微小RNA基因在系统性红斑狼疮疾病诊断和治疗中的作用

摘要

本发明属于生物技术领域，公开了一类小核糖核酸的用途，用于制备检测系统性红斑狼疮(SLE)的试剂或试剂盒。本发明还公开了可用于检测所述小核糖核酸水平、进而用于诊断系统性红斑狼疮的检测试剂或试剂盒。本发明首次揭示和证明了所述小核糖核酸与系统性红斑狼疮密切相关，为该疾病的防治提供了新的药物靶点，调节小核糖核酸水平是一种新的治疗、干预疾病的手段。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；具体地，本发明涉及诊断系统性红斑狼疮的方法和试剂盒，以及微小RNA基因在I型干扰素通路异常激活相关疾病(如系统性红斑狼疮疾病)防治中的应用。

背景技术

系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)是典型的非器官特异性自身免疫病，其临床及免疫学表型极为复杂多样，包括免疫耐受缺陷，淋巴细胞功能调节和凋亡障碍，补体缺陷和免疫复合物清除障碍，细胞因子分泌调节障碍等，几乎覆盖整个免疫系统的紊乱，被公认为是自身免疫病的原型。目前SLE的发病机制还没有完全阐明，由于病因和发病机理未明，缺乏特异的治疗手段，无法从根本上提高疾病防治水平。

人类疾病很多是由于一些基因表达紊乱或失控所引起的。小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约21-25nt的不编码蛋白质的单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，通过核酸序列互补性结合到特定的靶mRNA上来调节靶mRNA翻译或降解靶mRNA，是一种起负调控作用的分子。目前研究显示许多miRNA参与了生物体发育、分化、生长、免疫应答等生理过程，且其表达及功能失调可能导致肿瘤发生，白血病以及病毒感染等多种病理现象。目前研究认为，miRNA的5’端2-8个碱基对其发挥作用起着关键作用，要求这区域与靶基因完全配对，其它区域与靶序列的配对要求不是很严格。

尽管目前有报道显示miR-146在免疫应答中起着重要的作用，然而本领域仍然不知道其对于一些具体的免疫疾病的影响状况，更没有报导其与系统性红斑狼疮的关系。

发明内容

本发明的目的在于提供小核糖核酸的用途，用于诊断系统性红斑狼疮或制备诊断系统性红斑狼疮的试剂或试剂盒，或作为筛选疾病治疗药物的靶点，或直接用于治疗相关疾病。

本发明的另一目的在于提供所述诊断系统性红斑狼疮的试剂或试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种小核糖核酸的用途，用于制备检测系统性红斑狼疮(SLE)的试剂或试剂盒；

其中，所述的小核糖核酸具有SEQ ID NO:2(miR-146a)所示的序列。

在另一优选例中，所述的小核糖核酸还包括选自下组的小核糖核酸：

具有SEQ ID NO:4所示核酸序列的小核糖核酸(miR-130b)，

具有SEQ ID NO:5所示核酸序列的小核糖核酸(miR99a)，

具有SEQ ID NO:6所示核酸序列的小核糖核酸(miR-10a)，

具有SEQ ID NO:7所示核酸序列的小核糖核酸(miR-134)，

具有SEQ ID NO:8所示核酸序列的小核糖核酸(miR-31)，或

具有SEQ ID NO:9所示核酸序列的小核糖核酸(miR-95)。

在另一优选例中，所述的试剂或试剂盒用于检测系统性红斑狼疮疾病活动程度或肾脏受累程度。

在本发明的第二方面，提供一种可用于检测系统性红斑狼疮的试剂盒，所述的试剂盒包含：

容器；

位于容器中的特异性地针对小核糖核酸的引物或探针，所述的小核糖核酸具有SEQ ID NO:2(miR-146a)所示的序列；以及

用于检测系统性红斑狼疮的说明书。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括特异性地针对选自下组的小核糖核酸的引物或探针：

具有SEQ ID NO:4所示核酸序列的小核糖核酸(miR-130b)，

具有SEQ ID NO:5所示核酸序列的小核糖核酸(miR99a)，

具有SEQ ID NO:6所示核酸序列的小核糖核酸(miR-10a)，

具有SEQ ID NO:7所示核酸序列的小核糖核酸(miR-134)，

具有SEQ ID NO:8所示核酸序列的小核糖核酸(miR-31)，或

具有SEQ ID NO:9所示核酸序列的小核糖核酸(miR-95)。

在另一优选例中，所述的探针是Taqman探针。

在本发明的第三方面，提供一种小核糖核酸的用途，用于制备调控I型干扰素通路的组合物；或用于筛选调控I型干扰素通路的物质，

其中，所述的小核糖核酸具有通式(I)所示的序列：

5’UGAGAACUGAAUUCCAURGGYU 3’               (I)；

其中，R选自A或G；Y选自C、U、或T。

在另一优选例中，所述的小核糖核酸用于制备抑制I型干扰素通路异常激活的组合物；或用于筛选抑制I型干扰素通路异常激活的物质。

在另一优选例中，所述的组合物还用于防治系统性红斑狼疮。

在另一优选例中，所述的小核糖核酸调控I型干扰素通路选自(但不限于)：(a)抑制肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的表达、(b)抑制白介素1受体相关激酶1(IRAK1)的表达、(c)抑制干扰素诱导因子5(IRF5)的表达；(d)抑制信号转导和转录激活子1(STAT1)的表达(e)抑制IFN α的表达；(f)抑制IFN β的表达；(g)抑制粘液病毒抗性因子1(MX1)表达；(h)抑制5’寡核苷酸合成酶(OAS1)表达；或(e)抑制淋巴细胞抗原6(Ly6E)表达。所述的调控包括：直接调控或间接调控。

