获自毕赤酵母的自动诱导型磷酸钠协同转运体启动子和利用该启动子制造重组蛋白的方法

摘要

本发明公开了获得自毕赤酵母的自动诱导型NPS启动子；携带所述启动子和核苷酸序列的重组表达载体，所述序列与所述启动子可操作地连接并编码重组蛋白；用所述重组表达载体转化或转染的宿主细胞；以及制造重组蛋白的方法，所述方法包括培养所述宿主细胞以表达所述重组蛋白并分离所述蛋白。所述NPS启动子可大规模地制造感兴趣的重组蛋白而无需任何诱导物。

说明书

技术领域

本发明涉及获自毕赤酵母(Pichia pastoris)的自动诱导型NPS启动子和利用所述启动子制造重组蛋白的方法。更具体而言，本发明涉及获自毕赤酵母的自动诱导型NPS启动子；携带所述启动子和核苷酸序列的重组表达载体，所述序列与所述启动子可操作地连接并编码重组蛋白；转化或转染有所述重组表达载体的宿主细胞；以及制造重组蛋白的方法，所述方法包括培养所述宿主细胞以表达所述重组蛋白并分离所述蛋白。

背景技术

蛋白质合成是开始于转录的多步过程，其中，由DNA编码的遗传信息转移至mRNA模板。转录开始于起始过程。RNA聚合酶与DNA的称为启动子的特定区域相结合，所述启动子通常位于待转录的基因的上游。许多启动子(但并非所有的启动子)含有共同(保守)序列，这样的序列称为共有序列。

在原核细胞中，启动子由位于转录起始位点上游的-10位点和-35位点的两段短序列构成。在-10位点的序列通常由六个核苷酸“TATAAT”(TATA盒)构成。在-35位点的另一序列通常由六个核苷酸TTGACA构成。大多数启动子相互之间的区别在于实际碱基序列以及离所述共有序列的转录起始位点的距离。这种变异性据信会导致启动子起始转录的不同频率，即启动强度。因此启动子是决定蛋白质制造效率的重要因素之一，并且目前正为在各种微生物中开发出强的且具有特异性的启动子而进行广泛的研究。

毕赤酵母，一种甲基营养型酵母，正成为甲醇代谢和过氧化物酶体生成的研究中有用的重要生物模型，并且是优于作为传统酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的蛋白制造宿主系统。此外，受益于其特征性代谢和生理活性，毕赤酵母被公认是一种有用的工业资源，其可用于环境友好的生物过程中。

毕赤酵母氧化甲醇经过甲醛和甲酸至二氧化碳。这些反应分别由醇氧化酶(AOX)、甲醛脱氢酶(FLD)和甲酸脱氢酶(FMDH)催化。毕赤酵母有两个醇氧化酶基因(AOX1和AOX2)，这两个基因有各自的诱导型启动子。受益于其高活性，所述AOX1启动子通常用以在酵母中表达重组蛋白，而已知所述AOX2启动子(美国专利号5,032,516)表现出相对较弱的活性(J.Tschopp等，Nucleic Acids Res.1987，第15卷，第3859-3876页)。此外，已研发出FLD基因启动子(D.Resina等，Journal ofBiotechnology，2004，第109卷，第103-113页)。对于毕赤酵母也已研发出甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子，该启动子已知为在各种微生物中的强组成型启动子(Waterham等，Gene，1997，第186卷，第37-44页)。

通过毕赤酵母制造重组蛋白中最常用的是参与甲醇代谢并由甲醇强烈诱导的启动子。当使用参与甲醇代谢的基因的启动子时，必须小心谨慎以避免火灾，这是因为转录需要甲醇这种高度易燃的燃料。在此情况下，生产设施必须包括特殊设备并要求仔细的检查。此外，采用GAP启动子时，难以控制蛋白表达的效率。当对所述细胞的生长有副作用时，其他组成型启动子由于会导致细胞不稳定，因此也难以使用在蛋白质的大规模制造中。

