合物、食物纤维、水分等，还可以根据需要将其中的适当的成分的一部分或全部除去。

制备(b)成分时，例如可通过使用上述Xaa Pro Pro、以及可得到Xaa Pro的酶组，对动物乳酪蛋白进行水解的方法；或通过曲霉菌使动物乳酪蛋白发酵的方法获得。

动物乳酪蛋白是含有较多Pro、在食品等中使用的、安全性已经得到确认的蛋白质，例如有牛乳、马乳、山羊乳、羊乳等的酪蛋白，可特别优选使用牛乳酪蛋白。

将动物乳酪蛋白进行水解或发酵时的酪蛋白浓度没有特别限定，为了高效生产(b)分解物，优选3～19％(重量)。

上述酶组优选有：例如含有可切断Xaa Pro Xaa或Xaa Pro Pro Xaa的羧基末端的Pro Xaa序列的肽酶的酶组(X)。

酶组(X)优选含有活性中心具有丝氨酸的丝氨酸型的蛋白酶、或者活性中心具有金属的金属蛋白酶。金属蛋白酶例如有：中性蛋白酶I、中性蛋白酶II和亮氨酸氨基肽酶等，进一步含有其中的至少一种，这可以有效地且在短时间内、进一步可通过一步反应获得所需水解物，因此优选。另外，可切断上述Pro Xaa序列的肽酶优选为等电点显示酸性区域的酶。

上述酶组或酶组(X)例如有来自米曲霉菌(Aspergillus oryzae)等曲霉菌的酶组。上述酶组可以是在适当的培养基中培养菌体、水提取所生产的酶得到的酶组等，特别优选在来自米曲霉菌的酶组中、等电点显示酸性区域的酶组。

来自米曲霉菌的酶组可以利用市售商品，例如有：Sumizyme FP、LP或MP(以上为注册商标，新日本化学(株)制备)、Umamizyme(注册商标，天野ENZYME(株)制备)、Sternzyme B11024、PROHIDROXYAMPL(以上为商品名，株式会社通口商会制备)、Orientase ONS(注册商标，阪急BIOINDUSTRY(株)制备)、Denazyme AP(注册商标，NAGASE生化学制备)等，特别优选使用Sumizyme FP(注册商标，新日本化学(株)制备)。

使用这些市售的酶组时，通常是设定为最佳条件，也可以根据所使用的酶组，适当改变可获得上述酪蛋白水解物的条件、例如所使用的酶量或反应时间等。

将上述动物乳酪蛋白水解时的酶组的添加量如下：例如向溶解有动物乳酪蛋白的水溶液中添加，得到酶组/动物乳酪蛋白重量比1/1000以上、优选1/1000～1/10、特别优选1/100～1/10、进一步优选1/40～1/10的比例的量。

反应条件可根据酶组适当选择，以获得目标酪蛋白水解物，但温度通常为25～60℃，优选45～55℃，pH为3～10，优选5～9，特别优选5～8。酶促反应时间通常为2～48小时，优选7～15小时。

酶促反应结束可通过使酶失活来进行，通常在60～110℃下使酶失活，中止反应。

酶促反应停止后，可以根据需要，通过离心除去或各种过滤器处理除去沉淀物。

还可根据需要，由所得水解物中除去具有苦味或臭味的肽。上述苦味成分或臭味成分的除去可使用活性碳或疏水性树脂等进行。例如，相对于所使用的酪蛋白量，可通过向所得水解物中添加1～20％(重量)的活性碳，反应1～10小时来实施。所使用的活性碳的除去可通过离心或膜处理操作等公知的方法进行。

含有所得(b)成分的反应液可以直接添加到饮料等液体产品中，用作功能性食品。为了提高(b)成分中的酪蛋白水解物的通用性，优选将上述反应液浓缩后进行干燥，制成粉末形态。通过制成粉末，例如可以将抑制血管内膜增厚作用、改善血管内皮功能作用、动脉硬化预防作用的至少一种作用赋予各种食品等，可以制成功能性添加剂。

