科博肽的提取方法、由该方法提取得到的科博肽以及包含该科博肽的制剂

摘要

本发明涉及一种治疗慢性疼痛的药物科博肽的提取方法、由该方法提取得到的科博肽、以及包含该科博肽的制剂。本发明的科博肽的提取方法为先用硫酸铵预处理眼镜蛇蛇毒原液，以除去蛇毒中的部分其它成分；通过超滤、透析或凝胶层析除盐浓缩，浓缩后用阳离子柱进行纯化，样品浓缩后冷冻干燥保存。所述科博肽制剂包括肠溶制剂、直肠给药制剂、结肠定位给药制剂等。本发明所提供的科博肽提取纯化工艺，提取的科博肽纯度大于95％，产率达到70％，方法简单、可靠，节约了成本和时间。

说明书

技术领域

本发明涉及一种科博肽的提取方法、由该方法提取得到的科博肽以及包含该科博肽的制剂。

背景技术

科博肽是一种从眼镜蛇蛇毒中提取的蛇毒神经毒素。蛇毒神经毒素按生理活性不同可把神经毒素分为两类：突触前神经毒素和突触后神经毒素。科博肽属于突触后神经毒素，为68个氨基酸组成的小分子单链蛋白，不含糖等非蛋白成分，含四个二硫键，分子量在7000道尔顿左右。

眼镜蛇毒神经毒素与N型乙酰胆碱受体有高度的亲和力，能阻止神经肌肉接头神经冲动信号的传递。影响试验动物脑内乙酰胆碱的代谢，并能提高人、鼠脑内脑啡肽的含量，产生镇痛作用。科博肽在临床上用于晚期癌症疼痛、慢性关节痛、坐骨神经痛、神经性头痛、三叉神经痛、麻风反应神经痛等慢性疼痛的治疗，尤其是慢性、顽固性、持续性疼痛的治疗。科博肽具有镇痛作用持久、无成瘾性、无耐受性等特点。

目前，蛇毒神经毒素提取方法主要利用离子交换层析和凝胶层析，现有技术的提取方法存在步骤繁琐、提取成本高等问题。例如：黄立峰等(福建产眼睛王蛇毒神经毒素的分离及活性测定，福建医科大学学报，2004，38，2，125～128)所公开的眼镜王毒蛇神经毒素分离方法需要在低温层析箱中进行整个分离过程，并且步骤繁琐，耗时长。李范珠等(浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒素的分离纯化及其镇痛作用研究，中国药师，2004，7，9，659～661)所公开的浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒素的分离纯化方法为将蛇毒直接进行三次柱层析，步骤繁琐，耗时长，提取成本高，在该篇文献中，提及蛋白纯度92％，所以神经毒素(即科博肽)的纯度应小于92％。

科博肽上市主要剂型为注射剂，包括注射用科博肽和科博肽注射液。科博肽是碱性蛋白，由于分子量小二硫键多，所以它的理化性质十分稳定，对热及化学试剂都有抗性，有利于口服制剂的制备，并且口服制剂与注射剂相比具有易于制备和贮存、患者顺应性高等有短。

杨惠萍等(科博肽肠溶胶囊治疗晚期中、重度癌症疼痛疗效观察，蛇志，2001，13(2)，4～5)研究了科博肽肠溶胶囊对晚期癌症患者的止痛效果。其中，每6h口服科博肽肠溶胶囊280μg/次。常规剂量每天560μg，在用药过程中根据疼痛缓解程度调整剂量由280～420μg～560μg递增。在68例中、重度癌痛患者中，显效41例，有效21例，无效6例，总有效率91.2％，药物最小日剂量280μg，最大日剂量为840μg，所有患者均可耐受，未见有药物依赖性出现。在该文中，还提及如因吞咽困难或恶心、呕吐不能口服时，可改为直肠给药。但在该文中并未公开科博肽肠溶胶囊的具体配方及制备方法。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种新的科博肽提取方法，该方法简单、可靠、节约了时间和成本。

本发明进一步要解决的技术问题是提供一种由上述方法制备得到的具有更高纯度的科博肽。

本发明还进一步要解决的技术问题是提供几种新的非注射给药的科博肽制剂。

为了解决本发明的第一个技术问题，本发明提供的科博肽提取方法为先用硫酸铵预处理蛇毒原液，以除去蛇毒中的部分其它成分；通过超滤、透析或凝胶层析除盐浓缩，浓缩后用阳离子柱进行纯化，样品浓缩后冷冻干燥保存。

