来自脐带血的具有Oct4表达能力的多能成体干细胞及其制备方法

摘要

本发明涉及来自脐带血(UCB)的具有Oct4表达能力的多能成体干细胞，并且这些细胞还同时表达CD29、CD31和CD44。还涉及其制备方法，具体涉及一种将脐带血来源的单核细胞通过在含有bFGF(基本成纤维细胞生长因子)和人血清或者血浆以分离的培养基中培养而得到的多能成体干细胞。另外，来自UCB的表达Oct4的多能成体干细胞在形态学上是梭状或者圆形细胞，虽然根据本发明的干细胞是成体干细胞，它们是多能的并能够分化成外胚层、中胚层和内胚层来源的组织或细胞，包括成骨细胞或者神经细胞等，因此它们可在治疗根深蒂固的疾病和不可治愈的疾病中有效地使用。

说明书

技术领域

本发明涉及来自脐带血的具有Oct4表达能力的多能成体干细胞及其制备方法，更具体地，涉及一种将脐带血来源的单核细胞通过在含有bFGF(基本成纤维细胞生长因子)和人血清或者血浆培养基中培养分离来得到的多能成体干细胞。

背景技术

虽然在我们的现代社会中由于生命科学和医学的发展，过去的许多疾病已经被治愈，仍存在一些根深蒂固的疾病或者不可治愈的疾病诸如缺血性坏死、癌症、痴呆和严重烧伤等疾病。此外，在器官移植领域存在许多问题。作为治疗引起这些疾病的根源的治疗方法，这些细胞治疗已经成为目前引人注目的中心。

细胞治疗是通过外部增殖或者分选自体同源干细胞、异源干细胞或者异种干细胞来治疗或者防止疾病的方法，或者其他方法诸如改变细胞的生物学特性的方法。细胞治疗在根深蒂固疾病和不可治愈的疾病治疗方面具有无穷的可能性，因为其具有非常宽的应用领域，例如使从患者自身、其他人或者其他动物收集的体细胞增殖或者将干细胞分化成所需的细胞类型以便在疾病治疗中使用。

已经报道，当成骨细胞、内皮祖细胞或者骨髓干细胞被移植到受损心肌中时，心肌的功能得到改善(Menasche，P.等人，J.Am.Coll.Cardiol.，41：1078，2003；Strauer，B.E.等人，Circulation，106：1913，2002；和Stamm，C.等人，Lancet，361：45，2003)。这种心肌功能的改善是由于通过干细胞分泌的动脉性细胞因子而形成机械支架，或者由于其他有益细胞聚集到缺血区域中(Orlic，D.等人，Circ Res，91：1092，2002)。

同时，术语“干细胞”指的是不仅具有自我复制能力而且具有能分化成不同细胞类型的细胞，并可被分类成全能干细胞、多能性(pluripotent)干细胞和多能(multipotent)干细胞。

全能干细胞是具有全能分化特性的细胞，它们能够形成完整的有机体，该性质由在卵子被精子受精后到8细胞期的细胞所具备。当这些细胞被分离并移植到子宫中时，他们可形成完整的有机体。

多能性干细胞是能够形成来源于外胚层、中胚层和内胚层的各种细胞和组织的细胞，多能性干细胞来自定位在受精4-5天后产生的胚泡内的内部细胞团。这些细胞被称为“胚胎干细胞”，并可分化成各种其他组织细胞，但不能形成新的活体组织。

多能干细胞是仅能正常分化成对含有它们的来源组织和器官特异的细胞，多能干细胞不仅在胎儿、新生儿和成体阶段的各种组织和器官的生长和发育中涉及，而且还在保持成体组织的内环境平衡和当组织损伤时诱导再生的功能中涉及。组织特异性多能细胞统称为“成体干细胞”。

