饮用水生物活性炭处理工艺的脱氢酶活性测定预处理方法

摘要

一种饮用水生物活性炭处理工艺的脱氢酶活性测定预处理方法，由三种试剂组合成的混合溶液，通过控制加入比例、加入时间及操作条件，完成预处理，并由此选定测定过程并绘制标准曲线。优点：本技术从化学的角度出发，利用有机试剂对吸附的微生物进行萃取洗脱，脱附程度较高；通过有效的配比和振荡方式对以活性炭为载体的脱氢酶活性进行检测，并确定最佳的有机溶剂组合和配比达到最大的测定效果；为相似生物载体的活性检测提供了借鉴方法，适用于饮用水处理工艺中生物载体的生物活性检测。

说明书

技术领域

本发明涉及水处理技术领域，具体地说是涉及一种饮用水活性炭处理工艺中活性炭填料的脱氢酶活性测定预处理方法。

技术背景

由于饮用水常规处理工艺的局限，深度处理工艺应用越来越普遍，其中生物活性炭技术因其兼具吸附和生物处理作用而得到广泛的应用，而评价生物载体填料的生物活性是判定其生物处理作用强弱的关键。生物体的脱氢酶活性在很大程度上反映了生物体的活性状态，因此脱氢酶活性检测被广泛应用于水处理领域。脱氢酶活性测定方法自1959年正式应用于生化分析中以来，国内外很多学者对其进行了多次改进。使用较多的为2，3，5-氯化三苯基四氮唑-脱氢酶活性检测方法，通过测定萃取出的还原产物三苯基甲胺，计算生物活性值。该方法较多应用于污水生物处理领域，而在饮用水生物处理中应用较少。已有的样品预处理方法包括超声洗脱和振摇破碎，样品测定主要包括萃取和离心。饮用水臭氧生物活性炭工艺中，细菌等微生物的吸附载体为微孔结构复杂的颗粒活性炭，其吸附机理有别于活性污泥，再者污水中微生物浓度高于饮用水，特别是高于以自然挂膜为炭床生物形成方式的处理工艺，其对载体的吸附作用可能强于饮用水，所以在臭氧生物活性炭工艺中采用超声洗脱或振摇破碎的方法无法使吸附的微生物完全脱落，从而导致之后的测定值很小或出现负值。实验结果表明，上述脱氢酶活性中的预处理方法难以高效实现活性炭填料的活性测定。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种饮用水生物活性炭处理工艺的活性炭填料的脱氢酶活性测定方法，本发明是通过以下技术方案来实现的：

针对饮用水生物活性炭处理工艺活性炭低生物活性情况，建立了一种基于新型有机混合试剂测定活性炭脱氢酶活性的预处理方法，即根据活性炭吸附特征，提出了预处理所用有机混合试剂的配比及使用方法，为饮用水生物处理中生物载体脱氢酶测定提供了新的预处理方法。

本发明方法的实施步骤：

1.饮用水生物活性炭处理工艺的脱氢酶活性测定预处理方法，其特征在于该方法步骤如下：

(1)对活性炭填料进行前处理：先分别取不同深度的活性炭填料置于具塞三角瓶A、B、C中，分别先添加氯仿、甲醇和蒸馏水的萃取混合液，然后再分别添加氯仿和蒸馏水；

(2)对前处理后的活性炭填料分别测定吸光度值：分别吸取定量的萃取后的上下两相液体置于比色管D、E、F中，依次加入三相盐酸缓冲液、亚硫酸钠溶液、纯水，以甲醛作为终止试剂，反应完全后再分别添加三氯甲烷，并分别测定吸光度值；

(3)绘制标准曲线并将步骤(2)中的吸光度值转化为三苯基甲胺生成量即脱氢酶活性值：按步骤(2)中的活性炭填料萃取液的测定过程，测定2，3，5-三苯基氯化四氮唑不同序列浓度下生成的三苯基甲胺的吸光度值，并绘制标准曲线，得出线性回归方程，最后将吸光度值代入回归方程得出三苯基甲胺生成量，即脱氢酶活性值。

在步骤(1)中所述的前处理方法为，分别取距离炭床顶层40、80、120cm深度活性炭填料20～25g放入100mL具塞三角瓶A、B、C中；首先加入体积比为1∶2∶1的氯仿、甲醇和蒸馏水的萃取混合液，恒温水浴摇床120rpm振摇10-15min，静置6h，再向三角瓶中分别加入氯仿和蒸馏水，使最终体积比例为1.25∶1∶1，置于摇床120rpm振荡20min，静置6h。

在步骤(2)中所述的针对前处理条件选定的测定过程：待分层稳定后，分别吸取具塞三角瓶A、B、C中间分界面下层有机相5ml，分界面上层无机相5ml，分别移至50ml比色管D、E、F，向比色管中依次加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH8.4)、Na₂SO₃溶液(0.36％)、蒸馏水以及2，3，5-三苯基氯化四氮唑溶液(0.4％)，体积比为3∶1∶1∶1；从比色管D、E、F中分别吸取2ml下层有机相和8ml上层水相，置于比色管G、H、I中，分别加入2ml甲醛固定以做样品空白，将比色管D、E、F、G、H、I于35-37℃条件下水浴恒温振荡培养3h，振荡速度80rpm，然后向D、E、F比色管内加3.0ml甲醛中止酶反应；再分别向D、E、F比色管中加9ml三氯甲烷，分别向G、H、I比色馆中加6ml三氯甲烷，混匀，将比色管D、E、F、G、H、I于室温继续振荡10min后，离心5min(4000转/分钟)，分别取下层有机相，于波长485nm处进行比色，记录吸光值。

