一种动物基因工程干扰素α和γ复合制剂及其生产方法和临床应用

摘要

一种动物基因工程干扰素复合制剂及其生产方法和临床应用。该动物基因工程干扰素复合制剂通过提取动物外周血或脾淋巴细胞，经培养和体外诱导剂诱导，Trizol提取细胞总RNA，设计特异性引物，通过RT－PCR技术克隆干扰素基因，通过T－A策略将其连接到pGEM－T载体；重新设计引物，两端加入不同的酶切序列和起始密码子ATG、终止密码子TAA，并去除前导肽序列，以重组T载体为模板进行PCR扩增，获取动物干扰素基因表达片段；将表达片段进行稀有密码子突变，经双酶切后，胶回收目的片段，连接到经同样双酶切的载体pFastBacTM Dual上；将动物interferon－α克隆到Polyhedrin promoter控制下的多克隆位点，将同一种属动物interferon－γ克隆到p10 promoter控制下的多克隆位点；将构建好的载体pFastBacTM Dual+interferon α+interferon γ转染到DH10BacTM E.coli进行重组；经蓝白斑筛选，PCR鉴定后，将构建好的recombinant bacmid提取纯化，通过脂质体法转染SF9昆虫细胞；表达产物鉴定、纯化；动物基因工程干扰素复合制剂抗病毒活性检测和临床应用效果评价。该动物基因工程干扰素在昆虫细胞共表达的生产方法和临床应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物基因工程干扰素复合制剂及其生产方法和应用，该动物基因工程干扰素复合制剂是经动物干扰素α和γ基因在同一载体上分别在不同的启动子控制下在同一宿主细胞中独立表达而得到的干扰素复合产物。

背景技术

禽流感、口蹄疫等一系列畜禽病毒性传染病的暴发流行给全球社会和经济造成了巨大损失，直接威胁着食品安全和人类健康。为了控制和消灭这些动物疾病，常规途径是通过疫苗免疫预防和使用抗生素，但是由于饲养环境条件差，病毒不断变异，与此同时，食品的生物安全已受到广泛重视，提倡绿色食品，限制抗生素和抗病毒化学药物的使用，加强食品中药物残留检测等，使传统的防治畜禽疾病的方法面临新问题和挑战。

干扰素是由机体细胞在病毒等诱导剂的刺激下产生的，具有抑止病毒在被其激活的细胞内复制的一类细胞因子类蛋白质分子。干扰素分为I型和II型二类，I型干扰素包括干扰素α和干扰素β，其主要活性是通过与靶细胞和其自身的受体相互作用，诱导产生抗病毒蛋白2-5A合成酶和蛋白激酶PKR等，从而抑制病毒在细胞内复制，即抗病毒活性。II型干扰素又称干扰素γ，它除具有I类干扰素所具有的抗病毒活性外，还具有很强的免疫调节活性：①通过上调巨噬细胞IgG Fc受体促进ADCC作用；②活化NK细胞，提高其杀伤能力，被活化的NK细胞也分泌干扰素γ；③诱导巨噬细胞、T、B等细胞MHC II类分子的表达，从而提高抗原呈递能力；④干扰素γ可诱导巨噬细胞可诱导性一氧化氮合酶的产生，促进NO的合成，是干扰素γ杀伤胞内病原体和抗肿瘤以及抑制病毒复制的分子机制之一。

但是由于干扰素mRNA不稳定和其基因的迅速关闭，细胞通过病毒或聚肌胞等干扰素诱导剂的诱导而产生的干扰素量少，持续时间也短。因此通过干扰素诱导剂刺激机体产生干扰素来预防和治疗动物病毒性传染病，其效果会大打折扣。同时，通过培养动物脾脏或外周血白细胞，诱导剂进行诱导，然后提取干扰素，即白细胞干扰素，易造成内源性病原的污染。

我们已将动物干扰素基因进行了原核表达，但经过检测表达蛋白的抗病毒活性很差，可能的原因是，在原核中表达，其表达蛋白不能进行糖基化，从而影响了重组蛋白的活性。另外，在原核中进行串联或并联共表达，其表达产物必须进行变性复性和经特异酶切才具有活性。变性复性和酶切不仅增加了成本，而且其产物损失严重。

本发明以杆状病毒为表达载体，以昆虫细胞为宿主细胞，将同种属动物干扰素α和γ基因的表达片段共同重组到杆状病毒中，分别置于不同的启动子控制下，在昆虫细胞中实现了独立共表达；在干扰素基因和启动子之间插有携带起绐密码子ATG的编码蜂素信号肽基因，实现干扰素的分泌表达，提高了表达量；选择昆虫细胞作表达宿主细胞，不仅表达效率高，而且实现了对干扰素表达蛋白的糖基化，提高了表达蛋白的生物学活性。