在本提取方法中，本发明人利用科博肽成分与非科博肽组分对盐浓度敏感程度的差异性，先用选定浓度的硫酸铵盐预处理蛇毒原液，可以盐析沉降蛇毒中的大部分非科博肽组分，从而可以简化随后的提取纯化工艺，节约了时间和成本。

所述科博肽的提取方法，可包括下述步骤：

1)取蛇毒粉溶解于蒸馏水或pH5～8的缓冲液中，离心，取上清液，加铵盐和/或钠盐至饱和度的40％～80％，离心，弃沉淀，得上清液；

2)将由步骤1)最终得到的上清液进行分离纯化、冷冻干燥，得到纯化的科博肽。

上述方法可以在室温(25℃)或者低于室温的温度下进行，优选在10℃以下。在10℃以下进行可减少菌类污染，尽可能减少热源物质。

优选地，在所述步骤1)中，加铵盐和/或钠盐硫酸铵至饱和度的50％～70％，最优选为60％。所述铵盐可以为硫酸铵、醋酸铵等的一种或多种，所述钠盐可以为硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等的一种或多种。所述铵盐和/或钠盐优选为硫酸铵、硫酸钠、氯化钠的一种或多种，最优选为硫酸铵。所述铵盐和/或钠盐可以以固体或者一定浓度的溶液形式加入。

在所述步骤1)中，所述离心条件可以为4000rpm离心10～20min。

在步骤1)中，所述缓冲液可使用pH7的磷酸盐缓冲液等。

在所述步骤2)中，可以采用现有技术的常规方法对上清液进行分离、纯化，例如采用超滤、透析、凝胶层析、离子交换色谱等。

优选地，所述步骤2)可包括下述步骤：

a、将由步骤1)最终得到的上清液用截留分子量为3k～6k的超滤、透析或凝胶层析，除盐浓缩，得浓缩液；

b、用pH值为5.0～7.0的缓冲液平衡阳离子交换柱，将由步骤a得到的浓缩液上样后，用0～0.6M钠盐和/或铵盐线性梯度洗脱；

c、接取具有科博肽活性成分峰，除盐浓缩同步骤a，然后冷冻干燥，得到科博肽。

在所述步骤a中，可以用中空纤维超滤器、透析膜或凝胶层析进行除盐浓缩。截流分子量优选为6k。

在所述步骤b中，所述铵盐可以为硫酸铵、醋酸铵等的一种或多种，最优选醋酸铵。所述钠盐可以为硫酸钠、氯化钠等的一种或多种，最优选氯化钠。在本发明中，由于采用硫酸铵对蛇毒进行预处理，因此仅需进行一次柱层析，即可获得纯度很高的科博肽，极大地简化了提取工艺，节省了时间和成本。

上述方法简单、可靠，产率可达到70％，提取的科博肽纯度大于95％。

根据本发明的另一个目的，本发明提供了一种由上述提取方法制备得到的科博肽，该科博肽的纯度可大于95％，优选为大于98％，更优选大于99％。

根据本发明的还一个目的，本发明提供了包含上述科博肽与适当的药学上可接受的辅料的药物制剂，如注射剂、口服制剂、直肠给药制剂等。本发明的科博肽制剂可用科博肽与适当的药学上可接受的辅料，通过现有技术的常规制剂方法制备得到。

所述科博肽制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂等，也可以制备成缓控释制剂、靶向制剂等。由于科博肽为碱性蛋白，在肠中较稳定且吸收较好，从而可获得较佳的生物利用度，因此制备成科博肽肠溶制剂、结肠定位给药制剂和直肠给药制剂等更有利于蛋白质多肽类药物的吸收。

本发明提供的科博肽肠溶制剂中，包含科博肽100～900μg，其中，肠溶片通常使用肠溶包衣来实现肠溶效果，所包含的肠溶性材料一般为片剂总重的4～8％，而肠溶胶囊一般通过将药物颗粒装在肠溶胶囊壳中而实现肠溶效果。

