硫普罗宁在制备治疗因脑缺血、糖尿病、肥胖继发的肝功能受损的药物中的用途

摘要

本发明涉及硫普罗宁或其钠盐的医药新用途，即硫普罗宁或其钠盐在制备治疗因脑缺血、糖尿病、肥胖继发的肝脏功能受损的药物中的应用。硫普罗宁具有特异性抑制肝脏细胞色素P450 2E1(CYP2E1)的作用，从而可保护因脑缺血、肥胖、糖尿病而继发的肝脏功能受损，是一种在临床上具有针对性的新用途。这种新用途进一步拓展了硫普罗宁的药用价值即作为肝CYP2E1的抑制剂保护肝脏功能，具有重要的医学价值和社会、经济效益。

说明书

一、技术领域

本发明涉及硫普罗宁作为细胞色素P450 2E1(CYP2E1)抑制剂在制备治疗因脑缺血、肥胖、糖尿病继发的肝脏功能受损的药物中的用途。

二、背景技术

硫普罗宁(英文名Tiopronin，化学名：巯基丙酰甘氨酸)，其分子式：C₅H₉NO₃SH，分子量：163.2，结构式如下：

肝脏是机体进行各类物质转化代谢的主要器官，表达多种参与物质代谢的酶系统，其中最重要的是细胞色素P450(简称CYPs)。CYPs是一个含有多种亚型的超家族酶系，代谢多种内源性物质(机体自身代谢合成的物质)及外源性物质(包括药物、环境毒物等)，主要表达于肝脏。在CYPs中，亚型2E1(CYP2E1)主要代谢小分子化合物，包括多种药物、卤代碳氢化合物、醇类、酮类和内源性物质如花生四烯酸、脂肪酸等。CYP2E1有较高的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性，可代谢药物、毒物等化合物生成毒性中间代谢物(electrophilic metabolites)或自由基(free radicals)，在毒理学方面具有十分重要的地位[Caro，A.A.，A.I.Cederbaum，Oxidative stress，toxicology，andpharmacology of CYP2E1.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2004.44：p.27-42.]。

CYP2E1被认为是影响机体对各种毒物损害及致癌性敏感程度的重要决定因素，尤其在介导肝脏损伤方面[Gonzalez，F.J.，Role of cytochromes P450 inchemical toxicity and oxidative stress：studies with CYP2E1.Mutat Res，2005.569(1-2)：p.101-10.]。已知，在肝脏小叶，位于中央静脉周围肝细胞CYP2E1表达水平较汇管区CYP2E1水平高出30倍。具有肝毒性的物质或致癌物经CYP2E1介导产生的肝细胞坏死主要表现在小叶中央区(即中央静脉周围)。这说明肝细胞CYP2E1表达水平高低与外源物所引起的毒性损伤程度关系密切[Caro，A.A.，A.I.Cederbaum，Oxidative stress，toxicology，and pharmacology of CYP2E1.AnnuRev Pharmacol Toxicol，2004.44：p.27-42.]。

在脑缺血、肥胖和糖尿病病人，可出现继发性肝脏CYP2E1高表达水平，引起肝功能损伤，其中肥胖和糖尿病在脂肪肝发病病因中排名第2、3位，仅次于酒精性肝损伤。CYP2E1在非酒精性肝损伤病理机制中有重要作用[Chalasani，N.，J.C.Gorski，M.S.Asghar，A.Asghar，B.Foresman，S.D.Hall，D.W.Crabb，Hepaticcytochrome P450 2E1 activity in nondiabetic patients with nonalcoholicsteatohepatitis.Hepatology，2003.37(3)：p.544-50.]。CYP2E1的过表达可造成细胞内的线粒体损伤，使得细胞内的氧化、抗氧化机制失去平衡。CYP2E1通过增强氧应激、减少抗氧化物质，加重脂质过氧化，导致自由基的生成增多。自由基可攻击细胞内任何分子，通过一系列病理过程，最终导致肝细胞结构与功能的损害。同时，由CYP2E1产生的活性氧通过扩散作用，可激活肝星状细胞形成肝纤维化[刘雪艳，戴敏，CYP2E1介导的脂质过氧化在脂肪性肝病发病机制中的作用.安徽医药，2007.11(2)：p.99-101.]。另一方面，肝细胞系中过度表达的CYP2E1可降低胰岛素受体IRS21和IRS22的酪氨酸磷酸化，从而引起胰岛素信号下降，使得脂肪酸合成及代谢异常，促进脂肪肝的形成[梅玫，陆伟，刘会领，罗雁，细胞色素P450 2E1在脂肪性肝炎大鼠肝组织的表达及作用.实用肝脏病杂志，2007.10(6)：p.369-72.]。