在本发明的第四方面，提供一种筛选调控I型干扰素通路的潜在物质的方法，所述方法包括步骤：

(a)将候选物质与含有小核糖核酸的体系接触，所述的小核糖核酸具有通式(I)所示的序列：

5’UGAGAACUGAAUUCCAURGGYU 3’               (I)；

其中，R选自A或G；Y选自C、U、或T；

(b)观察候选物质对于小核糖核酸的表达的影响；

其中，若所述候选物质可提高小核糖核酸的表达，则表明该候选物质是抑制I型干扰素通路的潜在物质；若所述候选物质可降低小核糖核酸的表达，则表明该候选物质是促进I型干扰素通路的潜在物质。

在另一优选例中，步骤(a)包括：在测试组中，将候选物质加入到含有小核糖核酸的体系中；和/或

步骤(b)包括：检测测试组的体系小核糖核酸的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的含有小核糖核酸的体系；

如果测试小核糖核酸的表达在统计学上高于(优选显著高于，如高20％，更优选高40％，进一步优选高60％或更高)对照组，就表明该候选物是抑制I型干扰素通路的物质；如果测试小核糖核酸的表达在统计学上低于(优选显著低于，如低20％，更优选低40％，进一步优选低60％或更低)对照组，就表明该候选物是促进I型干扰素通路的物质。

在另一优选例中，所述的体系是细胞体系(如Hela细胞(或细胞培养物)，HEK 293细胞(或细胞培养物)，或原代培养的PBMC细胞(或细胞培养物))。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了SLE患者中miR-146a表达水平下降。

A：将在SLE患者和正常对照组之间表达水平有明显差异的42个miRNA聚类分析作图，其中箭头所指代表下降幅度大于六倍的7个miRNA。

B：miR-146a在47例SLE患者，6例白塞病患者(BD)和21例正常对照(NC)中表达水平比较，数据以平均值(mean)±平均标准误(SEM)格式显示。

图2显示了miR-146a表达水平与疾病活动相关。其中，

A：miR-146a在正常对照、稳定性SLE患者和活动性SLE患者三组中的表达差异比较。

B：根据有无蛋白尿将病人分成两组，有蛋白尿组miR-146a表达水平明显低于无蛋白尿组。

C：miR-146a表达与SLE患者SLEDAI积分之间的相关性，根据前面结果，此处采用单尾Spearman检验方法。

D：miR-146a表达与SLE患者肾脏SLEDAI积分之间的相关性。

图3显示了miR-146a表达水平与干扰素积分之间呈现负相关(r＝-0.3073，P＝0.0378)。

图4显示了miR-146a在I型干扰素通路活化中的作用。

A：过表达miR-146a能够抑制I型干扰素的产生，其中IFN α引物能够识别最多的IFN α亚型。

B：首先转染miR-146a抑制序列或者随机无关序列预处理PBMC后，用R837(5ug/ml)刺激，两小时后检测两种不同处理方法miR-146a表达水平差异。

C：I型干扰素(1000U/ml)孵育293T/ISRE6小时后，转染入miR-146a，结果显示miR-146a能够抑制ISRE报告基因活性，数据以mean±SEM格式显示。

D：I型干扰素(1000U/ml)孵育PBMC6小时后，转染入miR-146a，PBMC原代细胞中miR-146a能够抑制I型干扰素下游干扰素诱导基因的产生。

图5显示了miR-146a的两个靶基因IRF5和STAT1的鉴定。

A：生物学预测miR-146a与IRF5和STAT13’UTR结合位点。

B：过转染空载体或者miR-146a表达载体后，比较两者IRF5和STAT13’UTR报告基因的活性，数据以mean±SEM格式显示。

C：293T细胞中应用Western免疫印迹的方法检测miR-146a对IRF5和STAT1蛋白水平的影响。以GAPDH的表达作为参照。其中，以空质粒转染组的IRF5/GAPDH和STAT1/GAPDH的比值表示为1。

图6显示了将病人来源的PBMC中人为增加miR-146a表达水平后，干扰素诱导基因表达水平下降。

图7显示了在正常人来源的PBMC中检测不同刺激剂对miR-146a表达水平的影响。刺激剂浓度分别是LPS(10ug/ml)，R837(5ug/ml)，CpG-A(5uM)和I型干扰素(1000U/ml)，刺激时间为6小时。

图8显示了miR-146a负反馈调节I型干扰素通路。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，首次发现和证明了具有通式(I)所示的序列的小核糖核酸(miRNA)与系统性红斑狼疮(SLE)密切相关。本发明人还进一步验证了所述miRNA的作用靶基因。并且，本发明人还发现所述的小核糖核酸可抑制I型干扰素通路，从而可用于防治I型干扰素通路异常活化相关疾病(如系统性红斑狼疮)。在此基础上完成了本发明。

本文中，除非另行定义，所述的“miR-146”是指miR-146a或miR-146b。

本发明人发现，一种小核糖核酸可调控I型干扰素通路。所述的小核糖核酸具有以下通式：

5’UGAGAACUGAAUUCCAURGGYU 3’              (I)；

其中，R选自A或G；Y选自C、U、或T。

通式(I)所示的小核糖核酸只是在3’端有两个碱基不同，而该小核糖核酸发挥作用的关键序列位于5’端2-8个碱基；并且，通式(I)所示的小核糖核酸具有相同的靶基因，因此它们具有基本相同的调控I型干扰素通路功能。所述的小核糖核酸优选具有SEQ ID NO:2(miR-146a)或SEQ ID NO:3(miR-146b)所示的序列。

作为本发明的优选方式，所述的小核糖核酸是具有SEQ ID NO:2所示核酸序列的小核糖核酸(miR-146a)，其在系统性红斑狼疮中表达非常低，进一步的研究发现，所述的小核糖核酸的表达信号与系统性红斑狼疮的活动程度和肾脏受累程度负相关；在系统性红斑狼疮中，所述的小核糖核酸的靶基因较正常对照组显著升高且与该小核糖核酸的表达信号呈负相关。

