共表达PRRSV ORF3及ORF5双基因核酸疫苗的制备方法

摘要

本发明提供一种共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF3及ORF5双基因核酸疫苗的制备方法，该方法是通过RT－PCR方法分别扩增PRRSV ORF3及ORF5的全基因序列，并将2个基因插入哺乳动物真核表达载体pIRES的2个多克隆位点，获得重组质粒S－W－PIRES。将重组质粒转染COS1细胞，通过RT－PCR方法检测到PRRSV ORF3及ORF5基因的转录，通过免疫组化检测到目的蛋白的瞬间表达。该核酸疫苗可在动物体内持续不断的产生GP3蛋白及GP5蛋白，使机体不断产生针对两者的抗体及细胞免疫反应，对猪体提供持久的免疫保护力，在PRRS的防控中具有广阔的应用前景。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种生物技术高新科技领域，共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF3及ORF5双基因核酸疫苗，用于对猪提供针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫保护作用。

(二)背景技术

猪繁殖与呼吸综合征可引起妊娠母猪流产、死产等繁殖障碍和仔猪呼吸道症状。自2006年6月初以来，在我国湖北、湖南、江西、安徽等十几个省份相继出现高致病性PRRSV为主要病原的猪“无名高热综合征”，给我国的养猪业造成了严重的经济损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒为单股正链RNA病毒，长约15kb。ORF3编码分子量为40～50ku的糖蛋白GP3，GP3在猪体内并不能刺激产生中和抗体，但它可通过细胞免疫为母猪提供一定的保护；ORF5编码约25ku的糖蛋白GP5，能诱导机体产生中和抗体及特异性细胞免疫。目前用于预防PRRS的弱毒苗和灭活苗已在我国广泛应用，但是猪繁殖与呼吸综合征仍未得到有效控制。核酸疫苗可将病毒保护性抗原的基因以质粒的方式导入动物体，其表达蛋白既可刺激产生体液免疫又可产生细胞免疫，本发明中将PRRSV ORF3及ORF5基因同时插入真核重组表达载体构建的核酸疫苗尚未见报道。

(三)发明内容

本发明的目的是研制一种能够有效控制猪繁殖与呼吸综合征的共表达PRRSV ORF3及ORF5双基因的核酸疫苗，使猪繁殖与呼吸综合征难以防治的现状得以突破。

本发明的目的是这样实现的：

在哺乳动物真核表达载体的2个多克隆位点中分别插入了PRRSV ORF3及ORF5完整基因，获得共表达PRRSV ORF3及ORF5双基因的核酸疫苗，该核酸疫苗可在哺乳动物细胞中同时表达PRRSV的GP3及GP5蛋白。

上述核酸疫苗通过以下方法构建而成：

1)ORF3及ORF5的扩增

根据PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332的基因序列，设计了针对PRRSV山东省分离株SD1株ORF3及ORF5的引物，引物序列如下：

ORF3的引物S1：5’-ATCGCTAGCCGCCACCATGGTTAATAGCTGTA-3’

S2：5’-GAGGAATTCAGAAGAATGTAAATAATTCTCATCTG-3’

预期扩增长度为852bp。

ORF5的引物W1：5’-AATCTAGAGCCGCCACCATGTTGGA-3’

W2：5’-GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3’

预期扩增长度为702bp。

以SD1株的cDNA为模板，通过引物S1及S2扩增ORF3，通过W1及W2扩增ORF5基因。

2)S-W-PIRES真核重组表达载体的构建

将ORF5的PCR产物W片段与pIRES重组质粒经Xba I和Not I双酶切，将ORF5插入pIRES，构建W-pIRES重组质粒。将W-pIRES及ORF3的PCR产物S片段经EcoR I和Nhe I双酶切后，将ORF3的PCR产物S片段插入W-pIRES，构建S-W-PIRES真核重组表达载体。

3)S-W-PIRES真核重组质粒的转染

将S-W-PIRES转染COS1细胞，通过RT-PCR检测ORF3及ORF5的转录情况，通过免疫组化检测目的蛋白的表达情况。上述试验均证明了目的基因的转录及目的蛋白的表达。