所述肠溶性材料可选自丙烯酸树脂II、EUDRAGIT L 100、EUDRAGIT RL90、EUDRAGIT L 100-55等。

科博肽肠溶制剂的制备是由科博肽和一定比例的辅料混合压片包肠溶衣或混合装入肠溶胶囊制得。辅料包括填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂和抗粘剂等。

根据本发明的目的，本发明提供的科博肽结肠定位给药制剂包含科博肽100～900μg和适量的结肠靶向材料。例如，当结肠靶向材料为葡聚糖酯(DSD)时，所使用的DSD通常可为制剂总重的65％～85％。

所述结肠靶向材料可选自葡聚糖酯、果胶、瓜耳胶、硫酸软骨素、药用丙烯酸聚合物、葡聚糖十二烷基酯、脱乙酰壳多糖等。

所述科博肽控释制剂主要是结肠定位给药制剂，包括利用时滞效应设计；利用胃肠道pH差异设计；利用结肠独特的酶系设计；利用结肠的特有细胞株设计；利用结肠压力较大设计等。可采用适宜的结肠靶向材料，如直链淀粉、葡聚糖酯、果胶、瓜耳豆胶、硫酸软骨素等。在本发明的一个实施例中，采用葡聚糖酯作为给药载体，可大大降低其小肠内透过上皮细胞吸收的可能性，药物到达结肠后，受特异性内源性葡聚糖酶作用，葡聚糖酯骨架迅速水解，释放出母体药物，发挥临床疗效，从而大大提高了结肠内部的药物浓度，减少用药剂量。

本发明提供的科博肽直肠给药制剂包含科博肽100～900μg和适量的直肠给药载体。

所述直肠给药载体可选自甲基纤维素、聚山梨醇-80、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等。

所述直肠给药制剂通常为栓剂。科博肽直肠给药栓剂是由科博肽(100～900μg)和栓剂基质组成，为了提高直肠吸收效果，可加入吸收促进剂等。

本发明的有益效果是：

1、本发明所提供的科博肽提取工艺，由于采用硫酸铵对蛇毒进行预处理，因此方法简单、可靠，节约了成本和时间，提取的科博肽纯度大于95％，产率达到70％。

2、本发明制备的科博肽的纯度可大于95％，能够用于制备各种制剂。

3、本发明制备的科博肽口服制剂具有良好的镇痛效果，并可具有较好的生物利用度。

为了阐释本发明，下面给出实施例，实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

附图说明

图1为由本发明实施例1得到的科博肽的电泳图谱，其中，泳道1为科博肽，泳道2为分子量标准品，其条带的分子量从上至下依次为16946、10700、8519、6214、2512。

图2A为由本发明实施例1得到的科博肽的HPLC图谱；

图2B为科博肽对照品的HPLC图谱。

具体实施方式

本发明所用原料，如无特别说明，均为市售购买产品。

科博肽的提取

实施例1

1)取湖南眼镜蛇毒粉(购自湖南益阳蛇类养殖场)20g溶解于500mL0.02MpH值为6.0磷酸盐缓冲液中，4000rpm离心10～20min，取上清液，加硫酸铵至饱和度60％，4℃沉淀过夜，4000rpm离心15～20min，弃沉淀，得上清液。

2)取所得上清液用分子量截留6k的中空纤维超滤器(6K，北京旭邦膜超滤设备有限公司)，除盐浓缩。

3)用0.02M pH值为6.0的磷酸盐平衡CM阳离子交换柱(柱料：CMSpharoseTM Fast Flow，Amersham Pharmacia BiothchAB)，浓缩液上样后，用0～0.6M NaCl线性梯度洗脱。

4)接取具有科博肽活性成分峰，除盐浓缩同步骤2)，然后冷冻干燥，得到科博肽样品，收率为70.5％。

冷冻干燥方法如下：灌装药液送入冻干机，先将板温预冻至-45℃，当药液温度低于-40℃时，开启真空泵，控制真空度小于0.2Mbar，开始升华，按冻干冻干条件为预冻2.5小时(20℃～-45℃)，升华2.5小时(-45℃～-40℃)+7小时(-40℃～0℃)、干燥7小时(0℃～30℃)+2小时(30℃～35℃)，真空小于0.2Mbar，控制产品温度最高不超过35℃，搁板温度不超过40℃。总耗时21小时。