因此，需要这样的强启动子，即该启动子经诱导可足以调控重组蛋白在适于大规模制造的所需时间点的表达或足以调控蛋白的过表达，并且其诱导所需的诱导物或者不受该过程的影响，或者根本不需要诱导物。

发明内容

为实现本发明，本发明人经过深入而全面的研究，建立了不存在传统方法中所遇到的问题的蛋白制造系统，这导致这样的发现，即，当随着细胞的生长，合适的起始磷浓度降低至一个有限水平时，本发明的获自毕赤酵母的NPS启动子在无需任何诱导物的情况下自动诱导，因此能有效地制造目标蛋白。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种启动子，其选自由以下序列组成的组：(1)SEQ ID NO.：4的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO.：4的位点337～位点1,044的核苷酸序列；(3)SEQ ID NO.：4的位点571～位点1,044的核苷酸序列；和(4)SEQ ID NO.：4的位点743～位点1,044的核苷酸序列。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种重组表达载体，其包括所述启动子和与所述启动子可操作地连接的编码重组蛋白的核苷酸序列。

根据本发明的再一方面，本发明提供了一种转化或转染有所述重组表达载体的宿主细胞；

根据本发明的再一方面，本发明提供了一种用于制造重组蛋白的方法，其包括：培养所述宿主细胞以表达所述重组蛋白；和从培养物中分离所述重组蛋白。

附图说明

由以下详细描述并结合附图将可以更清楚地理解本发明的以上以及其他目的、特征和其他优点，其中：

图1显示了采用NPS基因对来自于在磷限量培养基中培养的毕赤酵母的mRNA进行的Northern印迹结果(所述细胞以0.14(1)，0.08(2)和0.03(3)的特定生长速度生长)；

图2是显示重组表达载体pNPS-AM-CLLip的构建的示意图，所述重组表达载体包含获自毕赤酵母的NPS基因和与所述NPS基因可操作连接的报道基因；

图3A是其中绘制了在含有不同起始磷含量的培养基(●：磷不足，：磷限量，■：磷过量)中，分批培养用pNPS-AM-CLLip转化的毕赤酵母时，细胞培养物在不同培养时间的脂肪酶活性的曲线图；

图3B是其中绘制了在含有不同起始磷含量的培养基(○：磷不足，：磷限量，□：磷过量)中，分批培养用pNPS-AM-CLLip转化的毕赤酵母时，细胞培养物在不同培养时间的磷浓度的曲线图；

图3C是其中绘制了在含有不同起始磷含量的培养基[葡萄糖浓度-(○：磷酸盐耗尽，：磷限量，□：磷过量)，细胞密度-(●：磷不足，：磷限量，■：磷过量)]中，分批培养用pNPS-AM-CLLip转化的毕赤酵母时，在不同培养时间的葡萄糖浓度和细胞密度的曲线图；

图4是在含有不同起始磷含量的培养基中培养经pNPS-AM-CLLip转化的毕赤酵母所获得的脂肪酶蛋白的Western印迹结果；和

图5是描述筛选对NPS启动子生物功能必需的最小核苷酸序列的示意图(+：阳性脂肪酶活性，ND：未检测到脂肪酶活性)。

具体实施方式

根据本发明的一个方面，本发明涉及编码用于磷酸盐运输的Na⁺-磷酸盐协同转运体(下文中称为“NPS”)的基因。本发明的NPS基因具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。该NPS基因可根据SEQ ID NO：1的序列进行化学合成，或者采用对应于所述基因两端的预定区域的引物，使用毕赤酵母的基因组DNA作为模板，通过PCR进行合成。本发明的获自毕赤酵母的NPS基因能用作检测来自毕赤酵母各个种的NPS基因的探针。