为了改善营养平衡或风味等，上述粉末中可以含有各种辅助添加剂。例如，有各种碳水化合物、脂肪、维生素类、矿物质类、甜味剂、香料、色素、结构改良剂等。

在本发明的具有改善血管内皮功能和/或抑制血管内膜增厚作用的药剂中，以(b)成分作为有效成分时的给予量是：对于人，每天按照(b)成分中的Xaa Pro Pro或Xaa Pro Pro和Xaa Pro的合计量，通常为10μg～10g，优选1mg～5g，进一步优选3mg～1g左右，每天可分数次摄取。

给予期间，可以根据该疾病的症状等进行调节，通常优选在1天以上、优选7天～365天，常规性摄取。

(c)成分制备中所使用的属于瑞士乳杆菌种的菌株可以是单独的瑞士乳杆菌种，但发酵时，在不损害本发明所需效果的范围内可以含有其它乳酸菌等。

属于瑞士乳杆菌种的菌株优选使用作为可高产具有改善血管内皮功能作用和/或抑制血管内膜增厚作用的Ile Pro Pro和/或Val ProPro的生产菌而优选的菌体外蛋白酶活性高的菌株。例如优选以Twining等人的方法(Twining，S.Anal.Biochem.143 3410(1984))为基础，按照Yamamoto等人的方法(Yamamoto，N.等人，J.Biochem.(1993)114，740)测定的U/OD590的值显示400以上的菌株。

优选的瑞士乳杆菌例如有瑞士乳杆菌CM4株(Lactobacillushelveticus CM4 strain)(独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心日本国茨城县筑波市东1-1-1中央第6保藏号：FERMBP-6060，保藏日1997年8月15日)(以下称为CM4株)。该CM4株在已经根据专利程序中有关微生物保藏的国际承认的布达佩斯公约，以上述保藏号登记，该菌株已获得专利。

(c)成分是将含有属于瑞士乳杆菌种的菌株的发酵乳引子(starter)添加到含有乳蛋白质的原料中，适当选择发酵温度等发酵条件进行发酵来获得。

作为有效成分的(c)成分包含通过冷冻干燥、喷雾干燥等，将所得(c)成分的浓缩物等制成粉末所得。

属于瑞士乳杆菌种的菌株优选以预先进行预培养的、活性足够高的引子的形式使用。初始菌数优选10⁵～10⁹个/mL左右。

(c)成分利用于例如特定保健用食品等功能性饮食品中时，为了保持良好风味、良好的嗜好性，可以在上述属于瑞士乳杆菌种的菌株中结合使用酵母，使其发酵。酵母的菌种没有特别限定，例如优选啤酒糖酵母等酵母属酵母等。酵母的含有比例可根据其目的适当选择。

含有乳蛋白质的原料例如有牛乳、马乳、羊乳、山羊乳等动物乳，以及豆乳等植物乳，它们的加工乳—脱脂乳、还原乳、粉乳、炼乳，优选牛乳、豆乳、它们的加工乳，特别优选牛乳或其加工乳。

乳的固形成分浓度没有特别限定，例如使用脱脂乳时，无脂乳固形成分浓度通常在3～15％(重量)左右，从生产性考虑优选6～15％(重量)。

上述发酵乳可通过以下方法进行：通常静置或者搅拌发酵，例如在发酵温度25～45℃、优选30～45℃，发酵时间3～72小时、优选12～36小时，在乳酸酸度为1.5％以上时停止发酵。

本发明的具有改善血管内皮功能和/或抑制血管内膜增厚的作用的药剂中，在以(c)成分作为有效成分时的给予量是：对于人，每天按照(c)成分的干燥量通常为1～100g，特别优选2～50g左右，每天可分数次摄取。(c)成分中的Val Pro Pro和/或Ile Pro Pro的量通常是10μg～10g，优选1mg～5g，进一步优选3mg～1g左右，每天可分数次摄取。

给予期间可根据该疾病的症状等调节，通常在1天以上、优选7天～365天，常规性摄取。

本发明的动脉硬化预防剂含有上述具有改善血管内皮功能和/或抑制血管内膜增厚作用的药剂。特别是具有抑制血管内膜增厚作用时，可用作粥样动脉硬化预防剂。

本发明的动脉硬化剂的给予量是：对于人，按照上述(a)～(c)成分中的Xaa Pro Pro、或者Xaa Pro Pro和Xaa Pro的总量、或者Val Pro Pro和/或Ile Pro Pro的量，每天通常为10μg～10g，优选1mg～5g，进一步优选3mg～1g左右，每天可分数次摄取。

