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法律状态
2016-11-09
专利权的转移 IPC(主分类):C07K16/30 登记生效日:20161019 变更前: 变更后: 申请日:20060217
专利申请权、专利权的转移
2013-07-31
专利权的转移 IPC(主分类):C07K16/30 变更前: 变更后: 登记生效日:20130710 申请日:20060217
专利申请权、专利权的转移
2013-04-24
授权
授权
2008-06-04
实质审查的生效
实质审查的生效
2008-04-09
公开
公开
发明背景
前列腺病是男性发病率和死亡率的主要原因。对于前列腺癌的治 疗包括手术、激素、放射疗法和化学疗法。对于转移性前列腺疾病几 乎没有有效治疗。因此，代表诊断和预后标记的基因和/或基因产物 以及治疗靶标的鉴定是关键的。前列腺特异性抗原(PSA)是一种在 前列腺癌的临床诊断和分期中有用的这样的癌标记。但是，在4-10 ng/ml范围内PSA不能区别良性前列腺增生(BPH)和前列腺炎或者 前列腺癌，因此，需要细胞学和/或组织学评价来证实正确的诊断 (Barren，R.J.等人(1998)Prostate 36：181-188)。
前列腺特异性膜抗原(PSMA)是与转铁蛋白受体具有54％同源性 的大约110kD的II型跨膜糖蛋白，具有750个氨基酸。PSMA具有 三个结构域，包括一个19个氨基酸的胞内结构域，一个24个氨基酸 的跨膜结构域，和一个707个氨基酸的胞外结构域。PSMA蛋白质显 示神经羧肽酶和叶酸水解酶活性，据报道参与前列腺生长和分化的神 经内分泌调节(Heston，W.D.(1996)Urologe-Ausgabe A. 35：400-407)。PSM’是位于细胞质中的PSMA的一种可变剪接形式。
PSMA主要由前列腺上皮细胞表达。在前列腺癌中，特别是在低分 化的、转移的和激素难以治疗的癌中，PSMA的表达增加(Gregorakis， A.K.等人(1998)Seminars in Urologic Oncology 16：2-12； Silver，D.A.(1997)Clinical Cancer Research 3：85-515)。在 前列腺外组织例知小肠、唾液腺、十二指肠粘膜、近端肾小管和脑中 发现低水平PSMA表达(Silver，D.A.(1997)Clinical Cancer Research 3：85-515)。在一些恶性肿瘤(包括肾细胞癌和结肠癌)的 肿瘤外周和肿瘤内区域中的毛细血管的内皮细胞中也表达PSMA，但是 在正常组织的血管中不表达。另外，据报道PSMA与肿瘤血管生成相 关(Silver，D.A.(1997)Clinical Cancer Research 3：81-85)。 最近，已经证明PSMA在结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、肾癌和 黑素瘤中的肿瘤相关新血管系统的内皮细胞中表达(Chang，S.S. (2004)Curr Opin Investig Drugs 5：611-5)。
抗PSMA胞外域抗体已经描述(参见，例如，Liu，H.等人(1997) Cancer Res.57：3629-3634；Murphy，G.P.等人(1998)J.Urol. 160：2396-2401；Wang，S.等人(2001)Int.J.Cancer 92：871- 876；Kato，K.等人(2003)Int.J.Urol.10：439-444；美国专利 No.6,150,508和美国专利No.6,107,090)。最近，与PSMA结合的 人和人源化抗体已经描述(参见，例如，Bander，N.H.等人(2003) Semin.Oncol.30：667-676；PCT公布WO 02/098897；PCT公布WO 01/09192；PCT公布WO 03/064606；PCT公布WO 03/034903；和美 国申请No.2004/0033229)。这些抗体已经用于对前列腺癌细胞成像 (参见，例如，Yao，D.等人(2002)Semin.Urol.Oncol. 20：211-218；Bander，N.H.等人(2003)J.Urol.170：1717- 1721)。抗-PSMA抗体也已经在前列腺癌治疗中用于治疗性干预，一般 与化疗剂或放射性同位素联合使用(参见，例如，Nanus，D.M.等人 (2003)J.Urol.170：S84-89；Milowsky，M.I.等人(2004)J. Clin.Oncol.22：2522-2531；Henry，M.D.等人(2004)Cancer Res.64：7995-8001)。
有效治疗和/或预防PSMA表达相关疾病的改进的治疗性抗PSMA 抗体，特别是不需与化疗剂或放射性同位素偶联即具有细胞毒性效应 的抗体，是期望的。
发明内容
本发明提供分离的脱岩藻糖基化抗体(即缺乏岩藻糖残基的抗 体)，其可与人PSMA结合，并且与该抗体的非脱岩藻糖基化形式 (即含有岩藻糖残基的抗体)相比，表现出增强的对表达PSMA的细 胞的抗体引导的细胞毒性(ADCC)杀伤。还提供了使用本发明的抗 体和组合物治疗与PSMA表达有关的多种疾病的方法。
本发明的脱岩藻糖基化抗体与PSMA结合，并且与该抗体的岩藻 糖基化形式相比，在人效应细胞(例如单核细胞或单个核细胞)的存 在下通过增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)抑制表达PSMA的细胞的 生长。因此，本发明的抗体提供了治疗以PSMA表达为特征的疾病的 改进的手段。
因此，在一个方面，本发明涉及一种分离的抗前列腺特异性膜抗 原(PSMA)抗体，其缺乏岩藻糖残基。优选地，该抗体与含有岩藻糖残 基的抗体形式相比增强了表达细胞表面PSMA的细胞的抗体依赖性细胞 毒性。在优选的实施方案中，缺乏岩藻糖残基的抗体对LNCaP前列腺癌 细胞的ADCC活性的EC50为0.05μg/ml或更低，或0.04μg/ml或更低， 或0.03μg/ml或更低，或0.02μg/ml或更低，或大约0.018μg/ml或更 低。在其他优选的实施方案中，缺乏岩藻糖残基的抗体对LNCaP前列腺 癌细胞的ADCC活性的EC50比含有岩藻糖残基的抗体形式对LNCaP前列 腺癌细胞的ADCC活性的EC50至少低3倍(或者至少低4倍，或者至少 低5倍，或者至少低6倍)。
优选地，本发明的脱岩藻糖基化抗体为单克隆抗体。在一方面， 本发明涉及人源化或嵌合单克隆抗体。优选地，本发明的人源化或嵌 合抗体由选自3F5.4G 6、3D7.1.1、4E10-1.14、3E11、4D8、3E6、 3C9、2C7、1G3、3C4、3C6、4D4、1G9、5C8B9、3G6、4C8B9、E99、 J415、J533和J591的小鼠抗-PSMA抗体制备。在另一方面，本发明 涉及人单克隆抗体。
在一个优选实施方案中，人单克隆抗体包括人重链可变区和人轻 链可变区，其中：
(a)人重链可变区包含选自SEQ ID NO：1-9的氨基酸序列；
(b)人轻链可变区包含选自SEQ ID NO：10-18的氨基酸序列。
在各种实施方案中，优选以下的重链和轻链组合：
人重链可变区包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，且人轻链可变 区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列；
人重链可变区包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，且人轻链可变 区包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列；
人重链可变区包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，且人轻链可变 区包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列；
人重链可变区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，且人轻链可变 区包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列；
人重链可变区包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，且人轻链可变 区包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列；
人重链可变区包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，且人轻链可变 区包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列；
人重链可变区包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，且人轻链可变 区包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；
人重链可变区包含SEQ D NO：8的氨基酸序列，且人轻链可变 区包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列；
人重链可变区包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，且人轻链可变 区包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列。
在另一实施方案中，本发明的单克隆抗体包括：
(a)包含选自SEQ ID NO：19-27的氨基酸序列的人重链可变区 CDR1；
(b)包含选自SEQ ID NO：28-36的氨基酸序列的人重链可变区 CDR2；
(c)包含选自SEQ ID NO：37-45的氨基酸序列的人重链可变区 CDR3；
(d)包含选自SEQ ID NO：46-54的氨基酸序列的人轻链可变区 CDR1；
(e)包含选自SEQ ID NO：55-63的氨基酸序列的人轻链可变区 CDR2；和
(f)包含选自SEQ ID NO：64-72的氨基酸序列的人轻链可变区 CDR3。
在各种实施方案中，优选以下重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3的 组合：
(a)包含SEQ ID NO：19的人重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：28的人重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：37的人重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：46的人轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：55的人轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：64的人轻链可变区CDR3；
或
(a)包含SEQ ID NO：20的人重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：29的人重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：38的人重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：47的人轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：56的人轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：65的人轻链可变区CDR3；
或
(a)包含SEQ ID NO：21的人重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：30的人重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：39的人重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：48的人轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：57的人轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：66的人轻链可变区CDR3；
或
(a)包含SEQ ID NO：22的人重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：31的人重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：40的人重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：49的人轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：58的人轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：67的人轻链可变区CDR3；
或
(a)包含SEQ ID NO：23的人重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：32的人重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：41的人重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：50的人轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：59的人轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：68的人轻链可变区CDR3；
或
(a)包含SEQ ID NO：24的人重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：33的人重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：42的人重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：51的人轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：60的人轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：69的人轻链可变区CDR3；
或
(a)包含SEQ ID NO：25的人重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：34的人重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：43的人重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：52的人轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：61的人轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：70的人轻链可变区CDR3；
或
(a)包含SEQ ID NO：26的人重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：35的人重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：44的人重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：53的人轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：62的人轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：71的人轻链可变区CDR3；
或
(a)包含SEQ ID NO：27的人重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：36的人重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：45的人重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：54的人轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：63的人轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：72的人轻链可变区CDR3。
在另一方面，本发明提供一种脱岩藻糖基化人抗-PSMA抗体，其 包含产自或来源于人VH5-51或VH3-30.3基因的重链可变区。本发 明还提供一种脱岩藻糖基化人抗-PSMA抗体，其包含产自或来源于人 VkL6、04/014或L18基因的轻链可变区。本发明还提供一种脱岩藻糖 基化人抗-PSMA抗体，其包含产自或来源于人VH5-51或VH3-30.3基 因的重链可变区，和产自或来源于人VkL6、04/014或L18基因的轻 链可变区。
另一方面，本发明涉及一种嵌合鸡，其包含编码抗-PSMA抗体的 免疫球蛋白重链和轻链基因，使得在该嵌合鸡的鸡蛋中表达抗-PSMA 抗体，其中在该嵌合鸡的鸡蛋中表达的抗-PSMA抗体缺乏岩藻糖残 基。优选地，该免疫球蛋白重链和轻链基因是人免疫球蛋白重链和轻 链基因。
另一方面，本发明涉及包含编码抗-PSMA抗体的免疫球蛋白重链 和轻链基因的宿主细胞，其中所述宿主细胞缺乏岩藻糖基转移酶，使 得所述宿主细胞表达的抗-PSMA抗体缺乏岩藻糖残基。优选地，该免 疫球蛋白重链和轻链基因是人免疫球蛋白重链和轻链基因。优选地， 该岩藻糖基转移酶是FUT8。优选地，该宿主细胞是CHO细胞。
另一方面，本发明提供一种抑制PSMA+细胞生长的方法。该方法 包括使所述细胞与脱岩藻糖基化抗-PSMA抗体在足以诱导所述细胞的 抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的条件下接触。所述细胞可以是，例如 肿瘤细胞。优选地，所述抗-PSMA抗体是人抗体。
本发明还提供一种抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，其中该肿 瘤细胞或靠近该肿瘤细胞的血管内皮细胞表达PSMA。该方法包括给受 试者施用有效抑制受试者中肿瘤细胞生长的量的脱岩藻糖基化抗- PSMA抗体。优选地，所述抗-PSMA抗体是人抗体。在优选实施方案 中，所述肿瘤细胞是前列腺癌肿瘤细胞。
本发明的其他特征和优点通过下面的详述和实施例将是显而易见 的，该详述和实施例不应理解为限制性的。贯穿本申请中引用的所有 参考文献、Genbank项、专利和公布的专利申请的内容均在此处特别 引入作为参考。
附图说明
图1显示4A3、7F12、8C12、8A11和16F9的重链可变区氨基酸 序列(分别为SEQ ID NOs：1-5)与人种系VH5-51氨基酸序列(SEQ ID NO：73)的比对。
图2显示4A3、7F12和8C12的轻链可变区氨基酸序列(分别为 SEQ ID NOs：10-12)与人种系VkL6氨基酸序列(SEQ ID NO：74)的 比对。
图3显示8A11和16F9的轻链可变区氨基酸序列(分别为SEQ ID NOs：13和14)与人种系Vk04/014氨基酸序列(SEQ ID NO：75)的比 对。
图4A显示1C3人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：78)和氨基酸序列(SEQ ID NO：9)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO： 27)、CDR2(SEQ ID NO：36)和CDR3(SEQ ID NO：45)区，并指出了 V、D和J的种系来源。
图4B显示1C3人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：82)和氨基酸序列(SEQ ID NO：18)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：54)、CDR2(SEQ ID NO：63)和CDR3(SEQ ID NO：72)区，并指出 了V和J的种系来源。