发明内容

本发明的第一目的是提供该动物基因工程干扰素复合制剂。

本发明的第二目的是提供该动物基因工程干扰素复合制剂的生产方法。

本发明的另一目的是提供该动物基因工程干扰素复合制剂在细胞上抑制病毒繁殖和在临床上防治动物病毒性疫病的效果的应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种动物基因工程干扰素α和γ复合制剂，其特征在于：动物干扰素α和γ基因以同一杆状病毒为载体，在昆虫细胞中共表达而成。

上述的动物基因工程干扰素α和γ复合制剂，其特征在于：所述动物干扰素α和γ基因非受同一启动子控制下，在每个动物干扰素基因的起始密码子后和动物干扰素基因表达片段前可插入昆虫细胞可识别的信号肽基因序列。

上述的动物基因干扰素α和γ基因复合制剂，其特征在于：所述动物干扰素α和γ基因是指猪干扰素α和γ基因、牛干扰素α和γ基因、犬干扰素α和γ基因、鸡干扰素α和γ基因、鸭干扰素α和γ基因中的一种；

上述的动物基因工程干扰素α和γ复合制剂，其特征在于：通过以下步骤制得：

A、分别提取猪、牛、犬、鸡、鸭任何一种外周血或脾淋巴细胞，将提取的相应的猪、牛、犬、鸡、鸭外周血或脾淋巴细胞，经体外培养和诱导剂的诱导，Trizol方法提取细胞总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR技术克隆干扰素基因，通过T-A策略将其连接到T载体；

B、重新设计引物，扩增相应猪、牛、犬、鸡、鸭干扰素α和γ基因的表达片段，通过双酶切连接到载体pFastBac^TM Dual上，将编码干扰素α的基因表达片段置于启动子Polyhedrin promoter控制下，将编码同种属干扰素γ的基因表达片段置于p10 promoter控制下，并且在起始密码子和编码干扰素基因表达片段之间插有蜂素信号肽基因序列；

C、将已构建好分别带有蜂素信号肽的相应猪、牛、犬、鸡、鸭干扰素α和γ基因的载体pFastBac^TM Dual+interferonα+interferonγ转化DH10Bac^TME.coli进行重组；

D、将重组体进行蓝白斑筛选，PCR进行鉴定，并将通过鉴定已证明构建好的recombinant bacmid提取和纯化，通过脂质体法转染昆虫细胞。

E、转染72小时后，观察昆虫细胞病变，收集有病变的细胞上清液，即为重组杆状病毒P1代；

F、将重组杆状病毒P1代感染昆虫细胞，重组杆状病毒在昆虫细胞内同时表达相应猪、牛、犬干扰素α和γ蛋白，测定MOI和最佳感染持续时间，收集重组干扰素α和γ复合制剂；

G、运用细胞病变抑制法检测相应猪、牛、犬、鸡、鸭基因工程干扰素α和γ复合制剂在细胞上的抗病毒活性。

上述的动物基因工程干扰素α和γ复合制剂的制备方法，由以下步骤组成：

A、分别提取猪、牛、犬、鸡、鸭任何一种外周血或脾淋巴细胞，将提取的相应的猪、牛、犬、鸡、鸭外周血或脾淋巴细胞，经体外培养和诱导剂的诱导，Trizol方法提取细胞总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR技术克隆干扰素基因，通过T-A策略将其连接到T载体；

B、重新设计引物，扩增相应猪、牛、犬、鸡、鸭干扰素α和γ基因的表达片段，通过双酶切连接到载体pFastBac^TM Dual上，将编码干扰素α的基因表达片段置于启动子Polyhedrin promoter控制下，将编码同种属干扰素γ的基因表达片段置于p10 promoter控制下，并且在起始密码子和编码干扰素基因表达片段之间插有蜂素信号肽基因序列；

C、将已构建好分别带有蜂素信号肽的相应猪、牛、犬、鸡、鸭干扰素α和γ基因的载体pFastBac^TM Dual+interferonα+interferonγ转化DH10Bac^TM E.coli进行重组；

D、将重组体进行蓝白斑筛选，PCR进行鉴定，并将通过鉴定已证明构建好的recombinant bacmid提取和纯化，通过脂质体法转染昆虫细胞。

E、转染72小时后，观察昆虫细胞病变，收集有病变的细胞上清液，即为重组杆状病毒P1代；

F、将重组杆状病毒P1代感染昆虫细胞，重组杆状病毒在昆虫细胞内同时表达相应猪、牛、犬、鸡、鸭干扰素α和γ蛋白，测定MOI和最佳感染持续时间，收集重组干扰素α和γ复合制剂；