到目前为止已知的脐带血来源的成体干细胞包括能够分化成骨或骨骼肌的间质干细胞(Lee，O.K.等人，Blood，103：1669，2004；Gang，E.J.等人，BBRC，321：102，2004；Gang，E.J.等人，干细胞，22：617，2004)、能够分化成心脏细胞的心脏干细胞(US 2004/0126879)和内皮祖细胞(Yamamoto，K.等人，Arterio.Thromb.Vasc.Biol.，24：192，2004)。

尤其是，已经知道骨髓中包含有许多成体干细胞，并且成体干细胞仅能分化成骨、软骨、脂肪等等，因为其来自胚胎期的中胚层。但是，已经发现成体干细胞还可分化成来自外胚层的神经细胞，因此，人们希望在疾病治疗中具有非常广泛的应用领域范围。

但是，由于干细胞能够分化成有限种类的细胞类型，包括由间叶细胞分化成骨或骨骼肌，由心脏干细胞分化成心脏细胞以及由内皮祖细胞分化成血管内皮细胞，难以将这些细胞定义为真正的多能干细胞。

因此，本发明的发明人已经尝试将脐带血来源的单核细胞通过在含有bFGF和人血清或者血浆的培养基中培养分离来获得成体干细胞，结果发现，成体干细胞具有极好的附着能力，可表达作为胚胎干细胞特异性标记物的Oct4，并可分化成各种组织诸如成骨细胞和神经细胞，由此完成本发明。

发明内容

本发明的一个目的在于提供通过使用含有bFGF和人血清或血浆的培养基分离具有表达Oct4的能力的多能成体干细胞，其来自脐带血。

本发明的另一目的在于提供用于制备成体干细胞的方法，该方法包括下列步骤：在含有bFGF和人血清或血浆的培养基上培养来自脐带血的单核细胞，并回收成体干细胞，其中成体干细胞显示下列特性：

(a)具有表达Oct4的能力；

(b)对所有的CD24，CD29，CD31，CD 44，CD33，CD45和CD49B显示阳性免疫应答，并对CD34，CD51/61，CD62L，CD62P，CD90，CD133和CD135显示阴性免疫应答；

(c)在塑料上生长并显示圆形或者梭状形态学特征；和

(d)具有分化成来自中胚层、内胚层和外胚层的细胞的能力。

在本发明中，bFGF和人血清或血浆的含量优选分别为1-30ng/ml和5-30％，并且人血清或者血浆为自体同源的或者为同种异体的，并且培养基为α-MEM。

本发明还提供了通过上述方法得到的成体干细胞，其显示下列特性：

(a)具有表达Oct4的能力；

(b)对所有的CD24，CD29，CD31，CD33，CD45和CD49B显示阳性免疫应答，并对CD34，CD51/61，CD62L，CD62P，CD90，CD133和CD135显示阴性免疫应答；

(c)在塑料上生长并显示圆形或者梭状形态学特征；和

(d)具有分化成来自中胚层、内胚层和外胚层的细胞的能力。

在本发明中，成体干细胞优选为额外地对选自由SH-2、SH-3和SH-4组成的组的一个或多个显示阳性免疫应答，并优选对CD44、CD105和CD117显示阳性或阴性免疫应答。此外，来自中胚层的细胞优选为成骨细胞或者内皮细胞，来自外胚层的细胞优选为神经细胞。

本发明的其他特征和实施方式将通过下列“详细描述”和所附的“权利要求书”来阐明。

附图说明

图1是根据本发明的来自脐带血多能成体干细胞的照片。

图2显示了通过流动细胞计数测定的来自脐带血的多能干细胞的免疫学特性。A和E：对照组；B：CD34；C：CD45；D：SH-2；和F：SH-3。

图3显示了进行PAS染色的结果，以检查根据本发明的多能成体干细胞中抗原的表达和不表达。

图4是来自脐带血的多能成体干细胞分化成成骨细胞(A和B)，以及Von-Kossa染色结果(C和D)的照片。

图5显示了来自脐带血的多能成体干细胞与特异性抗原之间的结合，A和B显示出多能干细胞分别对一种神经元特异性抗原NSE(神经元特异性烯醇化酶)和一种星形胶质细胞特异性抗原GFAP(胶质纤维酸性蛋白)显示阳性应答，C和D显示对照组。