图5A显示2A10人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：79)和氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO： 24)、CDR2(SEQ ID NO：33)和CDR3(SEQ ID NO：42)区，并指出了V 和J的种系来源。
图5B显示2A10人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：83)和氨基酸序列(SEQ ID NO：15)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：51)、CDR2(SEQ ID NO：60)和CDR3(SEQ ID NO：69)区，并指出 了V和J的种系来源。
图6A显示2C6人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：80)和氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO： 25)、CDR2(SEQ ID NO：34)和CDR3(SEQ ID NO：43)区，并指出了 V、D和J的种系来源。
图6B显示2C6人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：84)和氨基酸序列(SEQ ID NO：16)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：52)、CDR2(SEQ ID NO：61)和CDR3(SEQ ID NO：70)区，并指出 了V和J的种系来源。
图7A显示2F5人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：81)和氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO： 26)、CDR2(SEQ ID NO：35)和CDR3(SEQ ID NO：44)区，并指出了 V、D和J的种系来源。
图7B显示2F5人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：85)和氨基酸序列(SEQ ID NO：17)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：53)、CDR2(SEQ ID NO：62)和CDR3(SEQ ID NO：71)区，并指出 了V和J的种系来源。
图8显示2A10、2C6和2F5的重链可变区氨基酸序列(分别为 SEQ ID NOs：6-8)与人种系VH5-51氨基酸序列(SEQ ID NO：73)的 比对。
图9显示1C3的重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：9)与人种系 VH3-30.3氨基酸序列(SEQ ID NO：76)和JH6b种系(SEQ ID NO：86) 的比对。
图10显示2C6的轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：16)与人种 系VkL6氨基酸序列(SEQ ID NO：74)和JK3种系(SEQ ID NO：87)的 比对。
图11显示1C3、2A10和2F5的轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：18、15、17)与人种系VkL18氨基酸序列(SEQ ID NO：77)和JK4 种系(SEQ ID NO：88)的比对。
图12是Ov7.5和Ov15表达载体的图示。标出了Ov的5’和3’调 节序列的位置。在该载体的3’末端包括由启动子(Cx)驱动的具有 EGFP和嘌呤霉素(Puro)的盒，该盒在所有细胞型中起作用，以利于被 稳定转染的cES细胞的分离和cES细胞对嵌合体贡献的鉴定。MAb盒 的细节在该图的下部示出。细黑线表示来源于人L和H链的内含子序 列或非翻译序列(尽管内含子序列在Ov15Mab7F12构建体中不存 在)。SiGVL：L链的信号肽的序列，VL：L链的V基因的序列。Cκ： κL链的恒定区的序列，IRES：内部核糖体进入序列，SiGVH：H链的信 号肽的序列，VH：H链的V基因的序列，CH1、H、CH2和CH3：γ1H链的 CH1、铰链、CH2和CH3域的编码序列。
图13A-13B是通过MALDI TOF质谱法测定的在鸡蛋中表达的 7F12抗-PSMA抗体的寡糖结构的概况。黑色圆形表示甘露糖；空心圆 形表示己糖(甘露糖或半乳糖)，黑色正方形表示N-乙酰基葡糖胺。 垂直线表示最后一个己糖能够与甘露糖或N-乙酰基葡糖胺残基中的任 一个沿该线连接。
图14A-14B显示与同种型对照相比，使用CHO细胞表达的7F12 (“7F12”)和鸡表达的7F12的ADCC测定结果。结果表示为％裂解。图 14A显示使用IL-2刺激的效应细胞的结果。图14B显示使用新鲜人外 周血效应细胞的结果。
图15是显示实验结果的条图，其中与同种型对照相比，CHO细胞 表达的7F12(“7F12”)和鸡表达的7F12的ADCC活性被抗CD16抗体阻 断。
图16A-16C显示与岩藻糖基化2A10mAb(“亲本”)和同种型对照 相比，使用脱岩藻糖基化2A10mAb(“脱岩藻糖”)的ADCC测定结果。 图16A和16B代表使用LNCaP-C42b靶细胞和IL-2刺激的效应细胞的 两个独立的实验。图16C代表使用LNCaP-C42b靶细胞和新鲜人外周 血效应细胞的实验。
图17是与岩藻糖基化2A10mAb(“亲本”)和同种型对照或者无 抗体对照相比，脱岩藻糖基化2A10mAb(“脱岩藻糖”)的ADCC测定结 果的条图，其中ADCC活性被抗CD16抗体阻断。
发明详述
本发明提供用于治疗和诊断与PSMA表达和/或PSMA表达细胞有 关的多种疾病的抗体组合物和改进的基于抗体的治疗。本发明的抗体 在抗体的碳水化合物链上缺乏岩藻糖残基。此外，该抗体表现出增强 的对PSMA+细胞的抗体引导的细胞毒性(ADCC)杀伤。在一个具体实 施方案中，本发明的抗体是人源化或完全人抗体，并且特别可用于治 疗人类与PSMA表达细胞有关的疾病。本发明还包括使用缺乏岩藻糖 残基的抗-PSMA抗体进行治疗(例如治疗和/或预防与PSMA的表达有 关的疾病)的方法。
为了使本发明更容易理解，首先定义了一些术语。其他的定义在 发明详述内容中说明。
术语“前列腺特异性膜抗原”和“PSMA”在本文中可以互换使 用，包括细胞天然表达的并且保持与本文所述抗体4A3、7F12、 8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3结合的人PSMA的任何变 体、同种型和物种同源物。人PSMA蛋白的完整的氨基酸序列的 Genbank登录号为NP_004467。编码人PSMA蛋白的完整的cDNA序列 的Genbank登录号为NM_004476。
本文所用的术语“缺乏岩藻糖残基的抗体”和“脱岩藻糖基化抗 体”可以互换使用，是指抗体的碳水化合物部分不含岩藻糖残基或已 经从中除去岩藻糖残基的抗体。缺乏岩藻糖残基的抗体可以如下产 生，例如：在使岩藻糖残基不与抗体的碳水化合物链连接或者这种连 接最小化的细胞或表达系统中表达抗体，或者化学修饰该抗体以从碳 水化合物链上除去岩藻糖残基(例如用岩藻糖苷酶处理抗体)。因 此，术语“缺乏岩藻糖残基”和“脱岩藻糖基化”不受制备具有改变 的碳水化合物结构的抗体的机制所限制。
本文所用的术语“表达岩藻糖残基的抗体”和“岩藻糖基化抗 体”可以互换使用，是指抗体的碳水化合物部分含有岩藻糖的抗体。
术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细 胞、粒细胞和上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞 因子和补体)的作用，导致选择性损伤、破坏或从人体中清除侵入的 病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞，或(在自身免疫或病 理性炎症的情况下)正常人细胞或组织。
本文所用的术语“效应细胞”是指与免疫应答的效应阶段有关的 免疫细胞，效应阶段与免疫应答的识别和激活阶段相反。免疫细胞的 例子包括骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(例如B细胞和T细 胞，包括细胞毒性T细胞(CTL))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨 噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞、粒 细胞、肥大细胞和嗜碱性细胞。某些效应细胞表达特异性的Fc受体 并且行使特异性的免疫功能。在优选实施方案中，效应细胞能够诱导抗 体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，例如能够诱导ADCC的嗜中性粒 细胞。例如，表达FcR的单核细胞和巨噬细胞参与对靶细胞的特异性杀 伤和向免疫系统的其他部分呈递抗原，或者与呈递抗原的细胞结合。在 其他实施方案中，效应细胞能够吞噬靶抗原或靶细胞。效应细胞上特定 FcR的表达可以用诸如细胞因子等体液因子来调节。例如，已经发现G- CSF或GM-CSF可以上调FcαRI的表达。这种增强的表达提高了带有Fc αRI的细胞对靶标的效应功能。效应细胞能够吞噬或裂解靶抗原或靶 细胞。
“靶细胞”是指如下任意的细胞或病原体，将其从受试者(例如人 或动物)中消除是有益的，并且可以被本发明的组合物(例如抗体)靶 向。例如，靶细胞可以是表达或过量表达PSMA的细胞。
术语“抗体依赖性细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的细胞毒性 反应，其中具有结合的抗-PSMA抗体的PSMA+靶细胞被带有Fc受体的效 应细胞识别，随后裂解，而不需要补体的参与。
本文使用的术语“增强ADCC”(例如指细胞时)包括，在效应细 胞存在下(例如，靶细胞：效应细胞比为1∶50)，与接触岩藻糖基化 抗PSMA抗体的相同细胞的细胞杀伤相比，当接触缺乏岩藻糖残基的抗- PSMA抗体时，任何可测量的细胞裂解的增加，例如，细胞裂解增加至 少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、 200％、250％、300％或325％。
本文提到的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段 (即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键互相连 接在一起的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合 部分。每条重链由重链可变区(在此缩写为VH)和重链恒定区组成。重 链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在 此缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。 VH和VL区可进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，CDR散布在 被称为构架区(FR)的更加保守的区域中。每个VH和VL均由三个CDR和 四个FR组成，它们从氨基端向羧基端以如下顺序排列：FR1，CDR1， FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有可与抗原相 互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织 或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效 应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。
本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部 分”)是指保留与抗原(例如PSMA)特异性结合的能力的抗体的一个或 多个片段。已证明抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来行使。 术语抗体的“抗原结合部分”中所包括的结合片段的例子包括：(i) Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii) F(ab’)2片段，即包含在铰链区处通过二硫键连接的两个Fab片段的 双价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂 的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段 (Ward等(1989)Nature 341：544-546)；和(vi)分离的互补决定区 (CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码， 但是它们可以利用重组方法通过合成连接体连接在一起，该连接体使 它们能够制成一条蛋白质链，其中VL和VH区配对构成单价分子(称为 单链Fv(scFv)；参见，例如Bird等(1988)Science 242：423- 426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879- 5883)。这种单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。这 些抗体片段用本领域技术人员公知的常规技术获得，并用与完整抗体 相同的方法对这些片段的实用性进行筛选。
本文使用的术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、 产生或分离的所有人抗体，例如：(a)从对于人免疫球蛋白基因的转 基因或转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤(下文进一步 描述)中分离的抗体，(b)从经转化表达人抗体的宿主细胞如转染瘤 中分离的抗体，(c)从重组组合人抗体文库中分离的抗体，和(d)通过 包括将人免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的任何其他手段制 备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体具有其中构架区和 CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区。但是在某些实施方 案中，这些重组人抗体可以经历体外诱变(或者，当使用人Ig序列 的转基因动物时，经历体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区 的氨基酸序列尽管是来源于人种系VH和VL序列并与之相关的序列，但 可能不是在体内天然存在于人抗体种系的所有组成成分 (repertoire)中。
本文使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单 一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位 的单一结合特异性和亲和性。
本文使用的术语“人抗体”是指具有的可变区中构架区和CDR区 都来源于人种系免疫球蛋白序列的抗体。而且，如果该抗体含有恒定 区，则恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包 含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外 随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
术语“人单克隆抗体”是指表现单一结合特异性的抗体，其具有 其中构架区和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区。在一 个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与无限增 殖化细胞融合的B细胞，该B细胞从具有含人重链转基因和轻链转基 因的基因组的转基因非人动物(例如转基因小鼠)中获得。本文所用 的术语“人单克隆抗体”也包括通过重组手段制备、表达、产生或分 离的完全人抗体，例如：(a)从对于人免疫球蛋白基因的转基因或转 染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤(下文进一步描述)中 分离的抗体，(b)从经转化表达人抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的 抗体，(c)从重组组合人抗体文库中分离的抗体，和(d)通过包括将人 免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的任何其他手段制备、表 达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体具有其中构架区和CDR区均 来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区。但是在某些实施方案中，这 些重组人抗体可以经历体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因 动物时，经历体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸 序列尽管是来源于人种系VH和VL序列并与之相关的序列，但可能不是 在体内天然存在于人抗体种系的所有组成成分(repertoire)中。
本文使用的“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的 其他抗体的抗体(例如，与PSMA特异性结合的分离的抗体基本不含 与除PSMA以外的抗原特异性结合的抗体)。但是，与人PSMA的表 位、同种型或变体特异性结合的分离的抗体可以具有与诸如来自其他 物种的其他相关抗原(例如PSMA种同源物)的交叉反应性。而且， 分离的抗体可基本不含其他细胞材料和/或化学物质。在本发明的一 个实施方案中，具有不同特异性的“分离的”单克隆抗体的组合以确 定的组成组合。
术语“人源化抗体”是指其中来源于另外一种哺乳动物种(如小 鼠)的种系的CDR序列已经被移植到人构架序列上的抗体。在人构架 序列内也可以进行其它的构架区修饰。
术语“嵌合抗体”是指其中可变区序列来源于一个物种而恒定区 序列来源于另一个物种的抗体，例如其中可变区序列来源于小鼠抗体 而恒定区序列来源于人抗体的抗体。
术语“表位”指能够与抗体特异性结合或被抗体特异性结合的 蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团组成，如氨基 酸或糖侧链，且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特 征。构象和非构象表位的区别在于当存在变性溶剂时与前者的结合 丧失，而与后者的结合不丧失。
本文所用的术语“特异性结合”是指抗体与预定的抗原结合。典 型地，抗体以10-7M或更低的解离常数(KD)结合，并且与预定抗原结 合的KD比与预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原(例如 BSA、酪蛋白)结合的KD至少低两倍。短语“识别抗原的抗体”和 “抗原特异性抗体”在此与术语“与抗原特异性结合的抗体”可互换 使用。
本文使用的术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类 别(例如IgM或IgG1)。
本文使用的术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的 核酸分子。一种载体类型是“质粒”，它是指环形双链DNA环，其中 可以连接另外的DNA片段。另一种载体类型是病毒载体，其中另外的 DNA片段可以连接到病毒基因组内。某些载体能够在它所导入的宿主 细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动 物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞 后可以整合到宿主细胞的基因组中，由此随宿主基因组一起复制。另 外，某些载体能够引导与它们有效连接的基因的表达。这些载体在本 文中被称为“重组表达载体”(或者简称为“表达载体”)。通常在 重组DNA技术中使用的表达载体常常为质粒形式。在本说明书中， “质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。 但是，本发明也包括其他形式的表达载体，如病毒载体(例如复制缺 陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，它们起等同的功能。