根据本发明的另一方面，本发明涉及用于调控毕赤酵母中NPS基因的表达的启动子。在一个实施方式中，所述NPS基因的启动子由SEQID NO.：4(1,044bp)的核苷酸序列构成。即使所述SEQ ID NO.：4的核苷酸序列的一部分，尤其是TATA区或CAT区，也被发现具有与由SEQ IDNO.：4构成的启动子几乎相同的功能。为了鉴别行使NPS基因启动子功能所必需的最小序列，制备了各种截短的启动子构建体，这些构建体包括缺失碱基1～336、1～570、1～742、1～838、1～891和1～921的序列。检测这些截短的启动子构建体使与其可操作连接的重组蛋白表达的能力。结果，观察到具有SEQ ID NO.：4的核苷酸序列的截短构建体在缺失碱基1～336、1～570或1～742时能表达重组蛋白，但在缺失1～838、1～891或1～921时不能表达重组蛋白。

因此，本发明的NPS基因启动子选自由(1)SEQ ID NO.：4的全长核苷酸序列；(2)SEQ ID NO.：4的位点337～位点1,044的核苷酸序列；(3)SEQ ID NO.：4的位点571～位点1,044的核苷酸序列；和(4)SEQ IDNO.：4的位点743～位点1,044的核苷酸序列组成的组。优选的是，本发明的NPS基因启动子包括SEQ ID NO.：4的位点743～位点1,044的核苷酸序列，该核苷酸序列由SEQ ID NO.：15表示。

这些NPS基因启动子可以根据在本发明中公开的核苷酸序列进行化学合成，或者采用对应于所述公开的各核苷酸序列的两端的预定区域的引物，使用毕赤酵母的基因组DNA作为模板，通过PCR进行合成。由于本发明的NPS基因启动子获得自毕赤酵母，因而能用作检测至少来自毕赤酵母各个种的NPS基因的启动子的探针。

当在磷限量的条件下进行培养时，可观察到毕赤酵母过表达所述NPS基因(实施例1)。在表达与所述NPS启动子结合的报道基因的试验中，观察到由于随着细胞生长，耗尽了起始浓度的磷酸盐，所述NPS启动子发生了自动诱导，因此使得即使在不存在任何诱导物的情况下也能过表达所述目标蛋白(实施例4)。当在细胞生长过程中，培养基中可供使用的磷酸盐变得有限时，所述NPS启动子自动诱导，并因此强烈表达与其可操作连接的基因。因此，获得自毕赤酵母的所述“NPS启动子”可用作自动诱导型启动子。

“启动子”是位于基因上游的DNA调控区域，该调控区域募集RNA酶到该调控区域上以提供调控基因转录的控制点。通常，启动子可分为两类。首先，响应于诱导物的存在而激活，“诱导型启动子”可启动与之相关的基因的表达。诱导型启动子在用于表达基因时要求募集诱导物，这类诱导物通常价格昂贵，并且在一些情况下可导致身体或宿主细胞的毒性。此外，诱导物的使用要求进行培养时要进行多种考虑，包括提供所述诱导物的时间点、培养基中诱导物的浓度等。另一方面，“组成型启动子”是未受调控的启动子，可使与其相关的基因连续转录而无需诱导物。然而，当使用组成型诱导物时，基因表达的时间点不受控制。因此，当目标蛋白导致对宿主细胞的生长的毒性或副作用时，其难以大规模制造。相反，“自动诱导型启动子”使与之相关的基因在所希望的时间点表达，这是因为它的激活并非响应于诱导物的存在而发生。它响应于培养条件的限制或特定营养的耗尽而被诱导，因此克服了诱导型启动子和组成型启动子的多种缺点。

得益于NPS基因的表达水平，可预期到本发明的NPS基因启动子对与其相关的基因的表达的作用。在一个实施方式中，采用对所述NPS基因的mRNA水平的检验，可定量地确定其表达水平。在本领域中已知多种RNA检验技术。例如，可使用RT-PCR、Northern印迹、杂交、斑点杂交、DNA阵列杂交和/或DNA微珠。