G、运用细胞病变抑制法检测相应猪、牛、犬、鸡、鸭基因工程干扰素α和γ复合制剂在细胞上的抗病毒活性。

上述的动物基因工程干扰素α和γ复合制剂的应用，其特征在于：制得的猪基因工程干扰素α和γ复合制剂在猪肾细胞或Merc-145细胞上抑制伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒、猪圆环病毒的复制和在临床上防治实验猪人工感染伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒、猪圆环病毒的效果中的应用；制得的牛基因工程干扰素α和γ复合制剂在牛肾细胞上抑制牛流行性腹泻病毒、水疱性口炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛细小病毒复制和在临床上防治实验幼年牛人工感染牛流行性腹泻病毒、水疱性口炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛细小病毒的效果中的应用；制得的犬基因工程干扰素α和γ复合制剂在犬肾细胞抑制犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬传染性肝炎病毒、犬副流感病毒、犬疱疹病毒、犬冠状病毒的复制和在临床上防治犬病毒性疫病的效果中的应用。制得的鸡基因工程干扰素α和γ复合制剂在鸡胚成纤维细胞上抑制新城疫病毒、禽流感病毒或传染性法氏囊炎病毒的复制和在临床上防治实验鸡人工感染新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊炎病毒和传染性支气管炎病毒的效果中的应用；制得的鸭基因工程干扰素α和γ复合制剂在鸭胚成纤维细胞上抑制鸭瘟病毒、鸭细小病毒、鸭病毒性肝炎病毒的复制和在临床上防治鸭瘟病毒、鸭细小病毒、鸭病毒性肝炎病毒感染效果中的应用。

本发明采用基因工程技术，对动物干扰素α和γ基因进行克隆，将同种属动物干扰素α和γ基因重组到同一载体，受不同启动子控制，每个表达基因前端分别插入蜂素信号肽基因，实现了分泌表达，增加了表达量。将编码干扰素α的基因表达片段置于启动子Polyhedrin promoter控制下，将编码干扰素γ的基因表达片段置于p10promoter控制下，构建载体pFastBac^TM Dual+interferonα+interferonγ，转化DH10Bac^TM E.coli进行同源重组，将重组子通过脂质体转染昆虫细胞SF9，实现同种属动物干扰素α和γ在同一载体的不同启动子下分别独立表达。使最终的干扰素在昆虫细胞内能够实现糖基化，使其具有较强的抗病毒活性，又具有较强的免疫调节活性，实现不同型干扰素的优势互补。

具体实施方式

下面是本发明的实施例，所述的实施例只是用来说明本发明，而不应当被视为是对本发明的限制。

实施例1

鸡基因工程干扰素α与γ复合制剂的生产方法具体由以下步骤进行：

A、提取鸡外周血或脾淋巴细胞，经体外培养和ConA诱导剂的诱导，Trizol方法提取细胞总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR技术克隆鸡干扰素α和γ基因，通过T-A策略将其连接到pGEM-T载体；

B、重新设计引物，上下游引物5′端加入酶切位点，鸡干扰素α加入BamHI和HindIII，鸡干扰素γ加入Eco I和SphI，以T载体为模板PCR扩增鸡干扰素α和γ基因的表达片段，通过双酶切分别连接到载体pFastBac^TM Dual上，将编码鸡干扰素α的基因表达片段置于启动子Polyhedrin promoter控制下，将编码鸡干扰素γ的基因表达片段置于p10 promoter控制下，并且在启动子和编码干扰素的基因之间插有蜂素信号肽基因序列；

C、将已构建好分别带有蜂素信号肽的鸡干扰素α和γ基因的载体pFastBac^TM Dual+interferonα+interferonγ转化DH10Bac^TM E.coli进行重组；

D、将重组体进行蓝白斑筛选，PCR进行鉴定，并将经鉴定证明已构建好的recombinant bacmid提取和纯化，通过脂质体法转染SF9昆虫细胞。

E、转染72小时后，观察SF9细胞病变，收集有病变的细胞上清液，即为重组杆状病毒P1代；

F、将重组杆状病毒P1代感染SF9细胞，重组杆状病毒在SF9细胞内同时表达鸡干扰素α和γ蛋白，测定MOI和最佳感染持续时间，收集重组鸡干扰素α和γ复合制剂；

G、运用细胞病变抑制法检测鸡基因工程干扰素α和γ复合制剂在细胞上和临床上的抗病毒活性。

实施例2

猪基因工程干扰素α与γ的复合制剂的生产方法具体由以下步骤组成：

A、提取猪外周血或脾淋巴细胞，经体外培养和ConA诱导剂的诱导，Trizol方法提取细胞总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR技术克隆猪干扰素α和γ基因，通过T-A策略将其连接到pGEM-T载体；