在步骤(3)中所述的绘制标准曲线：另取8支50mL比色管，分别向其中依次加入7.5ml三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、2.5ml蒸馏水及2.5ml不同浓度的2，3，5-三苯基氯化四氮唑系列溶液；再分别加入1g低亚硫酸钠，显色5min后，分别加入5mL三氯甲烷，80rpm振摇萃取3min，待溶液稳定后，分别取下层有机溶液至1cm的比色皿中；再次稳定1-2min后，于752紫外光栅分光光度计于485nm处测定吸光度值，绘制标准曲线，同时得到线性回归方程；根据得到的吸光度值，代入线性回归方程，进而计算出三苯基甲胺的生成量，即脱氢酶的活性。

本发明方法的优点如下：

该技术实现了有机混合试剂对脱氢酶的萃取作用，使得活性炭填料中活体微生物得以充分洗脱，为后续的显色物质测定提供了保障，实验证明效果十分明显；该脱氢酶活性的预处理方法只需要借助普通微生物实验室即可完成，复合试剂取材方便，操作成本较为低廉，其经济可行性较高；该技术也适用于其他填料的生物活性分析，操作步骤简便易行，应用前景广泛。

具体实施方式：

研究试验以南方某水厂臭氧-生物活性炭工艺为研究对象，通过控制不同实验条件，最终找到合理有效的预处理和测定方案。

实验在某水厂进行，该实验使用自制的活性炭取样器。活性炭池的运行参数为空床接触时间为15min，气水联合反冲洗。经过3个月，工艺运行趋于稳定，正式进入实验阶段。

分别取距离炭床顶层40、80、120cm深度的活性炭填料20～25g，分别放入3个100mL具塞三角瓶中，分别加入氯仿、甲醇和水的萃取混合液(体积比1∶2∶1)，于恒温水浴摇床120rpm振摇10min，静置6h。再向三角瓶中分别加入氯仿和水，使最终比例为1.25∶1∶1，置于摇床120rpm振荡20min，静置6h。

待三角瓶中液相分层稳定后，分别吸取中间分界面下层有机相5ml，分界面上层无机相5ml，移至3个50ml比色管D、E、F。向比色管中依次分别加入7.5ml三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、2.5mlNa₂SO₃溶液(0.36％)、2.5ml纯水以及2.5ml2，3，5-三苯基氯化四氮唑溶液(0.4％)。

从上述3个比色管中的混合液中分别吸取2ml下层有机相和8ml上层水相，置于另外3个对应的比色管G、H、I中，分别加入2ml甲醛固定以做空白对照。将6个比色管于37℃条件下水浴恒温振荡培养3h，振荡速度80rpm，然后向D、E、F内分别加3.0ml甲醛中止酶反应。

再分别向D、E、F中加9ml三氯甲烷，分别向G、H、I中加6ml三氯甲烷，，混匀。将6个比色管于室温继续振荡10min后，离心5min(4000rpm)。分别取下层有机相，于波长485nm处进行比色，记录吸光值；根据得到的吸光值，对照标准曲线，带入线性回归方程，进而计算出三苯基甲胺的生成量，即脱氢酶的活性。

绘制标准曲线：另取8支50mL比色管中，向其依次加入7.5ml三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、2.5ml蒸馏水以及2.5ml浓度分别为0、5、10、15、20、40、60、80μg/ml的2，3，5-三苯基氯化四氮唑系列溶液。再加入1g低亚硫酸钠，显色5min后，分别加入5mL三氯甲烷，振摇萃取3min。待溶液稳定后，分别取下层有机溶液至1cm的比色皿中。再次稳定1-2min后，于752紫外光栅分光光度计于485nm处测定吸光度值，绘制标准曲线，得到线性回归方程。

实验结果表明，使用已有的生物活性测定方法，在测试的过程中，经常出现空白的吸光值高于样品的吸光值，亦即在生物活性较低的情况下得到的脱氢酶活性为负值；而在使用上述该方法后，两次平行试验得到的结果如下表，同时由标准曲线得到线性回归方程为y＝534.97x-14.74(R²＝0.9849)，式中y代表三苯基甲胺的生成量，即脱氢酶的活性值，x代表试验测得的吸光度值，R²代表标准曲线的相关系数。

表1活性炭工艺炭床填料的两次平行试验脱氢酶活性结果

编号距炭顶层高度吸光度x₁活性值y₁吸光度x₂活性值y₂  A    40cm  0.075  25.383  0.066  20.568  B    80cm  0.045  9.334  0.050  12.009  C    120cm  0.034  3.449  0.033  2.914