荧光原位杂交技术检测沉积物中微生物种群的方法

摘要

本发明公开了一种荧光原位杂交技术检测沉积物中微生物种群的方法，包括沉积物样品的预处理、样品的涂布与脱水、杂交与洗净、用荧光显微镜观察，根据不同的探针所引起的荧光反应鉴别沉积物中所包含的微生物群落。本发明通过对荧光原位杂交技术的分析条件进行优化，削弱了样品的自发荧光，消除了非特异性杂交，确定了合适的杂交时间与洗脱液浓度，使得FISH技术很好的应用于沉积物样品中微生物种群的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说涉及荧光原位杂交技术(FISH)检测沉积物中微生物种群的方法。

背景技术

传统上，微生物群落结构的调查方法一直是建立在分离和培养的方法上。然而，由于环境微生物中只有一部分能被培养，进行微生物多样性分析时其结果往往是局限的，不能精确地反映混合菌群的组成和多样性，对于一些培养条件要求较苛刻或未被培养的细菌往往不能达到预期效果。因此用传统培养方法所得出的调查结果不能准确反映微生物群落的组成情况，建立和发展一种不依赖微生物培养的方法来进行微生物群落结构研究是非常必要的。

近几年，随着分子生物学技术如分子杂交、PCR、核酸测序等的发展，微生物学研究领域发生了深刻的变革，灵敏的检测和精确的细菌鉴定成为可能。借助分子生物学方法进行特异微生物的快速检测和鉴定已成为现代微生物诊断和生态学研究的重要手段。上世纪80年代末至90年代以来，分子生物学技术开始被广泛应用于微生物群落结构分析，且发展迅速，研究的焦点集中在具有保守序列的16SrRNA上。研究方法包括分子杂交法、PCR法、SSCP法、DGGE法、TGGE法、RFLP法、ERIC-PCR法和克隆基因文库分析法等，具有很高的灵敏性，与传统的培养方法或其它不依赖培养技术的方法相比显示出明显的优越性，推动了微生物群落结构研究的快速发展。但是，这些基于PCR的方法可能会在扩增反应中引入误差，降低所得信息的精确度。在实际工作中，用单一的分子生态学方法并不能完全达到预期的目的，常常需要综合运用多种分子生态学手段，有时甚至要结合传统方法，才有可能对复杂的微生态系统进行全面的分析。

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)作为一种不依赖PCR的分子分析技术是以上各种分子标记技术的有益补充，它结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性信息，可以在自然或人工的微生物环境中监测和鉴定不同的微生物个体，同时对微生物群落进行评价。目前，FISH技术广泛应用于微生物分子生态学和环境微生物学中，已成为微生物群落研究的重要技术手段。

FISH是一种重要的非放射性原位杂交技术，其原理是基于碱基互补的原则，用荧光素标记的已知外源DNA或RNA作探针，与载玻片上的组织切片、细胞涂片、染色体制片等杂交，与待测核酸的耙序列专一性结合，通过检测杂交位点荧光来显示特定核苷酸序列的存在、数目和定位。在微生物学研究中FISH检测最常使用的靶序列是16SrRNA，这是由于16S rRNA具有遗传稳定性，它的结构域具有保守区和可变区。对于每个分类水平，根据rRNA目标区域可设计寡核苷酸探针，进行种属特异性鉴定。16SrRNA基因比较测序在进行微生物鉴定时是最简便和准确的，尤其是对混合菌群和未被培养的微生物进行诊断时更为重要。在每个处于复制和代谢活跃的细胞中高拷贝的16SrRNA通常为监测单个细菌细胞提供了足够的靶序列。其他的靶序列如23S rRNA，18SrRNA和mRNA也被成功地用于FISH检测。根据序列的保守性和特异性设计所需要的不同分类级别的寡核苷酸探针，识别特异核苷酸序列的带标记的一段单链DNA或RNA分子，该探针与待测靶DNA同源互补，经变性—退火—复性形成靶DNA与核酸探针的杂交体。FISH中使用的寡核苷酸探针是一段长度为15～30bp，它容易渗透到目标细胞或组织中。通常在寡核苷酸探针的5’端通过共价键与简单荧光染料分子链接，经荧光检测系统对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。常用的荧光体有：荧光素(fluorescein)、四甲基若丹明(tetramethylrhodamine)、羰花青(如Cy3或Cy5)等。