本文使用的术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)是指 已经导入了重组表达载体的细胞。应当理解，这些术语不仅指特定受试 者的细胞，而且指该细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰 可能在后代中发生，这些后代实际上可能与亲本细胞不同，但是仍然包 含在本文使用的术语“宿主细胞”中。重组宿主细胞包括，例如，CHO 细胞、转染瘤和淋巴细胞。
本文使用的术语“受试者”包括任何人或非人类动物。术语“非 人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人 灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖类动物、爬行类动物 等。
术语“转基因非人类动物”是指具有含有一种或多种人类重链和/ 或轻链转基因或转染色体(整合或者非整合到动物的天然基因组DNA 内)的基因组并且能够表达全人类抗体的非人类动物。例如，转基因小 鼠可能具有人轻链转基因和人重链转基因或人重链转染色体，使得该小 鼠在用PSMA抗原和/或表达PSMA的细胞免疫时产生人抗-PSMA抗体。 人重链转基因可以整合到小鼠的染色体DNA内，例如转基因(例如 HuMAb)小鼠，或者人重链转基因可以保持在染色体外，如WO 02/43478所述的转染色体(例如KM)小鼠。这些转基因和转染色体小 鼠通过经历V-D-J重组和同种型转换能够产生抗PSMA人单克隆抗体的 多种同种型(例如IgG、IgA和/或IgE)。
本发明的各个方面在下面的部分中进一步详细描述。
缺乏岩藻糖残基并且具有增强的ADCC活性的抗-PSMA抗体
本发明涉及与抗体的岩藻糖基化形式相比对表达PSMA的细胞具 有增强的抗体引导的细胞毒性(ADCC)的脱岩藻糖基化抗-PSMA抗体。 在一个优选实施方案中，例如在0.1μg/ml的抗体浓度和1∶100的 靶细胞∶效应细胞比例的条件下，与抗体的岩藻糖基化形式相比，本 发明的脱岩藻糖基化抗体在体外诱导增强的LnCaP前列腺癌细胞 (ATCC CRL-1740)的ADCC。优选地，使用的效应细胞是IL-2刺激的 来自人外周血的效应细胞(例如，1×106人外周血单核细胞与10U/ml 人IL-2在37℃下温育过夜)。优选地将抗体的脱岩藻糖基化形式与 从哺乳动物宿主细胞如CHO细胞中表达获得的岩藻糖基化形式进行比 较。
在优选实施方案中，抗体的脱岩藻糖化形式的ADCC活性的EC50为 0.05μg/ml或更低，更优选0.04μg/ml或更低，更优选0.03μg/ml或 更低，更优选0.02μg/ml或更低，更优选大约0.018μg/ml。在其他优 选的实施方案中，抗体的脱岩藻糖化形式的ADCC活性的EC50为 0.01μg/ml或更低，更优选0.009μg/ml或更低，更优选0.008μg/ml 或更低，更优选0.007μg/ml或更低，更优选0.005μg/ml或更低，更 优选0.002μg/ml。优选利用实施例4所述的测定法使用IL-2刺激的 效应细胞，或者利用实施例4所述的测定法使用新鲜的人外周血效应 细胞，测定ADCC活性的EC50。
在其他优选实施方案中，抗体的脱岩藻糖化形式的ADCC活性的 EC50比抗体的岩藻糖基化形式(例如CHO细胞表达的抗体形式)的EC50至少低3倍，更优选至少低4倍，更优选至少低5倍，更优选至少低6 倍，更优选至少低7倍，更优选至少低8倍，更优选至少低9倍，更 优选至少低10倍。另外，优选利用实施例4所述的测定法使用IL-2 刺激的效应细胞，或者利用实施例4所述的测定法使用新鲜的人外周 血效应细胞，测定ADCC活性的EC50。典型地，发现使用新鲜的人外周 血效应细胞获得的EC50(岩藻糖基化)∶EC50(脱岩藻糖基化)的比例 较高，但是发现使用新鲜的人外周血效应细胞获得的最大裂解百分比 较低。
本发明的脱岩藻糖基化抗体的增强的ADCC活性可以定量为，例 如，当对于脱岩藻糖基化和岩藻糖基化形式在相同条件下(例如相同 的抗体浓度和相同的靶细胞∶效应细胞比)测定ADCC活性时，与该 抗体的岩藻糖基化形式相比细胞裂解百分比的增加。另外或者可替代 地，本发明的脱岩藻糖基化抗体的增强的ADCC活性可以定量为，例 如，与岩藻糖基化形式相比，脱岩藻糖基化形式的EC50值降低所测定 的增加的功效。这可以根据岩藻糖基化形式与脱岩藻糖基化形式的 EC50的比例来定量。
可以在本发明的ADCC测定中使用并且本发明的脱岩藻糖基化抗 体比该抗体的岩藻糖基化形式对其表现出增强的ADCC活性的PSMA+细 胞系的例子包括LnCaP细胞、22Rv1细胞和/或PCa2b细胞。脱岩藻 糖基化抗-PSMA抗体获得的增强的ADCC效应可以导致，在使用该抗体 的岩藻糖基化形式观察不到ADCC的抗体浓度下，脱岩藻糖基化形式 对PSMA+细胞具有ADCC活性。
抗-PSMA抗体的脱岩藻糖基化
抗-PSMA抗体(例如鼠、嵌合、人源化和人抗体)是本领域公知 的，并且可以在本发明中使用。本发明的抗-PSMA抗体经过修饰，使 得该抗体缺乏岩藻糖残基。可以通过多种方法中的一种来制备缺乏岩 藻糖残基的抗体。例如，可以使用重组DNA技术在具有改变的糖基化 机制从而使岩藻糖残基向碳水化合物链上的添加受到抑制的细胞中表 达抗体。另外或者可替代地，可以通过化学去除岩藻糖残基而使抗体 脱岩藻糖基化。
另外，在一个优选实施方案中，该抗体可以在嵌合鸡表达系统中 表达，使得该抗体在嵌合鸡的鸡蛋中产生。在鸡蛋中表达抗-PSMA抗 体的嵌合鸡的产生在实施例1中详细描述，这种鸡蛋表达的抗-PSMA 抗体上缺乏岩藻糖残基在实施例3中得到证明。适用于在鸡蛋中表达 蛋白质的嵌合鸡在PCT公开WO 2004/015123中描述。因此，另一方 面，本发明涉及一种嵌合鸡，其含有编码抗-PSMA抗体的免疫球蛋白 重链和轻链基因，使得在嵌合鸡的鸡蛋中表达抗-PSMA抗体，其中在 嵌合鸡的鸡蛋中表达的抗-PSMA抗体缺乏岩藻糖残基。优选地，所述 免疫球蛋白重链和轻链基因是人免疫球蛋白重链和轻链基因。
在另一个实施方案中，在一种细胞中表达抗体，该细胞缺乏岩藻 糖基转移酶，从而使得该细胞系产生在其碳水化合物中缺乏岩藻糖的 蛋白质(见实施例5和6)。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺 乏岩藻糖基转移酶FUT8(α(1，6)岩藻糖基转移酶)，从而在 Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其碳水化合物中缺乏岩 藻糖。Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系是通过使用两种置换载体 在CHO/DG44细胞中定向破坏FUT8基因而产生的(参见，Yamane等人 的美国专利公开No.20040110704，和Yamane-Ohnuki等人.(2004) Biotechnol Bioeng 87：614-22)。作为另一个例子，Hanai等人的EP 1,176,195描述了一种细胞系，该细胞系的编码岩藻糖基转移酶的 FUT8基因被功能破坏，使得在这种细胞系中表达的抗体由于减少或消 除了α1，6键相关的酶而表现出低岩藻糖基化。Hanai等人也描述了天 然具有将岩藻糖添加到与抗体Fc区结合的N-乙酰葡糖胺上的低酶活 性或者不具有该酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了变异的CHO细胞 系Lec13细胞，其将岩藻糖添加到Asn(297)-连接的碳水化合物上的能 力降低，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(参见， Shields，R.L.等人.(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。 Umana等人的PCT公开WO 99/54342描述了表达糖蛋白修饰的岩藻糖基 转移酶的工程细胞系(例如β(1，4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III (GnTIII))，使得该工程细胞系中表达的抗体表现出增加的等分GlcNac 结构，导致抗体的ADCC活性增强(参见Umana等人.(1999)Nat. Biotech.17：176-180)。
在另一个实施方案中，表达抗-PSMA抗体，并且使用岩藻糖苷酶切 去岩藻糖残基。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体上除去岩藻 糖残基(Tarentino，A.L.等人.(1975)Biochem.14：5516-23)。
另外，在其他实施方案中，也修饰抗体的其他形式的糖基化。例 如，可以制备非糖基化的抗体(即缺乏糖基化的抗体)。这种碳水化合 物修饰可以通过(例如)改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实 现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，导致除去一个或多个可变 区构架糖基化位点，由此消除了该位点的糖基化。这种非糖基化可以增 强抗体对抗原的亲和力。这种方法在Co等人的美国专利Nos. 5,714,350和6,350,861中详细描述。
抗-PSMA抗体上不含岩藻糖残基的表征
本发明的抗体缺乏岩藻糖残基，例如，在Fc部分碳水化合物链 中。可以使用本领域公知的标准技术如APTS毛细管电泳激光诱导的 荧光法来检测抗体中岩藻糖残基的不存在。简要地说，可以通过加入 肽N-聚糖酶(Prozyme)并温育过夜来释放纯化的抗-PSMA抗体的N- 连接的寡糖。重悬浮碳水化合物，在脱唾液酸化和岩藻糖残基的丢失 最小的温和还原胺化条件下用8-氨基芘-1，3，6-三磺酸酯(APTS)衍生 化。使用激光诱导的荧光检测器(Beckman Coulter)通过毛细管电 泳分析反应加合物。根据电泳中与含有岩藻糖的相同抗体相比的位移 观察岩藻糖的不存在。检测抗-PSMA抗体上不含岩藻糖残基的另外一 种技术是使用HPLC的单糖分析。测定PSMA结合的合适的测定法在实 施例中进一步描述。分析抗体的碳水化合物含量和结构的其他技术包 括对表达的碳水化合物的MS序型分析(profiling)(糖组学)、对释 放的完整聚糖的直接MALDI-TOF分析(提供碳水化合物类别的质 量)、低CID MSMS谱(提供聚糖的结构组成)、高CID MSMS谱和 MSn谱(提供关于聚糖连接的信息)和序贯外切糖苷酶消化(提供聚 糖的结构连接信息)。检测抗体的碳水化合物含量的方法在实施例3 中详细描述。
PSMA+细胞的抗体依赖的细胞杀伤的表征
可以检测脱岩藻糖基化抗-PSMA抗体介导对表达PSMA的细胞的吞 噬和杀伤的能力。在一个实施方案中，当在相同浓度下比较时，脱岩 藻糖基化抗-PSMA抗体与含有岩藻糖的相同抗体相比增强了对表达 PSMA的细胞的杀伤。在另一实施方案中，脱岩藻糖基化抗-PSMA抗体 诱导对表达PSMA的细胞的杀伤，其中含有岩藻糖的相同抗体在相同 浓度下不诱导细胞杀伤。
单克隆抗体的ADCC活性可以利用建立的体外测定法检测。一个例 子是，可以采用铬释放ADCC测定。简要地说，来自健康供体的外周血 单核细胞(PBMC)或者其他效应细胞通过Ficoll Hypaque密度离心纯 化，然后裂解掺杂的红细胞。洗涤后的PBMC可以悬浮在含有10％热灭 活的胎牛血清的RPMI中，并以各种效应细胞：肿瘤细胞比例下与51Cr 标记的表达PSMA的细胞混合。然后加入各种浓度的抗-PSMA抗体。可 以使用同种型匹配的抗体作为阴性对照。测定可以在37℃下进行4-18 小时。通过测定51Cr向培养上清液中的释放来测定样品的细胞裂解。也 可以将抗PSMA单克隆抗体互相组合检测，以确定多种单克隆抗体是否 增强细胞裂解。
可以用于检测抗-PSMA抗体介导对表达PSMA的细胞的吞噬和杀伤 能力的一种替代测定法是时间分辨荧光测定。简要地说，向表达PSMA 的细胞加入荧光增强配体的乙酰氧基甲酯(BATDA)，BATDA穿透细胞 膜。在细胞内，酯键被水解，该化合物不再能够通过细胞膜。然后加入 各种浓度的抗-PSMA抗体。细胞裂解后，加入铕溶液(Perkin Elmer)， 任何游离的配体均与铕结合，形成高度荧光和稳定的螯合物(EuTDA)， 该螯合物可以用微孔板读数器(Perkin Elmer)读取。测定的信号与裂解 的细胞量相关。
用于检测本发明的抗-PSMA抗体的ADCC活性的优选ADCC测定法在 实施例4中详细描述。
抗-PSMA抗体也可以在体内模型(例如小鼠)上检测，以确定它们 介导对表达PSMA的细胞(例如肿瘤细胞)的吞噬和杀伤的能力。例 如，可以基于以下标准选择这些抗体，这些标准不是排除性的：
1)与表达PSMA的活细胞结合；
2)与PSMA结合的高亲和力；
3)与PSMA上的独特表位结合(以消除具有互补活性的单克隆抗体 在组合使用时竞争结合相同表位的可能性)；
4)被表达PSMA的细胞内化；
5)在人效应细胞存在下对表达PSMA的细胞的生长抑制、吞噬和/ 或杀伤的体外介导。
本发明优选的单克隆抗体满足这些标准中的一条或几条。在一个具 体实施方案中，单克隆抗体组合使用，例如作为含有两种或多种抗 PSMA单克隆抗体或其片段的药物组合物。例如，具有不同但是互补活 性的抗PSMA单克隆抗体可以在一种治疗中组合，以达到所需的治疗或 诊断效果。一种示例是如下一种组合物，其含有在效应细胞存在下介导 高效的靶细胞杀伤的抗-PSMA单克隆抗体，和抑制表达PSMA的细胞生 长的另一种抗PSMA单克隆抗体相组合。
与PSMA结合的表征
例如，通过本领域公知的标准测定，如ELISA、FACS分析和/或 Biacore分析，可以检测本发明的抗体与PSMA的结合。在典型的ELISA 测定中，简要地说，用在PBS中浓度为0.25μg/ml的纯化的PSMA包 被微孔板，然后用在PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。向每孔中加入抗 体稀释液，在37℃下温育1-2小时。用PBS/Tween洗板，然后与偶联 到碱性磷酸酶上的第二试剂(例如人抗体或山羊抗人IgG Fc-特异性多 克隆试剂)在37℃下一起温育1小时。洗涤后，板用pNPP底物(1 mg/ml)显色，并在OD 405-650下分析。
为了证明单克隆抗体与表达PSMA的活细胞的结合，可以使用流式 细胞术。在流式细胞术方案的一个典型(但非限定性的)实例中，表达 PSMA的细胞系(在标准生长条件下生长)与在含有0.1％BSA和20％小 鼠血清的PBS中的各种浓度的单克隆抗体相混合，并在37℃下温育1 小时。洗涤后，细胞与荧光素标记的第二抗体(例如抗人IgG抗体)在 与第一抗体染色相同的条件下反应。可以利用光散射和侧向散射性质通 过FACScan仪分析样品，来对单细胞画门(gate)。(除了或替代)流 式细胞测定，可以采用一种使用荧光显微镜的替代测定法。细胞可以完 全如上所述染色，并用荧光显微镜检测。该方法允许显示单个细胞，但 是根据抗原密度可能降低灵敏度。
可以进一步通过Western印迹法进一步检测抗-PSMA抗体与PSMA 抗原的反应性。例如，可以由表达PSMA的细胞制备细胞提取物，并进 行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原 转移到硝酸纤维素膜上，用20％小鼠血清封闭，并用待检测的单克隆抗 体探针结合。可以用与碱性磷酸酶连接的抗物种特异性第二抗体检测抗 体的结合，并用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO) 显色。评价抗体与PSMA结合能力的其他技术在本领域中公知，包括 RIA和Biacore分析。用来测定PSMA结合的合适的测定法在实施例4 中详细描述。
嵌合或人源化抗-PSMA抗体
在某些实施方案中，本发明的脱岩藻糖基化抗-PSMA抗体是嵌合或 人源化抗体。这些抗体可以用本领域中可以获得的小鼠抗-PSMA抗体和 建立的将小鼠抗体转化为嵌合或人源化抗体的程序来制备。这些小鼠 抗-PSMA抗体的非限定性例子包括3F5.4G6、3D7.1.1、4E10-1.14、 3E11、4D8、3E6、3C9、2C7、1G3、3C4、3C6、4D4、1G9、5C8B9、 3G6、4C8B9、E99、J415、J533和J591单克隆抗体。分泌3F5.4G6、 3D7.1.1、4E10-1.14、3E11、4D8、3E6、3C9、2C7、1G3、3C4、3C6、 4D4、1G9、5C8B9、3G6或4C8B9的杂交瘤已经公开保藏，并且在美国 专利No.6,159,508中记载。分泌E99、J415、J533或J591的杂交瘤 已经公开保藏，并且在美国专利No.6,107,090中记载。而且，人源化 抗-PSMA抗体，包括J591的人源化形式，在PCT公开WO 02/098897中 详细记载。此外，其他小鼠抗人PSMA抗体已经在本领域中描述，例如 mAb 107-1A4(Wang，S.等人.(2001)Int.J.Cancer 92：871-876) 和mAb 2C9(Kato，K.等人.(2003)Int.J.Urol.10：439-444)。
人单克隆抗-PSMA抗体
本发明优选的抗体包括人抗-PSMA单克隆抗体。人抗-PSMA单克隆 抗体的例子包括如最初由PCT公布WO 03/01/09192和WO 03/064606和 2005年2月18日提交的名称为“Human Monoclonal Antibodies to Prostate Specific Membrane Antigen(PSMA)”的美国临时申请No. 60/654,125(其内容引入本文作为参考)中所述分离并结构表征的 4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3抗体。4A3、 7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3的VH氨基酸序列分 别显示在SEQ ID NO：1-9中。4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、 2C6、2F5和1C3的VL氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：10-18中。可 以在本发明中使用的其他人抗-PSMA抗体包括在PCT公开WO 03/034903 和美国申请No.2004/0033229中公开的抗体。
假定这些抗体中的每一个都能够与PSMA结合，则VH和VL序列可以 “混合并匹配”，从而产生本发明的其他的抗-PSMA结合分子。PSMA与 这些“混合并匹配的”抗体的结合可以用本领域公知的结合试验(例如 FACS分析和ELISA测定)来检测。优选地，当VH和VL链混合并匹配 时，来自特定VH/VL配对的VH序列被替换为结构上相似的VH序列。同 样，优选地，来自特定VH/VL配对的VL序列被替换为结构上相似的VL序 列。例如，4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6和2F5的VH序 列特别适合混合并匹配，因为这些抗体使用来源于相同种系序列(VH5-51)的VH序列，因此它们表现出结构相似性。同样，4A3、7F12、 8C12和2C6的VL序列特别适合混合并匹配，因为这些抗体使用来源于 相同种系序列(VL L6)的VL序列，因此它们表现出结构相似性。同样， 8A11和16F9的VL序列特别适合混合并匹配，因为这些抗体使用来源 于相同种系序列(VL 04/014)的VL序列，因此它们表现出结构相似性。 同样，1C3、2A10和2F5的VL序列特别适合混合并匹配，因为这些抗体 使用来源于相同种系序列(VL L18)的VL序列，因此它们表现出结构相 似性。
在具体实施方案中，本发明提供脱岩藻糖基化的单克隆抗体或其 抗原结合部分，其包括：
(a)包含选自SEQ ID NO：1-9的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含选自SEQ ID NO：10-18的氨基酸序列的轻链可变区；
其中该抗体与人PSMA特异性结合。
优选的重链和轻链组合包括：
(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含 SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区；或