B、重新设计引物，上下游引物5′端加入酶切位点，猪干扰素α加入EcoR I和HindIII，猪干扰素γ加入NcoI和SphI，以T载体为模板PCR扩增猪干扰素α和γ基因的表达片段，通过双酶切分别连接到载体pFastBac^TM Dual上，将编码猪干扰素α的基因表达片段置于启动子Polyhedrin promoter控制下，将编码猪干扰素γ的基因表达片段置于p10 promoter控制下，并且在启动子和编码干扰素的基因之间插有蜂素信号肽基因序列；

C、将已构建好分别带有蜂素信号肽的猪干扰素α和γ基因的载体pFastBac^TM Dual+interferonα+interferonγ转化DH10Bac^TM E.coli进行重组；

D、将重组体进行蓝白斑筛选，PCR进行鉴定，并将经鉴定证明已构建好的recombinant bacmid提取和纯化，通过脂质体法转染SF9昆虫细胞。

E、转染72小时后，观察SF9细胞病变，收集有病变的细胞上清液，即为重组杆状病毒P1代；

F、将重组杆状病毒P1代感染SF9细胞，重组杆状病毒在SF9细胞内同时表达猪干扰素α和γ蛋白，测定MOI和最佳感染持续时间，收集重组猪干扰素α和γ复合制剂；

G、运用细胞病变抑制法检测猪基因工程干扰素α和γ复合制剂在细胞上和临床上的抗病毒活性。

实施例3

牛基因工程干扰素α与γ的复合制剂的生产方法具体由以下步骤组成：

A、提取牛外周血淋巴细胞，经体外培养和ConA诱导剂的诱导，Trizol方法提取细胞总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR技术克隆牛干扰素α和γ基因，通过T-A策略将其连接到pGEM-T载体；

B、重新设计引物，上下游引物5′端加入酶切位点，牛干扰素α加入BamHI和HindIII，牛干扰素γ加入NcoI和SphI，以T载体为模板PCR扩增牛干扰素α和γ基因的表达片段，通过双酶切分别连接到载体pFastBac^TM Dual上，将编码牛干扰素α的基因表达片段置于启动子Polyhedrin promoter控制下，将编码牛干扰素γ的基因表达片段置于p10promoter控制下，并且在启动子和编码干扰素的基因之间插有蜂素信号肽基因序列；

C、将已构建好分别带有蜂素信号肽的牛干扰素α和γ基因的载体pFastBac^TM Dual+interferonα+interferonγ转化DH10Bac^TM E.coli进行重组；

D、将重组体进行蓝白斑筛选，PCR进行鉴定，并将经鉴定证明已构建好的recombinant bacmid提取和纯化，通过脂质体法转染SF9昆虫细胞。

E、转染72小时后，观察SF9细胞病变，收集有病变的细胞上清液，即为重组杆状病毒P1代；

F、将重组杆状病毒P1代感染SF9细胞，重组杆状病毒在SF9细胞内同时表达牛干扰素α和γ蛋白，测定MOI和最佳感染持续时间，收集重组牛干扰素α和γ复合制剂；

G、运用细胞病变抑制法检测牛基因工程干扰素α和γ复合制剂在细胞上和临床上的抗病毒活性。

实施例4

犬基因工程干扰素α与γ复合制剂的生产方法具体由以下步骤组成：

A、提取犬外周血淋巴细胞，经体外培养和ConA诱导剂的诱导，Trizol方法提取细胞总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR技术克隆犬干扰素α和γ基因，通过T-A策略将其连接到pGEM-T载体；

B、重新设计引物，上下游引物5′端加入酶切位点，犬干扰素α加入BamHI和HindIII，犬干扰素γ加入NcoI和SphI，以T载体为模板PCR扩增犬干扰素α和γ基因的表达片段，通过双酶切分别连接到载体pFastBac^TM Dual上，将编码犬干扰素α的基因表达片段置于启动子Polyhedrin promoter控制下，将编码犬干扰素γ的基因表达片段置于p10 promoter控制下，并且在启动子和编码干扰素的基因之间插有蜂素信号肽基因序列；

C、将已构建好分别带有蜂素信号肽的犬干扰素α和γ基因的载体pFastBac^TM Dual+interferonα+interferonγ转化DH10Bac^TM E.coli进行重组；