关于FISH技术应用于环境样品中微生物群落结构的分析，许多研究都有所涉及，但没有应用于检测沉积物样品中微生物数量和分布情况的标准化方法。与纯培养菌液及活性污泥不同，由于沉积物样品成分组成复杂，样品镜检过程中，受到了样品中化学物质(如碳酸钙等)自身荧光的干扰，这就需要进行特殊的处理，以获得良好的效果。不仅这样，FISH实验过程中，由于固定方法或者洗脱不完全，很容易导致非特异性杂交，产生假阳性；杂交反应的时间也是一个重要的影响因素，杂交时间过短会造成杂交不完全，杂交时间过长会增加非特异性着色。因此，需要对FISH技术进行优化，使其很好地应用于沉积物样品微生物群落结构的检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速检测沉积物中特定微生物的荧光原位杂交技术。

为解决上述技术问题，本发明的思路如下：

为了得到较为理想结果，本发明对FISH分析条件进行了优化，主要是对样品的自发荧光进行了削弱，对非特异性杂交进行了消除，确定了合适的杂交时间与洗脱液浓度。

为了消除样品自身荧光的干扰，获得较佳的效果，样品用多聚甲醛固定后，用0.2mol/L HCl进行处理，使其与碳酸钙等物质反应，减少它们的干扰，之后再进行杂交。对比荧光显微镜观察的图片(图1a、b)可看出，盐酸处理可消除部分自发荧光的发生，减小背景值，提高了显微镜观察的效果。

但是，对于微生物的自身荧光，如许多霉菌和酵母菌如假单胞菌属、军团菌属、蓝细菌属等一些细菌中存在的荧光特性，通过分析样品的自身背景荧光和避免其对FISH检测的影响是很困难的，应用传统的表面荧光显微镜则很难获得较高的信噪比，而应用共聚焦激光扫描显微镜则能获得较好的效果。

对于非特异性杂交的排除，本研究主要采用DAPI染色来解决。研究发现，使用DAPI染色是控制因方法问题导致假阳性的有效手段。DAPI可与DNA双链凹槽处结合，在紫外光下发出蓝紫色荧光。因此，在杂交后对样品进行DAPI染色，并同时进行荧光镜检，由于DAPI检测的是总菌数，因此，DAPI染色无荧光产生，但FISH杂交后却有荧光的即为非特异性结合的假阳性(如图2a、b所示)。

FISH检测的精确性和可靠性主要依赖于寡核苷酸探针的特异性，因此探针的设计也十分重要，通常在18bp的寡核苷酸探针中一个错配碱基是足够鉴别不同的微生物细胞。因此实验中对于与靶序列相似具有错配碱基的探针，加入了竞争性探针，使得靶细菌能够很快被检测到，如对于亚硝酸氧化菌探针NIT3(5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3’)，加入了竞争性探针CNIT3(5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’)，以提高检测结果的特异性。

杂交反应的时间可随探针浓度的增加而缩短，这个时间需要确定在一个范围内，既不能过高，也不能过低。本发明方法的杂交时间为1.5～3h。由于洗脱液中NaCl的浓度根据杂交缓冲液中去离子甲酰胺含量的不同而有所变化，而文献对洗脱液中NaCl浓度的报道高低不一，盐浓度过高或过低均会影响杂交结果。因此对于每种探针，均选取了与文献报道相近的3个不同NaCl浓度进行条件优化，并最终确定了本试验所采用的浓度。