(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含 SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链可变区；或
(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含 SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区。
(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含 SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链可变区；或
(a)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含 SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区；或
(a)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含 SEQ ID NO：15的氨基酸序列的轻链可变区；或
(a)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含 SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区；或
(a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含 SEQ ID NO：17的氨基酸序列的轻链可变区；或
(a)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含 SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一方面，本发明提供包含4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、 2A10、2C6、2F5或1C3的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合 的脱岩藻糖基化抗体。4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、 2F5和1C3的VH CDR1的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：19-27 中。4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3的VHCDR2的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：28-36中。4A3、7F12、 8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3的VH CDR3的氨基酸序 列分别示于SEQ ID NO：37-45中。4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、 2A10、2C6、2F5和1C3的VK CDR1的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：46-54中。4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和 1C3的VKCDR2的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：55-63中。4A3、 7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3的VKCDR3的氨 基酸序列分别示于SEQ ID NO：64-72中。CDR区用Kabat系统 (Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)勾画出。
假如这些抗体均能与PSMA结合，并且抗原结合特异性主要是由 CDR1、CDR2和CDR3区提供的，则VH CDR1、CDR2和CDR3序列与VKCDR1、CDR2和CDR3序列可以“混合并匹配”(即来自不同抗体的 CDR可以混合并匹配，但是每个抗体必须含有VH CDR1、CDR2和CDR 3和VK CDR1、CDR2和CDR3)，产生本发明的其他的抗-PSMA结合 分子。PSMA与这些“混合并匹配的”抗体的结合可以用本领域公知的 结合试验(例如FACS分析、ELISA测定)检测。优选地，当VH CDR 序列混合并匹配时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列 被替换为结构上相似的CDR序列。同样，当VK CDR序列混合并匹配 时，来自特定VK序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选地被替换为 结构上相似的CDR序列。本领域技术人员容易理解，通过将一个或多 个VH和/或VLCDR区序列替换为来自本文公开的单克隆抗体4A3、 7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3的CDR序列的结 构上相似的序列，可以产生新的VH和VL序列。
因此，在另一个方面，本发明提供一种脱岩藻糖基化的单克隆抗 体或其抗原结合部分，其包括：
(a)包含选自SEQ ID NO：19-27的氨基酸序列的人重链可变区 CDR1；
(b)包含选自SEQ ID NO：28-36的氨基酸序列的人重链可变区 CDR2；
(c)包含选自SEQ ID NO：37-45的氨基酸序列的人重链可变区 CDR3；
(d)包含选自SEQ ID NO：46-54的氨基酸序列的人轻链可变区 CDR1；
(e)包含选自SEQ ID NO：55-63的氨基酸序列的人轻链可变区 CDR2；和
(f)包含选自SEQ ID NO：64-72的氨基酸序列的人轻链可变区 CDR3；
其中该抗体与PSMA特异性结合。
在一个优选实施方案中，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：19的人重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：28的人重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：37的人重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：46的人轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：55的人轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：64的人轻链可变区CDR3。
在另一优选实施方案中，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：20的人重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：29的人重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：38的人重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：47的人轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：56的人轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：65的人轻链可变区CDR3。
在另一优选实施方案中，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：21的人重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：30的人重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：39的人重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：48的人轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：57的人轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：66的人轻链可变区CDR3。
在另一优选实施方案中，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：22的人重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：31的人重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：40的人重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：49的人轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：58的人轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：67的人轻链可变区CDR3。
在另一优选实施方案中，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：23的人重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：32的人重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：41的人重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：50的人轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：59的人轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：68的人轻链可变区CDR3。
在另一优选实施方案中，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：24的人重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：33的人重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：42的人重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：51的人轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：60的人轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：69的人轻链可变区CDR3。
在另一优选实施方案中，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：25的人重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：34的人重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：43的人重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：52的人轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：61的人轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：70的人轻链可变区CDR3。
在另一优选实施方案中，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：26的人重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：35的人重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：44的人重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：53的人轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：62的人轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：71的人轻链可变区CDR3。
在另一优选实施方案中，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：27的人重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：36的人重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：45的人重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：54的人轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：63的人轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：72的人轻链可变区CDR3。
具有特定种系序列的抗体
在某些实施方案中，本发明的脱岩藻糖基化抗体包含来自特定种 系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球 蛋白基因的轻链可变区。
例如，在一个优选实施方案中，本发明提供一种脱岩藻糖基化的 单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或来源于人VH 5-51基因 的重链可变区，其中该抗体与人PSMA特异性结合。在另一优选实施 方案中，本发明提供提供一种脱岩藻糖基化的单克隆抗体或其抗原结 合部分，其包含产自或来源于人VH 3-30.3基因的重链可变区，其中 该抗体与PSMA特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一 种脱岩藻糖基化的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或来源 于人VK L6基因的轻链可变区，其中该抗体与人PSMA特异性结合。在 另一优选实施方案中，本发明提供一种脱岩藻糖基化的单克隆抗体或 其抗原结合部分，其包含产自或来源于人VK 04/014基因的轻链可变 区，其中该抗体与人PSMA特异性结合。在另一优选实施方案中，本 发明提供一种脱岩藻糖基化的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含 产自或来源于人VK L18基因的轻链可变区，其中该抗体与人PSMA特 异性结合。
在另一优选实施方案中，本发明提供一种脱岩藻糖基化的单克隆 抗体或其抗原结合部分，其中该抗体：
(a)包含产自或来源于人VH 5-51或3-30.3基因(该基因分别 编码SEQ ID NO：73和76所示的氨基酸序列)的重链可变区；
(b)包含产自或来源于人VK L6、04/014或L18基因(该基因分 别编码SEQ ID NO：74、75和77所示的氨基酸序列)的轻链可变 区；且
(c)与人PSMA特异性结合。
一种优选的VH和VK种系组合是VH 5-51和VK L6。分别具有VH 5- 51和VK L6的VH和VK的抗体的例子是4A3、7F12、8C12和2C6抗 体。另一种优选的VH和VK种系组合是VH 5-51和VK 04/014。分别具 有5-51和VK 04/014的VH和VK的抗体的例子是8A11和16F9抗体。 另一种优选的VH和VK种系组合是VH 5-51和VKL18。分别具有VH 5- 51和VK L18的VH和VK的抗体的例子是2A10和2F5抗体。另一种优 选的VH和VK种系组合是VH 3-30.3和VK L18。分别具有VH 3-30.3和 VK L18的VH和VK的抗体的一个例子是1C3抗体。
如此处所用的，如果一种人抗体的可变区是从使用人种系免疫球 蛋白基因的系统中获得的，则该人抗体包含“产自”或“来源于”特 定种系序列的重链或轻链可变区。这样的系统包括用目标抗原免疫携 带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，或者用目标抗原筛查展示在噬菌 体上的人免疫球蛋白基因文库。“产自”或“来源于”人种系免疫球 蛋白序列的人抗体可以这样鉴定：将该人抗体的氨基酸序列与人种系 免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较(例如使用Vbase数据库)，选择 在序列上最接近于该人抗体序列(即有最高％同一性)的人种系免疫 球蛋白序列。“产自”或“来源于”特定人种系免疫球蛋白序列的人 抗体与该种系序列相比可能包含氨基酸差异，例如由于天然发生的体 细胞突变或有意引入定点突变而导致的。但是，选择的人抗体在氨基 酸序列上与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列一般至少90％相 同，并且含有当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠种 系序列)相比较时确认该人抗体属于人类抗体的氨基酸残基。在某些 情况下，人抗体在氨基酸序列上与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基 酸序列可以至少95％、或者甚至至少96％、97％、98％或99％相同。一 般来说，来源于特定人种系序列的人抗体表现与该人种系免疫球蛋白 基因编码的氨基酸序列有不超过10个氨基酸的差异。在某些情况 下，该人抗体可能表现与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有 不超过5个、或者甚至不超过4、3、2或1个氨基酸的差异。
同源抗体
在另一实施方案中，本发明的脱岩藻糖基化抗体包含的重链和轻 链可变区含有与本文所述优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列， 并且其中该抗体保留了本发明的抗-PSMA抗体的需要的功能特性。
例如，本发明提供一种脱岩藻糖基化单克隆抗体或其抗原结合部 分，包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(a)重链可变区包含与选自SEQ ID NO：1-9的氨基酸序列至少 80％同源的氨基酸序列；
(b)轻链可变区包含与选自SEQ ID NO：10-18的氨基酸序列至 少80％同源的氨基酸序列；且
(c)该抗体与人PSMA特异性结合。
在另外一些实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与上述序列 85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。具有与上述序列的VH和 VL区高度(即80％或更高)同源的VH和VL区的抗体可以如下获得：诱 变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)编码SEQ ID NO：1-18的一种 或多种核酸分子，然后用此处所述的结合试验检测编码的被改变抗体 的保留的功能(即与PSMA结合)。编码SEQ ID NO：6-9和15-18的 核酸分子可见SEQ ID NO：78-85。编码SEQ ID NO：1-5和10-14的 核酸分子可见PCT公布WO 03/064606图17A和17B。
如此处所用的，两个氨基酸序列之间的百分同源性等同于两个序 列之间的百分同一性。考虑为了两个序列之间进行最佳比对所需要引 入的空位的数目和每个空位的长度后，两个序列之间的百分同一性是 这两个序列共有的相同位点的数目的函数(即％同源性＝相同位点的数 目/位点的总数×100)。两个序列之间的序列比较和百分同一性的确定 可以如下面的非限制性实施例中所述用数学算法实现。