4)S-W-PIRES真核重组质粒的动物试验

将S-W-PIRES质粒免疫小鼠及猪，同时设空载体PIRES及生理盐水对照组，检测核酸疫苗免疫后动物体内针对GP3及GP5的ELISA抗体、中和抗体及淋巴细胞增殖反应。上述试验均证明了核酸疫苗S-W-PIRES在动物体内均可刺激产生针对GP3及GP5的抗体，中和抗体效价可达1∶18.4以上，淋巴细胞增殖能力明显高于对照组。

该核酸疫苗首次在哺乳动物细胞真核表达载体中插入了PRRSV ORF3及ORF5基因，突破了PRRSV常规灭活疫苗及弱毒疫苗的局限性，避免了弱毒疫苗使用后毒力返强情况的发生，弥补了灭活疫苗免疫后不能产生细胞免疫的缺陷，又可使针对GP5的抗体优先产生，改变了PRRSV感染后针对GP5的中和抗体产生慢而且产生量少的不足。该核酸疫苗可在动物体内持续不断的产生GP3蛋白及GP5蛋白，使机体不断产生针对两者的体液免疫及细胞免疫，对猪体提供持久的免疫保护力，在PRRS的防控中具有广阔的应用前景。

4、实施例

1)PCR引物设计合成

根据PRRSV SD1株的序列及真核表达载体PIRES多克隆位点设计分别针对ORF3和ORF5的引物，由上海博亚生物公司合成。

ORF3的引物S1：5’-ATCGCTAGCCGCCACCATGGTTAATAGCTGTA-3’

S2：5’-GAGGAATTCAGAAGAATGTAAATAATTCTCATCTG-3’

预期扩增长度为852bp。

ORF5的引物W1：5’-AATCTAGAGCCGCCACCATGTTGGA-3’

W2：5’-GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3’

预期扩增长度为702bp。

2)病毒RNA的提取

将PRRSV SD1株接种Marc-145细胞，当细胞出现75％左右病变并开始脱落时，冻融3次收集病毒液，用Trizol试剂盒提取病毒总RNA，操作方法按说明书进行。

3)反转录

取提取的RNA 7μL，Oligo(dT)1μL 70℃作用10min，后于冰上加入5×buffer4μL、dNTP Mixture 3μL、RNase Inhibitor 1μL、ddH₂O 3μL、M-MLV 1μL，42℃水浴1h。以此合成的cDNA为模板进行PCR反应。

4)PCR扩增

以PRRSV SD1株cDNA为模板进行PCR扩增，通过引物S1及S2扩增ORF3，通过W1及W2扩增ORF5基因。10×PCR Buffer 5μL，25pmol及L上、下游引物各2μL，10mmol及L dNTPs 4μL，1∶200稀释的质粒模板2μL，ddH₂O 34μL，Taq E 1μL。95℃预变性5min，循环参数为94℃ 1min，退火温度下(ORF3、ORF5片段的退火温度分别为58.7℃、59.6℃)1min，72℃ 1min，30个循环后72℃延伸8min。全部反应结束后取5μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检查。针对ORF3及ORF5的PCR产物分别命名为S片段及W片段。

5)真核表达载体的构建

将上述PCR产物经UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收。将真核表达载体PIRES及W片段分别经XbaI+NotI双酶切。酶切产物经UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收。将经XbaI+NotI双酶切的PIRES回收片段与相应酶切的W片段经T4 DNA ligase连接，16℃过夜。将连接产物转化DH5α感受态细胞，将菌液在Amp及LB平板上涂布，37℃培养16h进行筛选。挑取克隆摇菌后提取质粒，进一步对所提质粒进行酶切及PCR鉴定，构建W-PIRES真核表达载体。将鉴定正确的W-PIRES重组质粒及S片段再分别经过NheI+EcoRI双酶切，按上述相同的方法连接，构建S-W-PIRES真核双表达载体。鉴定正确的克隆摇菌后送上海博亚公司测序。

6)COS1细胞的转染

将构建成功的S-W-PIRES真核表达载体阳性克隆接种Amp及LB，碱裂解法质粒大抽提，检测所提质粒DNA无RNA且超螺旋比例多于50％时用于转染。COS1细胞长至80％汇合时进行转染，操作按转染试剂盒说明书进行。转染后72h进行检测。