本发明人还发现，选自下组的小核糖核酸均在系统性红斑狼疮中表达非常低(与正常人的水平相比，降低6倍以上)：

具有SEQ ID NO:4所示核酸序列的小核糖核酸(miR-130b)，

具有SEQ ID NO:5所示核酸序列的小核糖核酸(miR99a)，

具有SEQ ID NO:6所示核酸序列的小核糖核酸(miR-10a)，

具有SEQ ID NO:7所示核酸序列的小核糖核酸(miR-134)，

具有SEQ ID NO:8所示核酸序列的小核糖核酸(miR-31)，或

具有SEQ ID NO:9所示核酸序列的小核糖核酸(miR-95)。

基于本发明的上述新发现，所述的小核糖核酸有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)：

(i)将所述小核糖核酸直接作为药物治疗小核糖核酸水平下降所致的疾病，如系统性红斑狼疮；

(ii)用于制备系统性红斑狼疮(SLE)临床检测的试剂或试剂盒；

(iii)用于筛选防治系统性红斑狼疮的物质；

(iv)用于调节肿瘤坏死因子受体相关因子6、白介素1受体相关激酶1、干扰素诱导因子5或信号转导和转录激活子1的表达水平，或预防或治疗肿瘤坏死因子受体相关因子6、白介素1受体相关激酶1、干扰素诱导因子5或信号转导和转录激活子1表达或活性失调相关的疾病；

(v)用于进行系统性红斑狼疮的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析。

(vi)用于评估相关人群系统性红斑狼疮的患病风险，早期监测早期预防；

(vii)用于评估相关人群的系统性红斑狼疮治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法。

(viii)直接作为药物防治I型干扰素通路异常相关疾病，如系统性红斑狼疮。

(X)作为一种靶点，筛选调控I型干扰素通路的物质，所述物质例如被用于制备抑制I型干扰素通路异常激活相关疾病的药物。

在得知了所述的小核糖核酸的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来筛选调控I型干扰素通路的物质。

在本发明的一种优选方式中，提供一种筛选方法，所述的方法包括：将候选物质与含有通式(I)所示小核糖核酸的体系接触；观察候选物质对于通式(I)所示小核糖核酸的表达的影响；若所述候选物质可提高(优选显著提高，如提高20％或更低；更优选提高40％或更高)通式(I)所示小核糖核酸的表达，则表明该候选物质是抑制I型干扰素通路的潜在物质；反之，则该候选物质是促进I型干扰素通路的潜在物质。

更优选的，可通过设置对照组来观察候选物质对于通式(I)所示小核糖核酸的表达的影响状况；所述对照组是不添加所述候选物质的含有通式(I)所示小核糖核酸的体系。

由于通式(I)所示小核糖核酸的激动剂或拮抗剂可调节通式(I)所示小核糖核酸的表达，因此，所述的通式(I)所示小核糖核酸的激动剂或拮抗剂可通过对通式(I)所示小核糖核酸的影响来调节I型干扰素通路。

所述的通式(I)所示小核糖核酸的激动剂是指任何可维持通式(I)所示小核糖核酸的稳定性、促进通式(I)所示小核糖核酸表达、延长通式(I)所示小核糖核酸有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为可用于调控(特别是抑制)I型干扰素通路有用的物质。

所述的通式(I)所示小核糖核酸的拮抗剂是指任何可降低通式(I)所示小核糖核酸的稳定性、抑制通式(I)所示小核糖核酸表达的物质，这些物质均可用于本发明，作为可用于调控(特别是促进)I型干扰素通路有用的物质。所述的拮抗剂例如是miR-146a或miR-146b或它们的类似物的反义寡核苷酸链；所述的拮抗剂通过增强I型干扰素通路，可开发为一些肿瘤和感染性疾病的治疗药物。

在得知了所述通式(I)所示小核糖核酸的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的通式(I)所示小核糖核酸或其编码基因、或其药物组合物给药于需要治疗的受试者(如SLE患者)。优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将通式(I)所示小核糖核酸或其类似物通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带通式(I)所示小核糖核酸或其类似物的表达单位递送到靶点上，并使之表达通式(I)所示小核糖核酸，这些均是本领域技术人员所熟知的。

所述的小核糖核酸的类似物是指关键区域与通式(I)所示序列相同(即SEQID NO:1中第2-8位)，且具有与通式(I)所示序列相同或接近的对I型干扰素通路调控作用的小核糖核酸。较佳的，该类似物与SEQ ID NO:2所示的序列具有70％以上的同源性，更佳的具有85％以上的同源性，最佳的具有95％以上的同源性。

本发明的小核糖核酸或其激动剂或拮抗剂，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌注、静脉、或皮下给药。

所述的小核糖核酸或其激动剂或拮抗剂可直接用于疾病治疗，例如，用于系统性红斑狼疮的治疗。在使用本发明小核糖核酸或其激动剂时，还可同时使用其他治疗系统性红斑狼疮的药剂。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的小核糖核酸或其激动剂或拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。

使用药物组合物时，是将安全有效量的所述小核糖核酸或其激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

通过给予受试者所述的小核糖核酸(如miR-146a或miR-146b)或其激动剂或拮抗剂，可提高受试者中该小核糖核酸的含量、表达，从而预防或治疗该小核糖核酸降低相关的疾病，如干扰素通路异常激活相关疾病。已有研究显示，I型干扰素通路的异常激活在狼疮发病中发挥着关键的作用。

本发明还涉及定量和定性检测所述小核糖核酸水平，从而判断系统性红斑狼疮的发生或发展的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，例如包括(但不限于)：实时荧光定量PCR，聚类分析，非参数Mann-Whitney检验，Spearman相关性分析等。