样品鉴定：

A、采用尿素-SDS-PAGE法测定分子量：分离胶浓度为15.5％，交联度为6％；浓缩胶浓度为3％，交联度为2.6％。测得分子量为7000道尔顿左右(见图1)。分子量标准品来源于Pharmacia公司。

B、高效液相色谱法：

色谱柱：C8(4.6mm×150mm)；流动相：0.1％三氟醋酸溶液为流动相A，三氟醋酸-50％乙腈溶液(1:1000)为流动相B；柱温：36℃；检测波长：214nm。

检测方法：洗脱初始状态流动相B为8％，保持4分钟，在12分钟内，流动相B增至100％，保持6分钟，再在6分钟内回到初始状态，保持10分钟。

检测结果：与科博肽标准品(中国生物制品检定所)保留时间一致(见图2A、2B)，样品纯度为99.4％。

图2A和图2B中，各峰的具体数据见表1。其中，峰1为科博肽峰。

表1

实施例2

在步骤1)中，加硫酸铵至饱和度的40％，其它同实施例1。收率为67.3％，分子量在7000道尔顿左右，样品纯度为98.9％。

实施例3

在步骤1)中，加硫酸铵至饱和度的80％，其它同实施例1。收率为73.4％，分子量在7000道尔顿左右，样品纯度为97.2％。

实施例4

在步骤1)中，将硫酸铵用磷酸钠代替，其它同实施例1。收率为68.5％，分子量在7000道尔顿左右，样品纯度为96.1％。

实施例5

在步骤1)中，将硫酸铵用氯化钠代替，其它同实施例3。收率为71.5％，分子量在7000道尔顿左右，样品纯度为98.4％。

实施例6

在步骤3)中，将氯化钠用醋酸铵代替，其它同实施例1。收率为65.4％，分子量在7000道尔顿左右，样品纯度为96.5％。

科博肽制剂的制备

实施例7  科博肽肠溶胶囊的制备

科博肽0.18g，环糊精100g，淀粉100g，微粉硅胶10g，硬脂酸镁10g混匀，装入2号肠溶胶囊，制备1000粒。

实施例8  科博肽肠溶片的制备

科博肽0.28g，淀粉80g，糊精60g，蔗糖粉25g，羧甲基淀粉纳8g微晶纤维素25g，混匀，18目筛制粒，35℃干燥20分钟，加入硬脂酸镁2g混匀压片，包肠溶衣，制得1000片。

实施例9  科博肽直肠给药栓剂

羟丙基甲基纤维素1Kg，1L水，0.56g科博肽，甘油适量。将上述原辅料在室温下混合，搓成粗9mm的条状物，再切成约3cm的小块，压模定型，制得1000颗栓剂。

实施例10  科博肽酶控结肠给药制剂

葡聚糖酯(DSD)240g，淀粉15g，乳糖35g，科博肽0.8g混匀，加入10％PVP乙醇溶液适量制软材，16目筛制粒，25℃干燥20分钟，14目整粒，加入微粉硅胶2g，硬脂酸镁7g，滑石粉1g，混匀，压片，制得1000片。

实施例11  科博肽果胶钙结肠定位胶囊

取64g低甲氧果胶溶于920ml水，60℃超声脱气使其均匀分散。用直径0.6240±0.001cm；0.6884±0.001cm(帽)的金属棒以蘸胶法制备胶囊。取科博肽0.8g和220g淀粉，70g糊精混匀过100目筛，加适量10％PVP溶液制软材，40目制粒，45℃条件下干燥4小时，40目筛整粒，填充胶囊。

科博肽口服制剂的镇痛效果试验

实施例12

利用鼠热板法镇痛试验验证科博肽口服制剂的镇痛效果，选取体重为19～21克的小鼠(中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心)40只，随机分成4组，每组10只，第1～3组灌胃科博肽阿拉伯胶液(10％)，剂量分别为0.1mg/kg、0.05mg/kg、0.02mg/kg，第4组同法给阿拉伯胶液。结果见以下表1。由表1可见，与空白对照组相比较，三个剂量组在给药后痛阈提高均有显著差异，具有良好的镇痛作用。

表1 科博肽口服制剂的镇痛效果试验结果(n＝10)