D、将重组体进行蓝白斑筛选，PCR进行鉴定，并将经鉴定证明已构建好的recombinant bacmid提取和纯化，通过脂质体法转染SF9昆虫细胞。

E、转染72小时后，观察SF9细胞病变，收集有病变的细胞上清液，即为重组杆状病毒P1代；

F、将重组杆状病毒P1代感染SF9细胞，重组杆状病毒在SF9细胞内同时表达犬干扰素α和γ蛋白，测定MOI和最佳感染持续时间，收集重组犬干扰素α和γ复合制剂；

G、运用细胞病变抑制法检测犬基因工程干扰素α和γ复合制剂在细胞上和临床上的抗病毒活性。

实施例5

鸭基因工程干扰素α与γ的复合制剂的生产方法具体由以下步骤组成：

A、提取鸭外周血或脾淋巴细胞，经体外培养和ConA诱导剂的诱导，Trizol方法提取细胞总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR技术克隆鸭干扰素α和γ基因，通过T-A策略将其连接到pGEM-T载体；

B、重新设计引物，上下游引物5′端加入酶切位点，鸭干扰素α加入BamHI和HindIII，鸭干扰素γ加入NcoI和SphI，以T载体为模板PCR扩增鸭干扰素α和γ基因的表达片段，通过双酶切分别连接到载体pFastBac^TM Dual上，将编码鸭干扰素α的基因表达片段置于启动子Polyhedrin promoter控制下，将编码鸭干扰素γ的基因表达片段置于p10 promoter控制下，并且在启动子和编码干扰素的基因之间插有蜂素信号肽基因序列；

C、将已构建好的包含有鸭干扰素α和γ基因的pFastBac^TM Dual转化DH10Bac^TM E.coli进行重组；

D、将重组体进行蓝白斑筛选，PCR进行鉴定，并将经鉴定证明已构建好的recombinant bacmid提取和纯化，通过脂质体法转染SF9昆虫细胞。

E、转染72小时后，观察SF9细胞病变，收集有病变的细胞上清液，即为重组杆状病毒P1代；

F、将重组杆状病毒P1代感染SF9细胞，重组杆状病毒在SF9细胞内同时表达鸭干扰素α和γ蛋白，测定MOI和最佳感染持续时间，收集重组鸭干扰素α和γ复合制剂；

G、运用细胞病变抑制法检测鸭基因工程干扰素α和γ复合制剂在细胞上和临床上的抗病毒活性。

实施例6

由实施例1得到的鸡基因工程干扰素α和γ复合制剂在鸡胚成纤维细胞上能够抑制100个TCID50的新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊炎病毒的增殖。在96孔微量细胞培养板上用RPMI1640培养基培养鸡胚成纤维细胞，5％的CO₂培养箱37℃条件下培养24小时，用不同剂量的鸡基因工程干扰素α和γ复合制剂进行处理，24小时后吸弃，再分别接种100个TCID50的新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊炎病毒。结果表明鸡基因工程干扰素α和γ复合制剂对新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊炎病毒感染所引起的细胞病变均具有抑制作用。未经处理的细胞接种病毒后，均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而经实施例1得到的鸡基因工程干扰素α和γ复合制剂处理的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察7天，细胞形态正常，未出现任何病变。运用鸡基因工程干扰素复合制剂，配合广谱抗菌素和多种维生素，在临床上对鸡的新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊炎病毒的感染具有明显的预防和治疗效果。

实施例7

由实施例2得到的猪基因工程干扰素α和γ复合制剂在猪肾细胞(PK)和Merc145细胞上能够抑制100个TCID50的伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒、猪圆环病毒的增殖。在96孔微量细胞培养板上用DMEM培养基培养猪肾细胞PK-15和Merc145细胞，5％的CO₂培养箱37℃条件下培养至细胞长成单层后，用不同剂量的猪基因工程干扰素α和γ复合制剂进行处理，24小时后吸弃，再分别接种100个TCID50的伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒。结果表明本品对伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒感染所引起的细胞病变均具有抑制作用。未经实施例2得到的猪基因工程干扰素α和γ复合制剂处理的细胞接种病毒后，均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而经实施例2得到的猪基因工程干扰素α和γ复合制剂处理的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察7天，细胞形态正常，未出现任何病变。运用猪基因工程干扰素复合制剂，配合广谱抗菌素和多种维生素，在临床上对猪的伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒的感染具有明显的预防和治疗效果。