图6显示了免疫染色后来自脐带血的多能干细胞中Oct4的表达[A：相差；B：Oct4；C：融合]。

图7显示了免疫染色后来自脐带血的多能干细胞中SH-4和Oct4的表达[A：SH-4；B：Oct4；C：融合]。

具体实施方式

本发明涉及用于从脐带血中分离表达Oct4的多能成体干细胞的方法，所述分离方法如下。

首先，70-100ml脐带血以1∶1的比例用PBS稀释并搅拌，并在Ficollpague与脐带血之比为15∶25的聚蔗糖上分离。出于这种目的，在15ml聚蔗糖溶液上，将上述血液样品溶液(以1∶1的比例在PBS中稀释)离心以得到白色层(单核细胞层)，并将白色层离心。这里，将上层完全除去并将沉淀储存在冰中。

接着，缓慢振荡沉淀使其分散，并加入10ml培养液以分散均匀，然后以1200rpm离心5分钟，将上层完全除去并加入10ml培养液，以1000rpm离心5分钟(该过程重复两次)，从而得到细胞。

将含有5-30％人血清或血浆和10ng/ml的bFGF(基本成纤维细胞生长因子)[Roche，Seitzerland]的α-MEM(Gibco)加入得到的细胞中，将最佳细胞数(大约3-5×10⁶/ml)覆盖在培养容器中培养3天。3天后，相对较重的细胞诸如RBC(血红细胞)存在与培养液的下层，待分离的成体干细胞存在于上层。仔细收集上层将其移到新的培养容器中培养，从而最终得到具有表达Oct4能力的成体干细胞。

获得表达得自干细胞培养液的所需表面抗原的多能干细胞的方法包括使用具有分类功能的流式细胞计的FACS方法(Int.Immunol.，10(3)：275，1998)，使用磁珠的方法，以及使用抗体特异性识别多能干细胞的淘选(panning)方法(J.Immunol.，141(8)：2797，1998)。而且，用于从大量培养液中得到多能干细胞的方法包括其中在细胞表面表达以特异性识别分子(此后称为“表面抗原”)的抗体单独使用或结合成柱使用的方法。

流式细胞分选方法可包括液滴电荷法和细胞捕获法。在任何一种这些方法中，特异性识别细胞表面上的抗原的抗体被荧光标记，从与细胞表面上表达的分子结合的抗体发出的荧光被转化成电信号，由此定量在细胞上表达的抗原量。能够通过结合所使用的荧光类型来分离表达多种表面抗原的细胞。在这种情况下可使用的荧光标记的例子包括FITC(异硫氰酸酯)、PE(藻红蛋白)、APC(异藻青蛋白)、TR(Texas Red)、Cy3，CyChrome、Red613、Red670、TRI-Color、Quantum Red等等。

使用流式细胞计数器的FACS方法包括：其中收集从例如其中离心分离细胞的得到的干细胞培养液并直接用抗体染色的方法；和其中细胞在合适的培养基上培养并生长之后用抗体染色的方法。细胞染色通过将识别表面抗原的初级抗体与目标细胞样品混合并在冰上孵育混合物30分钟到1小时来进行。当初级抗体被荧光标记后，洗涤后将细胞用流式细胞计数器分离。当初级抗体没有被荧光标记时，与初级抗体反应的细胞和荧光标记的具有初级抗体结合能力的第二抗体在洗涤后混合，并在冰水中孵育30分钟到1小时。洗涤后，用初级和第二抗体染色的细胞用流式细胞计数器分离。