一种检测待测组织或样品中是否存在所述小核糖核酸及其存在量的方法是利用实时荧光定量PCR进行检测，它包括：制备各miRNA的特异性探针(所述探针优选携带可检测信号)，制备各miRNA的特异性引物，进行PCR，然后通过检测PCR结束后的可检测信号的强弱来判断所述小核糖核酸的水平。作为本发明的优选方式，基于TaqMan荧光技术，即以TaqMan荧光探针为基础进行检测。TaqMan荧光探针为一种寡核苷酸，其两端分别标记一个荧光发射基团(作为可检测信号)和一个荧光淬灭基团。当探针完整时，荧光发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而通过荧光检测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，即荧光信号的累计与PCR产物形成的完全同步，从而实现定性和定量。

所述的小核糖核酸特异性的引物和/或探针也包含在本发明内，用于检测样品中是否存在所述小核糖核酸及其存在量，从而用于判断受试者是否患有系统性红斑狼疮或患病风险。所述的探针可固定在微阵列(microarray)或基因芯片上，用于分析组织或样品中miRNA的差异表达分析和基因诊断。

本发明还包括可用于检测miRNA的表达水平，进而诊断系统性红斑狼疮的试剂盒，所述的试剂盒中可包括特异性扩增所述的miRNA(选自以下组的至少一个：miR-146a、miR-130b、miR99a、miR-10a、miR-134、miR-31、miR-95)的引物。优选的，它还含有以下试剂：与所述的miRNA特异性结合的探针；更优选所述探针携带可检测信号。作为本发明的优选方式，所述的小核糖核酸是通式(I)所示小核糖核酸。作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还含有系统性红斑狼疮临床检测的说明书。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示和证明了一类小核糖核酸与系统性红斑狼疮密切相关，找到了可作为SLE临床诊断的重要生物标志物，为该疾病的诊断或防治提供了新的靶点。

(2)首次揭示通式(I)所示小核糖核酸的过表达可抑制I型干扰素通路的激活，从而为I型干扰素通路异常激活相关疾病的防治提供了有效途径。

(3)本发明人分析了大量的SLE患者中小核糖核酸的水平，并与正常人作了细致的比较，因此结果准确可靠。

材料和方法

1.研究对象

选择SLE患者共52例，均为上海仁济医院风湿免疫科门诊与病房病人(来自于上海市以及中国其它多个省市)，诊断均符合美国风湿病学会SLE分类标准推荐的11项标准中的至少4项，其中男4例，女48例，平均年龄33.5岁(12-60岁)，将其中47例病人按SLE疾病活动性积分(SLEDAI 2K)分为SLE非活动组(0～4分，即SLE稳定组)18例和SLE活动组(≥5分)29例。其中26例符合ARA狼疮肾炎标准。

另外，设置正常对照组29例，来自医院体检正常人群(来自于上海市以及中国其它多个省市)，其中男2例，女27例，平均年龄28.5岁(19-50岁)。设置6例白塞病(BD)患者。

各组性别和年龄差异无统计学意义，无现存感染，研究组与对照组每人采外周静脉ACD抗凝血1ml，作为检测样品。

2.引物和探针设计

miRNA逆转录引物和Real-time PCR反应探针直接从ABI(AppliedBiosystems公司， MicroRNA(miRNA)Assays)购买获得；此外，本领域人员可以方便地根据所述的miRNA序列来设计所述引物和探针。

靶基因和I型干扰素下游基因定量引物的设计：检索NCBI数据库查到人类IRAK1、TRAF6、Ly6E、OAS1、MX1基因cDNA全长序列，以Oligo 6.71软件设计扩增模板的引物如下：

IRAK1正义链：5′TGGACTTTGCTGGCTACTG 3′(SEQ ID NO:10)，

IRAK1反义链：5′CTGTCCTGATGTAGAAACTGAAT 3′(SEQ ID NO:11)；

TRAF6正义链：5′TTGCACAAGATGGAACTGAG 3′(SEQ ID NO:12)，

TRAF6反义链：5′ATTGATGCAGCACAGTTGTC 3′(SEQ ID NO:13)；

Ly6E正义链：5′CTTACGGTCCAACATCAGAC 3′(SEQ ID NO:14)，

Ly6E反义链：5′GCACACATCCCTACTGACAC 3′(SEQ ID NO:15)；

OAS1正义链：5′GAAGGCAGCTCACGAAAC 3′(SEQ ID NO:16)，

OAS1反义链：5′TTCTTAAAGCATGGGTAATTC 3′(SEQ ID NO:17)；

MX1正义链：5′GGGTAGCCACTGGACTGA 3′(SEQ ID NO:18)，

MX1反义链：5′AGGTGGAGCGATTCTGAG 3′(SEQ ID NO:19)；

IFN α正义链：5’-TCCATGAGATGATCCAGCAG-3’(SEQ ID NO:24)，

IFN α反义链：5’-ATTTCTGCTCTGACAACCTCCC-3’(SEQ ID NO:25)；

IFN β正义链：5’-TCTAGCACTGGCTGGAATGAG-3’(SEQ ID NO:26)，

IFN β反义链：5’-GTTTCGGAGGTAACCTGTAAG-3’(SEQ ID NO:27)。

引物设计好后通过BLAST分析(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)避免扩增的目的片段序列存在非特异性，由上海生工公司合成。

内参照基因---核糖体蛋白L13a(RPL13A)的定量引物来源于QuantitativePCR Primer Database(QPPD)网站所报导序列，也为上海生工公司合成：

RPL13A正义链5′CCTGGAGGAGAAGAGGAAAGAGA 3′(SEQ ID NO:20)，

RPL13A反义链5′TTGAGGACCTCTGTGTATTTGTCAA 3′(SEQ ID NO:21)。

3.RNA抽提和逆转录

应用Trizol酚氯仿法抽提(Invitrogen公司产品)血液样品的总RNA，得到的RNA用毛细管电泳(NanoDrop Specthophotometer)鉴定其完整性，紫外分光光度计测定其浓度。

