检测油菜菌核病菌对多菌灵抗性的引物序列及其方法

摘要

本发明公开了一种检测油菜菌核病菌对多菌灵抗性的引物序列及其方法，包括两组引物，第一组引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO：1所述的碱基序列，第一组引物的反向引物具有序列表中SEQ ID NO：3所述的碱基序列；第二组引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO：2所述的碱基序列，第二组引物的反向引物具有序列表中SEQ ID NO：3所述的碱基序列。本发明引物序列特异性高，能够用于快速检测、准确检测油菜菌核病菌对多菌灵的抗性。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种检测油菜菌核病菌对多菌灵抗性的引物序列及其方法。

背景技术

油菜菌核病菌(Sceloritinia sclerotiorum)引起的油菜菌核病是油菜生产上最重要的病害。该病菌在油菜花期开始侵染幼嫩的油菜花，随着带菌花瓣掉落到叶片上，茎杆上，病菌开始蔓延，侵染整株植物。在病害流行的年度，能够引起15％-20％的经济损失。

由于缺乏有效的抗病品种，目前生产上用于防治油菜菌核病的主要方法是化学防治。多菌灵杀菌剂是防治油菜菌核病的主要药剂，但由于该类药剂长期大量使用，在一些地区油菜菌核病菌已对该药剂产生了明显的抗性。油菜菌核病菌中多菌灵抗性菌株的检测对延缓和治理药剂抗性都起着至关重要的作用。

已有研究发现，β-微管蛋白基因编码198或200位氨基酸的密码子发生点突变是导致大多数病原菌产生田间抗药性的主要原因。油菜菌核病菌对多菌灵表现出高水平和中水平两类抗性。在多菌灵高抗的油菜菌核病菌的菌株中，编码β-微管蛋白基因第198位氨基酸的密码子由GAG突变为GCG，从而导致该氨基酸由Glu突变为Ala。该位点的突变，降低了苯丙咪唑类杀菌剂的亲合力，使得菌株表现出高水平抗性。编码β-微管蛋白基因第200位氨基酸的密码子由TTC突变为TAC，氨基酸由Phe突变为Tyr，会导致菌株对多菌灵产生中等水平抗性，同时对乙霉威抗性也增加。

传统的抗药性生物测定方法费时、费力。已报道的ASO-PCR技术仅能检测由198位氨基酸点突变引起的多菌灵抗性，不能检测由200位点突变引起的抗性。因此，需要建立一种新的快速检测技术，准确、全面检测多菌灵抗性的油菜菌核病菌。

发明内容

本发明提供了一种检测油菜菌核病菌对多菌灵抗性的引物序列，该引物特异性高，利用该引物序列能快速、准确、全面检测油菜菌核病菌对多菌灵的抗性。

一种检测油菜菌核病菌对多菌灵抗性的引物序列，包括两组引物，第一组引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO：1所述的碱基序列，第一组引物的反向引物具有序列表中SEQ ID NO：3所述的碱基序列；第二组引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO：2所述的碱基序列，第二组引物的反向引物具有序列表中SEQ ID NO：3所述的碱基序列。

由背景技术可知，油菜菌核病菌对多菌灵的高水平抗性是由于β-微管蛋白基因的第198位密码子GAG突变成GCG所致，第一组引物的正向引物的3’末端碱基为C，使得其与抗性菌株的突变碱基C配对，而不能与敏感菌株碱基A配对，第一组引物的正向引物的3’端倒数第二个碱基为T，使得该正向引物与敏感菌株的DNA的两个碱基产生错位，在相同的PCR反应条件下比只有一个碱基错配的引物特异性更高。

编码β-微管蛋白基因第200位氨基酸的密码子由TTC突变为TAC导致菌株对多菌灵产生中等水平抗性，根据相同的原理，第二组引物的正向引物的3’末端碱基设为A，使得其与抗性菌株的突变碱基A配对，而不能与敏感菌株碱基T配对，为了提高了引物的特异性，第二组引物的正向引物的3’端倒数第二碱基由T变成A。

第一组引物和第二组引物共用一个反相引物，反相引物在β-微管蛋白基因中的第六个内含子内，是对油菜菌核特异的序列。

利用第一组引物对对多菌灵高抗的油菜菌核病菌的DNA进行扩增可以得到403bp的片断，利用第二组引物对对多菌灵中抗的油菜菌核病菌的DNA进行扩增可以得到400bp的片断，利用任何一组引物对对多菌灵敏感的油菜菌核病菌或其它真菌的DNA进行扩增，不能扩增出任何产物。

本发明还提供一种应用上述引物检测油菜菌核病菌对多菌灵抗性的方法，包括以下步骤：

a、提取待检测菌的DNA；

b、以待检测菌的DNA为模板，使用第一组引物和第二组引物进行PCR扩增；

c、PCR产物经凝胶电泳后用EB进行显色，观测凝胶上有无DNA条带，判定待测菌的抗性。

当凝胶上显现DNA条带时，说明待检测菌表现出对多菌灵的抗性，未显现时，则说明待检测菌表现出对多菌灵敏感。当需要确认抗性菌属于高抗还是中抗，应单独使用一组引物对待测菌的DNA进行扩增，扩增产物经凝胶电泳后用EB显色，看凝胶中是否存在DNA条带。

本发明提供的两组引物和方法能同时检测对多菌灵表现高抗和中抗的油菜菌核病菌，检测引物具有很高特异性，且整个PCR和电泳过程仅需2h。因此，本发明的引物和检测方法可用来快速、准确、全面检测油菜菌核病菌对多菌灵的抗性。