动脉硬化预防剂的给予期间可考虑要摄取的人或动物的年龄或该人或动物的动脉硬化危险因子的环境等进行各种调整，通常在1天以上、优选7天～365天，常规性摄取。

本发明的具有改善血管内皮功能和/或抑制血管内膜增厚作用的药剂、以及动脉硬化预防剂的给予方法通常是口服给予。

本发明的药剂的形态可以制成口服给予用的制剂形态。例如有：片剂、丸剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微胶囊、散剂、颗粒剂、液体制剂等。

制剂化时，例如可根据需要，使用药剂可接受的载体、佐剂、赋形剂、辅助赋形剂、防腐剂、稳定剂、结合剂、pH调节剂、缓冲剂、增稠剂、凝胶化剂、保存剂、抗氧化剂等，以通常可见的制剂实施所要求的单位用量形式制备。

本发明的功能性食品含有作为本发明的具有改善血管内皮功能和/或抑制血管内膜增厚作用的药剂的有效成分的上述(b)或(c)成分，可以制成具有改善血管内皮功能和/或抑制血管内膜增厚作用的特定保健用食品等健康食品。

关于为获得上述功效而需要的摄取量，功能性食品可以连续服用，可连续或断续地长期摄取，因此对于人，按照上述(b)成分中的Xaa Pro Pro、或者Xaa Pro Pro与Xaa Pro的总量，以及按照上述(c)成分中的Val Pro Pro和/或IlePro Pro量，每天通常为10μg～10g，优选1mg～5g，进一步优选3mg～1g左右，根据每天的摄取次数，可以使功能性食品中每次的摄取量比上述量更低。

本发明的功能性食品的摄取期间没有特别限定，优选长期摄取，但为获得上述功效，通常在1天以上，特别在7天～365天左右，常规性摄取。

本发明的功能性食品除上述有效成分(b)或(c)成分之外，还可以根据需要添加瑞士乳杆菌以外的乳酸菌的发酵物、或饮食品中使用的其它成分、例如糖类、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质、香料或它们的混合物等的添加物。

本发明的功能性饮食品的形态可以是将上述(b)或(c)成分直接或者是制成粉末或颗粒添加到各种饮食品中，由此制成固形物、凝胶状物、液状物的任何形态，例如可以制成乳酸菌饮料等发酵乳制品、各种加工饮食品、干燥粉末、片剂、胶囊剂、颗粒剂等，还可进一步制成各种饮料、酸乳酪、流食、果冻、糖果、袋装旅行食品、粉片糖、曲奇饼、蛋糕、面包、饼干、巧克力等。

实施例

以下，通过实施例、分析例和比较例进一步详细说明本发明，但本发明的范围并不受限于这些。

制备例1

将1g来自牛乳的酪蛋白(日本NZMP公司制备)加入到99g调节至约80℃的蒸馏水中，充分搅拌，然后添加1N氢氧化钠(和光纯药公司制备)溶液，制成pH 7.0，将温度调节至20℃，制备底物溶液。

向所得底物溶液中添加来自米曲霉菌、至少含有金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶I、中性蛋白酶II和亮氨酸氨基肽酶的市售的酶(注册商标“Sumizyme FP”，新日本化学工业公司制备)，按照酶/酪蛋白的重量比为1/25添加，在50℃下反应14小时。接着，在110℃下进行10分钟的高压灭菌，使酶失活，获得酪蛋白酶分解物溶液。接着，将所得酶分解物溶液通过喷雾干燥进行干燥，制成粉末。

对所得粉末中的含有成分进行分析。蛋白质通过凯氏定氮法测定，氨基酸通过氨基酸分析装置测定。由该蛋白质的质量减去氨基酸所得的量为肽量。脂肪通过酸解法、灰分通过直接灰化法、水分通过常压加热干燥法分别测定。从100％中减去各成分，其余为碳水化合物的量。结果，氨基酸为35.8％(重量)，肽为45.7％(重量)，水分为6.6％(重量)，脂肪为0.2％(重量)，灰分为4.1％(重量)和碳水化合物为7.6％(重量)。