一部分总RNA用作oligo dT逆转录，使用Superscript II逆转录酶试剂盒(Invitrogen公司产品)逆转录为cDNA，首先加RNA 8ul、oligo dT 1ul、dNTP 4ul混匀离心后65℃ 5min，快速置于冰上再加入5×FS缓冲液4ul、0.1M DTT 2ul，混匀离心后42℃ 2min，最后加入1ul的SSRT II混匀离心后于42℃ 50min，70℃ 15min条件下反应。

另一部分总RNA用作miRNA特异性引物逆转录，加样体系为：

dNTP 0.03ul，MMLV 0.2ul，10×缓冲液0.3ul，RNase抑制剂0.02ul，ddH₂O(无RNase)0.45ul，引物1ul，RNA 1ul。

逆转录反应条件为16℃ 30min，42℃ 30min，85℃ 5min。

4.实时荧光定量PCR(Real-time PCR)

在ABI Prism 7900测序仪(Applied Biosystems公司)上进行实时荧光定量PCR操作。

针对每一个所检测的miRNA，用miRNA Taqman方法的加样体系为MasterMix2ul、特异性探针1ul和模板1ul，每个样本做两负孔，负孔之间CT值差异均控制在0.5个CT之内，每块板上均设有板间对照(Control)。反应条件为50℃ 2min，95℃ 10min；之后95℃ 15s，60℃ 1min共进行40个循环。

靶基因SYBR Green定量加样体系为SYBR Green Master Mix 2.5ul、ROX0.1ul、引物(正义链0.1ul，反义链0.1ul)、ddH₂O 1.2ul和cDNA模板1ul，同样每个样本做两负孔，负孔之间CT值差异控制在0.5个CT之内，每块板上设置有板间对照(Control)。反应条件为95℃ 15s；之后95℃ 5s，60℃ 30s共进行40个循环；之后95℃ 15s，60℃ 15s，95℃ 15s。

5.IFN积分计算

IFN积分计算根据已有的相关研究报道[Xuebing Feng，Hui Wu，Bevra H.Hahn，and Betty P.Tsao，et al Association of Increased Interferon-Inducible GeneExpression With Disease Activity and Lupus Nephritis in Patients With SystemicLupus Erythematosus.Arthritis Rheum 2006 Sep；54(9):2951-62.]，本发明人选用Ly6E、OAS1、MX1三个基因来计算IFN积分。首先利用正常对照组各个基因表达水平的平均值和标准差来标化每个样本相应基因的表达水平，然后将每个样本的标化值相加即可得IFN积分。公式如下：

$>\underset{i=1}{\overset{3}{\Sigma }}\frac{\mathrm{Gene}{i}_{\mathrm{SLE}}-\mathrm{meanGene}{i}_{\mathrm{ctr}}}{\mathrm{SD}\left(\mathrm{Gene}{i}_{\mathrm{ctr}}\right)},$>

i＝Ly6E、OAS1、MX1三个基因中的一个基因，

Gene i_SLE＝每个SLE患者的基因表达水平，

Gene i_ctr＝正常对照组的基因表达水平。

SLE患者中IFN积分的平均值为65.3，最小值和最大值分别为-0.45和412.6；正常对照组中三个值分别是为0、-1.88和6.55。

6.数据分析

分析各孔CT值，选取CT值小于33并且复孔间重复性好的样本，计算出用内参标化后的2^(-ΔΔCT)值，即代表该样本该基因初始拷贝数的数量。第一批表达数据首先运用SAM2.20软件分析，然后将表达有差异的数据导入HCE 3.0软件作聚类分析。后一批扩大样本数据用Graph Pad 4.03软件进行分析，两组独立样本数据比较应用非参数Mann-Whitney检验，相关分析应用Spearman相关性检验。P值小于0.05代表有统计学意义。

7.miR-146a表达载体的构建

以采用常规方法获得的基因组DNA为模板，运用PCR方法扩增出长度约为280bp的miR-146a前体片段，引物如下：

上游引物5’GTGAGATCTGCATTGGATTTACC 3’(SEQ ID NO:22)；

下游引物：5’GACCTCGAGACTCTGCCTTCTGT 3’(SEQ ID NO:23)。

利用Bgl II/Xho I进行酶切，然后将其插入经过同样酶切的pSUPER basic载体(OligoEngine)内。通过常规测序方法确定插入片段的完整性和准确性，获得正确的miR-146a表达载体。

将干扰素诱导因子5(IRF5)和信号转导和转录激活子1(STAT1)基因3’端非翻译区(UTR)内预测可与miR-146a互补结合的一段序列克隆接入pMIR-REPORT载体(Ambion公司)萤火虫荧光素酶下游的Sac I/Hind III酶切位点内，构建3’UTR荧光报告载体。引物序列如下：

IRF5正向引物：5-’GTCGAGCTCTCTTGTGTATATTC-3’(SEQ ID NO:28)，

IRF5反向引物：5’-GAGAAGCTTGGAGTGTGCAGAGAT-3’(SEQ ID NO:29)；

STAT1正向引物：5’-GTGGAGCTCTTTACTGTTTGTTATGG-3’(SEQ ID NO:30)，

STAT1反向引物：5’-ACGAAGCTTAATAGACTAAATACCAC-3’(SEQ ID NO:31)。

所有载体均通过测序方法确定其插入片段的完整性和准确性。表达载体扩增提取采用EndoFree Plasmid Maxi kit(Qiagen公司)方法。转染以后miR-146a是否成功过表达采用RT-PCR方法检测。

8.细胞培养，转染和刺激

293T和SMMC-7721细胞培养于加了10％FBS的DMEM营养液中，293T/ISRE(稳转ISRE报告基因的293T细胞)则培养于加了10％FBS和20μg/ml的潮霉素B的DMEM营养液中，这三种细胞系采用脂质体2000(Invitrogen公司)转染方法。通过密度梯度离心方法(Cedarlane公司)从人外周血中分选得到外周血单个核细胞(PBMC)，然后在加了10％FBS的RPMI 1640中培养2小时，运用电转仪(Amaxa公司，programme T-16)将1.5μg空载体或者miR-146表达载体分别电转入3×10⁶的PBMC中，否则电转入3μg miRIDIAN^TM(有miR-146a抑制剂)或一段随机无关序列(Dharmacon公司)。刺激细胞时，首先在转染后18或者24小时之后细胞换液，然后将细胞分别培养于单独新鲜培养基中和加入I型干扰素(PBLInterferonsource公司)或各种TLR配体(Invivogen)的新鲜培养基中。

