一种用于桑黄菌液体培养的合成培养基及发酵生产桑黄多糖的方法

摘要

本发明提出一种用于桑黄菌液体培养的合成培养基，所述合成培养基中以葡萄糖为碳源，20种氨基酸为氮源，以及无机盐和维生素组成，碳氮比按50∶1设计，具体浓度g/L如下：葡萄糖30～80g，谷氨酸0.1～1.5g，谷氨酰胺0.1～1.5g，天冬氨酸0.1～1.5g，天冬酰胺0.1～1.5g，谷氨酸0.01～0.1g，色氨酸0.01～0.1g，缬氨酸0.01～0.1g，丙氨酸0.01～0.1g等。本全合成培养基培养过程桑黄菌丝生长迅速，桑黄菌丝体产量最高可达20g/L，同时不引入农副产品为碳氮源，不夹带培养基中蛋白质、培养基成分等物质，发酵生产的桑黄胞外多糖纯度高、质量稳定，桑黄多糖产量最高为0.198g/L。本发明具有成分清晰、质量稳定等优点，可用于桑黄菌液体大规模培养和多糖合成代谢调控规律研究。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于药用真菌桑黄菌液体培养的全合成培养基的以及采用所述培养基的桑黄菌发酵生产桑黄多糖的方法。

背景技术

桑黄(Phellinus igniarius)又称火木层孔菌，属担子菌纲，层孔菌属，寄生于桑树树木之上，是一种珍稀的食药用真菌，桑黄主要活性成分为桑黄多糖，能提高机体免疫力，具有显著的抗肿瘤活性，极具开发价值。

由于桑黄菌生理生态的复杂性、特殊性，桑黄子实体数量稀少。采用液体深层培养技术大规模生产桑黄菌丝体以及其活性多糖物质是满足国内外市场需要的有效途径。在现有生产技术和文献报道中，桑黄液体培养采用的发酵培养基主要采用天然农副产品为碳氮源，如土豆汁、糖蜜、黄豆饼粉、玉米浆等。由于复合碳氮源的成分复杂，批次之间存在成分上的差异往往造成桑黄菌液体培养生产菌丝体产量和多糖分子量不稳定，同时也给桑黄多糖的下游提取分离带来困难。

全合成培养基具有成分清楚、质量稳定、杂质少等优点，可以用于桑黄多糖合成的定向调控和代谢流分析，以及大规模生产过程质量控制的需要；同时有利于下游多糖分离提取。目前，国内外还没有桑黄全合成培养基的文献和专利报道。

发明内容

本发明的目的在于提供用于桑黄培养的合成培养基配方，以及利用此培养基生产桑黄多糖的方法。

实现本发明目的的具体技术解决方案如下：

合成培养基中以葡萄糖为碳源，20种氨基酸为氮源，以及无机盐和维生素组成，碳氮比约按50∶1设计，具体浓度如下(g/L)：葡萄糖30～80g，谷氨酸0.1～1.5g，谷氨酰胺0.1～1.5g，天冬氨酸0.1～1.5g，天冬酰胺0.1～1.5g谷氨酸0.01～0.1g，色氨酸0.01～0.1g，缬氨酸0.01～0.1g，丙氨酸0.01～0.1g，亮氨酸0.01～0.1g，异亮氨酸0.01～0.1g，苯丙氨酸0.001～0.1g，蛋氨酸0.01～0.1g，脯氨酸0.01～0.1g，甘氨酸0.01～0.1g，丝氨酸0.01～0.1g，赖氨酸0.01～0.1g，半胱氨酸0.01～0.1g，酪氨酸0.01～0.1g，精氨酸0.01～0.1g，组氨酸0.01～0.1g，MgSO₄ 0.5～2g，KH₂PO₄ 0.5～2g，NaCl0.3～1.5g，FeSO₄ 0.01～0.15g，MnSO₄7H₂O0.01～0.07g，ZnSO₄.7H2O 0.01～0.1g，CoCl₂ 0.0001～0.05g，CuSO₄ 0.0001～0.03g，CaCl₂0.05～0.5g，VB₁50～500ug，H₂O 1.0L。

培养基初始pH控制在5.5～7.5，灭菌温度115～121℃，灭菌时间30min.

利用此合成培养基摇瓶发酵生产桑黄菌丝体和桑黄多糖的发酵工艺：接种量5～15％，培养温度24～28℃，往复式摇床转数160～220rpm。

本发明所具有的优点：采用全合成培养基培养过程桑黄菌丝生长迅速，桑黄菌丝体产量最高可达20g/L，是目前深层培养桑黄菌丝体产量最高的报道；同时培养基中不引入农副产品为碳氮源，桑黄多糖中不夹带培养基中蛋白质、培养基成分等物质，发酵生产的桑黄胞外多糖纯度高、质量稳定，桑黄多糖产量最高为0.198g/L。本发明具有成分清晰、质量稳定等优点，可用于桑黄菌液体大规模培养和多糖合成代谢调控规律研究。

