厌氧同时还原硫酸盐和反硝化功能菌株的筛选用培养基及筛选方法

摘要

厌氧同时还原硫酸盐和反硝化功能菌株的筛选用培养基及筛选方法，它涉及一种菌株的筛选用培养基及筛选方法。它解决了现有技术筛选厌氧同时还原硫酸盐和反硝化功能细菌存在分离困难、分离周期长，及分离到的菌株的硫酸盐还原和反硝化降解效能低的问题。筛选用培养基分液体和固体两种筛选用培养基。菌株的筛选：一、取污水或活性污泥；二、配制筛选用培养基；三、固体培养基分离；四、液体富集；五、重复三至四的操作；六、功能验证；选取性能优异的菌株即可。本发明筛选的菌株能同时去除硫酸盐和硝酸盐，且去除率高。筛选用培养基的针对性强。本发明方法简单有效、分离快速、培养周期短、工作效率高，并筛选出目前筛选不到的污水处理性能优异的菌株。

说明书

技术领域

本发明涉及一种菌株的筛选用培养基及筛选方法。

背景技术

厌氧同时还原硫酸盐与反硝化细菌主要用于同时含有硫酸盐和硝酸盐污水的处理，现有筛选同时还原硫酸盐与反硝化细菌方法的分离周期较长，同时不易获得纯菌株，及时获得了菌株，其对硫酸盐和硝酸盐的降解效能低。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术筛选厌氧同时还原硫酸盐与反硝化功能细菌存在分离困难、分离周期长，及分离到的菌株的硫酸盐还原和反硝化降解效能低的问题，提供了一种厌氧同时还原硫酸盐和反硝化功能菌株的筛选用培养基及筛选方法。

本发明厌氧同时还原硫酸盐和反硝化功能菌株的筛选用培养基分液体筛选培养基和固体筛选培养基两种；每升液体筛选培养基由3.0～5.0gNa₂SO₄、1.0～3.0g KNO₃、1.0～3.0g NaNO₃、0.5～2gMgSO₄·7H₂O、0.3～0.6g K₂HPO₄、3.0～6.0g酒石酸钾钠、0.5～2g KH₂PO₄、0.1～0.5gCaCl₂·2H₂O、0.3～0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，液体筛选培养基的pH值为7.5；每升固体筛选培养基是由3.0～5.0g Na₂SO₄、1.0～3.0g KNO₃、1.0～3.0g NaNO₃、0.5～2gMgSO₄·7H₂O、0.3～0.6g K₂HPO₄、3.0～6.0g酒石酸钾钠、0.5～2g KH₂PO₄、0.1～0.5gCaCl₂·2H₂O、10～15g琼脂粉、0.05～0.4mL浓度为0.2～0.4g/L的刃天青溶液、0.3～0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，固体筛选培养基的pH值为7.5。

本发明的液体培养基和固体培养基均处于厌氧状态。

本发明厌氧同时具有还原硫酸盐和反硝化功能的菌株的筛选方法是按下述步骤实现的：一、分别配制如权利要求1所述的液体筛选培养基和固体筛选培养基；二、取厌氧同步去除硫氮工艺的污水或活性污泥，在厌氧条件下进行倍比稀释；三、固体培养基分离：将步骤一配制固体培养基在沸水浴中融化，然后冷却至45～55℃，迅速将步骤二稀释的污水或活性污泥用注射器注入固体培养基中，采用Hungate厌氧及“滚管”方法在冷水(10℃)中混合，然后放入恒温培养箱中在厌氧、35～38℃条件下培养，直至长出菌落；四、液体培养基富集：挑取步骤三培养的单菌落接种到步骤一配制的液体培养基，厌氧环境下培养7天～14天；五、分离纯化；六、重复步骤三至五的操作进行多次分离纯化，直至获得纯菌株；七、对步骤六得到的纯菌株性能检测，选取还原硫酸盐和反硝化功能性能优异的菌株，即完成对厌氧同时具有还原硫酸盐和反硝化功能的菌株的筛选。整个筛选过程在厌氧条件下进行。

本发明的水处理除污菌株能同时去除硫酸盐和硝酸盐，并且去除效率高，硝酸盐的去除率高达97.98％，的去除率高达96.48％。筛选用培养基的针对性强。本发明的方法简单有效、分离快速、培养周期短、工作效率高，并可筛选出目前筛选不到的污水处理性能优异的菌株的优点。