对于脑缺血、肥胖和糖尿病继发的肝损伤病例，临床上目前多选用一般性的非特异性的保肝药物治疗，缺乏针对机制的特异性治疗措施。通过研究脑缺血、肥胖和糖尿病继发肝损伤的病理机制，CYP2E1的作用逐渐被认识，为寻找特异性药物进行保护治疗提供了依据。本发明意外发现CYP2E1特异性抑制剂硫普罗宁可有效治疗脑缺血、肥胖和糖尿病继发的肝损伤。

人CYP2E1基因共含有11,413个碱基对(base pair，bp)，上游2788个bp，下游599个bp，含9个外显子和典型TATA盒。大鼠CYP2E1基因包括编码区10,373个bp，上游1530个bp，下游825个bp，含9个外显子和8个内含子。CYP2E1基因编码区在种属方面有良好的保守性，对于转录起始部位上游重要区域(140个bp)的碱基序列，大鼠CYP2E1基因与人完全一致。经免疫抑制、免疫定量及结构研究均证实大鼠是研究CYP2E1基因表达和功能的极佳动物，并且与人类CYP2E1可催化相同反应，是用于研究的良好动物模型[Morel，G.，B.Cossec，A.M.Lambert，S.Binet，Evaluation of rat hepatic 2E1 activity in function ofage，sex and inducers：choice of an experimental model capable of testing thehepatotoxicity of low molecular weight compounds.Toxicol Lett，1999.106(2-3)：p.171-80]。

三、发明内容

本发明所要解决的问题是提供硫普罗宁或其钠盐的医药新用途，即在制备治疗因脑缺血、糖尿病或肥胖继发的肝脏功能受损的药物中的应用。

本发明提供的技术方案是：硫普罗宁或其钠盐在制备治疗因脑缺血、糖尿病或肥胖继发的肝脏功能受损的药物中的应用。

所述治疗因脑缺血、糖尿病或肥胖继发的肝脏功能受损的药物为含有作为活性成分的硫普罗宁或其钠盐和可药用载体和/或赋型剂的组合物。

所述药物是注射剂或口服制剂。

所述注射剂是无菌粉针剂、冻干粉针剂或水针剂。

所述口服制剂是片剂、胶囊剂、口服液、缓控释制剂或颗粒剂。

本发明的建议的用法用量：以胶囊剂口服为例，成人建议用量为200～600mg/每天，疗程1～3月，或遵医嘱；以冻干粉针剂注射为例，成人建议用量为100～200mg/每天，用葡萄糖或生理盐水稀释后静脉滴注，疗程2周～1月，或遵医嘱。

本发明提供了硫普罗宁或其钠盐的医药新用途，硫普罗宁或其钠盐作为针对机制的特异性治疗药物，用于治疗因脑缺血、糖尿病或肥胖继发的肝脏功能受损具有较好的效果。

四、附图说明

图1为说明苯胺羟化酶(细胞色素P450 2E1催化反应)在底物浓度4～800μmol/L范围内符合Michaelis-Menten方程的示意图；

图2A为说明硫普罗宁呈浓度依赖性抑制CYP2E1活性的示意图；

图2B为图2A的半对数作图，用于计算硫普罗宁IC₅₀值(半数抑制浓度)；

图3为硫普罗宁抑制脑缺血继发的CYP2E1升高的示意图；

图4为硫普罗宁抑制糖尿病继发的CYP2E1升高的示意图；

图5为硫普罗宁抑制肥胖继发的CYP2E1升高的示意图。

五、具体实施方式

实施例1：本发明所述药物组合物由硫普罗宁100克、羧甲基纤维素30克、蔗糖20克、药用淀粉50克(或选择其他可药用载体和/或赋型剂如麦芽糖等)，制成1000粒胶囊。其制备方法为：将硫普罗宁与可药用载体和/或赋型剂混合物置于离心式包衣造粒机料锅中形成颗粒，然后灌装肠溶胶囊，每粒胶囊含硫普罗宁100mg。