此外，独立检验了本发明NPS启动子诱导重组蛋白表达的能力。在本发明的一个实施方式中，报道基因的表达处于NPS启动子的控制之下，并可以定量地测量。适于该目的的报道基因的例子包括lacZ(β-半乳糖苷酶)、uidA(β-葡萄糖醛酸酶)、neo(新霉素磷酸转移酶)、cat(氯霉素乙酰转移酶)、dhfr(二氢叶酸还原酶)、aphIV(潮霉素磷酸转移酶)和lux(荧光素酶)。在本发明中，其中纤维素结合域与来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的脂肪酶连接的融合蛋白(Ahn等，Journal ofMicrobiol.Biotechnol.2003，第13卷，第451页)优选用作报道子。除了不导致毒性之外，所述融合蛋白还具有由于该纤维素结合域而高效率地分泌脂肪酶的优点，并能测量活性，因此反映出了所述融合蛋白的表达水平(实施例2)。

可使用本领域中广泛已知的方法定性地或定量地分析所表达的报道子。尽管取决于报道基因，但是所述方法优选涉及使用与相应报道蛋白或其片段特异性结合的抗体。适合的抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗体，并包括可接受修饰抗体或衍生物，如Fab片段和单链抗体。为通过抗原-抗体反应对分析物进行鉴别和定量，可采用凝集法测定、Western印迹、ELISA、RIA、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)或免疫沉淀。

如上所述，本发明的NPS启动子能在所希望的时间点强烈表达可操作连接的基因而无需诱导物的协助，并因此可用在重组蛋白的制造中。术语“重组蛋白”意指通过基因工程技术制备的蛋白，而并非局限于任何特定的一种蛋白。因此，术语“重组蛋白”可与术语“目标蛋白”交换使用。

重组蛋白的制造之前必须构建携带有NPS启动子和与该启动子可操作连接的编码所述重组蛋白的核苷酸序列的重组表达载体。所述重组表达载体构成本发明的一个方面。所述重组载体可由商业提供的载体进行制备。在此情况下，在所述载体中原本存在的启动子可由本发明的NPS启动子所替代。此外，所述重组载体可经过设计以含有本发明的NPS启动子和通常使用的调控序列。

如此处所使用的术语“载体”是指起到稳定地将重组蛋白的核苷酸序列输送到宿主细胞中的作用的媒介物。为了能够使用，载体必需具有自身复制并转化到宿主细胞中的能力，并且必须包括可检测部分。

如此处所使用的术语“重组表达载体”意指用于向宿主细胞中引入并表达特定可操作连接的基因的环状DNA分子。如在本领域中广泛已知的，为了提高引入到宿主细胞中的异源基因的表达水平，所述基因必须可操作地与能在所述宿主细胞中起作用的转录和翻译调控序列连接。优选的是，感兴趣的基因由含有调控序列、可选择的标记和复制起点的一个载体所携带。

如此处所使用的术语“调控序列”指对重组蛋白的表达是必须的或者有益的核苷酸序列。调控序列的例子包括分泌信号序列、多聚腺苷酸化信号序列、前肽序列、增强子、上游激活序列和转录终止因子。在本发明中，所述调控序列至少包括启动子，并优选包括启动子和分泌信号序列。可选的是，所述调控序列可包括其他调控因子，以提高目标蛋白的表达水平。

如此处使用的术语“分泌信号序列”意指能使所表达的蛋白运输到细胞外的氨基酸序列，并通常用以促进重组蛋白的分离和纯化。转移到细胞外的表面蛋白或分泌蛋白具有在细胞膜中被信号肽酶切割的N-末端序列。可用在本发明中的分泌序列的例子包括但不局限于α-因子信号序列、杀伤毒素前导信号序列(killer toxin leader signal sequence)、转化酶信号序列和α-淀粉酶信号序列。