9.荧光报告系统

首先把SMMC-7721细胞系铺于96孔板，将20ng 3’UTR荧光报告载体，10ng pRL-TK载体(Promega公司)和270ng空载体(pSUPER basic)或者miR-146a表达载体混匀后转染入每孔SMMC-7721细胞，转染后细胞培养24小时，裂解后即可按照双荧光报告系统(Promega公司)说明上机(TR717，AppliedBiosystems公司)检测，对于每个孔而言可以得到一个ISRE与Renilla的荧光信号比值。293T/ISRE细胞系步骤同上，不同的是转入300ng空载体或miR-146a表达载体。每次实验均为四复孔，每个实验重复三次。

10.Western免疫印迹法

首先将293T细胞培养在6孔板上，然后分别在每孔细胞内转染入3μgmiR-146a表达载体，转染24小时后，裂解细胞抽取蛋白。上清加入SDS-PAGE胶中进行电泳，用直接抗体进行免疫印迹，通过Luminol/Enhancer试剂(Pierce公司)检测。IRF5和GAPDH抗体分别由Abcam公司和Chenicon公司购买获得，SATA1和HRP标记的二抗来源于Santa Cruz公司。蛋白质相对表达量通过Quantity One 4.52软件(Bio-Rad公司)计算分析获得。

实施例1 一组miRNA在SLE患者和正常对照组之间表达水平存在差异

为探讨miRNA在SLE方面发挥的作用，本发明人应用Real-time PCR方法对SLE患者和正常对照组外周血156个成熟miRNA表达水平差异进行了研究。

结果发现，有42个miRNA表达水平在SLE患者中明显低于正常人，其中包括miR-146a在内的7个miRNA表达水平降低高达6倍以上，见图1A和表1。

表1

 

名称序列(GenBank登录号)SEQ ID NO:miR-146a5’UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU 3’(MI0000477)2miR-130b5’CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU 3’(MI0000748)4miR99a5’AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG 3’(MI0000101)5miR-10a5’UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG 3’(MI0000266)6miR-1345’UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG 3’(MI0000474)7miR-315’AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU 3’(MI0000089)8miR-955’UUCAACGGGUAUUUAUUGAGCA 3’(MI0000097)9

接着，本发明人对47例SLE患者，6例BD患者和21例正常对照运用同样的方法检测miR-146a的表达水平。miR-146a在SLE患者中表达水平显著低于正常对照(P<0.0001)，而BD患者相比正常人无明显变化，见图1B。

根据病人具体情况和个体化治疗原则，所有病人用药种类和剂量不尽相同，进一步本发明人分析了用药剂量与miR-146a表达之间的关系。挑选了29例激素用量较大的活动性病人，分析激素用量与miR-146a之间的相关性，发现激素水平对miR-146a表达并无影响(P＝0.1442)。根据是否同时服用非特异性免疫抑制剂将病人分成两组，两组之间miR-146a表达同样不存在统计学差异(P＝0.7149)。综上表明在SLE病人中miR-146a表达水平降低系原发性的，与用药情况无关。

实施例2 miR-146表达信号与疾病活动程度和肾脏受累程度负相关

根据本发明人前面数据结果，进一步研究了miR-146a表达水平与疾病的相关性。

结果显示，miR-146a在SLE患者中显著低于正常对照组，非参数Mann-Whitney检验显示差异有统计学意义(P值均<0.0001)，见图2A。

miR-146a水平在SLE患者活动组(SLEDAI积分≥5)显著低于稳定组(SLEDAI积分0～4分)，非参数Mann-Whitney检验显示差异有统计学意义(P＝0.0080)，见图2A。

在此基础之上进一步应用Spearman单尾相关性检验发现SLEDAI积分和miR-146a两者之间存在负相关(r＝-0.2882，P＝0.0247)，见图2C。

排除其他肾脏疾患影响后本发明人根据24小时尿蛋白水平将SLE分成尿蛋白阳性组(24小时尿蛋白大于0.5g)和尿蛋白阴性组(24小时尿蛋白小于0.5g)两组，分析后发现miR-146a水平在两组之间同样存在明显差异(P＝0.0271)，见图2B。

单纯根据肾脏累及的四项指标(血尿、脓尿、蛋白尿和管型尿)计算得到肾脏(Renal)积分，本发明人也发现miR-146a水平与肾脏积分之间存在负性相关(r＝-0.3815，P＝0.0081)，见图2D。

实施例3 miR-146a水平与I型干扰素通路过度活化相关

已有研究结果显示IRAK1和TRAF6活化后可通过多种信号通路传导导致下游I型干扰素的产生，而且I型干扰素通路在狼疮发病中发挥着关键性作用。本发明人通过检测I型干扰素下游三个代表性基因的mRNA表达水平来反映病人体内I型干扰素通路的活化程度，并探索SLE中miR-146a表达水平降低与I型干扰素通路的关系。Spearman双尾相关性检验结果显示，miR-146a表达水平与IFN积分水平之间存在负性相关(r＝-0.3073，P＝0.0378)，见图3。

实施例4 miR-146a可负反馈调节I型干扰素通路

为了进一步研究miR-146a表达与I型干扰素通路过度活化之间的相关性，本发明人对miR-146a对I型干扰素的产生及干扰素通路下游活化的影响作了进一步研究。把miR-146a电转入1名正常人来源的PBMC中，然后用TLR7的配体R837(购自invivogen)刺激，检测I型干扰素的mRNA水平。