<构成肽的氨基酸的测定>

将上述制备的粉末溶解于适量的蒸馏水中，使用自动肽分析仪(商品名PPSQ-10(株)岛津制作所制造)进行分析，再研究粉末中由N末端一侧起，各氨基酸依次的位置。自动肽分析仪不检测游离氨基酸。

第5个残基的氨基酸的合计为120pmol，第6个残基的氨基酸的合计为100pmol。由这些结果可知，上述粉末中所含的肽的大部分为二肽和三肽。第2个残基的氨基酸为Pro的肽的比例为49.5％，显著上升。第3个残基的氨基酸为Pro的肽的比例为29.8％，较多。

因此，上述粉末中较多含有Xaa Pro或Xaa Pro Pro，可以推定这些肽是对生物体内蛋白酶的酶解作用抗性高的肽。

<酶解物中所含的肽的测定>

对于上述酶解物的粉末，使用各种化学合成标准肽，按照常规方法求出该粉末中所含的表1所示的二肽和三肽的量。结果如表1所示。

[表1]

 

肽序列粉末10mg/mL中的存在浓度(μg/mL)Ile Pro16.0Glu Pro7.1Arg Pro10.3Gln Pro34.5Met Pro18.4Tyr Pro128.9其他的Xaa Pro299.4Ser Pro Pro2.9Val Pro Pro29.5Ile Pro Pro28.1Phe Pro Pro27.2其他的Xaa Pro Pro28.8

另外，将上述粉末用蒸馏水稀释并溶解，所得溶液中的肽和游离氨基酸量为8.15mg/mL，肽量为4.57mg/mL，该肽中的Xaa Pro量为514.5μg，因此，Xaa Pro相对于粉末中的肽和游离氨基酸总量的比例为6.3％(重量)，并且该肽中的Xaa Pro Pro的量为116.5μg，因此，XaaPro Pro相对于粉末中肽和游离氨基酸总量的比例为1.4％(重量)。

实施例1-1

为了研究血管内皮功能的改善效果，以40岁以上、65岁以下的成人男性中显示收缩期血压140～159mmHg或舒张期血压90～99mmHg的各24人的2组作为对象，将制备例1中制备的1.25g酪蛋白水解物粉末填充到胶囊中，作为受试食品，或者将1.25g酪蛋白钠粉末填充到胶囊中作为安慰剂，在早餐时或早餐后30分钟之内使其每天一次，摄取七天，实施两组间的双盲交叉试验。

试验是使用体积描记器(plethysmograph EC6，Primetech Co.制造)，测定摄取受试食品和安慰剂之前、以及摄取7天之后的安静时或驱血带松开后的前臂动脉血流量来进行。结果，各组的平均如表2所示。

[表2]

表2中的检查值是各24人的平均值±标准偏差的表示，FBF表示前臂血流量。

受试食品组的最大血流量和(B)/(A)×100与安慰剂组相比，有显著差异(p<0.001)。受试食品组的最大血流量和(B)/(A)×100与摄取前相比，有显著差异(p<0.001)。

由表2中可知，安静时的前臂动脉血流量在对摄取前后的受试食品组与安慰剂组比较中未见显著差异。

而松开后的最大流入量在摄取前两组间未见显著差异，但摄取后不管与摄取前相比还是与安慰剂组相比，受试食品组中都显示显著高的值(均为t检测，p<0.001)。

反应性充血后的最大血流量与安静时相比，在摄取前的两组之间未见显著差异，但摄取后，不管与摄取前比较还是与安慰剂组比较，受试食品组中都显示显著高的值(均为t检测，p<0.001)。未见试验期间血压的显著改善。

由以上结果表明，制备例1中制备的酪蛋白水解物在通过摄取对使用体积描记器的生理性血管内皮功能评价中，显示显著的改善作用，确认作为血管内皮功能改善剂有效。还可确认该改善作用并不伴随有降血压作用。

对于上述各组的受试者，口腔内喷雾给予0.3mg硝基甘油，10分钟后观察血管内皮对外因性NO的非依赖性血管扩张反应，其中，以最大血流量作为测定值。结果如表3所示。

[表3]