实施例2：本发明所述药物组合物由硫普罗宁100克，加麦芽糖50克，或选择其他药用载体和/或赋型剂如蔗糖、果糖等，加注射用水至1000ml，分装成1000支制得。其制备方法为：将硫普罗宁100克和麦芽糖50克溶于1升注射用水中，充分搅拌溶解，加入0.01～0.1％注射用活性炭吸附热原，过滤除去活性炭，正压微孔过滤除菌，分装，每支含100mg硫普罗宁。

本发明运用大鼠为动物模型，观察了硫普罗宁胶囊及注射剂对CYP2E1的体内外抑制特性，以及基于这一特性对脑缺血、肥胖、糖尿病继发的肝脏损伤的保护作用。

1硫普罗宁胶囊及注射剂抑制CYP2E1活性影响的体外实验研究

1.1硫普罗宁胶囊及注射剂对CYP2E1酶活性抑制常数的测定

CYP2E1催化苯胺羟化反应，故苯胺羟化酶为CYP2E1的探针，即测定苯胺羟化酶活性可指示CYP2E1活性水平。取正常动物肝脏，测定苯胺羟化酶活性，苯胺羟化酶活性随底物浓度增加而增加，呈饱和动力学特征，符合Michaelis-Menten方程。经计算K_m值的95％可信区间为24.91至41.61μmol/L，V_max值为0.39μmol/min/mg(图1)。

依据实验结果，选择苯胺浓度为40μmol/L，进行硫普罗宁IC₅₀值(半数抑制浓度)测定实验。将硫普罗宁胶囊中的颗粒溶于水配置成浓度梯度，或取硫普罗宁注射剂稀释成相同浓度，加入体外温育体系。结果可见，硫普罗宁呈浓度依赖性抑制苯胺羟化酶活性，即其抑制程度与硫普罗宁胶囊或注射剂配置的终浓度高低密切相关。半对数线性回归分析表明硫普罗宁IC₅₀值为0.12mmol/L(图2A，B)。

2硫普罗宁胶囊及注射剂对脑缺血、糖尿病、肥胖所致肝损伤保护作用的实验研究

2.1硫普罗宁胶囊及注射剂对脑缺血所致肝损伤的影响

与假手术组比，脑缺血组大鼠血清谷氨酸氨基转移酶(sALT)、天冬氨酸氨基转移酶(sAST)以及CYP2E1(苯胺羟化酶)活性均明显升高(P均＜0.05)，表明在脑缺血24小时后肝脏存在继发性损害。

与脑缺血组比，硫普罗宁胶囊及注射剂组肝脏CYP2E1活性、血清谷氨酸氨基转移酶(sALT)以及天冬氨酸氨基转移酶(sAST)均明显降低(P均＜0.05)，表明硫普罗宁可保护因脑缺血出现的肝脏继发性损害。

表1本发明硫普罗宁胶囊及注射剂对脑缺血继发肝损伤的影响.n(例数)＝10，x±s(均数±标准差)

注：与假手术组比较，^aP＜0.05，^bP＜0.01，^cP＜0.01；与脑缺血组比较，^eP＜0.05，^fP＜0.01，^gP＜0.01.

2.2硫普罗宁胶囊及注射剂对糖尿病所致肝损伤的影响

与对照组比，糖尿病组大鼠血清谷氨酸氨基转移酶(sALT)、天冬氨酸氨基转移酶(sAST)以及CYP2E1(苯胺羟化酶)活性均明显升高(P均＜0.05)，表明肝脏出现继发性损害。

与糖尿病组比，硫普罗宁胶囊及注射剂组肝脏CYP2E1活性、血清谷氨酸氨基转移酶(sALT)以及天冬氨酸氨基转移酶(sAST)均明显降低(P均＜0.05)，表明硫普罗宁可保护因糖尿病出现的肝脏继发性损害。

表2本发明硫普罗宁胶囊及注射剂对糖尿病继发肝损伤的影响.n(例数)＝10，x±s(均数±标准差)

注：与对照组比较，^aP＜0.05，^bP＜0.01，^cP＜0.01；与糖尿病组比较，^eP＜0.05，^fP＜0.01，^gP＜0.01.