使用磁珠的方法允许表达目标表面抗原的细胞的大量分离。虽然通过该分离方法的细胞纯度比上述使用流式细胞计数器的方法低，但可以通过重复的纯化确保足够的细胞纯度。

作为标记物，可以是胚胎干细胞特异性蛋白、造血抗原，间叶细胞的表面抗原和神经系统的神经原特异性抗原以及类似物。胚胎干细胞特异性蛋白包括Oct4以及其类似物，并且造血抗原包括CD34和CD45及其类似物，间叶细胞的表面抗原包括SH-2和SH-3及其类似物，神经系统的神经原特异性抗原包括NSE和GFAP及其类似物。识别上述表面抗原的抗体的单个使用或结合使用从而可得到所需的细胞。

本发明的多能成体干细胞对单核巨嗜细胞抗原CD45显示阳性应答，对造血谱系抗原CD34显示阴性应答，并具有表达Oct4的能力，由此推断其为其中进行从造血细胞分化成单核细胞的干细胞。

实施例

此后，将通过实施例详细描述本发明。但是，对本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅用于说明的目的，而不构成对本发明的范围的限制。

实施例1：从脐带血中分离成体干细胞

根据Institutional Review Board指南，从首尔国立大学医院和三星第一医院足月产前新生儿采集脐带血。

将70-100ml采集的脐带血样品在PBS中按1∶1的比例稀释并搅拌。然后，将血液样品在聚蔗糖上按15∶25的比例分离，其中血液样品(以1∶1的比例在PBS中稀释)缓慢漏到15ml聚蔗糖溶液上引起分层，接着以2500rpm离心20分钟。离心后，从底部开始形成三个不同的层，这三层中，用移液管吸取血沉棕黄层(中间层：单核细胞层)，并用HBSS洗涤三次，接着以1800rpm离心15分钟，从离心液中将上层完全除去并将沉淀储存在冰中。

将沉淀轻微摇动以便分散，并加入10ml培养液以分散均匀，然后1200rpm离心5分钟，将上层完全除去并加入10ml培养液，1000rpm离心5分钟(该过程重复两次)，由此获得细胞。

将含有5-30％人血清或血浆和10ng/ml的bFGF(基本成纤维细胞生长因子)[Roche，Seitzerland]的α-MEM(Gibco)加入得到的细胞中，将最佳细胞数(大约3-5×10⁶/ml)覆盖在培养容器中培养3天。3天后，相对较重的细胞诸如RBC(血红细胞)存在与培养液的下层，待分离的成体干细胞存在于上层。仔细收集上层将其移到新的培养容器中培养，从而最终得到具有表达Oct4能力的成体干细胞。

图1是来自根据本发明的脐带血的多能成体干细胞的显微照片。

实施例2：来自脐带血的多能成体干细胞的免疫特性

为了检查实施例1中得到的来自脐带血的多能成体干细胞的免疫特性，分析了细胞表面抗原的表达模式。出于这种目的，将实施例1中培养的2×10⁶-10⁷个细胞用PBS溶液洗涤并在室温下与它们的对应抗体一起孵育。用流式细胞计数器分析抗原的表达和未表达。而且，进行PAS染色(希式高碘酸染色法)。

结果，如图4所示，本发明的来自脐带血的多能成体干细胞分别对CD45、SH-2和SH-3显示63.38％、96.54％和63.99％的阳性应答，并对CD34显示超过90％的阴性应答。而且，分析了其他抗原的免疫表现型，结果，多能成体干细胞的免疫特性对于CD51/61，CD62L，CD62P，CD133，CD135，CD90都是阴性的，对于CD29，对于CD44是阳性的，对于CD49B是阳性的，对于CD105(SH-2)是阳性或阴性的，对于CD90是阴性的。