为了被表达，编码重组蛋白的核苷酸序列必须可操作地连接于包括本发明的启动子的调控序列。如此处所使用的术语“可操作地连接”指一条核苷酸序列与另一条核苷酸序列功能性地排列。例如，如果其参与成熟蛋白的分泌，则分泌序列可操作地连接于所述蛋白。如果编码序列的转录处于启动子的控制之下，则其可操作地连接于所述启动子。如果核糖体结合位点位于能使编码序列被翻译的位置，则其可操作地连接于所述编码序列。通常，“可操作地连接的”DNA序列与另一序列相接触。例如，分泌性前导序列与目标基因相接触，并存在于开放阅读框之内。然而，增强子不需要与目标基因相接触。

用所述重组表达载体转化或转染的宿主细胞构成本发明的另一方面。可用在本发明中的宿主细胞的例子包括典型的真核细胞宿主和原核细胞宿主，如大肠杆菌(E.coli)、各假单胞菌种(Pseudomonas spp.)、各芽孢杆菌种(Bacillus spp.)、各链霉菌种(Streptomyces spp.)，真菌和酵母，昆虫细胞如草地贪夜蛾(SF9)，动物细胞如CHO和小鼠细胞、非洲绿猴细胞(如COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40和BMT 10)，培养得到的人类细胞和植物细胞。在本发明中优选酵母细胞。更优选为毕赤酵母，这是因为它有与本发明的NPS启动子相同的来源。

可根据由Davis等在Basic Methods in Molecular Biology，198中公开的技术进行转化或转染。优选的例子包括DEAE-葡聚糖介导转染、电穿孔、转导、磷酸钙转染、阳离子脂质体介导转染、划痕荷载和感染。

根据本发明的另一方面，本发明涉及制造重组蛋白的方法，其包括培养经转染或转化的细胞以表达所述重组蛋白并分离所述重组蛋白。

根据常规技术，本发明的宿主细胞可培养在适用于重组蛋白生成的营养培养基中，例如，在早期阶段(初始培养阶段)磷浓度为0.001～0.02mM的含磷培养基。例如，可通过在允许表达和/或分离目标蛋白的条件下小规模或大规模发酵或摇瓶发酵而在实验室或工业发酵罐中培养宿主细胞。可采用已知技术在含有碳源、氮源和无机盐的合适营养培养基中进行培养。培养基可以是商业提供的一种培养基，或者可以参考在American Type Culture Collection的目录中公开的组分和组成而制备的培养基。本发明的宿主细胞可经过分批培养或补料分批培养。

如此处所使用的术语“分批培养”指使用在初始阶段将生长所必需的所有营养物一次加入的培养基的生物分批过程。在分批培养中，所述宿主细胞能够生长到一种必需营养物耗尽之后，或者生长到不适于其生长的条件形成(例如，pH降低，因此抑制宿主细胞的生长)之后。

如此处所使用的术语“补料分批培养”指基于在发酵开始后立即、或者在所述培养基达到预定阶段后、或者所述营养底物耗尽之后，将一种或多种生长营养底物补加到培养物中的生物分批过程。在补料分批过程中，例如将pH调节至预定值，并且将至少一种生长营养物再补加到培养物中。所述宿主细胞的生长速度取决于营养物的补加速率。通常，单种营养物或碳源是生长限制因素。同样，其他营养或条件也可用作限制因素。例如，宿主细胞的生长可受限制于氮源、氧或各种特定营养物如维生素或氨基酸(当所述宿主细胞对此是营养缺陷型时)。

可采用本领域中已知的方法从所述培养物中分离重组蛋白。例如，从所述培养物中分离重组蛋白可通过但不局限于传统方法来实现，所述传统方法例如为离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发和沉淀。此外，各种技术，包括色谱法(例如离子交换法、亲合法、疏水法和尺寸排阻法)、电泳法、分离结晶法(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE和萃取法可使用在所述重组蛋白的纯化中。