实施例8

由实施例3得到的牛基因工程干扰素α和γ复合制剂在牛肾细胞(MDBK)上能够抑制100个TCID50的牛口蹄疫病毒、牛流行性腹泻病毒、水疱性口炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛细小病毒的增殖。在96孔微量细胞培养板上用DMEM培养基培养牛肾细胞(MDBK)，5％的CO₂培养箱37℃条件下培养至细胞长成单层后，用不同剂量的牛基因工程干扰素α和γ复合制剂进行处理，24小时后吸弃，再分别接种100个TCID50的牛口蹄疫病毒、牛流行性腹泻病毒、水疱性口炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛细小病毒。结果表明本品对牛口蹄疫病毒、牛流行性腹泻病毒、水疱性口炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛细小病毒感染所引起的细胞病变均具有抑制作用。未经实施例3得到的牛基因工程干扰素α和γ复合制剂处理的细胞接种病毒后，均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而经实施例3得到的牛基因工程干扰素α和γ复合制剂处理的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察7天，细胞形态正常，未出现任何病变。运用牛基因工程干扰素复合制剂，配合广谱抗菌素和多种维生素，在临床上对牛的口蹄疫病毒、流行性腹泻病毒、水疱性口炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛细小病毒的感染具有明显的预防和治疗效果。

实施例9

由实施例4得到的犬基因工程干扰素α和γ复合制剂在犬肾细胞(MDCK)上能够抑制100个TCID50的犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬传染性肝炎病毒、犬副流感病毒、犬疱疹病毒、犬冠状病毒的增殖。在96孔微量细胞培养板上用DMEM培养基培养犬肾细胞(MDCK)，5％的CO₂培养箱37℃条件下培养至细胞长成单层后，用不同剂量的犬基因工程干扰素α和γ复合制剂进行处理，24小时后吸弃，再分别接种100个TCID50的犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬传染性肝炎病毒、犬副流感病毒、犬疱疹病毒、犬冠状病毒。结果表明本品对犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬传染性肝炎病毒、犬副流感病毒、犬疱疹病毒、犬冠状病毒感染所引起的细胞病变均具有抑制作用。未经实施例4得到的犬基因工程干扰素α和γ复合制剂处理的细胞接种病毒后，均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而经实施例4得到的犬基因工程干扰素α和γ复合制剂处理的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察7天，细胞形态正常，未出现任何病变。运用犬基因工程干扰素复合制剂，配合广谱抗菌素和多种维生素，在临床上对犬的犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬传染性肝炎病毒、犬副流感病毒、犬疱疹病毒、犬冠状病毒的感染具有明显的预防和治疗效果。

实施例10

由实施例4得到的鸭基因工程干扰素α和γ复合制剂在鸭胚成纤维细胞上能够抑制100个TCID50的鸭瘟病毒、鸭细小病毒、鸭病毒性肝炎病毒的增殖。在96孔微量细胞培养板上用DMEM培养基培养鸭胚成纤维细胞，5％的CO₂培养箱37℃条件下培养至细胞长成单层后，用不同剂量的鸭基因工程干扰素α和γ复合制剂进行处理，24小时后吸弃，再分别接种100个TCID50的鸭瘟病毒、鸭细小病毒、鸭病毒性肝炎病毒。结果表明本品对鸭瘟病毒、鸭细小病毒、鸭病毒性肝炎病毒感染所引起的细胞病变均具有抑制作用。未经实施例4得到的鸭基因工程干扰素α和γ复合制剂处理的细胞接种病毒后，均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而经实施例4得到的鸭基因工程干扰素α和γ复合制剂处理的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察7天，细胞形态正常，未出现任何病变。运用鸭基因工程干扰素复合制剂，配合广谱抗菌素和多种维生素，在临床上对鸭的鸭瘟病毒、鸭细小病毒、鸭病毒性肝炎病毒的感染具有明显的预防和治疗效果。

