一种从桑叶总生物碱中分离1－脱氧野尻霉素单体的方法

摘要

本发明涉及中药有效成分分离技术领域，特指一种从桑叶总生物碱中分离1－脱氧野尻霉素单体的方法，包括下列步骤：样品溶液制备；吸附剂的预处理与装柱；样品溶液室温下通过树脂柱；分部收集洗脱液，定性检测；合并相同组分的洗脱液，减压浓缩后真空干燥；重结晶，得1－脱氧野尻霉素晶体。晶体经高效液相色谱法检测，纯度高于95％，收率大于75％。

说明书

技术领域

本发明涉及中药有效成分分离技术领域，特指一种从桑叶总生物碱中分离1-脱氧野尻霉素单体的方法。

背景技术

桑叶始载于《神农本草经》，味苦、甘，性寒，归肺、肝经，具有疏风清热、平肝明目的功效。历代中医药书籍中记载桑叶能够治疗消渴症，近代医家也常将桑叶用于治疗糖尿病，且取得满意疗效。1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)为桑叶中降血糖有效成分之一，现代药理研究表明它是人体小肠中多种α-糖苷酶抑制剂，可阻碍α-糖苷酶与二糖结合，使摄食的多糖、寡糖和双糖消化成葡萄糖、果糖等单糖的吸收过程受到阻滞，因而具有明显降低血糖的作用。

经检索，查得有关从桑叶中提取分离总生物碱的专利文件三条。CN1579445A的方法通过加入絮凝剂再经醇沉获得桑叶提取物，其中1-脱氧野尻霉素的含量为1.0-3.0％；CN1175818C的方法通过絮凝、柱色谱分离精制，获得了高含量的桑叶总碱浸膏，其中桑叶总碱含量大于浸膏总重量的70％，1-脱氧野尻霉素含量大于浸膏总重量的50％；CN101020655的方法，不需要加入絮凝剂，通过在桑叶的提取液中加入无机酸酸化处理，冷却除杂，再经过柱层析，获得1-脱氧野尻霉素含量大于10％的桑叶总碱浸膏。现有的分离方案仅得到了桑叶总生物碱，进一步从中分离1-脱氧野尻霉素单体的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的提供一种从桑叶总生物碱中分离高纯度1-脱氧野尻霉素的方法，尤其指纯度在95％以上的1-脱氧野尻霉素单体的分离制备方法。

本发明提供的一种从桑叶总生物碱中分离1-脱氧野尻霉素单体的方法，通过以下步骤实现：

(1)将桑叶总生物碱提取物溶于水中，制得上柱液；

(2)离子交换树脂经预处理后，湿法装柱，进行吸附，吸附柱的径高比为1∶8-1∶30；树脂的处理量为0.4-0.8mg桑叶生物碱提取物/mL湿树脂；

(3)吸附完成后对吸附柱进行洗脱，洗脱液流速为0.5-2.0mL/min，分部收集洗脱液；

(4)分别对所收集的洗脱液进行定性检测，与1-脱氧野尻霉素对照品进行比较，将与1-脱氧野尻霉素对照品在相同位置且显相同颜色斑点的单一组分洗脱液合并，减压浓缩和真空干燥；

(5)经多次重结晶，得1-脱氧野尻霉素单体。

上述制备方法中，步骤(1)的桑叶总生物碱提取物的生物碱含量不少于40％。

上述制备方法中，步骤(2)中所用的树脂为Amberlite CG-50树脂，D151树脂，D152树脂或D110阳离子交换树脂中的一种，多次吸附过程中，可使用不同型号的树脂。

上述制备方法中，步骤(3)中洗脱溶剂为0-30％(V/V)的C₁～C₄醇性溶剂，按每份10-20mL分部收集洗脱液。

上述制备方法中，步骤(4)中采用硅胶GF₂₅₄薄层板分别对所收集的洗脱液定性检测，所用展开剂为正丙醇∶醋酸∶水＝3～5∶1∶1，氯-联甲苯胺为显色剂，日光下观测，合并与1-脱氧野尻霉素对照品在相同位置且显相同颜色斑点的单一组分洗脱液。

上述制备方法中，步骤(5)中所用重结晶溶剂为甲醇与丙酮的混合溶剂，甲醇与丙酮的体积比1∶1-10，溶解步骤(4)中所得固体的温度为40-70℃，加热时间为10-30min，静置结晶。重结晶次数可以为1-5次。