表3的检查值是各24人的平均值±标准偏差的表示，FBF表示前臂血流量。

表3中，两组在摄取前后的比较、以及两组间的比较中均未见显著差异。安静时也得到同样结果。

由以上结果可知，制备例1中制备的酪蛋白水解物对反应性血流量的改善效果与NO响应性血管中膜的功能改善无关，可以直接反应血管内皮功能的改善。

合成例

按照以下所示有机化学合成法合成IPP和VPP。合成使用岛津制作所制造的肽自动合成装置(PSSM-8型)，通过固相法进行。

固相载体使用50mg为2-氯三苯甲基型的聚苯乙烯树脂、结合有氨基用芴基甲基氧基羰基(以下简称为Fmoc)保护的脯氨酸的树脂(岛津制作所公司制备，注册商标SyoProPep Resin)。按照常规方法，按照上述氨基酸序列，将各100μmol氨基被Fmoc基保护的Fmoc-Ile、Fmoc-Pro和Fmoc-Val按照肽序列依次反应，得到肽结合树脂。

接着，将该肽结合树脂悬浮于1mL的反应液A(10％(容量)乙酸、10％(容量)三氟乙醇、80％(容量)二氯甲烷)中，在室温下反应30～60分钟，将肽从树脂上切离，然后将反应液A通过玻璃滤器过滤。减压除去滤液的溶剂，然后立即加入1mL反应液B(82.5％(容量)三氟乙酸、3％(容量)乙基甲基硫醚、5％(容量)纯水、5％(容量)茴香硫醚、2.5％(容量)乙二硫醇、2％(容量)苯硫酚)，在室温下反应6小时，除去支链保护基团。向其中加入10mL无水乙醚，使肽沉淀，以3000转离心5分钟进行分离。将该沉淀用无水乙醚洗涤多次，然后吹入氮气进行干燥。将上述得到的未纯化的合成肽总量溶解于2mL的0.1N盐酸水溶液中，然后通过使用C18的反相柱的HPLC，按照以下条件进行纯化。

泵：型号L6200智能泵(日立制作所)，检测仪器：以型号L4000UV检测器(日立制作所)检测215nm的紫外部吸收，柱：μBondasphere 5μC18(Nihon Waters公司制造)，洗脱液：A液：0.1％(重量)TFA水溶液，B液：含0.1％(重量)TFA的乙腈(B/A+B)×100(％)：0→40％(60分钟)，流速：1mL/分钟。分取显示最大吸收的洗脱组分，将其冷冻干燥，分别得到5.7mg、6.5mg目标合成肽IPP和VPP。通过全自动蛋白质一次结构分析装置(型号PPSQ-10，岛津制作所制造)，将纯化肽由肽的N末端进行分析，进一步通过氨基酸分析装置(型号800系列，日本分光公司制造)进行分析，结果可以确认如设计所示。

实施例1-2

使用Wistar系大鼠(7周龄，雄性)作为试验动物，驯化饲养一周。接着分别将1g/L一氧化氮合成抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐(L-NAME，Sigma公司制备)，1g/L L-NAME与合成的0.3g/L Val ProPro、或1g/L L-NAME与合成例中合成的0.3g/L Ile Pro Pro溶解于饮水中，使其自由摄取一周。作为对照，只让其摄取未溶解L-NAME的水，以此作为未处置。

然后，将大鼠在二乙醚麻醉下放血致死，摘除胸部主动脉血管，切取2mm宽，制作主动脉环。将该环安装于用5mL的tyrode液(组成158.3mM NaCl、4.0mM KCl、2.0mM CaCl₂、1.05mM MgCl₂、0.42mM NaH₂PO₄、10.0mM NaHCO₃、5.6mM葡萄糖；pH7.4，37±0.5℃)充满的马格努斯装置(LABO SUPPORT公司制造，产品名microtissueorgan bath MTOB-1Z)上，施加2.0g的静止张力，使其平衡。接着，用1μM的去氧肾上腺素使主动脉环收缩，用10μM乙酰胆碱，对得到稳定收缩的标本观察血管内皮依赖性的扩张反应。求出血管扩张反应的扩张度相对于1μM去氧肾上腺素导致的收缩的比例。结果如表4所示。各值均为每组8只的平均值。