通过以下实施例能更好地理解本发明，提供所述实施例的目的是为了说明本发明，而不应理解为限制本发明。

实施例

<实施例1>

来自毕赤酵母的NPS启动子的克隆

为了筛选在磷限量条件下能够在毕赤酵母中过表达的基因，根据本申请人在2004年11月27日递交的韩国专利申请2004-98303中公开的方法，在磷限量培养基中以连续方式进行培养。将从如此培养的细胞团(cell mass)中分离出的mRNA用作RT-PCR的底物，以获得过表达基因库。通过核苷酸测序发现，所述基因库含有负责磷代谢的Na⁺-磷酸盐协同转运体(NPS)基因。

随之，克隆了用于调控所述基因表达的启动子。在这点上，在合成引物(SEQ ID NO.：2和SEQ ID NO.：3)的存在下，用先前克隆的Na⁺-磷酸盐协同转运体(NPS)基因作为探针进行反向PCR。使用毕赤酵母的经各种限制性酶消化后的基因组DNA作为所述反向PCR的模板。通过反向PCR从KpnI消化后所得的基因组DNA片段中检测到编码Na⁺-磷酸盐协同转运体(NPS)的基因。将该NPS基因克隆在pSTBlue-1载体中，由此形成的重组载体命名为“pST1”。通过碱基测序，发现了NPS的开放阅读框及其上游区域，即1,044bp长的启动子(SEQ ID NO.：4)。该启动子称为“P_NPS”。

通过使用分离自在磷限量条件下培养的细胞的mRNA对所述NPS基因进行Northern印迹，观察到所述基因在磷限量条件下的过表达(图1)。

<实施例2>

携带所述启动子P_NPS的重组表达载体的构建

使用脂肪酶基因作为报道基因以验证所克隆的启动子P_NPS的活性。详细地说，脂肪酶L1F(CBD-L1-脂肪酶，其中编码纤维素结合域的基因与脂肪酶连接)用作报道基因，这是因为它能更稳定地表达脂肪酶L1(Ahn等Journal of Microbiol.Biotechnol.2003，第13卷，第451页)。携带有脂肪酶基因和所述启动子P_NPS的重组表达载体基于pPIC9载体(Invitrogen，U.S.A.)。

参考图2，其中描述了制备携带有脂肪酶报道基因和所述启动子P_NPS的重组表达载体的方法。在合成引物SEQ ID NO.：5和SEQ ID NO.：6(分别含有AvrII和NotI限制性位点)的存在下，通过PCR由pYEGA-AM-CLLip(Ahn等，Journal of Microbial.Biotechnol.2003，第13卷，第451页)扩增含有源自α-淀粉酶的分泌信号和脂肪酶的序列。同样，在合成引物SEQ ID NO.：7和SEQ ID NO.：8(分别含有BglII和AvrII限制性酶位点)的存在下，将实施例1中克隆的pST1用作模板，通过PCR扩增所述启动子P_NPS。编码源自α-淀粉酶的分泌信号和脂肪酶的基因用AvrII和NotI进行消化，而所述启动子P_NPS用BglII和AvrII进行处理。随后，将编码源自α-淀粉酶的分泌信号和脂肪酶的报道基因和所述启动子P_NPS连接至用BglII和NotI部分消化的pPIC9载体。结果，制备了携带所述启动子P_NPS和编码源自α-淀粉酶和脂肪酶的基因的重组表达载体，并称之为“pNPS-AM-CLLip”。当由所述载体表达时，所述α-淀粉酶用作分泌信号以对所述脂肪酶进行胞外分泌。

