从败酱草中精确提取抗病毒的败酱草多糖的方法

摘要

从败酱草中精确提取抗病毒的败酱草多糖的方法，它涉及一种提取抗病毒的败酱草多糖的方法。本发明解决了现有技术提取的败酱草多糖存在含有对抗病毒无效的蛋白质成分及核酸的问题。本发明从败酱草中提取有效抗病毒部位的败酱草多糖的方法按如下步骤进行：一、配制溶液；二、除去蛋白；三、重复步骤二；四、加入乙醇沉淀；四、层析，抽滤；即得到败酱草中抗病毒有效部位的败酱草多糖。本发明提取的抗病毒有效部位的败酱草多糖不含对抗病毒无效的蛋白成分及核酸，抗病毒效果明显，安全性高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取抗病毒的败酱草多糖的方法。

背景技术

2004年07月28日在中国公开的专利号为ZL03100182.3的专利《败酱草中抗呼吸道合胞病毒物质的提取方法》对败酱草的提取虽然能够得到败酱草抗呼吸道合胞病毒的有效部位，但其是个粗提物，含有对抗病毒无效的蛋白成分及核酸，不利于对败酱草多糖的药效学研究以及药物的临床应用。

发明内容

本发明为了解决现有技术提取的败酱草多糖存在含有对抗病毒无效的蛋白质成分及核酸的问题，而提供一种从败酱草中精确提取抗病毒的败酱草多糖的方法。

本发明的从败酱草中精确提取抗病毒的败酱草多糖的方法按如下步骤进行：一、将从败酱草中提取的粗提洗脱物用蒸馏水溶解成浓度为80～120mg/mL的洗脱物溶液；二、加入洗脱物溶液体积1/6～1/4的氯仿和洗脱物溶液体积1/18～1/12的正丁醇，震荡15～30min，再将混合液以3500～4000r/min的速度离心12～18分钟，除去交界处的变性蛋白和下层混浊液；三、将上层水溶液重复步骤二的操作3～7次，得到脱蛋白溶液；四、加入脱蛋白溶液体积5倍、质量浓度为95％的乙醇进行沉淀，再静置8～14小时，分离沉淀和上清液；五、取沉淀用蒸馏水溶解后重复步骤四的操作5次，收集沉淀并将沉淀用冷冻干燥机抽滤成粉末，再用蒸馏水溶解成浓度为1g/mL的溶液，将溶液上样于大孔树脂柱上，用蒸馏水以5.00mL/min流速进行洗脱，将精提洗脱物进行减压浓缩至败酱草多糖的浓度大于1g/mL，将浓缩液用冷冻干燥机抽滤成粉末；即得到抗病毒的败酱草多糖；步骤一中的从败酱草中提取粗提洗脱物的方法和步骤按照专利ZL03100182.3的方法操作。

本发明的提取出的败酱草多糖经紫外波谱扫描和高效液相色谱测试分析发现其不含对抗病毒无效的蛋白质和核酸。本发明提取的败酱草多糖经过细胞培养的方法在Hela细胞上做的体外试验而得到半数中毒浓度(TC₅₀)为10.89mg/ml，半数有效浓度(EC₅₀)为0.0801mg/ml，治疗指数(TI)为135.95，说明本发明提取的败酱草多糖药物安全性大。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的从败酱草中精确提取抗病毒的败酱草多糖的方法按如下步骤进行：一、将从败酱草中提取的粗提洗脱物用蒸馏水溶解成浓度为80～120mg/mL的洗脱物溶液；二、加入洗脱物溶液体积1/6～1/4的氯仿和洗脱物溶液体积1/18～1/12的正丁醇，震荡15～30min，再将混合液以3500～4000r/min的速度离心12～18分钟，除去交界处的变性蛋白和下层混浊液；三、将上层水溶液重复步骤二的操作3～7次，得到脱蛋白溶液；四、加入脱蛋白溶液体积5倍、质量浓度为95％的乙醇进行沉淀，再静置8～14小时，分离沉淀和上清液；五、取沉淀用蒸馏水溶解后重复步骤四的操作5次，收集沉淀并将沉淀用冷冻干燥机抽滤成粉末，再用蒸馏水溶解成浓度为1g/mL的溶液，将溶液上样于大孔树脂柱上，用蒸馏水以5.00mL/min流速进行洗脱，将精提洗脱物进行减压浓缩至败酱草多糖的浓度大于1g/mL，将浓缩液用冷冻干燥机抽滤成粉末；即得到抗病毒的败酱草多糖；步骤一中的从败酱草中提取粗提洗脱物的方法和步骤按照专利ZL03100182.3的方法操作。