两个核苷酸序列之间的百分同一性可以用GCG软件包(可从 http://www.gcg.com获得)中的GAP程序、使用NWSgapdna.CMP矩阵 和40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重 来确定。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分同一性也可以用已经整 合入ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和W.Miller(Comput. Appl.Biosci.，4：11-17(1988))的算法来确定，其使用PAM120权 重残基表，12的空位长度罚分，4的空位罚分。另外，两个氨基酸序 列之间的百分同一性也可以用已经整合入GCG软件包(可从 http://www.gcg.com获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J. Mol.Biol.48：444-453(1970))的算法来确定，其使用Blossum 62 矩阵或PAM250矩阵，16、14、12、10、8、6或4的空位权重，和 1、2、3、4、5或6的长度权重。
两个氨基酸序列之间的百分同一性可以用已经整合入ALIGN程序 (2.0版本)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.， 4：11-17(1988))的算法来确定，其使用PAM120权重残基表，12的 空位长度罚分，4的空位罚分。另外，两个氨基酸序列之间的百分同 一性也可以用已经整合入GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得) 的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453 (1970))的算法来确定，其使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵， 16、14、12、10、8、6或4的空位权重，和1、2、3、4、5或6的 长度权重。
另外或者可替代地，本发明的蛋白质序列可以进一步用作“查询 序列”来对公共数据库进行检索，例如用来鉴定相关序列。这种检索 可以用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的XBLAST程 序(2.0版本)进行。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序进行，得分 ＝50，字长＝3，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了 获得用于比较目的的空位比对，可以采用如Altschul等(1997) Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402所述的空位BLAST。当采用 BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各自程序(例如XBLAST和 NBLAST)的缺省参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
具有保守修饰的抗体
在某些实施方案中，本发明的脱岩藻糖基化抗体包括含CDR1、 CDR2和CDR3序列的重链可变区和含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链 可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个包含基于本文所述优选抗 体(例如4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5或1C3) 的特定氨基酸序列或其保守修饰，并且其中该抗体保留本发明抗- PSMA抗体的需要的功能特性。因此，本发明提供一种脱岩藻糖基化的 单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的 重链可变区和含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)重链可变区CDR3序列包含SEQ ID NO：37-45的氨基酸序列 及其保守修饰；
(b)轻链可变区CDR3序列包含SEQ ID NO：64-72的氨基酸序列 及其保守修饰；且
(c)该抗体与人PSMA特异性结合。
在一个优选实施方案中，重链可变区CDR2序列包含SEQ ID NO： 28-36的氨基酸序列和其保守修饰；且轻链可变区CDR2序列包含SEQ ID NO：55-63的氨基酸序列和其保守修饰。在另一优选实施方案中， 重链可变区CDR1序列包含SEQ ID NO：19-27的氨基酸序列和其保守 修饰；且轻链可变区CDR1序列包含SEQ ID NO：46-54的氨基酸序列 和其保守修饰。
本文所用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变含该 氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨 基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域公知的标准技术，如定点诱 变和PCR介导的诱变，向本发明抗体中引入修饰。保守氨基酸置换是 将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨 基酸残基的家族在本领域中已经定义。这些家族包括：具有碱性侧链 (例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨 酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨 酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨 酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、 β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪 氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明抗体的 CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被置换为来自相同侧链家族的 其他氨基酸残基，并且可以用此处所述的功能试验检测改变的抗体保 留的功能(即以上(i)至(iv)所述的功能)。
可替代地，在另一实施方案中，可以(例如通过饱和诱变)沿 抗-PSMA抗体编码序列的全部或部分随机引入突变，并且可以针对结 合活性筛查产生的修饰的抗-PSMA抗体。
与本发明的抗-PSMA抗体结合相同表位的抗体
在另一实施方案中，本发明提供与本文提供的本发明的各种抗- PSMA抗体结合相同表位的脱岩藻糖基化抗体，例如与本文描述的 4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5或1C3抗体结合相 同表位的其他人抗体。这些其他抗体可以根据它们在标准PSMA结合 测定中与本发明的其他抗体(例如4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、 2A10、2C6、2F5或1C3)交叉竞争(例如以统计学显著性的方式竞争 性抑制其结合)的能力来鉴定。被试抗体抑制例如4A3、7F12、 8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5或1C3与人PSMA结合的能力证 明，该被试抗体可以与该抗体竞争结合人PSMA；根据非限制性的理 论，该抗体可以与人PSMA上与它所竞争的抗体相同或相关(例如结 构上相似或空间上接近)的表位结合。在一个优选实施方案中，与 4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5或1C3结合人PSMA 上相同表位的脱岩藻糖基化抗体是人单克隆抗体。这些人单克隆抗体 可以如PCT公布WO 01/09192和WO 03/064606所述制备和分离。
工程化抗体和修饰的抗体
本发明的脱岩藻糖基化抗体还可以如下制备：用具有本文所公开 的一种或多种VH和/或VL序列的抗体作为起始材料，改造一种修饰的 抗体，该修饰的抗体可能具有与起始抗体相比改变的特性。可以通过 修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)例如一个或多个CDR区内和/或 一个或多个构架区内的一个或多个氨基酸残基来改造抗体。另外或者 可替代地，可以通过修饰恒定区内的残基来改造抗体，例如改变该抗 体的效应功能。
可以进行的一种类型的可变区改造是CDR移植。抗体主要是通过 位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互 作用。由于这个原因，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列在各个抗 体之间更加多样化。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用， 因此通过构建如下的表达载体能够表达模拟特定天然存在抗体的特性 的重组抗体：该表达载体包含来自特定天然存在抗体的CDR序列，该 CDR序列被移植到来自具有不同特性的不同抗体的构架序列上(参见， 例如，Riechmann，L.等(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.等 (1986)Nature 321：522-525；Queen，C.等(1989)Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033；Winter的美国专利 5,225,539，和Queen等人的美国专利5,530,101；5,585,089； 5,693,762和6,180,370)。
因此，本发明的另一个实施方案涉及一种脱岩藻糖基化的单克隆 抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区和轻链可变区，该重链可 变区包括分别包含选自SEQ ID NOs：19-27，SEQ ID NOs：28-36，和 SEQ ID NOs：37-45的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3序列，该轻 链可变区分别包含选自SEQ ID NOs：46-54，SEQ ID NOs：55-63，和 SEQ ID NOs：64-72的氨基酸序列。因此，该抗体含有单克隆抗体 4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5或1C3的VH和VLCDR序列，但是可能含有与这些抗体不同的构架序列。
这些构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或 发表的参考文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA 序列可以在以下资源中发现：“VBase”人种系序列数据库(可从因 特网上www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase获得)，以及Kabat，E.A. 等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest， 第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH 出版号91-3242；Tomlinson，I.M.等(1992)“The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops”J.Mol.Biol. 227：776-798；和Cox，J.P.L.等(1994)“A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” Eur.J.Immunol.24：827-836；其内容均在此引用作为参考。
用于本发明抗体的优选构架序列在结构上类似于所选择的本发明 抗体使用的构架序列，例如，类似于本发明的优选单克隆抗体使用的 VH5-51或3-30.3序列(分别为SEQ ID NO：73或76)和/或VKL6、 04/014或L18构架序列(分别为SEQ ID NO：74、75或77)。VHCDR1、2和3序列和VKCDR1、2和3序列可以被移植到与该构架序列 的来源种系免疫球蛋白基因具有相同序列的构架区上，或者CDR序列 可以被移植到与该种系序列相比含有一个或多个突变的构架区上。例 如，已经发现，在某些情况中，将构架区内的残基进行突变对于保持 或增强抗体的抗原结合能力是有利的(参见，例如，Queen等的美国 专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一种类型的可变区修饰是突变VH和/或VK CDR1、CDR2和/或 CDR3区内的氨基酸残基，从而改善目标抗体的一种或多种结合特性 (例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变，以引入突 变，对抗体结合的影响，或者其他目标功能特性，可以用此处所述和 实施例中提供的体外或体内试验来评价。优选地引入(如上文所述 的)保守修饰。这些突变可以是氨基酸置换、添加或缺失，但是优选 置换。而且，一般改变CDR区内不超过1、2、3、4或5个残基。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供脱岩藻糖基化抗PSMA 单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含的重链可变区含有：(a)VHCDR1区，其包含选自SEQ ID NO：19-27的氨基酸序列，或与选自 SEQ ID NO：19-27的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5个氨基酸 置换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VH CDR2区，其包含选自SEQ ID NO：28-36的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO：28-36的氨基酸 序列相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸 序列；(c)VH CDR3区，其包含选自SEQ ID NO：37-45的氨基酸序 列，或与选自SEQ ID NO：37-45的氨基酸序列相比具有1、2、3、4 或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VK CDR1区，其 包含选自SEQ ID NO：46-54的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO： 46-54的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或 添加的氨基酸序列；(e)VK CDR2区，其包含选自SEQ ID NO：55-63 的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO：55-63的氨基酸序列相比具有 1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VKCDR3区，其包含选自SEQ ID NO：64-72的氨基酸序列，或与选自 SEQ ID NO：64-72的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5个氨基酸 置换、缺失或添加的氨基酸序列。
本发明的工程化抗体包括(例如)为了改善抗体特性而对其VH和 /或VK内的构架残基进行了修饰的抗体。进行这样的构架修饰一般是 为了降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个构架残基 “回复突变”为相应的种系序列。更特别地，经历体细胞突变的抗体 可含有与衍生该抗体的种系序列不同的构架残基。通过比较抗体构架 序列与衍生该抗体的种系序列，可以鉴定这些残基。例如，对于8C12 和8A11，VH的氨基酸残基#13(FR1内)是苏氨酸，而在相应的VH5- 51种系序列中该残基为赖氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构 型，可以通过(例如)定点诱变或PCR介导的诱变，将该体细胞突变 “回复突变”为种系序列(例如，8C12或8A11的VH的FR1的残基13 可以从苏氨酸“回复突变”为赖氨酸)。这些“回复突变”的抗体也 包括在本发明中。
另一种类型的构架修饰涉及对构架区内、乃至一个或多个CDR区 内的一个或多个残基进行突变，以除去T细胞表位，从而降低该抗体 的潜在的免疫原性。该方法也被称为“脱免疫”，在Carr等人的公 布号为20030153043的美国专利中详细记载。
除了在构架区或CDR区内进行的修饰以外，或者作为它的替代方 案，也可以将本发明的抗体改造为在Fc区内包括修饰，一般是为了 改变该抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体固定、Fc受 体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，也可以将本发明的抗体化 学修饰(例如一个或多个化学部分可以连接到该抗体上)，或者修饰 以改变其糖基化，由此改变该抗体的一种或多种功能特性。这些实施 方案均在下文详细描述。Fc区中残基的编号是Kabat的EU指数的编 号。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使该铰链区中半胱氨酸 残基的数目改变，例如增加或减少。该方法在Bodmer等人的美国专 利No.5,677,425中详细记载。改变CH1铰链区中半胱氨酸的数目是 为了(例如)促进轻链和重链的装配，或提高或降低抗体的稳定性。
在另一实施方案中，对抗体的Fc铰链区进行突变，以降低该抗 体的生物半衰期。更具体地，向Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面 区引入一个或多个氨基酸突变，使得该抗体与葡萄球菌蛋白A(SpA) 的结合比天然Fc-铰链结构域与SpA的结合减弱。该方法在Ward等人 的美国专利No.6,165,745中详细记载。
在另一实施方案中，修饰抗体以提高其生物半衰期。可以使用各 种方法。例如，可以引入一个或多个如下突变：T252L、T254S、 T256F，如Ward的美国专利No.6,277,375所述。或者，为了提高生 物半衰期，可以在CH1或CL区内改变该抗体，使之含有来自IgG Fc 区CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国 专利No.5,869,046和6,121,022所述。
在其他一些实施方案中，通过将至少一个氨基酸残基置换为不同 的氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应功能。例如，可以将 选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320、322的一个 或多个氨基酸置换为不同的氨基酸残基，使得该抗体对效应配体的亲 和力改变，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。其亲和力被改变的效 应配体可以是，例如，Fc受体或补体的C1成分。该方法在Winter等 人的美国专利No.5,624,821和5,648,260中更详细地描述。
在另外一个实例中，可以将选自氨基酸残基329、331和322的 一个或多个氨基酸置换为不同的氨基酸残基，使得该抗体的C1q结合 改变和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)降低或消除。该方法在 Idusogie等人的美国专利No.6,194,551中更详细地描述。
在另外一个实例中，改变氨基酸位点231和239中的一个或多个 氨基酸残基，从而改变该抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等 人的PCT公布WO 94/29351中进一步描述。