<实施例3>

毕赤酵母的转化

用在实施例2中制备的重组表达载体pNPS-AM-CLLip转化毕赤酵母GS115。实施例2中制备的表达载体插入到毕赤酵母GS115基因组上的his4基因中。为此，使用也存在于所述his4基因中的BspEI消化所述重组表达载体，然后采用锂/TE法(Hill等，Nucl.Acids.Res.1991，第19卷，第5791页)转化到毕赤酵母中。详细地说，将经BsPEI消化的所述重组表达载体、载体DNA和PEG/LiAc相混合并在30℃下反应30分钟。然后，在加入DMSO后，在42℃下反应15分钟。离心后，将沉淀在200μl TE缓冲液中悬浮。将所述悬浮液铺在His(-)板上(葡萄糖2％、酵母氮源0.67％、无his的氨基酸混合物0.077％、琼脂2％)，然后进行2～3天的培养。从所得的转化体中，选择出在基因组中仅插入单拷贝的所述重组表达载体的转化体。

<实施例4>

脂肪酶在P_NPS控制下的表达

采用报道基因来观察所述启动子P_NPS对所述报道基因在多种磷浓度下的表达方式的影响。

更详细地说，将实施例3中选择出的用pNPS-AM-CLLip转化的毕赤酵母以分批方式在含有不同初始磷浓度(用NaH₂PO₄·2H₂O进行调节)的培养基(如以下表1所示)中培养。取出来自细胞团的培养物并分析脂肪酶水平。

根据培养时间测量细胞团干重、脂肪酶活性以及葡萄糖、甘油和磷的浓度。如下进行所述测量。

(1)细胞团干重：将通过细胞培养物的离心获得的细胞沉淀用等渗缓冲液洗涤，在80℃干燥并称重。

(2)脂肪酶活性：用pH-stat法测量脂肪酶的滴度。

(3)葡萄糖水平：用葡萄糖分析仪定量分析葡萄糖。

磷水平：用Fiske-Shubbarow法(Fiske等，Journal of BiologicalChemistry，1925，第66卷，第375页)定量分析磷。

表1

在分批方式中采用的培养基的组成

 

组分培养基A(g/L)培养基B(g/L)培养基C(g/L)葡萄糖505050MgSO₄·7H₂O333(NH₄)₂SO₄151515K₂SO₄4.554.554.55KOH1.031.031.03CaCl₂0.30.30.3NaH₂PO₄·2H₂O0.0250.252.5微量元素2mL2mL2mL

参考图3A、3B和3C，绘制了当用pNPS-AM-CLLip转化的毕赤酵母以分批方式在含有不同起始磷含量的培养基中培养时，脂肪酶活性、磷浓度、细胞密度和葡萄糖浓度相对于培养时间的图。

如图所示，培养基中较高的起始磷浓度导致较快的细胞生长速率和葡萄糖摄入速率。在培养基C中，含有20mM的起始磷浓度(磷过量)，细胞生长至70O.D.并且50g/L葡萄糖在开始培养后22小时内完全耗尽的程度。在培养基B中，含有2.0mM的起始磷浓度(磷限量)，细胞生长至61O.D.并且起始量为50g/的L葡萄糖在开始培养后37.5小时完全消耗。培养基A含有0.20mM的起始磷浓度(磷贫乏)，即使在培养40小时后，经测量还具有43g/L的葡萄糖，而细胞生长至至多15O.D.。这些数据表明，磷浓度影响了细胞的生长。培养基C仅在对数期生长末期显示出低浓度磷，表明所述细胞的生长不受限于磷。在培养基B中，从开始培养后12小时开始，细胞的生长受到限制。因为起始提供非常少量的磷，培养基A仅允许细胞以受限的速率生长。

在培养基B中观察到脂肪酶活性，然而在培养基A和培养基C中几乎未检测到脂肪酶活性。这可由图4的Western印迹结果所证实。因此，当随着细胞为其生长而消耗磷，使磷浓度由恰当的起始水平降低至受限水平时，所述NPS启动子自动诱导，因而能够制造可操作连接的蛋白。相反，当磷的浓度丰富而使所述细胞未受磷的限制时，或者所述磷的浓度对于细胞生长而言太低时，则没有制造目标蛋白。结果，本发明的NPS启动子是可自动诱导的，因此能用磷浓度进行控制，可以在磷限量条件下表达而无需任何诱导物。

