一株产促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌及由该菌制备的脂肽与应用

摘要

本发明属于农业微生物学技术领域，同时涉及生物化学与分子生物学领域。分离得到一株产促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌菌株(Bacillusamyloliquefaciens)CH1，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC：M208127。从该解淀粉芽胞杆菌菌株CH1的培养物中获得具有生物活性物质，被表征为促真菌凋亡脂肽。该脂肽的分子量为1065或它的同系物。具有如说明书附图6所示的红外图谱。该脂肽由9碳烷基和8个氨基酸组成，在第7个烷基碳与最后一个氨基酸通过一个氧原子形成环肽。对该解淀粉芽胞杆菌菌株以及其制备的脂肽在细胞凋亡中的生物学应用前景进行了试验。

说明书

技术领域

本发明属于农业微生物学技术领域，具体涉及一株产促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌的分离筛选及活性物质的制备。本发明还涉及部分生物化学与分子生物学技术领域。

背景技术

许多芽胞杆菌，例如枯草芽胞杆菌(Bacilus subtilis)，蕈状芽胞杆菌(B.mycoides)和解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)，都可以抑制许多植物病原真菌和人类病原真菌的生长。许多这类抗真菌物质都被鉴定出具有环状脂肽表面活性剂的特征。这些脂肽能抑制很多真菌的生长，包括曲霉属(Aspergillus)，镰孢菌属(Fusarium)，丝核菌属(Rhizoctonia)和一些酵母(假丝酵母属)等。还有一些脂肽的抗肿瘤活性也得到了关注。现在有许多研究者对芽孢杆菌产生的脂肽产生了浓厚的兴趣，关注的内容主要包括它很高的表面活性和潜在的疗效方面的特性。

芽胞杆菌产生的环状脂肽主要包括一个脂肪酸链连接的多肽形成一个环，所以脂肽是一个生物学上的表面活性剂，它包括一个亲脂和一个亲水基团。基于脂肽是一个高生物表面活性剂，被认为它能通过与细胞膜的相互作用而使其破裂。还有人认为它们能在双层膜中形成选择性离子通道，包括在磷脂双分子层中形成选择性离子通道。

有关脂肽的作用机理如上所述，基于其表面活性剂的作用导致细胞质膜的穿孔而起杀菌作用。然而，我们在对由一株解淀粉芽胞杆菌产生的脂肽作用机理进行研究的时候发现，诱导真菌细胞凋亡也是其抑菌的重要机理之一。凋亡，又称细胞程序性死亡，首先在动物中发现。最近的研究成果表明，真菌(包括酵母和丝状真菌)在某些条件下(如衰老、UV、某些化学物质)也可诱导凋亡的发生，从而表现为典型的凋亡现象，如核浓缩，DNA的断裂，细胞质膜磷脂酰丝氨酸的外翻，活性氧的产生，凋亡小泡的形成等等一些动物中出现的凋亡特征。在动物细胞中，凋亡通常有2条途径，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase，另一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些活化的caspase可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。我们的实验结果表明，在解淀粉芽胞杆菌脂肽作用后，表现为核断裂，核浓缩、细胞质膜磷脂酰丝氨酸外翻、活性氧等细胞凋亡特征。脂肽诱导的细胞凋亡可能在解淀粉芽胞杆菌对真菌的拮抗作用中起重要的作用，因为在自然生态中芽胞杆菌产生的脂肽可能并不足以导致细胞膜的穿孔，但却可诱导凋亡的发生，这也部分解释了一定浓度的脂肽表现为抑菌作用而非完全杀死真菌。