在另外一个实例中，为了提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)的能力和/或提高抗体对Fcγ受体的亲和力，通过在下列位点 处修饰一个或多个氨基酸来修饰Fc区：238、239、248、249、252、 254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、 280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、 301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、 329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、 378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、 438或439。该方法在Presta的PCT公布WO 00/42072中进一步描 述。而且，人IgG1上对于FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合 位点已经作图，并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见， Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。位点 256、290、298、333、334和339处的特定突变显示改善了与 FcγRIII的结合。另外，下列组合突变体显示改善了与FcγRIII的结 合：T256A/S298A，S298A/E333A，S298A/K224A和 S298A/E333A/K334A。
本发明涉及的抗体的另一种修饰是PEG化。例如，为了提高抗体 的生物(例如血清)半衰期，可以将该抗体PEG化。为了PEG化一种抗 体，一般在一个或多个PEG基团可与抗体或抗体片段连接的条件下， 将该抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)如PEG的反应性酯或醛衍生物进 行反应。优选地，通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚 合物)的酰化反应或烷基化反应进行PEG化。本文所用的术语“聚乙 二醇”包括用来衍生化其他蛋白质的任何PEG形式，如单(C1-C10)烷 氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案 中，将要PEG化的抗体是非糖基化的抗体。将蛋白质PEG化的方法在 本领域中公知，并且可以应用于本发明的抗体。参见，例如， Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。
改造抗体的方法
如上所述，能够利用具有此处公开的VH和VK序列的脱岩藻糖基化 抗-PSMA抗体，通过修饰VH和/或VK序列或与之连接的恒定区，产生 新的抗-PSMA抗体。因此，在本发明的另一方面，利用本发明的抗- PSMA抗体例如4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5或 1C3的结构特征，产生结构上相关的脱岩藻糖基化抗-PSMA抗体，该 抗体保留本发明抗体的至少一种功能特性，如与人PSMA结合。如上 所述，例如，4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5或 1C3的一个或多个CDR区或其突变可以与已知的构架区和/或其他CDR 重组组合，从而产生另外的、重组改造的本发明的抗-PSMA抗体。其 他类型的修饰包括以上部分所述的修饰。用于改造方法的起始材料是 此处提供的一种或多种VH和/或VK序列，或其一个或多个CDR区。为 了产生工程化抗体，不一定实际制备(即表达为蛋白质)具有此处提 供的一种或多种VH和/或VK序列，或其一个或多个CDR区的抗体。而 是利用该序列中所含的信息作为起始材料，产生由原始序列衍生的 “第二代”序列，然后制备该“第二代”序列，并将其表达为蛋白 质。
因此，在另一实施方案中，本发明提供一种制备抗-PSMA抗体的 方法，包括：
(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO： 19-27的CDR1序列、选自SEQ ID NO：28-36的CDR2序列、和/或选 自SEQ ID NO：37-45的CDR3序列；和/或(ii)轻链可变区抗体序 列，其包含选自SEQ ID NO：46-54的CDR1序列、选自SEQ ID NO： 55-63的CDR2序列、和/或选自SEQ ID NO：64-72的CDR3序列；
(b)改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内的至 少一个氨基酸残基，从而产生至少一个改变的抗体序列；和
(c)将所述改变的抗体序列表达为蛋白质。
可以利用标准分子生物学技术制备和表达所述改变的抗体序列。 然后可以使用本文公开的方法将这样制备的改变的抗体序列制成脱岩 藻糖基化的形式，以获得脱岩藻糖基化的改变的抗-PSMA抗体。
改变的抗体的功能特性可以用本领域中使用的和/或此处所述 的，如实施例中所述的标准试验(例如流式细胞术、结合测定、ADCC 测定)来评价。
在改造本发明抗体的方法的某些实施方案中，可以沿全部或部分 抗-PSMA抗体编码序列随机或选择性引入突变，并可以针对结合活性 和/或如此处所述的其他功能特性，筛选获得的修饰的抗-PSMA抗体。 突变方法在本领域中已经描述。例如，Short的PCT公布WO 02/092780记载了利用饱和诱变、合成连接装配或它们的组合产生和 筛选抗体突变的方法。另外，Lazar等人的PCT公布WO 03/074679 也记载了利用计算筛选方法优化抗体的生理化学性质的方法。
编码本发明的抗体的核酸分子
本发明的另一方面涉及编码本发明的抗体的核酸分子。本文使用的 术语“核酸分子”包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双 链的，但优选双链DNA。这些核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物 中，或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过包括碱/SDS处理、 CsC1显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳在内的标准技术和本领域公知的 其他方法与其他细胞成分或其他掺杂物(例如其他细胞核酸或蛋白质) 分离纯化时，核酸是“分离的”或“基本上纯的”。参见，F.Ausubel 等ed.(1987)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本发明的核酸可以 是(例如)DNA或RNA，并且可以含有或者可以不含内含子序列。在一 个优选实施方案中，该核酸是cDNA分子。
本发明的核酸可以利用标准分子生物学技术获得。对于杂交瘤 (例如，由下文进一步描述的携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制 备的杂交瘤)表达的抗体，编码由杂交瘤制备的抗体轻链和重链的 cDNA可以用标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于(例如使用噬 菌体展示技术)从免疫球蛋白基因文库中获得的抗体，可以从文库中 回收编码该抗体的核酸。
本发明优选的核酸分子是编码4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、 2A10、2C6、2F5或1C3单克隆抗体的VH和VL序列的核酸分子。编 码4A3、7F12、8C12、8A11、16F9的VH和VL氨基酸序列的DNA序列 在PCT公布No.WO 03/064606中公开(见图17A和17B)，其内容 引入本文作为参考。编码1C3的VH序列的DNA序列显示在SEQ ID NO：78中。编码1C3的VL序列的DNA序列显示在SEQ ID NO：82 中。编码2A10的VH序列的DNA序列显示在SEQ ID NO：79中。编码 2A10的VL序列的DNA序列显示在SEQ ID NO：83中。编码2C6的VH 序列的DNA序列显示在SEQ ID NO：80中。编码2C6的VL序列的 DNA序列显示在SEQ ID NO：84中。编码2F5的VH序列的DNA序列 显示在SEQ ID NO：81中。编码2F5的VL序列的DNA序列显示在 SEQ ID NO：85中。
一旦获得编码VH和VL片段的DNA片段，即可通过标准重组DNA 技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链 基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的 DNA片段与编码另外一种蛋白质如抗体恒定区或柔性连接体的另一个 DNA片段有效连接。在本文中使用的术语“有效连接”意思是两个 DNA片段连接在一起，使得这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在 阅读框内。
通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的 另外一种DNA分子有效连接，可以将分离的编码VH区的DNA转化为 全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中公知(参见，例 如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunologicl Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)，包括这些区域的DNA 片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选IgG1或 IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因来说，编码VH的DNA可以与只 编码重链CH1恒定区的另外一种DNA分子有效连接。
通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另外一种DNA分子 有效连接，可以将分离的编码VL区的DNA转化为全长轻链基因(以 及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域中公知(参 见，例如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunologicl Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)，包括这些区域的DNA 片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但 是最优选κ恒定区。
为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段与编码柔性连 接体例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3(SEQ ID NO：89)的另外一个片 段有效连接，使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白质，其VL 和VH区通过该柔性连接体连接(参见，例如Bird等(1988)Science 242：423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等(1990)Nature 348：552-554)。
本发明的核酸组合物通常在来自于cDNA、基因组或其混合物的天 然序列(除了修饰的限制性位点等以外)中可以根据标准技术进行突 变，以提供基因序列。对于编码序列来说，这些突变可能影响氨基酸序 列。具体地说，涉及基本同源于或来源于天然V、D、J、恒定、转换和 本文所述的其他这些序列的DNA序列(其中“来源于”是指一种序列与 另一种序列相同或由其改进而来)。
本发明的单克隆抗体的产生
通过多种技术能制备本发明的单克隆抗体(mAb)，包括常规的单 克隆抗体方法，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495 所述的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交技术，但是原则 上，能使用制备单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致 癌转化。
用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠系统。用小鼠产生杂交瘤 是一种完善建立的程序。免疫程序和分离用于融合的被免疫脾细胞的 技术是本领域公知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也 是公知的。
在各种实施方案中，抗体可以是，例如，人抗体、人源化抗体或 嵌合抗体。
本发明的嵌合或人源化抗体可以基于如上所述制备的鼠单克隆抗 体的序列制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目标鼠杂交 瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术将其改造为含有非鼠(例如 人类)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以利用本领域 公知的方法将鼠可变区连接到人恒定区上(参见，例如，Cabilly等 人的美国专利No.4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以利用本 领域公知的方法将鼠CDR区插入人构架内(参见，例如，Winter的美 国专利No.5,225,539，和Queen等人的美国专利No.5,530,101； 5,585,089；5,693,762和6,180,370)。在本领域中公知多种小鼠 抗-PSMA抗体能够用来产生嵌合或人源化抗-PSMA抗体，例如 3F5.4G6、3D7.1.1、4E10-1.14、3E11、4D8、3E6、3C9、2C7、 1G3、3C4、3C6、4D4、1G9、5C8B9、3G6、4C8B9、E99、J415、J533 和J591。在一个优选实施方案中，本发明的抗体是人单克隆抗体。这 种抗PSMA人单克隆抗体能用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的 转基因或转染色体小鼠产生。这些转基因和转染色体小鼠包括本文中 分别称作HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在此通称为“人Ig小 鼠”。
HuMAb小鼠(Medarex，Inc.)包含编码未重排的人重链(μ和γ)和κ 轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，和使内源μ和κ链 基因座失活的定向突变(参见，例如，Lonberg等(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，该小鼠表现为小鼠IgM或κ表达降低， 并且响应于免疫，导入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突 变，从而产生高亲和力人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.等(1994)，同 上；综述Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995) Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93，和Harding，F.和 Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764：536-546)。HuMab 小鼠的制备和使用，以及该小鼠携带的基因组修饰，在下面的文献中详 细描述：Taylor，L.等(1992)Nucleic Acids Research 20：6287- 6295；Chen，J.等(1993)International Immunology 5：647-656； Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：3720-3724； Choi等(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等(1993) EMBO J.12：821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.152：2912- 2920；Taylor，L.等(1994)International Immunology 6：579-591； 和Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，这些 文献的内容全文在此引入作为参考。进一步参见，Lonberg和Kay的美 国专利No.5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425； 5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和 5,770,429；和Surani等人的美国专利No.5,545,807；Lonberg和 Kay的PCT公布号WO 92/03918，WO 93/12227，WO 94/25585，WO 97/13852，WO 98/24884和WO 99/45962；和Korman等人的PCT公布号 WO 01/14424。
在另一实施方案中，可以用转基因和转染色体上携带人免疫球蛋 白序列的小鼠，例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠，严 生本发明的人抗体。这种小鼠在此称为“KM小鼠”，在Ishida等人 的PCT公布WO 02/43478中详细描述。
再者，表达人免疫球蛋白基因的替代转基因动物系统在本领域中 可以获得，能够用来产生本发明的抗-PSMA抗体。例如，可以使用一 种称作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的替代转基因系统，这种小鼠在 例如Kucherlapati等人的美国专利No.5,939,598；6,075,181； 6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述。
而且，表达人免疫球蛋白基因的替代转染色体动物系统在本领域 中可以获得，能够用来产生本发明的抗-PSMA抗体。例如，可以使用 携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠，其被称作“TC小 鼠”；这种小鼠在Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 97：722-727中描述。另外，本领域中已经描述了携带人重链和轻 链转染色体的牛(Kuroiwa等(2002)Nature Biotechnology 20：889-894)，其能够用来产生本发明的抗-PSMA抗体。
也可以使用筛查人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法制备本 发明的人单克隆抗体。这种用于分离人抗体的噬菌体展示方法在本领 域中已经建立。参见，例如，Ladner等人的美国专利No.5,223,409； 5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美国专利No.5,427,908和 5,580,717；McCafferty等人的美国专利No.5,969,108和 6,172,197；和Griffiths等人的美国专利No.5,885,793； 6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
也可以用SCID小鼠制备本发明的人单克隆抗体，该SCID小鼠中 重构了人免疫细胞，因此在免疫时能够产生人抗体应答。这种小鼠在 例如Wilson等人的美国专利No.5,476,996和5,698,767中描述。
人Ig小鼠的免疫