比较例1

将血管紧张素I(ACE)抑制药依那普利代替Val Pro Pro或Ile ProPro，以显示与Val Pro Pro或Ile Pro Pro同等程度的抑制活性的0.5mg/L的浓度使其自由摄取，除此之外与实施例1-2同样地测定血管扩张反应的扩张度。结果如表4所示。所述值是每组9只的平均值。

[表4]

 

受试物质扩张度(％)L-NAME26.1L-NAME+Val Pro Pro43.1^＊L-NAME+Ile Pro Pro36.8^＊L-NAME+依那普利31.6未处置92.4^＊

^＊：P<0.05

由表4的结果可知，与单独摄取L-NAME的组相比，同时摄取Val Pro Pro或Ile Pro Pro的组血管扩张的比例显著增加，表明Val ProPro和Ile Pro Pro具有改善血管内皮功能的作用。而在使用具有ACE抑制活性的依那普利的比较例1中，与单独摄取L-NAME的组相比，未见血管扩张的显著差别。因此，难以说只要具有ACE抑制活性的物质即具有改善血管内皮功能的作用。

实施例2-1

(CM4发酵乳饲料的制备)

将市售的脱脂粉乳用蒸馏水溶解，使固形成分率为9％(w/w)，通过高压灭菌器在105℃下高温加热灭菌10分钟，然后冷却至室温，接种3％(v/w)CM4株引子发酵液(菌数5×10⁸个/mL)，在37℃下以静置状态发酵24小时，得到CM4发酵乳。

将所得CM4发酵乳在达到80℃温度灭菌后通过冷冻干燥得到粉末。所得冷冻干燥粉末和市售粉末饲料(商品名“CE-2”，日本CLEA株式会社制备)按照质量比10:90混合，制备固体饲料，制成CM4发酵乳饲料。该饲料中含有34.1mg/kg来自CM4发酵乳的Val Pro Pro和17.1mg/kg Ile Pro Pro。

(不依赖于血脂改善的血管内膜增厚抑制效果的确认试验)

将ApoE缺损小鼠(5周龄，雄性)预备饲养一周，使其自由摄取上述制备的CM4发酵乳饲料、或者由未配合CM4发酵乳的冷冻干燥粉末的市售粉末饲料(商品名“CE-2”，日本CLEA株式会社制备)制备固体饲料得到的对照饲料31周(每组5只)。

由心脏采集上述摄取后的小鼠血液，通过血液生化学检查测定总胆固醇量、LDL胆固醇量、HDL胆固醇量和中性脂肪量。结果如表5所示。

采集小鼠的胸部主动脉，进行苏木精-伊红染色，计算血管的内膜/中膜的面积比。将该值制成图表，结果如图1所示。

比较例2

将市售的脱脂粉乳用蒸馏水溶解，使固形成分率为9％(w/w)，用高压釜在105℃下高温加热灭菌10分钟，然后冷却至室温。添加乳酸，使其与实施例2-1中制备的CM4发酵乳为同等酸度(2.3％)，获得未发酵乳。

将所得未发酵乳在80℃到达温度下进行灭菌，通过冷冻干燥获得粉末。将所得冷冻干燥粉末和市售的粉末饲料(商品名“CE-2”，日本CLEA株式会社制备)按照质量比10:90混合，制备固体饲料，制成未发酵乳饲料。该未发酵乳饲料中不含有Xaa Pro Pro和Xaa Pro。

使用所得未发酵乳饲料，与实施例2-1同样地使小鼠摄取，然后进行与实施例2-1同样的血液生化学检查和血管的内膜/中膜的面积比的计算。结果分别如表5和图1所示。

[表5]

由表5的结果可知，含有Val Pro Pro和Ile Pro Pro的CM4发酵乳相对于对照饲料和未发酵乳饲料，不具有高血脂改善作用。而由图1的结果可知，含有Val Pro Pro和Ile Pro Pro的CM4发酵乳相对于对照饲料和未发酵乳饲料，均显著抑制血管内膜的增厚。未发酵乳中也含有与CM4发酵乳同等以上的乳成分，因此可知，本发明的效果并不只是乳成分带来的效果。