附图说明

图1是SN22-2菌单株原子力扫描电镜照片。图2是SN22-2菌多株原子力扫描电镜照片。图3是SN22-2菌对硝酸盐去除率曲线图，图中-×-表示SN22-2菌对的去除率曲线，-●-表示培养基中的浓度曲线，-▲-表示培养基中的浓度曲线。图4是SN22-2菌对的去除率曲线图，图中-×-表示SN22-2菌对的去除率曲线，-★-表示培养基中的浓度曲线。图5是基于SN22-2菌株和相近的菌株16S rDNA序列构建的NJ系统发育树。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式中厌氧同时还原硫酸盐和反硝化功能菌株的筛选用培养基分液体筛选培养基和固体筛选培养基两种；每升液体筛选培养基由3.0～5.0gNa₂SO₄、1.0～3.0g KNO₃、1.0～3.0g NaNO₃、0.5～2gMgSO₄·7H₂O、0.3～0.6g K₂HPO₄、3.0～6.0g酒石酸钾钠、0.5～2g KH₂PO₄、0.1～0.5gCaCl₂·2H₂O、0.3～0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，液体筛选培养基的pH值为7.5；每升固体筛选培养基是由3.0～5.0g Na₂SO₄、1.0～3.0g KNO₃、1.0～3.0g NaNO₃、0.5～2g MgSO₄·7H₂O、0.3～0.6g K₂HPO₄、3.0～6.0g酒石酸钾钠、0.5～2g KH₂PO₄、0.1～0.5g CaCl₂·2H₂O、10～15g琼脂粉、0.05～0.4mL浓度为0.2～0.4g/L的刃天青溶液、0.3～0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，固体筛选培养基的pH值为7.5。

本实施方式的液体培养基和固体培养基均处于厌氧状态。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：每升液体筛选培养基由4gNa₂SO₄、2.0gKNO₃、2.0g NaNO₃、1.0g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5.0g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O、0.5g L-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成。其它与具体实施方式一相同。

本实施方式的液体培养基处于厌氧状态。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：每升固体筛选培养基由4gNa₂SO₄、2.0g KNO₃、2.0g NaNO₃、1.0g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5.0g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O 12g琼脂粉、0.1mL浓度为0.2g/L的刃天青溶液、0.5g L-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成。其它与具体实施方式一相同。

本实施方式的固体培养基处于厌氧状态。

具体实施方式四：本实施方式中利用具体实施方式一所述的筛选用培养基筛选厌氧同时具有还原硫酸盐和反硝化功能的菌株，整个筛选过程在厌氧条件下进行，筛选方法是按下述步骤实现的：一、分别配制如权利要求1所述的液体筛选培养基和固体筛选培养基；二、取厌氧同步去除硫氮工艺的污水或活性污泥，在厌氧条件下进行倍比稀释；三、固体培养基分离：将步骤一配制固体培养基在沸水浴中融化，然后冷却至45～55℃，迅速将步骤二稀释的污水或活性污泥用注射器注入固体培养基中，采用Hungate厌氧及“滚管”方法在冷水中混合，然后放入恒温培养箱中在厌氧、35～38℃条件下培养，直至长出菌落；四、液体培养基富集：挑取步骤三培养的单菌落接种到步骤一配制的液体培养基，厌氧环境下培养7天～14天；五、分离纯化；六、重复步骤三至五的操作进行多次分离纯化，直至获得纯菌株；七、对步骤六得到的纯菌株性能检测，选取还原硫酸盐和反硝化功能性能优异的菌株，即完成对厌氧同时具有还原硫酸盐和反硝化功能的菌株的筛选。

本实施方式步骤一中采用蒸煮方法配制液体培养基，在蒸煮过程中通入高纯氮气(高纯氮气中氧气浓度≤2ppm)以驱除氧气，同时向培养基中加入还原剂(L-半胱氨酸)，利用其还原作用去除氧，降低氧化还原电位，使氧化还原电位(ORP)低于-100mV，由此液体培养基处于厌氧状态。本实施方式在步骤一中采用蒸煮方法配制固体培养基，在煮沸之前，需不断搅拌，防止琼脂凝固在锅底。在煮沸之前加入0.2％的刃天青溶液(指示剂)待培养基煮沸后，加入L-半胱氨酸0.5g，通入高纯氮气驱氧30min，然后在121℃条件下灭菌20min。