同时，如图3所示，多能成体干细胞在PAS染色中显示阳性应答。

实施例3：来自脐带血的多能成体干细胞分化成成骨细胞

将实施例1中得到的来自脐带血的多能成体干细胞培养液用1ml成骨细胞诱导培养基(0.1μmol/L地塞米松(Sigma，USA)，0.05mmol/L抗坏血酸-2-磷酸(Sigma，USA)，10mmol/L β-磷酸甘油(Sigma)，和5-30％人血清或血浆)中稀释，对细胞进行计数。然后，将细胞在烧瓶中进行培养(5％CO₂；37℃；间隔每3-4天更换一次培养基)，诱导多能成体干细胞分化成成骨细胞。培养开始14天后，通过Von-Kassa染色确定来自脐带血的多能成体干细胞分化成成骨细胞(见图4)。

实施例4：来自脐带血的多能成体干细胞分化成神经细胞

将实施例1中得到的来自脐带血的多能成体干细胞培养液用1ml神经元诱导培养基(含有10ng/ml基本成纤维细胞生长因子(Roche，Switzerland)，10ng/ml人表皮生长因子(Roche，Switzerland)，10ng/ml人神经生长因子(Invitrogen，USA)和5-30％人血清或血浆)稀释。将细胞在5％CO₂温箱中37℃下在烧瓶中进行培养，诱导多能成体干细胞分化成神经细胞。培养开始14天后，确定多能干细胞对一种神经元特异性抗原NSE(神经元特异性烯醇酶)和一种星形细胞特异性抗原GFAP(胶质纤维酸性蛋白)显示阳性应答。这建议来自脐带血的多能成体干细胞分化成神经细胞(见图5)。

实施例5：来自脐带血的多能成体干细胞的Oct4表达

将实施例1中得到的成体干细胞用PBS洗涤三次，加入4％的多聚甲醛溶液允许在室温下反应5-10分钟使细胞固定，接着用PBS洗涤三次除去多聚甲醛溶液。通过上述过程固定的细胞中加入0.3％的triton X-100(PBS中)并允许室温下反应5分钟，形成外部材料可渗透到细胞中的条件，接着用PBS洗涤三次除去triton X-100。

在得到的细胞中加入10％的NGS，允许室温下反应30分钟，并加入含有初级抗体(以1∶200的比例稀释)的PBS和NGS(以1∶100的比例稀释)，然后允许在4℃下反应过夜，接着用PBS洗涤三次除去反应液。在加入含有第二抗体(以1∶200的比例稀释)的PBS和NGS(以1∶100的比例稀释)之后，允许得到的细胞在37℃下反应1小时，用PBS洗涤三次除去反应液。然后制片并使用显微镜观察。

结果，如图6所示，根据本发明的成体干细胞对作为蛋白质表达的胚胎干细胞以及未分化细胞标记物的Oct4显示阳性应答。此外，如图7所示，确定在根据本发明的成体干细胞中同时显示Oct4和SH-4的表达。

在根据本发明的成体干细胞中表达的Oct4是在胚胎干细胞中表达的转录因子，其在防止细胞分化中涉及，并在天然细胞分化开始后消失，并已知为多能性干细胞的标记物(Donovan，P.J.，Nature Genet.，29：246，2001；Pesce，M.和Scholer，H.R.，干细胞，19：271，2001)，因此，根据本发明的成体干细胞表达作为多能性胚胎干细胞标记物的Oct4的结果清楚地证明根据本发明的成体干细胞是多能性的事实。

工业实用性

本发明提供了使用含有bGFG和人血清或血浆的培养基分离来自脐带血的表达多能成体干细胞的方法。虽然根据本发明的成体干细胞是成体干细胞，它们是多能的并能够分化成成骨细胞或者神经细胞等，因此它们可在治疗根深蒂固的疾病和不可治愈的疾病中有效地使用。

虽然已经参考特定特征对本发明进行了详细描述，但对本领域技术人员来说显而易见的是，该描述仅仅是优选实施方式，而不限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围将由所附的权利要求书及其等同物限定。