结果发现，过表达miR-146a能够明显抑制IFN α和IFN β的表达(见图4A)。预先处理将体内miR-146a抑制后，可发现I型干扰素表达明显上调(见图4B)，结果提示，miR-146a能够负反馈调节I型干扰素的产生。

I型干扰素被诱导产生后，可与细胞膜表面干扰素受体(如IFNAR1或IFNAR2)结合使下游STAT磷酸化。活化的STAT1和STAT2，与DNA结合蛋白干扰素诱导因子9(IRF9)共同形成干扰素刺激基因因子3(ISGF3)，ISGF3可结合于ISRE产生活化信号，刺激下游干扰素诱导基因的产生[Platanias LC.Mechanisms of type-I-and type-II-interferon-mediated signalling.Nat RevImmunol 2005；5:375-86]。因此，本发明人通过测定ISRE的荧光活性来估计miR-146a对I型干扰素下游信号传导的影响。在用I型干扰素刺激的293T/ISRE细胞系中过表达miR-146a后能够明显抑制ISRE报告基因活性(见图4C)，提示miR-146a能够直接调控干扰素受体下游活化信号的传导。

为了进一步阐明miR-146a对干扰素诱导基因表达的影响，本发明人将来源于另外一个正常人的PBMC按照上面同样步骤处理，过表达miR-146a后同样能够抑制干扰素诱导基因的表达(见图4D)。综上miR-146a同时能够有效地调节I型干扰素下游的激活。

实施例5 miR-146a通过多个关键信号分子来调控I型干扰素通路

上面的研究结果提示miR-146a是I型干扰素通路的一个负反馈调控因子，为了探索其作用发挥的分子机制，本发明人运用生物信息学分析miR-146a潜在的靶基因。已有的很多软件分析结果都显示miRNA主要作用于基因的阳性调节基序及其下游的信号转导分子网络。因此，本发明人将I型干扰素通路上关键的信号蛋白与miR-146a序列综合预测，寻找其潜在的结合位点。使用miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/targets/v5/)和TargetScan(http://www.targetscan.org/)软件。结果发现，在已经确定的两个靶基因IRAK1和TRAF6以外，IRF5和STAT13’UTR同样存在miR-146a的结合位点，见图5A。已知这几个蛋白质都是I型干扰素通路上的相关分子。在多个种族中均发现IRF5基因上的一个单倍型可以影响IRF5多个剪切体的表达从而增加SLE发病易感性，且SLE病人和狼疮鼠模型中也同时检测到基础状态下及刺激后状态下STAT1表达水平皆明显升高。

进一步体外实验验证了本发明人这一预测，在过转染miR-146a的SMMC-7721细胞系中，IRF5和STAT1 3’UTR报告基因的活性明显受到抑制，见图5B，提示miR-146a可通过互补结合于预测序列抑制这两个基因的表达。在293T细胞系过表达miR-146a后使用Western免疫印迹检测，发现蛋白水平上IRF5和STAT1的表达均有明显下降，见图5C。因此，miR-146a可通过调节I型干扰素通路上的关键信号分子来调控固有免疫应答。

实施例6 人为升高SLE患者中miR-146a表达水平可部分逆转I型干扰素活化水平

miR-146a通过调节I型干扰素通路上的关键信号分子来调控固有免疫应答，那么人为升高SLE患者体内miR-146a表达水平是否会逆转I型干扰素通路过度活化的程度。将miR-146a电转入来源于一例SLE患者的PBMC，miR-146a水平升高能够降低部分干扰素诱导基因的水平，见图6。计算干扰素积分，也发现过转染miR-146a载体的干扰素积分(67.87)低于过转空载体的干扰素积分(153.59)，提示人为升高SLE患者体内miR-146a表达水平可作为潜在的治疗手段。

实施例7 药物筛选

以HEK 293T为受试对象，检测候选物质刺激前后的HEK 293T中miR-146的表达状况；检测方法如前述“材料和方法”中第4项、第8项和实施例4中所述。

测试组：添加候选物质的重组的HEK 293T(制备方法见“材料和方法”中第8项)培养物；

对照组：不添加候选物质的重组的HEK 293T(制备方法见“材料和方法”中第8项)培养物。

观察测试组和对照组的miR-146的表达状况，如果测试组中miR-146的表达上升，则说明该候选物质是对于防治I型干扰素通路异常激活相关疾病有用的物质。

实施例8 miR-146a的拮抗剂可用来增强I型干扰素通路

上面的研究结果表明miR-146a能抑制I型干扰素通路。而降低miR-146a的水平或用miR-146a的反义寡核苷酸链及其类似物抑制miR-146a的作用，将会增强I型干扰素通路。见图4B，利用miR-146a的反义寡核苷酸抑制miR-146a，IFN α和IFN β的表达明显高于对照组。

讨论

本发明首先检测SLE患者中miRNA的表达差异，分析差异表达的miR-146a在I型干扰素通路活化中的左右，对自身免疫性疾病的发病机理做了进一步的扩展。miR-146a表达与疾病活动之间的明显相关也提示miR-146a可作为SLE的一个新的生物标志物。

本发明在样本筛选阶段排除了感染因素的影响，其次将miR-146a表达水平与不同用药(包括激素和免疫抑制剂)剂量之间做相应统计分析后所得均未发现差异，故排除了药物因素对结果的干扰，表明结果差异确实是因为疾病本身情况所致。

miR-146a在病人中水平显著低于正常对照，且其水平与反映病情活动程度和肾脏损害情况的SLEDAI积分和Renal积分呈负性相关，提示miR-146a可以作为判断病情活动程度和肾脏损害严重度的一个生物标记物，为早期便捷地对SLE进行诊断，评估疾病活动程度和肾脏受累严重情况提供了良好的依据。