许多芽胞杆菌产生的生物活性剂物质能用于植物病害的生物控制，从而减少化学药物的使用来保护环境。抗真菌，肿瘤和病毒也使芽胞杆菌作为寻找新抗生素的生物资源。但是现在仅有很少的抗真菌物质被分离鉴定，而且现在被鉴定的芽胞杆菌产抗菌物质多为枯草芽胞杆菌所产脂肽。我们分离到的解淀粉芽胞杆菌产生的脂肽为分子量较大的脂肽，不同于以往报道的小分子量脂肽，该脂肽对水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌、棉花枯萎病菌、小麦赤霉病、棉铃炭疽病菌、杨树溃疡病菌、灰霉菌等多种植物病原真菌具有显著的拮抗效果。我们以丝状真菌水稻纹枯病菌以及酵母菌中的假丝酵母为代表进行研究，发现该脂肽促真菌细胞凋亡的作用是其拮抗作用的重要表现。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，通过分离、筛选获得一株产促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌，分析该菌株是否具有能对植物真菌病原菌具有有很好拮抗作用的活性物质，申请人从水稻根系分离得到了这株目的细菌。试验表明分离的这株细菌属于一株解淀粉芽胞杆菌，它能产生促真菌凋亡的一种脂肽，可作为细胞凋亡研究的诱导物，也可作为抗植物病原菌的有效成分。本发明提供了分离筛选该解淀粉芽胞杆菌的方法，对其产生的活性物质进行了表征分析，并对该活性物质的应用前景进行了试验，从而完成本发明。

实现本发明的技术如下所述：

申请人通过分离筛选获得一株分离的对植物真菌病原菌具有很好拮抗作用活性物质的微生物菌株CH1，经16SrRNA分析和其他形态学等分析，确定该菌株为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)，申请人将其命名为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CH1。该菌株已于2008年9月5日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M208127。

从该解淀粉芽胞杆菌菌株CH1的培养物中获得具有生物活性物质，被表征为促真菌凋亡脂肽。该脂肽的分子量为1065或它的同系物。具有如说明书附图6所示的的红外图谱。该脂肽由9碳烷基和8个氨基酸组成，在第7个烷基碳与最后一个氨基酸通过一个氧原子形成环肽。其序列及构型如下：

对该解淀粉芽胞杆菌菌株以及其制备的脂肽在细胞凋亡中的生物学应用前景进行了试验。

具体制备步骤是这样的：

1.细菌的分离筛选与鉴定：从中国湖北省武汉市华中农业大学水稻田取分蘖期的水稻分离具有抗水稻纹枯病菌的细菌。对检测到显著抗真菌活性的细菌进行16SrRNA和形态鉴定。确定我们分离得到的是一株解淀粉芽胞杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)。

2.抗真菌活性物质的分离纯化及有效成分鉴定：对上述获得的解淀粉芽胞杆菌培养2天后发酵液用“两步萃取法”(见实施例1)提取抗菌活性物质，将萃取后液体真空旋转蒸发浓缩(见实施例1)，并溶于少量的蒸馏水中。用葡聚糖G-25柱进一步分离纯化，绘制洗脱曲线。利用洗脱曲线各峰值的组分进行抗菌活性检测。

在抗真菌活性分析后，对有活性的抗菌物质进行真空冷冻干燥进行浓缩(见实施例1)。浓缩的溶液进行薄层层析分离，对各斑点进行抗菌活性检测，并对纯化的抗真菌物质进行定量。

3.抗真菌脂肽诱导真菌凋亡的各种特征检测。用步骤2纯化的脂肽处理假丝酵母和水稻纹枯病菌，并利用荧光显微镜检测观察。

实施结果：

通过16SrRNA分析和其它形态观察确定我们分离的菌株为一解淀粉芽胞杆菌Bacillus.amyloliquefaciens。该菌对Rhizoctonia solani，Helminthosporium maydis，Fusarium oxysporium，Botrytiscinereapers，Gibberella zeae，Dothiorella gregaria，Colletotrichum gossypii等植物病原真菌都有明显的抗菌效果。我们成功的分离到了该菌株的抗真菌有效成分，并对其抗菌活性和基本特性进行了分析。随后用纯化的脂肽处理假丝酵母和水稻纹枯病菌能很好的诱导其凋亡。用双苯甲亚胺(Hoechest 33258)染色能很明显的看出脂肽处理的细胞能很好的被染色，也就是说其细胞膜通透性有较大改变，且丝状真菌纹枯病菌单个细胞中细胞核数量超过23个，假丝酵母细胞核则呈明显的核浓缩现象。处理后细胞内活性氧水平也明显高于对照组，Annexin V检测也显示脂肽处理细胞有较多细胞出现磷脂酰丝氨酸外翻，而对照组明显少于处理组。缺口末端标记分析(TUNEL分析)同样显示处理组的细胞被染色多，说明细胞内DNA断裂较多。这些特性都为细胞凋亡特征，从而可以肯定我们纯化的该脂肽能很好的诱导细胞凋亡。由此我们推测我们分离到的解淀粉芽孢杆菌产生的脂肽具有促真菌凋亡的作用。