具体的技术方案如下：

一种荧光原位杂交技术检测沉积物中微生物种群的方法，包括如下步骤：

(1)沉积物样品的预处理：

(1a)取0.2g沉积物样品于离心管中，离心，去上清；

(1b)加1mL PBS缓冲液，充分混合后，离心，去上清；

(1c)重复步骤(1b)2～3次；

(1d)加入1mL的4％多聚甲醛固定液，充分混合，再加入0.2mol/L HCl 1mL，充分混合，4℃下过夜后，离心，去上清；

(1e)加入1mL PBS缓冲液，充分混合后，离心，去上清；

(1f)重复步骤(1e)1次；

(1g)加入PBS与98％乙醇按体积比1：1的混合液1mL，混匀，-20℃下保存备用；

(2)样品的涂布与脱水：

(2a)将步骤(1g)得到的样品用蒸馏水稀释10倍，超声将细胞充分分散；

(2b)取10uL步骤(2a)得到的样品均匀涂布在载玻片上，置37-55℃下干燥1～2h；

(2c)将干燥后的载玻片按50％、80％和98％的酒精浓度顺序脱水各3min，放置5～10min，自然干燥；

(3)杂交与洗净：

(3a)在有盖小盒内放入吸水纸，将其用杂交缓冲液浸润，水浴保温为37～55℃；

(3b)将20uL含有探针的杂交缓冲液滴到载玻片上，盖上盖玻片；

(3c)将载玻片放入有盖小盒中，46℃杂交1.5～3h；

(3d)将杂交后的载玻片取出，在已保温至48℃的杂交洗脱液中沥一下，竖直放入盛有杂交缓冲液的容器中，48℃严格保温20min；

(3e)用蒸馏水冲洗载玻片的正反面，再用力甩干上面的水珠，晾干；

(3f)在载玻片上加入50uL DAPI，静置20min；

(3g)用蒸馏水冲洗，甩干水分，晾干；

(4)用荧光显微镜观察，根据不同的探针所引起的荧光反应鉴别沉积物中所包含的微生物群落。

其中，所述的载玻片和盖玻片为经过清洗和包被的玻片。清洗与包被过程为本技术领域内的常规操作。

步骤(3b)所述的含有探针的杂交缓冲液中，探针浓度为100ng/uL。

表1 探针与微生物种群对应关系表

步骤(3b)所述的探针为NIT3和CNIT3、或NSO190、或ARCH915、或CREN537、或ALF1b、或BET42a、或GAM42a。

用不同探针可针对不同的微生物种群起荧光反应，具体对应关系见表1

步骤(3)所述的杂交缓冲液含有SDS、Tris-HCl(pH8.0)、NaCl和去离子甲酰胺，针对不同的探针，去离子甲酰胺含量略有差别，具体组成见表2。

表2 杂交缓冲液组成与探针的对应关系

步骤(3)所述的杂交洗脱液含有SDS、EDTA(pH8.0)、Tris-HCl(pH8.0)和NaCl，针对不同的探针，NaCl含量略有差别，具体组成见表3。

表3 杂交洗脱液组成与探针对应关系

步骤(4)中通过如下方式鉴别微生物种群，与探针NIT3和CNIT3特异性结合的为亚硝酸氧化细菌，与探针NSO190特异性结合的为氨氧化细菌，与探针ARCH915特异性结合的为古生菌，与探针CREN537特异性结合的为泉古菌、与探针ALF1b特异性结合的为变形菌α亚纲、与探针BET42a特异性结合的为变形菌β亚纲，与探针GAM42a特异性结合的为变形菌γ亚纲。

有益效果：本发明通过对FISH分析条件进行优化，削弱了样品的自发荧光，消除了非特异性杂交，确定了合适的杂交时间与洗脱液浓度，使得FISH技术很好的应用于沉积物样品中微生物种群的检测。

附图说明

图1a为用HCl处理前荧光显微镜观察效果图。

图1b为用HCl处理后荧光显微镜观察效果图。

图2a为DAPI染色检测照片。

图2b为FISH杂交检测照片。

图3为亚硝酸氧化菌NIT3探针杂交照片。

图4为氨氧化细菌ISO190探针杂交照片。

图5为古生菌ARCH915探针杂交照片。

图6为泉古菌CREN537探针杂交照片。

图7为变形菌α亚纲ALF1b探针杂交照片。

图8为梅梁湾和贡湖湾沉积物中总菌数与古生菌数。

图9为梅梁湾与贡湖湾沉积物中氨氧化细菌、亚硝酸氧化菌及泉古菌数量。

图10为梅梁湾与贡湖湾沉积物中变形菌γ亚纲菌数。

具体实施方式：

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：沉积物样品的采集。

2006年4月采集自太湖梅梁湾1个采样点(2号：N31°30.306’，E120°13.370’)和贡湖湾草型湖泊1个采样点(5号：N31°23.767’，E120°19.471’)。现场利用柱状采样器采集表层30cm沉积物，前10cm每1cm1个样品，10～20cm每2cm1个样品，20cm以下每5cm1个样品，分别装入封口袋并贴上标签，置冰箱内保存。