7)RT-PCR鉴定转染后细胞系中PRRSV基因的转录

用Invitrogen公司的Trizol Reagent提取细胞总RNA，用12.5μL DEPC水溶解。RNA用于进行反转录，反应体系为20μL，其中模板RNA溶液12.5μL，5×buffer 4μL，10mmol及L dNTPs Mixture 1μL，RNase Inhibitor 0.5μL，下游引物1μL，AMV RNase 1μL。混匀后室温放置10min，然后转入42℃恒温槽中保温1h最后冰浴2min。将反转录产物进一步用于PCR反应，反应条件同4。全部反应结束后取5μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检查。分别用针对ORF3及ORF5的引物所进行的RT-PCR都可扩增出特异性条带，大小与预期大小相近。

8)免疫组化检测瞬间表达情况

将合适浓度的细胞涂于载玻片上，晾干后，95％乙醇固定10min，PBS洗涤1次，晾干后4℃保存备用。检测时于细胞片上滴加含0.3％ H₂O₂的80％-100％甲醇溶液，室温封闭内源性过氧化物酶30min，0.25％Triton-100室温作用10min，PBS洗3次，用1％BSA室温封闭20min，加入1％BSA稀释的1∶100的PRRSV阳性猪血清，4℃过夜。PBS洗3次，再滴加1∶100稀释的HRP标记的兔抗猪IgG，37℃孵育30min。PBS洗3次，再用50mM Tris-HCl(pH7.5)洗5min，加入DAB显色液室温3-10min，以出现棕色细胞而背景无非特异性染色为度，用去离子水冲洗中止显色，观察。可检出染成棕色的阳性细胞，而正常细胞及对照质粒PIRES转染的细胞成阴性，镜检看不到染成棕色的细胞。

9)核酸疫苗的小鼠试验

用碱裂解法提取PIRES、S-W-PIRES真核表达质粒，测定OD₂₆₀及OD₂₈₀，计算DNA含量＝OD₂₆₀×50μg及mL×稀释倍数，调整为1μg及μL。试验动物为5周龄、体重20～22g的BALB及c小鼠，随机分为3组，每组15只，在小鼠的后腿两侧进行注射免疫。第一组：100μL S-W-PIRES；第二组：注射PIRES对照100μL；第三组：注射100μL PBS作为空白对照。首免与二免之间间隔2周，二免与三免之间间隔4周，三免后4周宰杀。每隔2周采集血清，分别用GP3、GP5做为抗原进行ELISA检测；进行取宰杀后的血清进行中和抗体检测。在二免后4周及三免后4周每组宰杀6只，分离脾脏淋巴细胞，进行淋巴细胞增殖测定。二免后2周，抗GP3蛋白及抗GP5蛋白的血清效价开始明显上升；S-W-PIRES组中和抗体效价可达1∶32；S-W-PIRES免疫组淋巴细胞增殖能力明显高于PIRES空载体免疫组及PBS免疫组。

10)核酸疫苗的猪体试验

用碱裂解法提取PIRES、S-W-PIRES真核表达质粒，测定OD₂₆₀及OD₂₈₀，计算DNA含量＝OD₂₆₀×50μg及mL×稀释倍数，调整为1μg及μL。选用一月龄血清学检测PRRS阴性大白仔猪24头，随机分为3组，饲养管理条件相同。两后肢肌肉及耳背部皮内注射DNA疫苗。分组情况如下：第一组注射400μgS-W-PIRES；第二组注射空白质粒PIRES对照；第三组注射PBS作为空白对照。首免与二免之间间隔2周，二免与三免之间间隔2周。自首免后每间隔2周采血一次，采用前腔静脉采血，共4次。血清进行PRRSV抗体的ELISA检测及中和抗体检测。在二免后2周及三免后2周采血分离外周血脾淋巴细胞，进行淋巴细胞增殖试验。二免后2周，抗GP3蛋白及抗GP5蛋白的血清效价开始明显上升；S-W-PIRES组中和抗体效价可达1∶18.4；S-W-PIRES免疫组淋巴细胞增殖能力明显高于PIRES空载体免疫组及PBS免疫组。