解淀粉芽胞杆菌CH1(Bacillus.amyloliquefaciens CH1)的菌学特征：

解淀粉芽胞杆菌CH1菌体杆状，菌体大小1-1.4μm×2.3-3.5μm在PDA(含200g马铃薯煮出液，20g葡萄糖，20g琼脂，加蒸馏水至1L)平板上能快速扩散，不形成特定的菌落形态，边缘不规则，呈灰白色，粘稠有荚膜，培养48h后表面有小皱褶。在LB平板上形成米白色的菌落，菌落直径3-5mm，表面干燥有皱褶，中间塌陷，边缘波状。37℃生长明显快于28℃。芽胞近端生，鞭毛周生。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离的解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens CH1的16SrRNA校正序列。

序列表SEQ ID NO：2是本发明分离的分子量为1065的脂肽的氨基酸推测序列。

图1是解淀粉芽胞杆菌产生的脂肽抗丝状真菌活性。图中：图1A，图1D为PD培养基对照；图1B为加有10％的在37℃培养的CH1发酵液的PDA培养基；图1C为加有10％的在28℃培养的CH1发酵液的PDA培养基。水稻纹枯病菌在含10％CH1发酵液的培养基上生长明显受到抑制，而且在37℃培养的CH1发酵液对水稻纹枯病菌的抑制效果更明显。

图2是解淀粉芽胞杆菌产生的脂肽抗假丝酵母活性。图2A为用100μg/ml脂肽处理2h后，取100个细胞涂平板；图2B为PD培养基对照；图2C为PBS对照。提纯的脂肽可明显抑制假丝酵母的生长繁殖，表现为与对照相比，菌落数减少，菌落大小也明显小于PD或PBS对照。

图3是抗真菌物质用葡聚糖凝胶G-25柱进行分离纯化收集峰抗菌活性检测。图3A为经葡聚糖凝胶G-25柱分离纯化后的洗脱曲线，可以看出发酵液可以被分出5个组分(5个峰值)；图3B为吸光度峰值处物质进行抗真菌活性检测结果，可以看出9号和19号收集管的物质具有抗菌活性，而且9号收集管的抗菌效果明显比19号好。

图4是对9号收集管的物质冷冻干燥浓缩并进行薄层层析纯化后不同斑点抗菌活性检测。薄层层析显色后由近及远依次命名为斑点1，2，3。结果斑点1，2的抗菌效果比较明显，而斑点3只有微弱的抗菌活性。

图5是脂肽的红外图谱。分离纯化的脂肽样品经冷冻干燥成粉末后，压片进行红外图谱分析结果。从图中可以看出，样品中含有氨基，甲基，酰胺键，碳氧键，亚甲基，甲基等功能键，和脂肽的功能基团、功能键相一致。

图6是脂肽的ESI-MS质谱图。对分离纯化的分子量为1065的成分进行ESI-MS质谱分析。

图7是本发明制备脂肽的推测序列。该脂肽由9碳烷基和8个氨基酸组成，在第7个烷基碳和最后一个氨基酸(即亮氨酸)通过一个氧原子形成一个环肽，具有Asp-Val-Leu结构，推测其为一种表面活性物质。

图8是Hoechest 33258染色，显示凋亡细胞核的形状。图8A，C，E为用PBS处理的水稻纹枯病菌；图8B，D为经过100μg/ml的抗真菌脂肽处理水稻纹枯病菌；图8E为用PBS处理的假丝酵母；图7F为经过100μg/ml的抗真菌脂肽处理的假丝酵母；图8A，B是在低倍镜下观察效果；图8C—F是在高倍镜下的观察效果在低倍镜和高倍镜下处理组的荧光比对照组强很多，可以看出能很好的被Hoechest 33258染色，说明处理后细胞膜通透性有较大改变。其中可以看出浓缩的细胞核被染色。