当使用人Ig小鼠产生本发明的人抗体时，可以根据Lonberg，N. 等(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等(1996) Nature Biotechnology 14：845-851；和PCT公布WO 98/24884和WO 01/14424一般性所述，用表达PSMA的细胞系(例如LnCaP细胞，ATCC CRL-1740)、用纯化的或富集的PSMA抗原制品(例如LnCaP细胞膜) 和/或用重组PSMA或重组PSMA融合蛋白免疫该小鼠。优选地，第一次 输注时小鼠为6-16周龄。例如，可以使用LnCaP细胞的膜制品腹膜内 免疫人Ig小鼠。
产生抗PSMA完全人单克隆抗体的详细程序在PCT公布WO 0I/09192和WO 03/064606中描述。应用各种抗原积累的经验证明，当 最初使用弗氏完全佐剂中的抗原腹膜内(IP)免疫，接着隔周用弗氏不完 全佐剂中的抗原腹膜内免疫(最多共六次)时，转基因小鼠产生应答。但 是，发现除弗氏佐剂之外的佐剂也是有效的。另外，发现在没有佐剂 时，全细胞具有高度免疫原性。在免疫方案进程中可以用眼眶后取血获 得的血浆样品监测免疫应答。通过ELISA(如下所述)筛选血浆，用具 有足够抗-PSMA人免疫球蛋白效价的小鼠进行融合。用抗原对小鼠进行 静脉内加强免疫，3天后处死并且取出脾脏。预期每次免疫可能需要进 行2-3次融合。每一种抗原一般免疫6-24只小鼠。通常HCo7和HCo12 系都使用。另外，HCo7和HCo12转基因都可以杂交，产生具有两种不 同人重链转基因(HCo7/HCo12)的一种小鼠。
产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤的产生
为了制备产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，从被免疫的携带人 免疫球蛋白基因的转基因小鼠中分离脾细胞和/或淋巴结细胞，并且与 合适的无限增殖化细胞系(例如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。针对抗原特 异性抗体的产生筛选得到的杂交瘤。例如，使用50％PEG，将来自被免 疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与六分之一数量的P3×63-Ag8.653非 分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)融合。将细胞以大约2×105的密 度接种于平底微量滴定板中，接着在含有20％胎克隆血清、18％ “653”条件基质、5％Origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮 酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/毫升青霉素、50 mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1×HAT(Sigma；融合后24小时加 入HAT)的选择性培养基中温育两周。大约两周之后，在用HT替换了 HAT的培养基中培养细胞。然后通过ELISA针对人单克隆IgM和IgG抗 体筛选各孔。一旦发生广泛的杂交瘤生长，则通常在10-14天之后观察 培养基。将分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再次筛选，如果对于人 IgG仍然是阳性，则可以通过有限稀释将单克隆抗体至少亚克隆两次。 然后体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生少量抗体用于表 征。
为了纯化人单克隆抗体，选择的杂交瘤可以在用于单克隆抗体纯化 的两升旋转摇瓶中生长。过滤上清液，浓缩，之后用蛋白A-sepharose (Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。洗脱下来的IgG通过 凝胶电泳和高效液相色谱法检查以确保纯度。将缓冲溶液换成PBS，用 1.43的消光系数根据OD280确定浓度。可将单克隆抗体分成等份并且 在-80℃下保存。
产生本发明单克隆抗体的转染瘤的产生
利用(例如)众所周知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(例 如，Morrison，S.(1985)science 229：1202)，也能在宿主细胞转染 瘤中产生本发明的抗体。
例如，为了表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术 (例如，使用表达目标抗体的杂交瘤进行PCR扩增或cDNA克隆)，获得 编码部分或全长轻链和重链的DNA，并将该DNA插入到表达载体中，使 得基因与转录和翻译控制序列有效连接。在上下文中，术语“有效连 接”意思是抗体基因连接到载体中，使得载体中的转录和翻译控制序列 发挥它们调节该抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择与所用的表达 宿主细胞相匹配的表达载体和表达控制序列。抗体轻链基因和抗体重链 基因可被插入到分开的载体中，或者，更通常地，将两个基因插入到同 一表达载体中。通过标准方法将抗体基因插入到表达载体中(例如，抗 体基因片段上一与载体上的互补限制性位点连接，或者如果不存在限制 性位点的活，则平端连接)。通过将本文描述的抗体的轻链和重链可变 区插入到已经编码期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体 中，使得VH区段与载体中的CH区段有效连接，而VK区段与载体中的CL区段有效连接，可以产生任意抗体同种型的全长抗体基因。另外，或者 可替代的，重组表达载体可以编码有利于宿主细胞分泌抗体链的信号 肽。可将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽与该抗体链基因的氨基 末端符合阅读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽 (即，来自非免疫球蛋白的蛋白质的信号肽)。
除了抗体链基因，本发明的重组表达载体还带有控制该抗体链基因 在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”包括启动子、增强子 和控制抗体链基因转录或翻译的其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化 信号)。这样的调节序列例如在Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))中描述。本领域技术人员应当理解，表达载体的设 计，包括调节序列的选择，取决于诸如要转化的宿主细胞的选择、期望 的蛋白质表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列 包括指导蛋白质在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如来源于 巨细胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期 启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。可替代地可以使用 非病毒调节序列，例如泛蛋白启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调节 元件也可由来自诸如SRα启动子系统等不同来源的序列组成，SRα启动 子系统含有来自SV40早期启动子的序列和人1型T细胞白血病病毒的 长末端重复序列(Takebe，Y.等(1988)Mol.Cell.Biol.8：466- 472)。
除了抗体链基因和调节序列以外，本发明的重组表达载体还可以携 带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起 点)和选择性标记基因。选择性标记基因有利于筛选载体已经导入其中 的宿主细胞(参见，例如，Axel等人的美国专利No.4,399,216， 4,634,665和5,179,017)。例如，选择性标记基因一般给已经导入载体 的宿主细胞带来抗药性，例如G418、潮霉素或氨甲喋呤抗性。优选的 选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主细胞中 用于氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体 转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式包括常用于将外源DNA导 入原核或真核宿主细胞中的各种技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、 DEAE-葡聚糖转染等等。虽然在理论上可以在原核或真核宿主细胞中表 达本发明的抗体，但是优选在真核细胞中表达，最优选在哺乳动物宿主 细胞中表达该抗体，因为真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞 更可能装配和分泌正确折叠并且具有免疫活性的抗体。据报道，抗体基 因的原核表达无法高产率地产生活性抗体(Boss，M.A.和Wood，C.R. (1985)Immunology Today 6：12-13)。
用于表达本发明的重组抗体的优选宿主细胞包括改变所表达的抗体 的岩藻糖基化的细胞。例如，该宿主细胞可以是缺乏岩藻糖基转移酶因 此该宿主细胞产生在其碳水化合物中缺乏岩藻糖的蛋白质的细胞，或者 是表达糖蛋白修饰的岩藻糖基转移酶因此在宿主细胞中表达的抗体具有 增多的等分(bisecting)GlcNac结构(可阻止糖基化)的宿主细 胞。用于表达重组抗体的其他哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO 细胞)(包括Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞，和DHFR选择性标记一起使 用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol. 159：601-621所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别地， 用于NSO骨髓瘤细胞的另一种优选表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因 的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以 使抗体在宿主细胞中表达的时间，或更优选地，培养足以使抗体分泌到 宿主细胞所生长的培养基中的时间，而产生抗体。可应用标准蛋白质纯 化方法从培养基中回收抗体。
免疫偶联物
另一方面，本发明涉及与诸如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂) 或放射性毒素等治疗性部分偶联的脱岩藻糖基化抗-PSMA抗体或其片 段。这些偶联物在此被称为“免疫偶联物”。包括一个或多个细胞毒 素的免疫偶联物被称作“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒剂包括对细 胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素 B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖 苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔 红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、 1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔 和嘌呤霉素和它们的类似物或同系物。治疗剂还包括，例如，抗代谢 物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟 尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine))，烷化剂(例如，氮芥、苯丁酸氮 芥(thioepa chlorambucil)、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛 莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂 霉素C和顺-二氯二胺合铂(II)(DDP)顺铂)，氨茴霉素类(例如，柔红 菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放线菌素D(以 前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，抗有丝 分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。
能与本发明抗体偶联的治疗性细胞毒素的其他优选例子包括倍癌 霉素、刺孢霉素、美坦生、auristatin、和它们的衍生物。刺孢霉素 抗体偶联物的一个例子是可作为商品购得的(MylotargTM；Wyeth- Ayerst)。
可以利用本领域中使用的连接体技术将细胞毒素与本发明的抗体 偶联。已经用于将细胞毒素与抗体偶联的连接体类型的实例包括但不 限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的连接体。可以选择(例如)在 溶酶体区室内易被低pH切割或易被蛋白酶切割的连接体，该蛋白酶 例如是在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(例如组织蛋 白酶B、C、D)。
关于细胞毒素的类型、用于偶联治疗剂与抗体的连接体和方法的 进一步讨论，参见Saito，G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev. 55：199-215；Trail，P.A.等(2003)Cancer.Immunol.Immunother. 52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen， T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.和 Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089- 1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)Adv.Drug Deliv. Rev.53：247-264。
本发明的抗体也可以与放射性同位素偶联，产生细胞毒性放射性 药物，也称作放射性免疫偶联物。能够与诊断或治疗性使用的抗体偶 联的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。制 备放射性免疫偶联物的方法在本领域中已经建立。放射性免疫偶联物 的例子可以作为商品获得，包括ZevalinTM(IDEC Pharmaceuticals) 和BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)，并且能够利用类似的方法 使用本发明的抗体制备放射性免疫偶联物。
本发明的抗体偶联物可以用来改变特定的生物学反应，且药物部 分不应理解为局限于经典的化疗剂。例如，药物部分可以是具有需要 的生物活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质包括，例如，具有酶活性 的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外 毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物反应 调节物，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL- 2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM- CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。
将这种治疗性部分与抗体偶联的技术是众所周知的，参见，例 如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(ed.)，pp.243-56(Alan R.Liss， Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”， in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等(ed.)，pp. 623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”， in Monoclonal Antibodies’84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(ed.)，pp.475-506(1985)； “Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(ed.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.， 62：119-58(1982)。
药物组合物
另一方面，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，其含有与 药学上可接受的载体配制在一起的一种或组合的本发明的单克隆抗体 或其抗原结合部分。这样的组合物可以包含一种或组合的(例如两种 或多种不同的)本发明的抗体或免疫偶联物。例如，本发明的药物组 合物可以含有与靶抗原上的不同表位结合或具有互补活性的抗体组合 (或免疫偶联物)。
本发明的药物组合物也可以在联合治疗中施用，即与其他药剂联 用。例如，联合治疗可包括本发明的脱岩藻糖基化抗-PSMA抗体联合 至少一种其他的抗肿瘤剂、抗炎剂或免疫抑制剂。这些治疗剂包括甾 体和非甾体抗炎药(NSAIDS)，例如阿司匹林和其他水杨酸盐，如高剂量 的布洛芬(Motrin，Advil)、萘普生(Naprosyn)、舒林酸(奇诺力)、双 氯芬酸(Voltaren)、吡罗昔康(Feldene)、酮洛芬(Orudis)、二氟尼柳 (Dolobid)、萘丁美酮(Relafen)、依托度酸(Lodine)、奥沙普秦 (Daypro)、吲哚美辛(Indocin)和阿司匹林。可在联合治疗中使用的治 疗剂的其他例子在下面本发明抗体的应用一节中更详细地描述。
本文所用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所 有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延 迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱 或表皮给药(如通过注射或输注)。根据给药途径，可将活性化合物即 抗体或免疫偶联物用一种材料包裹，以保护该化合物免受可使该化合 物失活的酸和其他天然条件的作用。
本发明的药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。“药 学上可接受的盐”是指保持了亲代化合物的所需生物活性而不引起任 何不期望的毒理学作用的盐(参见如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm. Sci.66：1-19)。这样的盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成 盐包括那些由诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷 酸等无毒性无机酸衍生的盐，以及由诸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基 取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等无毒性有机 酸衍生的盐。碱加成盐包括那些由诸如钠、钾、镁、钙等碱土金属衍 生的盐，以及由诸如N，N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡 因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等无毒性有机胺衍生的盐。