2.3硫普罗宁胶囊及注射剂对肥胖所致肝损伤的影响

与对照组比，肥胖组大鼠血清谷氨酸氨基转移酶(sALT)、天冬氨酸氨基转移酶(sAST)以及CYP2E1(苯胺羟化酶)活性均明显升高(P均＜0.05)，表明肝脏出现继发性损害。

与对照组比，硫普罗宁胶囊及注射剂组肝脏CYP2E1活性、血清谷氨酸氨基转移酶(sALT)以及天冬氨酸氨基转移酶(sAST)均明显降低(P均＜0.05)，表明硫普罗宁可保护因肥胖出现的肝脏继发性损害。

表3本发明硫普罗宁胶囊及注射剂对肥胖继发肝损伤的影响.n(例数)＝10，x±s(均数±标准差)

注：与对照组比较，^aP＜0.05，^bP＜0.01，^cP＜0.01；与肥胖组比较，^eP＜0.05，^fP＜0.01，^gP＜0.01.

3硫普罗宁抑制脑缺血、糖尿病、肥胖所继发的高CYP2E1活性的体外实验

3.1硫普罗宁抑制脑缺血所继发的高CYP2E1活性的体外实验研究

脑缺血组大鼠，肝微粒体CYP2E1活性即苯胺羟化酶活性为(0.47±0.07)μmol/min/g，较假手术组苯胺羟化酶活性(0.25±0.08)μmol/min/g升高1.9倍。体外孵育体系中，加入不同浓度的硫普罗宁(取硫普罗宁原料药，稀释成不同浓度，加入体外温育体系)，脑缺血组CYP2E1活性明显被抑制，并且呈浓度依赖性(图3)。

3.2硫普罗宁抑制糖尿病所继发的高CYP2E1活性的体外实验研究

糖尿病组大鼠，肝微粒体CYP2E1活性即苯胺羟化酶活性为(0.67±0.04)μmol/min/g，较对照组苯胺羟化酶活性(0.36±0.12)μmol/min/g升高1.8倍。体外孵育体系中，加入不同浓度的硫普罗宁(取硫普罗宁原料药，稀释成不同浓度，加入体外温育体系)，糖尿病组CYP2E1活性明显被抑制，并且呈浓度依赖性(图4)。

3.3硫普罗宁抑制肥胖所继发的高CYP2E1活性的体外实验研究

肥胖组大鼠，肝微粒体CYP2E1活性即苯胺羟化酶活性为(2.61±0.2)μmol/min/g，较对照组苯胺羟化酶活性(0.97±0.27)μmol/min/g升高2.7倍。体外孵育体系中，加入不同浓度的硫普罗宁(取硫普罗宁原料药，稀释成不同浓度，加入体外温育体系)，肥胖组CYP2E1活性明显被抑制，并且呈浓度依赖性(图5)。

4方法

4.1苯胺羟化酶的酶动力学参数测定

断头处死正常大鼠，制备肝微粒体，以牛血清白蛋白为标准，按Lowry法测定蛋白量。苯胺羟化酶反应体系的总体积为1mL，含10 mM MgCl₂，150 mMKCl，50 mM Tris-HCl(pH 7.4)，0.8 mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，40 mM异柠檬酸，1.2 U异柠檬酸脱氢酶，8 mM苯胺和1 mg微粒体蛋白。反应体系于37℃温育，反应时间30 min，测定630 nm处吸收峰。

测定酶动力学参数时，在反应体系中加入不同浓度的苯胺，终浓度分别为4，16，80，400，800μmol/L，37℃温育，反应时间30 min，经Lieweaver-Burk双倒数作图法计算K_m值及V_max值。

4.2硫普罗宁抑制动力学参数测定

断头处死正常大鼠，制备肝微粒体，以牛血清白蛋白为标准，按Lowry法测定蛋白量。在体外温育体系中，苯胺终浓度0.04 mmol/L，将硫普罗宁加入微粒体蛋白浓度为1 mg/mL的反应体系中，设置平行管。取硫普罗宁原料药，稀释成不同浓度，加入体外温育体系。配置的硫普罗宁终浓度分别为0，0.04，0.08，0.16，0.32，0.48 mmol/L，加入反应体系，总体积1 mL于37℃温育，反应时间30 min，运用半对数线性回归分析计算IC₅₀值。IC₅₀是指能将某种酶活力抑制50％所需的抑制剂浓度。

4.3硫普罗宁胶囊及注射剂对脑缺血、糖尿病、肥胖所致肝损伤保护作用的实验研究

4.3.1脑缺血模型

雄性Wistar大鼠40只，SPF级，体重230～270g，购自湖北省医学科学研究院动物实验中心。动物随机分为假手术组、脑缺血组、硫普罗宁胶囊组、硫普罗宁注射剂组，每组10只。硫普罗宁胶囊组大鼠于手术前连续灌胃给予硫普罗宁3天(80 mg/kg)；硫普罗宁注射剂组于手术前连续腹腔注射硫普罗宁(60 mg/kg)3天，假手术组和脑缺血组注射等容量生理盐水。