图9是PI和FITC-Annexin V染色检测细胞磷脂酰丝氨酸外翻结果。图9A，C，F为用PBS处理的对照；图9B，D，G为用120μg/ml的抗真菌脂肽处理的细胞；图9A，B为水稻纹枯病菌；图9C—G为假丝酵母。绿色荧光为FITC染色结果，红色为PI对凋亡晚期或者坏死细胞染色结果。显示用120μg/ml的抗真菌脂肽处理后磷脂酰丝氨酸外翻而且细胞膜完整的细胞比对照组多，即凋亡细胞比对照组明显增多。其中D图为典型的凋亡细胞磷脂酰丝氨酸外翻。

图10是细胞内活性氧(ROS)检测。图10A，C分别为用PBS处理的水稻纹枯病菌和假丝酵母；图10B，D分别为120μg/ml的抗真菌脂肽处理的水稻纹枯病菌和假丝酵母。结果显示用120μg/ml的抗真菌脂肽处理的细胞内的活性氧明显高于对照组。

图11是TUNNEL分析结果。图11A为用磷酸缓冲液(PBS)处理的水稻纹枯病菌对照；图11B为用100μg/ml的抗真菌脂肽处理的水稻纹枯病菌；图11C为用PBS处理的假丝酵母对照；图11D为用100μg/ml的抗真菌脂肽处理的假丝酵母。经荧光显微镜观察可以发现用脂肽处理的细胞内荧光比对照组强烈，说明其细胞内DNA断裂较多。绿色荧光为FITC标记的dUTP所发荧光。

具体实施方式

实施例1

1、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的筛选分离：

从中国湖北省武汉市华中农业大学水稻田取分蘖期的水稻数株，洗净后分离根部。将水稻根部外表面以自来水冲洗干净后，再以无菌水冲洗三次，然后以70％乙醇浸泡消毒30s，取出，以无菌水冲洗3次后，用无菌剪刀将水稻根部切成约1mm大小的碎块，然后置于PDA培养基(含200g马铃薯煮出液，20g葡萄糖，20g琼脂，加蒸馏水至1L)上于28℃培养48h。将分离得到的细菌以PD液体培养基(含200g马铃薯煮出液，20g葡萄糖，加蒸馏水至1L)于28℃，180rpm摇床中振荡培养48h，离心，收集上清液并以0.22μm滤膜过滤后，与PDA培养基按体积比分别为10％，5％，2.5％混合倒平皿接种水稻纹枯病菌(华中农业大学植保系植物病理教研室，见参考文献[1])，检测抗菌活性。对检测到显著抗真菌活性的细菌进行16SrRNA和形态鉴定。以PD液体培养基过夜培养分离到的细菌，用常规方法提取细菌的基因组DNA，见参考文献[2]，以测定16SrRNA的通用引物(primerF：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；primerR：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA，由上海生工生物工程技术有限公司合成)进行PCR(PCR反应体系为：双蒸水18.3μl，10×PCR缓冲液2.5μl，通用正反引物，dNTP各1μl，Taq酶0.2μl(PCR反应试剂均为广东东盛生物科技有限公司产品)。反应程序：94℃ 4min，再30循环的94℃ 45s，52℃ 45s，72℃ 90s，再72℃ 10min)，1％琼脂糖电泳检测成功扩增到大小大约为1.5kb的DNA片段，并由上海生工生物工程技术有限公司进行序列测定后在NCBI中经Blast比较分析确定为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)。

培养解淀粉芽胞杆菌的条件为PD培养基或者LB培养基，28℃-37℃培养。

菌株保存方法：取培养好的Bacillus.amyloliquefaciens CH1菌液添加灭菌甘油至终浓度25％于-80℃保存。

2.解淀粉芽胞杆菌CH1无菌发酵液的获取：

接种保存的解淀粉芽胞杆菌CH1菌种10μl到10ml灭菌的PD培养基中，28℃，200rpm振荡培养过夜。然后接种2.5ml新鲜培养物到含250ml新鲜PD培养基的1L三角瓶中，28℃或者37℃，200rpm振荡培养48h。一般每次用4个三角瓶培养1L的培养物。然后8000g离心10min收集上清，并用0.45μm的滤膜过滤灭菌，再用0.22μm的滤膜过滤灭菌，得发酵液-20℃保存备用。