<实施例5>

NPS启动子的必要控制区的筛选

为了鉴别其在转录中起到根本作用的区域，从5’-端将先前克隆的1,044bp长的P_NPS(SEQ ID NO.：4)截短至预定位点，并将由此形成的启动子片段与如同实施例2的在pNPS-AM-CLLip载体中那样用作报道基因的所述脂肪酶基因连接。

详细地说，所述启动子P_NPS(SEQ ID NO.：4)的、缺失位点1～位点336、570、742、838、891和921的区域的多条核苷酸片段是采用SEQID NO.：9和8、SEQ ID NO.：10和8、SEQ ID NO.：11和8、SEQ ID NO.：12和8、SEQ ID NO.：13和8、以及SEQ ID NO.：14和8多套引物，用pNPS-AM-CLLip作为模板，通过PCR进行制备的。由此得到的各PCR产物用BglII和AvrII消化并独立地连接至预先用BglII和AvrII消化的pNPS-AM-CLLip。所得重组表达载体分别命名为pNPS(Δ336)-AM-CLLip、pNPS(Δ570)-AM-CLLip、pNPS(Δ742)-AM-CLLip、pNPS(Δ838)-AM-CLLip、pNPS(Δ891)-AM-CLLip和pNPS(Δ921)-AM-CLLip。如实施例3所述，将这些表达载体转化到毕赤酵母GS115之中，并选择在所述基因组中仅分别插入单拷贝的相应重组表达载体的转化体。

为了测定截短的启动子是否是活性的，将所选择的转化体在能利用脂肪酶活性形成晕圈(halo)的板上进行培养。如图5所示，分别用pNPS(Δ336)-AM-CLLip，、pNPS(Δ570)-AM-CLLip和pNPS(Δ742)-AM-CLLip转化的毕赤酵母株观察到具有相似的脂肪酶活性，而在用pNPS(Δ838)-AM-CLLip、pNPS(Δ891)-AM-CLLip或pNPS(Δ921)-AM-CLLip转化的毕赤酵母中未检测到活性。因此，从3’-端沿5’-端方向跨越302bp长度的区域对于SEQ ID NO.：4的P_NPS功能是必需的。启动子P_NPS的必需部分用SEQ ID NO.：15表示。

工业应用性

随着细胞生长，当恰当的起始磷浓度降至受限水平时，本发明的源自毕赤酵母的NPS启动子自动诱导，从而能有效地制造目标蛋白。利用本发明的可自动诱导的NPS启动子的诱导型或组成型表达系统可以是解决大规模制造重组蛋白的传统方法所面临的细胞株的稳定性问题和其他问题的有前景的解决方案。

尽管结合目前认为最实际和最优选的实施方式对本发明进行了描述，但应当理解本发明并不局限于所公开的实施方式及其附图，而相反，本发明旨在涵盖在所附权利要求的精神和范围之内的各种改进和变化。

序列表

<110>韩国生命工学研究院

      李弘远

      安廷梧

      郑俊基

      崔毅星

      金千锡

      李殷教

      洪智涎

      李赫远

      朴明洙

<120>获自毕赤酵母的自动诱导型磷酸钠协同转运体启动子和利用该启动子制造重组蛋白的方法

<130>FCI08KR2709C

<150>KR10-2006-0033064

<151>2006-04-12

<160>15

<170>Kopatentln 1.71

<210>1

<211>732

<212>DNA

<213>毕赤酵母

<220>

<221>基因

<222>(1)..(732)

<400>1

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

<210>4

<211>1044

<212>DNA

<213>毕赤酵母

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(1044)

<400>4

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

<210>8

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>启动子

<400>8

<210>9

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

<210>10

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

<210>11

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

<210>12

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

<210>14

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>14

<210>15

<211>302

<212>DNA

<213>毕赤酵母

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(302)

<400>15