上述制备方法分离得到的1-脱氧野尻霉素的纯度采用高效液相色谱法检测，色谱条件：JASCO LC 1500高效液相色谱系统，HiQSiLC₁₈分析柱(5μm，250mm×4.6mm)及ODS3预柱(5μm，10mm×4.6mm)；流动相：乙腈-0.1％醋酸(50∶50V/V)；流速：1.0mL/min；柱温30℃；荧光检测器激发波长254nm，发射波长322nm；进样量10μL。分析结果表明，1-脱氧野尻霉素的纯度可达95％以上，收率75％以上。

本发明提供了一种从桑叶中分离1-脱氧野尻霉素单体的方法，具有如下优点：

1、本发明所述的方法可以使1-脱氧野尻霉素从桑叶生物碱中得到有效分离，单体组分含量可达95％以上。

2、本发明所述的方法操作简单，设备要求低。

3、本发明所述的方法采用柱层析对1-脱氧野尻霉素进行分离，所用树脂可再生重复使用，有利于降低工艺的成本。

具体实施方式

以下通过具体实施例来说明本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。

实施例1

取桑叶总生物碱粉末溶于水中，制成上柱液，将其通过经预处理的D151树脂的树脂柱吸附，树脂柱内径1.5cm，柱长60cm，吸附柱的径高比为1∶20，树脂的处理量为0.5mg桑叶总生物碱/mL湿树脂，吸附完成后用水洗脱，洗脱流速为1.0mL/min，分部收集洗脱液，分别对所收集的洗脱液进行定性检测，与1-脱氧野尻霉素对照品进行比较，将与1-脱氧野尻霉素对照品在相同位置且显相同颜色斑点的单一组分洗脱液合并，减压浓缩和真空干燥，而后用甲醇/丙酮(1∶5)进行重结晶，溶解温度60℃，加热时间为10min，自然冷却静置结晶，反复3次，得白色固体样品，经高效液相色谱检测，其1-脱氧野尻霉素含量为95.5％，收率为81.3％。

实施例2

取桑叶总生物碱粉末溶于水中，制成上柱液，将其通过经预处理的Amberlite CG-50树脂的树脂柱吸附，树脂柱内径1.5cm，柱长60cm，吸附柱的径高比为1∶30，树脂的处理量为0.8mg桑叶总生物碱/mL湿树脂，吸附完成后用10％甲醇洗脱，洗脱流速为1.5mL/min，分部收集洗脱液，分别对所收集的洗脱液进行定性检测，与1-脱氧野尻霉素对照品进行比较，将与1-脱氧野尻霉素对照品在相同位置且显相同颜色斑点的单一组分洗脱液合并，减压浓缩和真空干燥，而后用甲醇/丙酮(1∶3)进行重结晶，溶解温度50℃，加热时间为15min，自然冷却静置结晶，反复5次，得白色固体样品，经高效液相色谱检测，其1-脱氧野尻霉素含量为96.9％，收率为77.8％。

实施例3

取桑叶总生物碱粉末溶于水中，制成上柱液，将其通过经预处理的D152树脂的树脂柱吸附，树脂柱内径1.5cm，柱长60cm，吸附柱的径高比为1∶10，树脂的处理量为0.4mg桑叶总生物碱/mL湿树脂，吸附完成后用5％乙醇洗脱，洗脱流速为0.5mL/min，分部收集洗脱液，分别对所收集的洗脱液进行定性检测，与1-脱氧野尻霉素对照品进行比较，将与1-脱氧野尻霉素对照品在相同位置且显相同颜色斑点的单一组分洗脱液合并，减压浓缩和真空干燥，而后用甲醇/丙酮(1∶4)进行重结晶，溶解温度70℃，加热时间为10min，自然冷却静置结晶，反复2次，得白色固体样品，经高效液相色谱检测，其1-脱氧野尻霉素含量为95.2％，收率为80.5％。

实施例4

取桑叶总生物碱粉末溶于水中，制成上柱液，将其通过经预处理的D110树脂的树脂柱吸附，树脂柱内径1.5cm，柱长60cm，吸附柱的径高比为1∶25，树脂的处理量为0.6mg桑叶总碱/mL湿树脂，吸附完成后用15％甲醇洗脱，洗脱流速为2.0mL/min，分部收集洗脱液，分别对所收集的洗脱液进行定性检测，与1-脱氧野尻霉素对照品进行比较，将与1-脱氧野尻霉素对照品在相同位置且显相同颜色斑点的单一组分洗脱液合并，减压浓缩和真空干燥，而后用甲醇/丙酮(1∶8)进行重结晶，溶解温度65℃，加热时间为20min，自然冷却静置结晶，反复3次，得白色固体样品，经高效液相色谱检测，其1-脱氧野尻霉素含量为95.8％，收率为79.3％。