3.解淀粉芽胞杆菌CH1发酵液中抗真菌物质的纯化：

用PD培养基于28℃培养解淀粉芽胞杆菌2天后离心，收集上清液。用“两步萃取法”提取抗菌活性物质，具体步骤是：将培养物上清液首先用等体积的乙酸乙酯萃取后取水相，再以等体积的正丁醇萃取后，以8000g离心20min收集正丁醇相。将得到的正丁醇酯相用真空旋转蒸发器(RE52CS-2型，购自上海亚荣生化仪器厂，按照仪器使用说明书操作)在65℃下蒸干，再用少量的蒸馏水溶解。溶解后得到的溶液离心去沉淀后，将上清液用葡聚糖G-25柱进一步分离纯化，以蒸馏水或10mmol/L的磷酸缓冲液(见参考文献[2])进行洗脱，收集各洗脱组分，每管收集6ml分离洗脱液，并测定OD280，绘制洗脱曲线，结果见图3A，可以看出发酵液可以被分出5个组分(5个峰值)。洗脱曲线各峰值的组分，经过滤除菌后以10％的体积比与PDA培养基混合后用于培养水稻纹枯病菌，进行抗菌活性检测。结果见图3B显示9号和19号收集管的样品，该样品具有抗菌生物活性，而且9号收集管的样品的抗菌效果明显优于19号收集管的样品。

在抗真菌活性分析后，对9号收集管的抗菌物质样品于-53℃进行真空冷冻干燥进行浓缩(heto powerdryLL3000型真空冷冻干燥仪，按照仪器操作说明书操作)。浓缩的溶液用15cm×5cm×0.25cm的硅胶板分离，用正丁醇-乙醇-醋酸-水(v/v＝30：70：5：20)作为展开液。以0.3％水合茚三酮(0.3g茚三酮，100ml正丁醇，3ml醋酸)显色后呈现三个紫色斑点，由近及远依次命名为斑点1，2，3。显示我们分离的物质为一种肽或者蛋白。对不同斑点的抗真菌活性检测，结果见图4，显示斑点1，2的抗菌效果比较明显，而斑点3只有微弱的抗菌活性。纯化的抗真菌物质用考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)进行定量，以牛血清白蛋白作为标准样品，全部分析方法参照上述南京建成生物工程研究所生产考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒的说明书。

4.抗真菌物质的特性鉴定：

(1)红外分析

分离纯化的上述脂肽样品经真空冷冻(-53℃)干燥浓缩成粉末后，压片进行红外图谱分析结果。从图5中可以看出，样品中含有氨基，甲基，酰胺键，碳氧键，亚甲基，甲基等功能键，与脂肽的功能基团、功能键相一致，因此我们所分离的抗真菌物质为一种脂肽。

(2)液相色谱/电喷雾质谱(LC/ESI—MS)分析

我们选取分子量为1043的同系物进行ES-MSI质谱分析。所用质谱仪为Q-trap串联的质谱仪(QTRAP3200，Applied Biosystems，CA，USA)。

样品在Nano-LC(Aksigent公司，名称TEMPER)上通过自动进样器吸入10ul的样品，然后进行反相色谱(C18，OD＝360um，ID＝4.6um)分离。进样室处在16℃环境中，流动相：A为0.1％的甲酸水溶液，B为60％的乙腈和0.1％的甲酸水溶液，流速为200μL/min。梯度淋洗程序为：5％ B(0-5分钟)，然后40分钟内将B线性增加到60％，并保持5分钟。

质谱条件以TurboIonspray参数进行优化后如下：

正离子模式下，离子喷雾电压(IS)2600V，去簇电压60V.质量扫描范围为200--1500。离子源气体I(GSI)，气体II(GSII)，辅助雾化气(CUR)，和加热温度(TEM)分别设定为40，5，30和175℃。