专利ZL03100182.3从败酱草中提取出粗提洗脱物的方法按如下步骤进行：将败酱草1kg用自来水清洗5次，用蒸馏水清洗3次，7000mL蒸馏水浸泡12小时，于100℃煮沸90分钟后用脱脂棉过滤，药渣加5000mL蒸馏水于100℃煮沸90分钟，用脱脂棉过滤，将两次滤液混合，混合滤液减压浓缩，浓缩到浓度为1g/mL(每mL含生药1g)。然后用水醇法制备乙醇沉淀物，向浓缩的水提液(1g/mL)中缓慢加入95％的乙醇，并不断搅拌，直至乙醇体积达到20％～90％后，于4℃温度下放置12小时，于3500转/分离心10分钟，过滤收集沉淀，将乙醇沉淀物加水溶解后，加在预处理好的大孔吸附树脂柱顶端，用水洗脱，洗脱液减压浓缩，干燥，得粗提洗脱物。

本实施方式步骤五的冷冻干燥机为日本的YAMATO冷冻干燥机，型号为Freeze Dryer DC400/800。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一中将从败酱草中提取的粗提洗脱物用蒸馏水溶解成浓度为90～110mg/mL的洗脱物溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一中将从败酱草中提取的粗提洗脱物用蒸馏水溶解成浓度为100mg/mL的洗脱物溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中加入洗脱物溶液体积1/5的氯仿。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中加入洗脱物溶液体积1/16～1/14的正丁醇。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中加入洗脱物溶液体积1/15的正丁醇。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中将混合液以3600～3900r/min的速度离心14～16分钟。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中将混合液以3800r/min的速度离心15分钟。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤四中加入乙醇后静置10～12小时。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤四中加入乙醇后静置9小时。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤五中将精提洗脱物进行减压浓缩至败酱草多糖的浓度为1.2g/mL。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤三中将上层水溶液重复步骤二的操作4～6次。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤三中将上层水溶液重复步骤二的操作5次。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中震荡20～25min。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中震荡22min。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤五中用沉淀体积1.5～3倍的蒸馏水溶解沉淀。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式十七：本实施方式的从败酱草中精确提取抗病毒的败酱草多糖的方法按如下步骤进行：一、将从败酱草中提取的粗提洗脱物用蒸馏水溶解成浓度为100mg/mL的洗脱物溶液；二、加入洗脱物溶液体积1/5的氯仿和洗脱物溶液体积1/1 5的正丁醇，震荡20min，再将混合液以3500r/min的速度离心15分钟，除去交界处的变性蛋白和下层混浊液；三、将上层水溶液重复步骤二的操作5次，得到脱蛋白溶液；四、加入脱蛋白溶液体积5倍、质量浓度为95％的乙醇进行沉淀，再静置12小时，分离沉淀和上清液；五、取沉淀并用沉淀体积2倍的蒸馏水溶解沉淀，再重复步骤四的操作5次，收集沉淀并将沉淀用冷冻干燥机抽滤成粉末，再用蒸馏水溶解成浓度为1g/mL的溶液，将溶液上样于大孔树脂柱上，用蒸馏水以5.00mL/min流速进行洗脱，将精提洗脱物进行减压浓缩至败酱草多糖的浓度为1.1g/mL，将浓缩液用冷冻干燥机抽滤成粉末；即得到抗病毒的败酱草多糖；步骤一中的从败酱草中提取粗提洗脱物的方法和步骤按照专利ZL03100182.3的方法操作。

本实施方式提取的抗病毒有效部位的败酱草多糖进行Kruskal-Wallis检验法比较各剂量组与病毒对照组细胞病变程度，其结果如表1所示；本实施方式提取的抗病毒有效部位的败酱草多糖进行Kruskal-Wallis检验法比较不同给药时间各药物组与病毒对照组细胞病变程度，其结果如表2所示。