实施例2：玻片的清洗与包被。

玻片的清洗步骤如下：

(1)将玻片用肥皂水浸泡过夜；

(2)用自来水冲洗干净后用蒸馏水冲洗并浸泡；

(3)用1％HCl浸泡24h后用蒸馏水冲洗干净；

(4)高温灭菌20min后，置于冰箱4℃保存待用；

玻片包被步骤如下：

(1)将竖放于载玻片架上的玻片于APEs与丙酮按体积比1：50的混合液中浸泡1min；

(2)将架移到丙酮中来回沥几次；

(3)37℃烘箱烘干，收藏于载玻片盒中，可保存1年。

实施例3：样品的检测。

对实施例1所采集的2个点的所有沉积物样品采用荧光原位杂交(FISH)技术进行特定微生物的检测。具体操作如下：

(1)沉积物样品的预处理：

(1a)取0.2g沉积物样品于离心管中，离心(14000rpm冷冻离心10min)，去上清；

(1b)加1mL PBS缓冲液，充分混合后，离心(14000rpm冷冻离心10min)，去上清；

(1c)重复步骤(1b)3次；

(1d)加入1mL的4％多聚甲醛固定液，充分混合，再加入0.2mol/L HCl 1mL，充分混合，4℃下过夜后，离心(14000rpm冷冻离心10min)，去上清；

(1e)加入1mL PBS缓冲液，充分混合后，离心(14000rpm冷冻离心10min)，去上清；

(1f)重复步骤(3e)1次；

(1g)加入PBS与98％乙醇按体积比1：1的混合液1mL，混匀，-20℃下保存备用；

(2)样品的涂布与脱水：

(2a)将步骤(1g)得到的样品用蒸馏水稀释10倍，超声将细胞充分分散；

(2b)取10uL步骤(2a)得到的样品均匀涂布在载玻片上，置37℃下干燥1～2h；

(2c)将干燥后的载玻片按50％、80％和98％的酒精浓度顺序脱水各3min，放置10min，自然干燥；

(3)杂交与洗净：

(3a)在有盖小盒内放入叠好的吸水纸，将其用杂交缓冲液浸润，水浴保温为46℃；

(3b)将20uL含有探针的杂交缓冲液滴到载玻片上，其中探针的浓度为100ng/uL，盖上盖玻片；

(3c)将载玻片放入有盖小盒中，46℃杂交2h；

(3d)将杂交后的载玻片取出，在已保温至48℃的杂交洗脱液中沥一下，竖直放入盛有杂交缓冲液的容器中，48℃严格保温20min；

(3e)用蒸馏水冲洗载玻片的正反面，再用力甩干上面的水珠，晾干；

(3f)在载玻片上加入50uL DAPI，静置20min；

(3g)用蒸馏水冲洗，甩干水分，晾干；

(4)用荧光显微镜观察，根据不同的探针所引起的荧光反应鉴别沉积物中所包含的微生物群落。

变换不同的探针，及相应的杂交缓冲液和杂交洗脱液，重复实施例3中描述的上述操作，检测出不同微生物种群的数量及分布情况。

采用Olympus BX41型荧光显微镜进行观察，以氘灯为光源，靠不同滤色玻片而获得一定波长范围的激发光，波长范围较大，但光照强度弱，因此所拍摄得到的荧光照片信号较弱。照片结果如图3--图7所示。

表4 探针荧光标记及荧光颜色

具体的检测结果如图8---图10所示，其中，细菌丰度(cell/g)为AS₁/(S₂V)，其中A为视野中细菌平均数，S₁为样品涂抹面积，S₂为视野面积，V为样品体积。

由图8看出，在所有沉积物样品中，古生菌均广泛存在，且其数量均约占总菌数的15％～20％左右。随着深度的增加，古生菌数量逐渐减少，但在总细菌中所占比例有所增加。同时发现，在沉积物表层的7cm左右，2号采样点的古生菌所占比例比贡湖湾大，而在更深层，两者所占比例相差不大。

由图9看出，梅梁湾氨氧化细菌及亚硝酸氧化细菌的数量均高于贡湖湾，但其在所占总细菌的比例却是贡湖湾高于梅梁湾。随着深度的增加，亚硝酸氧化细菌和氨氧化细菌数量均逐渐减少，梅梁湾到8cm左右、贡湖湾到10cm左右后，数量极低。泉古菌数量普遍高于氨氧化细菌。

由图10看出，变形菌α、β、γ亚纲在各层沉积物样品中均广泛存在，其中以β亚纲所占比例最大。

SEQUENCE LISTING

<110>南京大学

<120>荧光原位杂交技术检测沉积物中微生物种群的方法

<130>nju081020

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<223>NIT3(以3’-FAM为标记)

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