结果见图6，分离物质分子量为1065。结合图5和图6结果，我们推测该脂肽序列如图7所示，该脂肽由9C烷基和8个氨基酸组成，其中第7个烷基C和最后一个氨基酸(亮氨酸)通过一个氧形成一个环肽，具有Asp-Val-Leu结构，为一个表面活性剂。

5.解淀粉芽胞杆菌CH1发酵液抗真菌活性的测定：

研究中发现水稻纹枯病菌(R.solani)对解淀粉芽胞杆菌CH1发酵液敏感，所以在这里我们就选其作为抗真菌分析的敏感真菌代表进行阐述。将步骤2所获得的解淀粉芽胞杆菌CH1过滤灭菌发酵液用PDA培养基按体积比为10％，5％，2.5％的比率混合倒平皿备用。在PDA平皿中将所述的水稻纹枯病菌培养好，然后用打孔器打取直径6mm的菌饼，将菌饼接种到上述含解淀粉芽胞杆菌CH1过滤灭菌发酵液的PDA平皿中，并以菌饼直接接种在PDA平皿做对照，每个条件做3个重复。所有平皿放在28℃恒温培养箱中培养12h和24h，分别测量R.solani培养物的直径。从图1可以看出水稻纹枯病菌在含10％ CH1发酵液的培养基上生长明显受到抑制，而在37℃培养的CH1发酵液比在28℃培养的解淀粉芽胞杆菌CH1发酵液对水稻纹枯病菌的抑制效果更明显。

除开丝状真菌，我们还检测了解淀粉芽胞杆菌CH1发酵液对酵母的抗菌活性。接种假丝酵母(Candidatropicalis)假丝酵母(CCTCC AY91001，湖北省武汉大学内中国典型培养物保藏中心提供)到YPD培养基(10g酵母浸粉，20g蛋白胨和20g葡萄糖溶于800mL蒸馏水中，调节pH至5.5，补充蒸馏水至1L)，28℃培养过夜。然后取0.1ml的假丝酵母新鲜菌液接种到10ml YPD培养基中继续培养48h。取0.5ml的假丝酵母菌液6000rpm离心2min收集细胞，用PBS重悬细胞并调节其浓度至1000细胞/ml。然后用1ml浓度为100μg/ml的脂肽在28℃处理上述细胞4h，再取100μl该细胞悬液涂布在YPD琼脂培养基上，28℃培养2天。以仅用YPD(稀释一倍后涂布)或者PBS处理的细胞作对照，结果见图2。提纯的脂肽可明显抑制假丝酵母的生长繁殖，表现为与对照相比，菌落数减少，菌落大小也明显小于PD或PBS对照。

6.解淀粉芽胞杆菌CH1抗真菌脂肽处理后的细胞凋亡标记检测

(1)用双苯甲亚胺(Hoechst 33258)对经抗真菌脂肽处理过的菌丝染色：

首先在盖玻片上滴上几滴熔化的PDA培养基让其自然延伸至整个载玻片表面，然后接种水稻纹枯病菌到上述载玻片上，25℃培养12h以形成菌丝。然后分别滴加100μg/ml的抗真菌脂肽浸润菌丝2，4，6h，并以滴加PBS的处理作为对照。处理完后PBS冲洗3遍，再用0.1μg/ml的Hoechst 33258(Sigma-Aldrich，美国)(用PBS配制)染色5min。染色完后再用PBS洗盖玻片3遍，再用Olympus BX51荧光显微镜观察。

取1mL如步骤5培养方法培养的假丝酵母菌液，4000rpm离心3min收集沉淀，用PBS洗涤一遍，再用100ug/ml的脂肽溶液在摇床上40-50rpm低速处理2，4，6h后，用Hoechst 33258染色，洗涤后用50％甘油重新悬浮细胞，并以荧光显微镜进行观察。具体方法参见上述对水稻纹枯病菌的处理方法。以PBS处理假丝酵母作为对照。

结果见图8，在低倍镜和高倍镜下处理组的荧光比对照组强很多，处理组能很好的被Hoechst 33258染色，说明处理后细胞膜通透性有较大改变。其中还能看出有浓缩的细胞核被染色。