以上对本发明所提供的动物干扰素复合物及其制备方法和应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

下面是动物干扰素α和干扰素γ核苷酸序列和氨基酸序列：

猪干扰素α核苷酸序列和氨基酸序列

Tgc gac ctg cct cag acc cac agc ctg gct cac acc agg gcc ctg agg ctc ctg

gca caa atg agg aga atc tcc ccc ttc tcc tgc ctg gac cac aga agg gac ttt

gga tcc cct cat gag gcc ttg ggg ggc aac cag gtc cag aag gct caa gcc atg

gct ctg gtg cat gag atg ctc cag cag acc ttc cag ctc ttc agc aca gag ggc

tcg gct gct gcc tgg gat gag agc ctc ctg cac cag ttc tgc act gga ctg gat

cag cag ctc agg gac ctg gaa gcc tgt gtc atg cag gag gtg ggg ctg gaa ggg

acc ccc ctg ctg gag gag gac tcc atc ctg gct gtg agg aaa tac ttc cac aga

ctc acc ctc tat ctg caa gag aag agc tac agc ccc tgt gcc tgg gag atc gtc

agg gca gaa gtc atg aga tcc ttc tct tcc tcc aga aac ctg caa gac aga ctc

agg aag aag gag

CDLPQTHSLAHTRALRLLAQMRRISPFSCLDHRRDFGSPHEALGGNQVQKAQAMALVHE

MLQQTFQLFSTEGSAAAWDESLLHQFCTGLDQQLRDLEACVMQEVGLEGTPLLEEDSILA

VRKYFHRLTLYLQEKSYSPCAWEIVRAEVMRSFSSSRNLQDRLRKKE

猪干扰素γ核苷酸序列和氨基酸序列

tac tgc cag gcg ccc ttt ttt aaa gaa ata acg atc cta aag gac tat ttt aat

gca agt acc tca gat gta cct aat ggt gga cct ctt ttc tta gaa att ttg aag

aat tgg aaa gag gag agt gac aaa aaa ata att cag agc caa att gtc tcc ttc

tac ttc aaa ttc ttt gaa atc ttc aaa gat aac cag gcc att caa agg agc atg

gat gtg atc aag caa gac atg ttt cag agg ttc cta aat ggt agc tct ggg aaa

ctg aat gac ttc gaa aag ctg att aaa att ccg gta gat aat ctg cag atc cag

cgc aaa gcc atc agt gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctg tca cca aga tct