采用线栓法造成大鼠大脑中动脉阻断模型。手术步骤如下：采用10％水合氯醛，剂量350mg/kg腹腔注射麻醉。颈部正中切口，分离右颈总及颈内、颈外动脉，在距颈动脉分叉5mm处双线结扎颈外动脉，颈内动脉穿线备用，结扎右颈总动脉的近心端。在靠近动脉分叉的颈总动脉上剪一小口，插入一直径为0.2mm的渔线(渔线头端经硅酮及多聚赖氨酸处理)，经颈内动脉进入大脑中动脉起始部，以阻断大脑中动脉的血流。插入线长约17.5±0.5mm时，有明显阻力感。结扎颈内动脉及尼龙线，防止插线脱落。假手术组除不插入尼龙线外，其他手术步骤同脑缺血组和硫普罗宁组。大鼠苏醒后，出现脑缺血症状者(表现为提尾时，梗塞对侧前肢屈曲抬高，肩内收或自主运动时向对侧旋转)纳入数据统计。

大鼠于手术后24小时处死取血，测定血清谷氨酸氨基转移酶(sALT)、天冬氨酸氨基转移酶(sAST)与苯胺羟化酶(CYP2E1)活性。血清谷氨酸氨基转移酶(sALT)、天冬氨酸氨基转移酶(sAST)测定方法参照试剂盒说明书。

4.3.2糖尿病模型

雄性Sprague Dawley大鼠40只，体重245～275 g，SPF级，购自湖北省医学科学研究院动物实验中心。适应性饲养1周后，将其随机分为对照组、糖尿病组、硫普罗宁胶囊组、硫普罗宁注射剂组，每组10只。模型组、硫普罗宁胶囊组、硫普罗宁注射剂组大鼠均腹腔注射60 mg/kg链脲佐素溶液(用0.1 mmol/L，用pH4.5的柠檬酸盐缓冲液配置)，对照组同时注射等体积柠檬酸盐缓冲液。72h后测非空腹血糖，若血糖≥16.7 mmol/L，且持续3周，证明糖尿病模型制备成功，继续观察6周血糖。硫普罗宁胶囊组大鼠连续灌胃给予硫普罗宁2周(80mg/kg)；硫普罗宁注射剂组连续腹腔注射硫普罗宁2周(60 mg/kg)。

末次注射1小时后，处死大鼠取血，测定血清谷氨酸氨基转移酶(sALT)、天冬氨酸氨基转移酶(sAST)与苯胺羟化酶(CYP2E1)活性。

4.3.3肥胖模型

雄性Sprague Dawley大鼠40只，体重245～275 g，SPF级，购自湖北省医学科学研究院动物实验中心。动物随机分为4组，对照组、模型组、硫普罗宁胶囊组、硫普罗宁注射剂组，每组10只。对照组给予正常饮食喂养。模型组、硫普罗宁胶囊组、硫普罗宁注射剂组大鼠每天每只给予25 g高脂饲料喂养(猪油10％，胆固醇2％，基础饲料88％)，其余以普通饲料补足，实验时间共为12周。于第10周起，硫普罗宁胶囊组大鼠连续灌胃给予硫普罗宁3周(80 mg/kg)；硫普罗宁注射剂组连续腹腔注射硫普罗宁3周(60 mg/kg)；对照组和模型组注射等体积生理盐水。大鼠于末次进食12小时后处死取血，测定血清谷氨酸氨基转移酶(sALT)、天冬氨酸氨基转移酶(sAST)与苯胺羟化酶(CYP2E1)活性。

4.4硫普罗宁胶囊及注射剂对脑缺血、糖尿病、肥胖所继发的高CYP2E1活性影响的体外实验研究

取脑缺血、糖尿病、肥胖组动物肝脏，制备肝微粒体。取硫普罗宁原料药，稀释成不同浓度，加入体外温育体系。在体外温育体系中，微粒体蛋白终浓度1mg/mL，苯胺终浓度0.8 mmol/L，配置的硫普罗宁终浓度0，0.01，0.1，0.25，0.5 mmol/L)，37℃温育，反应时间30 min，测定苯胺羟化酶活性。