(2)Annexin V-FITC标记

在盖玻片上培养水稻纹枯病菌，滴加几滴120μg/ml的抗真菌脂肽覆盖菌丝，室温处理6h，以滴加PBS处理的菌丝作为对照。然后用PBS洗菌丝1遍，再用稀释液(0.3mol/L的NaCl和MgSO4)配制的1％的蜗牛酶和纤维素酶在室温处理4h。用稀释液洗涤洗涤菌丝1遍，然后用碘化丙锭(PI)和异硫氰酸荧光素FITC连接的Annexin V蛋白混合液(Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，购自beyotime)室温避光处理20min。混合液按试剂盒中的说明书所述配制，190μl的1×结合缓冲液里加5μl的Annexin V-FITC储存液和10μl的PI储存液(上述试剂为试剂盒自带，见Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，购自beyotime)。处理完后，用结合缓冲液(上述试剂盒自带)洗1遍，再用Olympus BX51荧光显微镜观察。

将培养好的假丝酵母用120μg/ml的脂肽处理6h后，用1％的蜗牛酶和纤维素酶室温处理4h，用稀释液洗涤菌体一遍，并以FITC-Annexin V及PI染色，处理完毕后，用结合缓冲液洗1遍，380g离心5min收集细胞，再用100μl结合缓冲液重悬细胞后荧光显微镜观察。以用PBS处理的酵母细胞作为对照。

结果见图9，可以明显地看出用120μg/ml的抗真菌脂肽处理后磷脂酰丝氨酸外翻而且细胞膜完整的细胞比对照组多，即凋亡细胞比对照组明显增多。图9-D为典型的凋亡细胞磷脂酰丝氨酸外翻。

(3)真菌细胞中活性氧ROS的检测

利用步骤(1)相同方法在盖玻片上培养水稻纹枯病菌，培养好后滴加几滴120μg/ml的抗真菌脂肽覆盖菌丝，室温处理4h，以滴加PBS处理的菌丝作对照。然后用PBS洗菌丝1遍，再用稀释液(0.3mol/L的NaCl和MgSO4)配制的1％的蜗牛酶(购自AMRESCO公司)和纤维素酶在室温处理4h。用稀释液洗涤菌丝1遍，再滴加几滴用稀释液配制的10μmol/L的DCFH-DA(二氯二氢荧光黄双乙酸钠)，室温处理45min，然后用稀释液洗涤3遍后，在荧光显微镜下观察。

取假丝酵母菌液用120μg/ml的脂肽溶液在摇床上低速处理4h后，1％的蜗牛酶和纤维素酶处理4h，再以终浓度为10μmol/L的DCF-DA进行反应45min，然后用稀释液重新悬浮细胞进行荧光显微镜观察。以PBS处理的酵母作为对照，具体处理方法如上述对水稻纹枯病菌处理的方法相同。

如图10所示，结果两种处理组菌丝红色荧光很明显，显示用120μg/ml的抗真菌脂肽处理的细胞内的活性氧明显高于对照组。

(4)脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记分析(TUNEL分析)

将在盖玻片上培养好的水稻纹枯病菌或假丝酵母用100μg/ml的抗真菌脂肽处理6h，然后用4％的多聚甲醛固定1h以灭活内在的DNA末端转移酶的活性。用PBS洗3遍后，用1％的蜗牛酶和纤维素酶溶液室温处理4h去壁。用裂解液洗细胞或盖玻片1次后，再以穿透液(用PBS配制的1％的Triton X-100)冰育2min后，立即用冰预冷的PBS冲洗细胞或盖玻片2遍。在细胞中添加25μl的TUNEL反应混合液(按照试剂盒说明配制：1μl末端脱氧核酸转移酶和24μl缓冲液混合而成，Byotime)37℃反应60min。用PBS冲洗细胞或盖玻片3遍后用50％甘油重悬细胞或封片，然后用于荧光显微镜观察。以用PBS处理的水稻纹枯病菌或酵母细胞作为对照。经荧光显微镜观察，结果见图11，可以发现用脂肽处理的细胞内荧光比对照组强烈，说明其细胞内DNA断裂较多。

参考文献：

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