aac cta aga aag cgg aag aga agt cag act atg ttc caa ggc cag aga gca tca

aaa

YCQAPFFKEITILKDYFNASTSDVPNGGPLFLEILKNWKEESDKKIIQSQIVSFYFKFFEIFK

DNQAIQRSMDVIKQDMFQRFLNGSSGKLNDFEKLIKIPVDNLQIQRKAISELIKVMNDLSP

RSNLRKRKRSQTMFQGQRASK

鸡干扰素α核苷酸序列和氨基酸序列

tgc aac cac ctt cgc ccc cag gat gcc acc ttc tct cac gac agc ctc cag ctc

ctc cgg gac atg gct ccc aca cta ccc cag ctg tgc cca cag cac aac gcg tct

tgc tcc ttc aac gac acc atc ctg gac acc agc aac acc cgg caa gcc gac aaa

acc acc cac gac atc ctt cag cac ctc ttc aaa atc ctc agc agc ccc agc act

cca gcc cac tgg aac gac agc caa cgc caa agc ctc ctc aac cgg atc cac cgc

tac acc cag cac ctc gag caa tgc ttg gac agc agc gac acg cgc tcc cgg acg

cga tgg cct cgc aac ctt cac ctc acc atc aaa aaa cac ttc agc tgc ctc cac

acc ttc ctc caa gac aac gat tac agc gcc tgc gcc tgg gaa cac gtc cgc ctg

caa gct cgt gcc tgg ttc ctg cac atc cac aac ctc aca ggc aac acg cgc act

CNHLRPQDATFSHDSLQLLRDMAPTLPQLCPQHNASCSFNDTILDTSNTRQADKTTHDILQ

HLFKILSSPSTPAHWNDSQRQSLLNRIHRYTQHLEQCLDSSDTRSRTRWPRNLHLTIKKHFS

CLHTFLQDNDYSACAWEHVRLQARAWFLHIHNLTGNTR

鸡干扰素γ核苷酸序列和氨基酸序列

cat act gca agt agt cta aat ctt gtt caa ctt caa gat gat ata gac aaa ctg

aaa gct gac ttt aac tca agt cat tca gat gta gct gac ggt gga cct att att

gta gag aaa ctg aag aac tgg aca gag aga aat gag aaa agg atc ata ctg agc

cag att gtt tcg atg tac ttg gaa atg ctt gaa aac act gac aag tca aag ccg

cac atc aaa cac ata tct gag gag ctc tat act ctg aaa aac aac ctt cct gat

ggc gtg aag aag gtg aaa gat atc atg gac ctg gcc aag ccc ccg    atg aac gac

ttg aga atc cag cgc aaa gcc gcg aat gaa ctc ttc agc atc tta cag aag ctg

gtg gat cct ccg agt ttc aaa agg aaa agg agc cag tct cag agg aga tgc aat

tgc

HTASSLNLVQLQDDIDKLKADFNSSHSDVADGGPIIVEKLKNWTERNEKRIILSQIVSMYLE

MLENTDKSKPHIKHISEELYTLKNNLPDGVKKVKDIMDLAKPPMNDLRIQRKAANELFSIL

QKLVDPPSFKRKRSQSQRRCNC

牛干扰素α核苷酸序列和氨基酸序列

tgc cac ctg cct cac acc cac agc ctg gcc aac agg agg gtc ctg atg ctc ctg

gga caa ctg agg agg gtc tcc cct tcc tcc tgc ctg cag gac aga aat gac ttt

gca ttc ccc cag gag gcg ctg ggt ggc agc cag ttg cag aag gct caa gcc atc

tct gtg ctc cac gag gtg acc cag cac acc ttc cag ctt ttc agc aca gag ggc

tcg gcc acc atg tgg gat gag agc ctc ctg gac aag ctc cgc    gat gca ctg gat

cag cag ctc act gac ctg caa ttc tgt ctg agg cag gag gag gag ctg caa gga

gct ccc ctg ctc aag gag gac tcc agc ctg gct gtg agg aaa tac ttc cac aga

ctc act ctc tat ctg caa gag aag aga cac agc cct tgt gcc tgg gag gtt gtc

aga gca caa gtc atg aga gcc ttc tct tcc tca aca aac ttg cag gag agt ttc

agg aga aag gac

CHLPHTHSLANRRVLMLLGQLRRVSPSSCLQDRNDFAFPQEALGGSQLQKAQAISVLHEV

TQHTFQLFSTEGSATMWDESLLDKLRDALDQQLTDLQFCLRQEEELQGAPLLKEDSSLAV

RKYFHRLTLYLQEKRHSPCAWEVVRAQVMRAFSSSTNLQESFRRKD

牛干扰素γ核苷酸序列和氨基酸序列

cag ggc caa ttt ttt aga gaa ata gaa aac tta aag gag tat ttt aat gca agt

agc cca gat gta gct aag ggt ggg cct ctc ttc tca gaa att ttg aag aat tgg

aaa gat gaa agt gac aaa aaa att att cag agc caa att gtc tcc ttc tac ttc

aaa ctc ttt gaa aac ctc aaa gat aac cag gtc att caa agg agc atg gat atc

atc aag caa gac atg ttt cag aag ttc ttg aat ggc agc tct gag aaa ctg gag

gac ttc aaa aag ctg att caa att ccg gtg gat gat ctg cag atc cag cgc aaa

gcc ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gac ctg tca cca aaa tct aac ctc

aga aag cgg aag aga agt cag aat ctc ttt cga ggc cgg aga gca tca acg

GQGQFFREIENLKEYFNASSPDVAKGGPLFSEILKNWKDESDKKIIQSQIVSFYFKLFENLK

DNQVIQRSMDIIKQDMFQKFLNGSSEKLEDFKKLIQIPVDDLQIQRKAINELIKVMNDLSP

KSNLRKRKRSQNLFRGRRAST

犬干扰素α核苷酸序列和氨基酸序列

tgc cac ctg ccc gac acc cac ggc ctg cgc aac tgg agg gtc ctg acg ctc ctg

gga cag atg agg aga ctc tcc gcc ggc tct tgt gac cac tac acc aat gac ttt

gcc ttc ccc aag gag ctg ttt gat ggc cag cgg ctc cag gag gcg cag gcc ctc

tct gtg gtc cac gtg atg acc cag aag gtc ttc cac ctc ttc tgc ccg gac acg

tcc tct gct cct tgg aac atg act ctc ctg gag gaa ctg tgc tcg ggg ctc tct

gag cag ctg gat gac ctg gag gcc tgt ccc ctg cag gag gcg ggg ctg gcc gag

acc ccc ctc atg cat gag gac tcc acc ctg agg acc tac ttc caa agg atc tcc

ctc tac ctg caa gac agg aac cac agc ccg tgt gcc tgg gag atg gtc cga gca

gaa atc ggg aga tcc ttc ttc tcc tcg aca atc ttg caa gaa aga atc agg agg

agg aaa

CHLPDTHGLRNWRVLTLLGQMRRLSAGSCDHYTNDFAFPKELFDGQRLQEAQALSVVHV

MTQKVFHLFCPDTSSAPWNMTLLEELCSGLSEQLDDLEACPLQEAGLAETPLMHEDSTLR

TYFQRISLYLQDRNHSPCAWEMVRAEIGRSFFSSTILQERIRRRK

犬干扰素γ核苷酸序列和氨基酸序列

cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa aac cta aag gaa tat ttt aat gca agt

aat cca gat gta tcg gac ggt ggg tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg

aga gag gag agt gac aaa aca atc att cag agc caa att gtc tct ttc tac ttg

aaa ctg ttt gac aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc

atc aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta aat agc agc acc agt aag agg gag

gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc cag cgc aag

gcg ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca cca aga tcc aac cta

agg aag cgg aaa agg agt cag aat ctg ttt cga ggc cgc aga gca tcg aaa

QAMFFKEIENLKEYFNASNPDVSDGGSLFVDILKKWREESDKTIIQSQIVSFYLKLFDNFK

DNQIIQRSMDTIKEDMLGKFLNSSTSKREDFLKLIQIPVNDLQVQRKAINELIKVMNDLSPR

SNLRKRKRSQNLFRGRRASK