具体实施方法

本实施例使用的菌种是购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)桑黄菌种(火木层孔菌，编号5.95)，

实施例1：

配制本发明中所述的发酵培养基1L，其各组分的浓度(g/L)为：葡萄糖50g，谷氨酸0.8g，谷氨酰胺0.8g，天冬氨酸0.8g，天冬酰胺0.8g谷氨酸0.04g，色氨酸0.04g，缬氨酸0.04g，丙氨酸0.04g，亮氨酸0.04g，异亮氨酸0.04g，苯丙氨酸0.04g，蛋氨酸0.04g，脯氨酸0.04g，甘氨酸0.04g，丝氨酸0.04g，赖氨酸0.04g，半胱氨酸0.04g，酪氨酸0.04g，精氨酸0.04g，组氨酸0.04g，MgSO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，NaCl 0.85g，FeSO₄ 0.05g，MnSO₄ 7H₂O 0.0383g，ZnSO₄ 7H2O 0.0383g，CoCl₂ 0.0043g，CuSO₄0.0096g，CaCl₂0.25g，VB₁200ug，H₂O 1.0L调节pH到6.0，将培养基分装到250mL的三角瓶中，装液量为50mL，灭菌温度115℃，时间30min。

桑黄菌丝培养：接种10％(V/V)桑黄种子液，培养温度25℃，转速180rpm/min，每24h取样，3500rpm离心10min。用蒸馏水洗涤菌丝体3次，烘干至恒重，称重264小时菌体干重达到17.67g/l。上清液浓缩，按体积比1∶4的比例加入酒精，4℃冰箱过夜，离心沉淀，用1∶4的酒精清洗3次，溶于水用苯酚硫酸法测多糖含量，264小时测定多糖含量为0.198g/l。

实施例2：

配制本发明中所述的发酵培养基1L，其各组分的浓度(g/L)为：葡萄糖70g，谷氨酸0.5g，谷氨酰胺0.5g，天冬氨酸0.5g，天冬酰胺0.5g，谷氨酸0.04g，色氨酸0.04g，缬氨酸0.04g，丙氨酸0.04g，亮氨酸0.04g，异亮氨酸0.04g，苯丙氨酸0.04g，蛋氨酸0.04g，脯氨酸0.04g，甘氨酸0.04g，丝氨酸0.04g，赖氨酸0.04g，半胱氨酸0.04g，酪氨酸0.04g，精氨酸0.04g，组氨酸0.04g，MgSO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，NaCl 0.85g，FeSO₄ 0.05g，MnSO₄7H₂O 0.0383g，ZnSO₄ 7H2O 0.0383g，CoCl₂ 0.0043g，CuSO₄0.0096g，CaCl₂ 0.25g，VB₁200ug，H₂O 1.0L调节pH到6.0，将培养基分装到250mL的三角瓶中，装液量为50mL，灭菌温度115℃，时间30min。

桑黄菌丝培养：接种10％(V/V)桑黄种子液，培养温度25℃，转速180rpm/min，每24h取样，3500rpm离心10min。用蒸馏水洗涤菌丝体3次，烘干至恒重，192小时菌体干重达到19.2g/l。上清液浓缩，按体积比1∶4的比例加入酒精，4℃冰箱过夜，离心沉淀，用1∶4的酒精清洗3次，溶于水用苯酚硫酸法测多糖含量，192小时测定多糖含量为0.08g/l。

实施例3：

配制本发明中所述的发酵培养基1L，其各组分的浓度(g/L)为：葡萄糖50g，谷氨酸0.8g，谷氨酰胺0.8g，天冬氨酸0.8g，天冬酰胺0.8g，谷氨酸0.04g，色氨酸0.04g，缬氨酸0.04g，丙氨酸0.04g，亮氨酸0.04g，异亮氨酸0.04g，苯丙氨酸0.04g，蛋氨酸0.04g，脯氨酸0.04g，甘氨酸0.04g，丝氨酸0.04g，赖氨酸0.04g，半胱氨酸0.04g，酪氨酸0.04g，精氨酸0.04g，组氨酸0.04g，MgSO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，NaCl 0.85g，FeSO₄ 0.05g，MnSO₄ 7H₂O0.0383g，ZnSO₄ 7H2O 0.0383g，CoCl₂ 0.0043g，CuSO₄0.0096g，CaCl₂ 0.25g，VB₁ 200ug，H₂O1.0L调节pH到6.0，将培养基分装到250mL的三角瓶中，装液量为50mL，灭菌温度115℃，时间30min。

桑黄菌丝培养：接种10％(V/V)桑黄种子液，培养温度25℃，转速180rpm/min，每24h取样，3500rpm离心10min。用蒸馏水洗涤菌丝体3次，烘干至恒重，240小时菌体干重达到20.63g/l。上清液浓缩，按体积比1∶4的比例加入酒精，4℃冰箱过夜，离心沉淀，用1∶4的酒精清洗3次，溶于水用苯酚硫酸法测多糖含量，240小时测定多糖含量为0.141g/l。