已知干扰素通路在SLE发病中发挥重要作用，干扰素通路异常激活是SLE的一个主要分子表型[Pascual V等，Banchereau J Systemic lupuserythematosus:all roads lead to type I interferons.Curr Opin Immunol.2006Dec；18(6):676-82.Epub 2006 Oct 2]。TRAF6/IRAK1作为TLR通路下游的接头蛋白，在诱导I型IFN的产生中起着关键的作用[Uematsu S，Sato SInterleukin-1 receptor-associated kinase-1 plays an essential role forToll-like receptor(TLR)7-and TLR9-mediated interferon-{alpha}induction.J Exp Med.2005 Mar 21；201(6):915-23.Epub 2005 Mar 14.和Kawai T，Sato S等，Interferon-alpha induction through Toll-likereceptors involves a direct interaction of IRF7 with MyD88 and TRAF6.Nat Immunol.2004 Oct；5(10):1061-8.Epub 2004 Sep 7]。本发明人的研究结果表明miRNA参与SLE疾病的发生发展，miRNA表达信号可作为SLE临床诊断的一个重要生物标志物；miR-146a可作为一个新的药物干预靶点，特异性干预miR-146a的表达水平可发展为新的治疗手段，这种有针对性和特异性的干预有望高效低副作用地对疾病进行治疗。

TLR通过与其相应的配体结合在自身免疫反应中发挥着重要的作用，在SLE患者的浆细胞样树突状细胞(p DC)中，RNA结合核蛋白和自身DNA与相应的自身抗体结合形成的免疫复合物可通过结合于TLR7或者TLR9促进I型干扰素的大量产生，这个反应需要包括MyD88，IRAK1，TRAF6，IRF5和IRF7在内的信号接头蛋白和转录蛋白的次序激活来实现。目前研究发现包含RNA的自身免疫复合物主要通过结合于细胞内涵体膜上组成性表达的TLR7和TLR9，使下游IRF5激活，在I型干扰素产生中发挥重要的作用。干扰素一旦产生，便可结合于干扰素受体，通过STAT蛋白的活化最终导致干扰素诱导基因基因的转录产生。生理状态下，免疫细胞可自发地通过多种机制来负反馈调节TLR信号传导通路从而保证免疫系统处于一个相对平衡的状态，这些机制包括细胞内组成性表达或者诱导表达负调节因子(如MyD88s，IRAKM，SOCS1)，负反馈调节的缺陷造成正向信号的过度传导最终引起人体疾病。这些观点已经在很多研究中得到证实，比如哮喘病人中遗传学研究发现IRAKM基因存在非活性损伤，同时在SOCS1基因缺陷狼疮鼠模型中可发现类似于系统性自身免疫病的临床表型。现在的研究结果发现miRNA也属于负调节因子中的一类，如在人单核细胞THP-1细胞系中发现miR-146可通过形成负反馈调节通路来调节TLR4信号传导。在原代细胞中，本发明人也发现R837(TLR7配体)、CpG(TLR9配体)、I型干扰素和LPS(TLR4配体)能够刺激正常人来源的PBMC中miR-146a表达升高(见图7)。这说明miR-146a确实参与了固有免疫应答的复杂的调节网络。虽然以往的研究中曾显示THP-1细胞系中TLR7和TLR9并不能刺激miR-146a表达，但可能是TLR表达模式的不同和刺激反应强度不同所致。因为已有研究证明在体外简单培养基中单一细胞的反应没有办法重复人外周血内激素与细胞因子多重相互作用下的实验结果。

在本发明中，发现miR-146a可通过TLR7通路抑制下游I型干扰素的产生及干扰素下游的反应性。为了探讨miR-146a的作用机制，本发明人采用生物信息学方法预测，在原有的发现基础上，预测得到两个新的靶基因：IRF5和STAT1，所有这些基因分子都是干扰素通路上下游关键的信号分子，因此miR-146a能够调节I型干扰素通路中的多个组成部分(见图8)。也许miR-146a对于某一个靶基因而言调节作用有限，但是几个靶基因的协同作用使miR-146a的调节明显放大。这与miR-181a的作用机制有类似之处，miR-181a通过对多种磷酸酶的温和调节，有效地降低T细胞对抗原识别的兴奋阈值，这是siRNA的单靶点强大的调节作用所无法比拟的。miR-146a的表达缺陷，导致其靶基因的大量蓄积，可进一步促进I型干扰素的大量产生及其下游信号的过度活化，结果中显示的miR-146a表达与I型干扰素之间的负相关也同样符合上面假设，本研究揭示了miRNA失调在自身免疫性疾病中发挥的作用。

为探讨SLE病人中miR-146a下降原因，本发明人应用生物信息学分析发现miR-146a启动子区域有一个潜在甲基化位点(http://cpgislands.usc.edu/)。该CpG岛的位置与一个预测的STAT1结合位点和一个确证的NFκB结合位点明显重叠(http://ecrbrowser.dcode.org/)。

因为I型干扰素在SLE发病机制中举足轻重的地位，导致TLR和IFN的拮抗剂成为靶点治疗SLE的热门，然而由于其对固有免疫和适应性免疫的潜在威胁使人们不得不谨慎对待。而不同于以往的有或无的调节特点，miRNA主要是在数量上对靶基因进行调节。因此人为调节体内miRNA的表达水平有可能发展成为对抗SLE的新生手段。本研究结果也显示当人为增加SLE病人PBMC中miR-146a表达水平时，反应干扰素通路活化程度的干扰素诱导基因的表达均明显下调。综上提示miR-146a可作为新的SLE治疗的靶点。

综上所述，SLE患者中miR-146a表达缺陷与疾病生物学及临床表型密切相关。本发明人的结果提示miR-146a可作为SLE一个新的生物标志物，人为改变患者体内miR-146a表达水平可发展为新的治疗手段。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>微小RNA基因在系统性红斑狼疮疾病诊断和治疗中的作用

<130>081646

<160>31

<170>PatentIn version 3.3

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<223>引物

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