步骤二中根据厌氧同步去除硫氮工艺的污水或厌氧活性污泥具体情况选择可以进行厌氧的倍比稀释。将污水或厌氧活性污泥的水样注入到经灭菌的含有高纯氮气的厌氧管中；水样需在4℃下保存。

经检测，本实施方式筛选的菌株对硝酸盐的去除率在82.75％以上，高达97.98％；对硫酸盐的去除率在90.84％以上，高达96.48％。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤三中菌落的培养温度为36℃。其它与具体实施方式四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤三中菌落的培养温度为37℃。其它与具体实施方式四相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤五中分离纯化是对液体培养富集的菌液进行镜鉴以及革兰氏染色，去除重复菌株。其它与具体实施方式四相同。

具体实施方式九：本实施方式污水选取大庆油田四厂杏九联合污水处理站。微生物分子生态学手段证实污水中有同时反硝化和硫酸盐还原菌，进行厌氧管的采样。采用具体实施方式四的方法进行筛选。

将本实施方式的筛选菌株标号为SN22-2，对其进行下述试验：

1、对SN22-2菌株形态和生理生化鉴定

菌株为杆菌(见图1和2)，菌体的宽为0.20～0.7μm，长为3.0～5.5μm，厌氧，短杆，极生鞭毛，生长温度为20～40℃，生长pH值为7.5，葡萄糖氧化发酵：发酵产酸；平板菌落呈白色、圆形且表面隆起；脂肪酸主要分布在C_12:0～C19-CYC-9；主要脂肪酸为C_{16:1-CIS-9-FAME}、C_16:0-FAME、C_18:0-FAME和C18:0DMA，C_{16:1-CIS-9-FAME}占到脂肪酸总数6.35％，C_16:0-FAME占到脂肪酸总数21.42％、C_18:0-FAME占到脂肪酸总数28.95％、C18:0 DMA占到脂肪酸总数为6.04％，水处理除污菌株生理生化指标：

接触酶                    +                 淀粉水解              -

油脂水解                  +                 乙酰甲基醇            -

甲基红                    +                 明胶液化              -

产吲哚                    +                 尿素水解              -

柠檬酸盐利用              +                 葡萄糖发酵            -

硝酸盐还原                +                 果糖发酵              -

产硫化氢                  +                 乳糖发酵              -

产氨试验                  +                 蔗糖发酵              -

革兰氏染色                G-                乙醇发酵              -

，石蕊牛奶检测：石蕊还原、牛奶凝固。

2、基于SN22-2菌株和相近的菌株16S rDNA序列构建的NJ系统发育树，如图5。

经测序后获得1468bp的16S rDNA序列，GenBank登录号为DQ450463，采用邻接法(NJ)构建系统进化树。系统发育树16个菌株的平均遗传距离为0.043。系统进化表明，SN22-2菌株的16S rDNA序列与Bacilluscoagulans(AB240205)的相似性为99％，结合菌株的形态学和生理学特性，初步鉴定Bacillus coagulans SN22-2。

2、SN22-2菌株的功能采用下述试验进行验证：

SN22-2菌株的接种量为5％，每24h取样，离子色谱测量NO₃^-NO₂^-和SO₄^2-的浓度，对菌株的降解率进行测试。

由图3可知，浓度变化范围是从初始的4368.45mg/L，降低到88.12mg/L，SN22-2菌株对于的去除率在第4天的时候即达到了82.75％，最高去除率达到了97.98％。而浓度最高值出现在第4天，为1493.60mg/L，这与第4天的的浓度大幅度降低有关，产生了大量的中间产物。SN22-2菌株具有很强的反硝化功能。

由图4可知，SN22-2菌株在反硝化过程中，培养基中的浓度变化范围从586.71mg/L降低到20.63mg/L，对于的去除率在第4天的时候达到了90.84％，最高达到96.48％，可知SN22-2菌株具有较强的硫酸盐还原能力。

因此，SN22-2菌株同时具有硫酸盐还原和反硝化能力。