附图说明

图1为本发明引物的序列图；

图2为本发明引物序列在β-微管蛋白基因序列上的位置图谱；

图3为引物特异性检测中各菌株DNA扩增后的凝胶电泳图；

图4为检测油菜菌核病菌抗性中各菌株DNA扩增后的凝胶电泳图。

具体实施方式

所选用的菌株

瓜果腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)、油菜立枯病菌(Rhizoctoniasolani)、油菜白斑病菌(Pseudocercosporella capsella)、油菜黑胫病菌(Leptosphaeria maculans)、芸苔链格孢(Alternaria brassicae)、甘蓝链格孢(A.brassicicola)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)、核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、指状青霉菌(Penicillium digitatum)以及油菜菌核病菌(4个多菌灵高抗菌株Ss1、Ss3、Ss6，Ss7，1个多菌灵中抗菌株Ss8和3个多菌灵敏感菌株Ss11、Ss12、Ss13)。

上述菌株均为常见的植物病原真菌，保藏于浙江大学生物技术研究所，也可以通过常规的细菌分离纯化方法得到。

提取DNA

用接种针从PDA平板上刮取菌丝(100mg)，置于1.5-mL Eppendorf管中，加500μL DNA提取裂解液(200mM Tris-HCl，50mM EDTA，20mMNaCl，1％SDS，pH 8.0)，用电钻驱动玻棒充分研磨，振荡混匀，室温静置10min；13200r/min 4℃，离心5min；取上清液约400μL于新的1.5-mLEppendorf管中，加750μL无水乙醇，混和混匀，13200r/min 4℃，离心5min，弃上清；沉淀用70％乙醇洗涤，室温放置干燥5-10min，溶于30μL无菌水中，-20℃保存备用。

上述的12种真菌以及待检测的油菜菌核病菌的DNA均采用上述方法提取。

引物合成

如图1所示，根据油菜菌核病菌中β-微管蛋白基因序列，设计了3个引物SsF198、SsF200和SsR12。

上述引物的具体序列以及与序列表中序列对应关系如下表所示：

  引物  名称  序列  序列表中  的序列号  SsF198  5’-TGG TCG AGA ACT CTG ACT C-3’  SEQ ID NO.1  SsF200  5’-TCG AGA ACT CTG ACG AGA CCA A-3’  SEQ ID NO.2  SsR12  5’-TGC AGA CGG GTA ATA TGG CAA A-3’  SEQ ID NO.3

上述引物在β-微管蛋白基因序列上物理位置如图1所示。上述序列可以通过常规方法合成，也可以委托专业生物试剂公司合成，本发明的引物由由上海博彩合成。

引物特异性验证

以上述提取的12种真菌的DNA为模板，用Ss198F/SsR12和Ss200F/SsR12两组引物进行PCR反应，每次反应均包含一个阴性对照(用无菌水代替DNA模板)。

25μL反应体系：1μL DNA模板(约0.4ng)，引物各0.2μmol l^-1，dNTP 0.2μmol l^-1，MgCl₂ 2mmol l^-1，1×缓冲液(北京东胜公司生产)，聚合酶1.5U个单位，双蒸水补足至25μL。

反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用1.5％的琼脂糖在1×TAE缓冲液中电泳后，用EB显色拍照。

如图3所示，4个多菌灵高抗菌株(Ss1，Ss3，Ss6，Ss7)均能扩增到403-bp的条带，1个多菌灵中抗菌株(Ss8)能扩增到400-bp的条带，而3个多菌灵敏感菌株(Ss11、Ss12、Ss13)和其它病原真菌都没有扩增到任何条带。由此可见，上述两组引物的特异性很高，适合检测油菜菌核病菌的多菌灵抗性。

检测不同地区油菜花携带油菜菌核病菌的多菌灵抗性

从江苏省海安市、浙江省杭州和平湖市的油菜地中收集油菜花瓣(每块地约100mg)。将油菜花瓣置于1.5-mL Eppendorf管中，加入100μl DNA提取缓冲液(1-2％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，200mM Tris-HCl，50mM EDTA，200mM NaCl，1％SDS和ddH₂O，pH8.0)，用尖头玻棒安装在常用的电工手电转上研磨1min，再向离心管中加入400μl的提取缓冲液蜗旋混匀后，室温静置10min；将上述混合液4℃，15,000rpm条件下离心5min，再将上清液转移到另一离心管中，然后加入750μl无水乙醇，混匀后4℃，15,000rpm条件下离心2min，弃上清；将沉淀的DNA用70％乙醇洗涤，室温干燥后溶于50μl无菌水，即为提取的DNA；将上述的DNA溶液用UNIQ-10柱式PCR产物回收试剂盒(上海生工生产)过柱纯化。

用Ss198F/SsR12和Ss200F/SsR12两组引物对上述田间样品提取的DNA进行PCR扩增，反应设阴性对照，PCR反应体系同上所述。如图4所示，江苏海安和浙江平湖的油菜花瓣DNA经PCR扩增后得到400-bp或403bp片段，说明这两个地方的油菜花瓣携带了对多菌灵表现抗性的油菜菌核病菌。浙江杭州油菜花瓣DNA经PCR扩增没得到产物，说明该地方的油菜花瓣未携带多菌灵抗性的油菜菌核病菌。

SEQUENCE LISTING

<110>浙江大学

<120>检测油菜菌核病菌对多菌灵抗性的引物序列及其方法

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>油菜菌核病菌(Sceloritinia sclerotiorum)

<400>1

tggtcgagaa ctctgactc                                                19

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>油菜菌核病菌(Sceloritinia sclerotiorum)

<400>2

tcgagaactc tgacgagacc aa                                            22

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>油菜菌核病菌(Sceloritinia sclerotiorum)

<400>3

tgcagacggg taatatggca aa                                            22