表1  不同剂量的败酱草多糖及病毒唑对呼吸道合胞病毒的增殖抑制作用

  组别  剂量  (mg/ml)       每孔CPE  平均  CPECPE抑制程度         累积CPE病变抑制率(％)  检验结果CPE抑制程度    CPE  败  酱  草  多  糖  1.560 0 0 0 0 0.00 4.00 21.50    0.00    100.00    ※※※※  0.780 0 0 0 1 0.25 3.75 17.50    0.25    98.59    ※※※※  0.390 1 0 0 1 0.50 3.50 13.75    0.75    94.83    ※※※※  0.195 1 1 1 1 1.00 3.00 10.25    1.75    85.42    ※※※※  0.098 1 1 1 1 1.00 3.00 7.25    2.75    72.50    ※※※※  0.049 2 2 1 2 1.75 2.25 4.25    4.50    48.57    ※※※※  0.024 3 2 2 3 2.50 1.50 2.00    7.00    22.22  0.012 4 3 3 4 3.50 0.50 0.50    10.50    4.55  病  毒  唑  0.6250 0 0 0 0 0.00 4.00 19.50    0.00    100.00    ※※※※  0.3125 0 0 1 0 0.25 3.75 15.50    0.25    98.41    ※※※※  0.1562 1 0 1 0 0.50 3.50 11.75    0.75    94.00    ※※※※  0.0781 2 1 1 2 1.50 2.50 8.25    2.25    78.57    ※※※※  0.0391 2 2 1 2 1.75 2.25 5.75    4.00    58.97    ※※※※  0.0190 2 2 2 3 2.25 1.75 3.50    6.25    35.90    ※※※※  0.0095 3 3 2 3 2.75 1.25 1.75    9.00    16.28  0.0048 4 3 4 3 3.50 0.50 0.50    12.50    3.85  正常  细胞  - 0 0 0 0 0.00 -  病毒  对照  - 4 4 4 4 4.00 -

表1中的CPE代表细胞病变效应，在“每孔CPE”一列中的，“0”表示无明显细胞病变，“1”表示为1％～25％的细胞病变，“2”表示为26％～50％的细胞病变，“3”表示为51％～75％的细胞病变，“4”表示为76％～100％的细胞病变；在“检验结果”一列中“※※※※”表示与病毒对照组相比P≤0.01。

表1说明，本实施方式提取的败酱草多糖的1.560mg/ml、0.780mg/ml、0.390mg/ml、0.195mg/ml、0.098mg/ml、0.049mg/ml各剂量组，病毒唑的0.625mg/ml、0.313mg/ml、0.156mg/ml、0.078mg/ml、0.039mg/ml、0.019mg/ml各剂量组具有明显的抑制呼吸道合胞病毒增殖的作用(P≤0.01)。采用Reed-Muench法计算本实施方式提取的败酱草多糖的EC₅₀为0.0801mg/ml，病毒唑的EC₅₀为0.036mg/ml；本实施方式提取的败酱草多糖治疗指数(TI＝TC₅₀/EC₅₀＝10.89/0.0801＝135.95)为135.95，病毒唑的TI为54.72。临床药理学规定临床用药治疗指数应该大于2，本实施方式提取的败酱草多糖的TI值为135.95，符合临床用药标准，并且本实施方式提取的败酱草多糖治疗指数明显高于ZL03100182.3的粗提洗脱物的治疗指数(ZL03100182.3的粗提洗脱物的TI为116.84)，表明本实施方式提取的败酱草多糖毒性进一步降低，中毒浓度与有效浓度距离加大，药物安全范围增宽，药物使用安全性越大。

表2  败酱草多糖不同时间给药与疗效的关系

组别加药时间    每孔CPE    程度CPE抑制率(％)组别加药时间  每孔CPE  程度CPE抑制率(％)败酱草98μg/mL    0h    2h    4h    6h    8h  1  1  2  2  2  1  1  1  1  2  1  2  2  2  1  1  1  1  2  2  84.00  71.43  51.35  26.47  26.47病毒唑50μg/mL    0h    2h    4h    6h    8h  0  0  1  1  1  0  0  1  1  1  0  0  1  1  1  0  1  1  1  1  100.00  98.02  87.80  72.73  52.00病毒对照细胞对照    -    -  3  0  4  0  4  0  4  0  ---    -    -  3  0  4  0  4  0  4  0  -  -

表2中的CPE代表细胞病变效应，在“每孔CPE程度”一列中的，“0”表示无明显细胞病变，“1”表示为1％～25％的细胞病变，“2”表示为26％～50％的细胞病变，“3”表示为51％～75％的细胞病变，“4”表示为76％～100％的细胞病变。

表2说明，本实施方式提取的败酱草多糖于感染后0h、2h、4h、6h加药，有抑制呼吸道合胞病毒作用(P＝0.001)；病毒唑组于感染后0h、2h、4h、6h、8h加药，均有抑制呼吸道合胞病毒作用(P≤0.01)。说明，本实施方式提取的败酱草多糖和病毒唑对呼吸道合胞病毒致细胞病变的抑制作用随时间的延长而减弱，进一步说明本实施方式提取的败酱草对呼吸道合胞病毒的抑制作用主要在病毒复制的早期。

将本实施方式提取的败酱草多糖进行紫外检测，在波长260、280nm未见核酸和蛋白质紫外吸收峰，这说明本实施方式提取的败酱草多糖不含有蛋白质和核酸。