由此可知，CM4发酵乳的抑制血管内膜增厚的效果与高血脂改善是不同的机理，对于包括人在内的动物高血脂以外的原因导致的粥样动脉硬化也有效。

实施例2-2

由合成例合成的Val Pro Pro和Ile Pro Pro、以及在实施例2-1中制备的CM4发酵乳、以及制备例1中制备的酪蛋白水解物的粉末(称为制备例1的粉末)分别与市售的粉末饲料(商品名“CE-2”，日本CLEA株式会社制备)按照表6所示的比例混合，制备固体饲料。作为对照，准备了市售的粉末饲料。

(血管内膜的增厚抑制效果的确认试验)

使ApoE缺损小鼠(6周龄，雄性，每组8只)分别自由摄取31周表6所示的饲料1～7。接着，摘出小鼠的胸部主动脉，用10％中性缓冲福尔马林固定，然后实施Elastica-van Gieson染色。对于组织标本，通过计算机采集显微镜下拍摄的图像，通过图像处理软件(Image J)计算血管的内膜增厚度(内膜/中膜的面积比(％))。结果如表6所示。另外，内膜增厚度的值是各组的平均值。

[表6]

 

饲料中的添加试样添加试样在饲料中的配合比例％(重量)      Val Pro Pro含量(mg/kg饲料) Ile Pro Pro含量(mg/kg饲料) 内膜增厚度(％)  SE饲料1Val Pro Pro0.003434.10.021.84.7饲料2Val Pro Pro0.0340341.00.018.73.2饲料3Ile Pro Pro0.00170.017.125.35.4饲料4Ile Pro Pro0.01700.0171.020.54.6饲料5CM4发酵乳10.000034.117.118.55.0饲料6制备例1的粉末0.870020.924.918.74.0饲料7无(对照)0.00.00.038.06.2

由表6的结果可知，Val Pro Pro和Ile Pro Pro可以浓度相关性地抑制血管内膜的增厚。另外，包含Val Pro Pro和Ile Pro Pro的CM4发酵乳、或含有Xaa Pro Pro和Xaa Pro的制备例1中制备的动物乳酪蛋白水解物的粉末也可以抑制血管内膜的增厚。因此，含有Val Pro Pro和Ile Pro Pro的至少一种肽的制剂或食品可以抑制血管内膜的增厚，对于预防粥样动脉硬化有效。

实施例3-1至3-2、比较例3和4

采用表7所示的引子液添加率和发酵时间的条件，按照实施例2-1，将CM4株(实施例3-1)、瑞士乳杆菌JCM1004(L.helveticus JCM1004)(实施例3-2)、加氏乳杆菌JCM1131(L.gasseri JCM1131)(比较例3)或市售的冷冻干燥引子CH-1(Chr.Hansen公司制备，包含嗜热链球菌(Streptococcus termophilus)、德氏乳杆菌种保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbruckii sp.bulgaricus))制备发酵乳，分别得到其冷冻干燥物。

将所得冷冻干燥物与市售的粉末饲料(商品名“CE-2”，日本CLEA株式会社制备)分别按照重量比10:90混合，制备固体饲料。该饲料中的Val Pro Pro和Ile Pro Pro的量如表7所示。

接着，使用所制备的各固体饲料，进行与实施例2-2同样的血管内膜增厚抑制效果的确认试验，计算内膜增厚度(内膜/中膜的面积比(％))。结果如表7所示。内膜增厚度的值是各组的平均值。

[表7]

 

引子液添加率(％)        发酵时间(hr)    Val Pro Pro含量(mg/kg饲料) IIe Pro Pro含量(mg/kg饲料)  内膜增厚度(％)      SE对照--0.00.028.04.5实施例3-13.02433.114.113.5^＊1.5比较例3-23.02416.23.511.7^＊3.1比较例310.0480.01.925.54.4比较例43.0246.02.419.44.2

^＊：p<0.05

由表7的结果可知，瑞士乳杆菌发酵物具有其它菌种制备的发酵物所没有的抑制血管内膜增厚的效果。