本发明的药物组合物也可含有药学上可接受的抗氧化剂。药学上 可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、 盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗 氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵 磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、 乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本发明药物组合物中的适当的水性或非水性载体的例子包 括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适当的混合 物、植物油如橄榄油、和注射用有机酯如油酸乙酯。例如通过应用诸 如卵磷脂等包被材料，在分散液的情况下通过维持所需的颗粒大小， 以及通过应用表面活性剂，能够维持适当的流动性。
这些组合物也可含有辅料，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散 剂。可以通过上述的灭菌程序或通过包含诸如对羟基苯甲酸酯、氯代 丁醇、苯酚山梨酸等各种抗细菌剂和抗真菌剂确保防止存在微生物。 也可能需要在组合物中包含等渗剂，例如，糖、氯化钠等。另外，通 过包含延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可实现注射型药物延长 的吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无 菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的 使用是本领域公知的。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容 以外，包括其在本发明的药物组合物中的应用。还可以向组合物中掺 入补充的活性化合物。
治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定 的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物 浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘 油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。 例如，通过使用诸如卵磷脂等包被材料，在分散液的情况下通过保持 所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动 性。在很多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如，糖、多元醇例 如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂， 例如单硬脂酸盐和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。
通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要 加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无 菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基础分散介质和上面 所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备无菌注射 液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由 其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。
可以与载体材料组合制备单一剂型的活性成分的量根据所治疗的 受试者和特定给药方式而不同。可以与载体材料组合制备单一剂型的 活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常，以100％计， 这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％ 至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分，与药学上可接 受的载体相组合。
调节剂量方案，以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例 如，可以施用单一大丸剂，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根 据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。特别有利 的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。 此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的受试者 的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预 定量的活性化合物与需要的药物载体组合产生所需的治疗效果。对本 发明剂量单位形式的具体说明取决于且直接依赖于(a)活性化合物的 独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制 这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。
对于抗体的给药，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常 为0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1 mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1- 10mg/kg范围内。一个示例性的治疗方案需要每周给药一次、每两周 一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、或每3- 6个月一次。本发明的脱岩藻糖基化抗-PSMA抗体的优选剂量方案包 括经静脉内给予1mg/kg体重或3mg/kg体重，该抗体使用如下剂量 方案之一给药：(i)每4周一次，共6次，然后每3个月一次；(ii) 每3周一次；(iii)3mg/kg体重一次，然后每3周1mg/kg体重。
在某些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或多种单克 隆抗体，在该情况中，每种抗体的给药剂量落在所述范围内。抗体通 常多次给药。单次给药之间的间隔可以是，例如，每周、每月、每三 个月或每年。间隔也可以是不定期的，例如通过测定患者中抗靶抗原 的抗体的血液水平来确定。在一些方法中，调节剂量以达到约1- 1000μg/ml的血浆抗体浓度，在一些方法中为约25-300μg/ml。
可替代地，抗体也可以作为持续释放制剂来给药，在此情况下需 要频率较低的给药。剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而不同。 通常，人抗体表现出最长的半衰期，之后是人源化抗体、嵌合抗体和 非人类抗体。给药剂量和频率根据处理是预防性的还是治疗性的而不 同。在预防性应用中，在长时间内以较不频繁的间隔给予相对较低的 剂量。有些患者在余生中持续接受处理。在治疗性应用中，有时需要 以较短的间隔给予较高的剂量，直到疾病的进展减轻或停止，优选直 到患者表现为疾病症状部分或完全改善。之后，可以以预防性方案给 患者给药。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能变化，以获得 可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应、而对患 者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力 学因素，包括应用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、给 药途径、给药时间、所应用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时 间、与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料， 接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史、 以及医学领域中公知的类似因素。
本发明的抗-PSMA抗体的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状 的严重程度降低、疾病无症状期的频率和持续时间增加、或者防止因 疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于癌性肿瘤的治疗，相对于 未接受治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选地使细胞生长或肿瘤生 长抑制至少约20％，更优选至少约40％，更优选至少约60％，更优选至 少约80％。化合物抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效 的动物模型系统中评价。另外，也可以通过本领域技术人员公知的试 验检查该化合物的体外抑制能力，来评价组合物的这种性能。治疗有 效量的治疗性化合物能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解受试者 的症状。本领域技术人员可以根据如下因素确定该量，如受试者的大 小、受试者症状的严重程度和选择的特定组合物或给药途径。
本发明的组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种 或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方 式根据期望的结果而不同。本发明抗体的优选给药途径包括静脉内、 肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径，例如注 射或输注。本文所用的短语“肠胃外给药”是指肠和局部给药以外的 给药模式，通常是注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘 内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关 节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
可替代地，本发明的脱岩藻糖基化抗体也可以通过非肠胃外途径 给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如，鼻内、经口、阴道、直 肠、舌下或局部。
活性化合物可以与保护化合物不被快速释放的载体一起制备，例 如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生 物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚 乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的很多方法受专 利保护或者通常为本领域技术人员所公知。参见，例如，Sustained and controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson， ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
治疗性组合物可应用本领域公知的医疗装置给药。例如，在一个 优选实施方案中，本发明的治疗组合物可用无针皮下注射装置给药， 如在美国专利No.5,399,163；5,383,851；5,312,335； 5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。 可用于本发明的公知的植入物和模块的例子包括：美国专利No. 4,487,603，该专利公开了用于以受控速率分散药物的可植入式微量 输注泵；美国专利No.4,486,194，该专利公开了用于通过皮肤给药 的治疗装置；美国专利No.4,447,233，该专利公开了用于以精确的 输注速率递送药物的医用输注泵；美国专利No.4,447,224，该专利 公开了用于连续递送药物的变流可植入式输注装置；美国专利No. 4,439,196，该专利公开了具有多腔室的渗透药物递送系统：和美国 专利No.4,475,196，该专利公开了一种渗透药物递送系统。这些专 利在此引入作为参考。本领域技术人员公知许多其他这样的植入物、 递送系统和模块。
在某些实施方案中，可以配制本发明的脱岩藻糖基化抗体以确保 在体内的正确分布。例如，血-脑屏障(BBB)阻止了许多高度亲水性的 化合物。为了确保本发明的治疗性化合物能够跨过BBB(如果需要 时)，可将它们配制在如脂质体中。至于制备脂质体的方法，参见， 例如，美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可以 包含可被选择性地转运入特定细胞或器官内的一个或多个部分，从而 增强定向药物递送(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin. Pharmacol.29：685)。定向部分的例子包括叶酸或生物素(参见，例 如，Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988) Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman 等(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等(1995)Antimicrob. Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等 (1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等(1994)J. Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen (1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994) Immunomethods 4：273。
本发明的应用和方法
本发明的脱岩藻糖基化抗体、抗体组合物和方法具有涉及诊断和 治疗与PSMA表达有关的疾病的许多体外和体内诊断和治疗应用。例 如，这些分子可以施用于(例如)在体外或离体培养的细胞，或者例 如在体内施用于人类受试者，从而治疗、预防或诊断多种疾病。本文 使用的术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动 物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、 猫、牛、马、猪、鸡、鸟类、两栖类动物和爬行类动物。优选的受试 者包括患有与PSMA表达有关的疾病的人类患者。这些方法特别适合 治疗患有异常PSMA表达相关疾病的人类患者。当抗-PSMA抗体与另一 种药物一起给药时，这两种药物可以相继或同时给药。
在体内和体外施用本发明的抗体组合物(例如抗体或免疫偶联 物)的适当途径在本领域中公知，可以由本领域技术人员选择。例 如，抗体组合物可以通过(例如静脉内或皮下)注射给药。使用的分 子的适宜剂量将取决于受试者的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和 /或配方。
在一个实施方案中，可以在开始时检测本发明的抗体与体外治疗 或诊断应用有关的结合活性。例如，可以利用ELISA和流式细胞测定 法检测本发明的组合物。而且，可以测定这些分子引发至少一种效应 细胞介导的效应细胞活性(包括抑制表达PSMA的细胞的生长和/或杀 伤)的活性。测定效应细胞介导的ADCC的方案在下面的实施例中描 述。
A.检测方法
在一个实施方案中，本发明的脱岩藻糖基化抗体可以用来检测 PSMA的水平，或在膜表面上含有PSMA的细胞的水平，然后可以将这 些水平与特定疾病症状相关联。
在一个具体实施方案中，本发明提供检测样品中PSMA抗原的存 在或测定细胞表面上PSMA抗原的量的方法，包括在允许在抗体或其 部分与PSMA之间形成复合物的条件下，将样品和对照样品与特异性 结合PSMA的脱岩藻糖基化抗体或其抗原结合部分相接触。然后检测复 合物的形成，其中样品与对照样品相比复合物形成的不同指示样品中 存在PSMA抗原。例如，可以使用本发明的组合物进行本领域众所周 知的标准检测方法，如ELISA和流式细胞测定。
因此，在一个方面，本发明进一步提供检测样品中PSMA(例如人 PSMA抗原)的存在或测定PSMA的量的方法，包括在允许在抗体或其 部分与PSMA之间形成复合物的条件下，将样品和对照样品与特异性 结合PSMA的本发明的抗体或其抗原结合部分相接触。然后检测复合 物的形成，其中样品与对照样品相比复合物形成的不同指示样品中存 在PSMA。
本发明的组合物也可以用来靶向表达PSMA的细胞，例如用于标 记这些细胞。为此应用，可以将结合剂与可被检测到的分子连接。因 此，本发明提供用于离体或在体内定位表达PSMA的细胞的方法。可 检测标记物可以是，如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。
B.PSMA+细胞的生长的抑制
该抗体可以用来抑制表达PSMA的细胞的生长，这又可以与PSMA 表达相关的某些疾病症状的预防或缓解相关联。与非疾病状态相比疾 病状态期间PSMA表达的差异可以如下确定：在允许在抗体与PSMA之 间形成复合物的条件下，使来自该疾病患者的试样和对照样品与抗- PSMA抗体接触。检测在抗体与PSMA之间形成的任何复合物，并对样 品和对照进行比较。
例如，该抗体可以用来在体内或在体外引起一种或多种下列生物 活性：抑制表达PSMA的细胞的生长和/或杀伤；在人效应细胞存在下 介导表达PSMA的细胞的吞噬作用或ADCC；抑制可溶性PSMA的脱 落。如本文所述，与岩藻糖基化形式的抗体相比，本发明的脱岩藻糖 基化抗体表现出增强的ADCC活性。
因此，在另一方面，本发明提供一种抑制PSMA+细胞的生长的方 法，包括在足以诱导所述细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的条件 下，使所述细胞接触脱岩藻糖基化的抗-PSMA抗体。例如，该细胞可 以是肿瘤细胞。在一个优选实施方案中，抗-PSMA抗体是人抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分可以用来调 节靶细胞上的PSMA水平，例如通过对细胞表面上的受体加帽 (capping)以及将其清除。抗-Fc受体抗体的混合物也可以用于该目 的。
靶标特异性效应细胞，例如与本发明的组合物连接的效应细胞， 也可以用作治疗剂。用于靶向的效应细胞可以是人白细胞，如巨噬细 胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性细胞、自然杀伤 细胞和其他带有IgG或IgA受体的细胞。需要时，效应细胞可以从所 治疗的受试者中获得。靶标特异性效应细胞可以作为在生理学可接受 的溶液中的细胞悬浮液施用。施用的细胞数可以是108-109个的数量 级，但是根据治疗目的而不同。通常，该量足以获得在靶细胞处例如 在表达PSMA的肿瘤细胞处的局部化，以及通过例如吞噬作用实现对 细胞的杀伤。施用途径也可以不同。
应用靶标特异性效应细胞的治疗可以与其他清除靶细胞的技术一 起进行。例如，使用本发明的组合物和/或带有这些组合物的效应细 胞的抗肿瘤治疗可以与化学治疗一起使用。另外，可以应用联合免疫 治疗将两种不同的细胞毒性效应群体导向至肿瘤细胞排斥。
C.免疫偶联物的应用和联合治疗
在一个实施方案中，通过将化合物与抗体连接，本发明的免疫偶 联物可以将目标化合物(例如治疗剂、标记物、细胞毒素、放射性毒 素、免疫抑制剂等)靶向至具有PSMA细胞表面受体的细胞。因此， 本发明也提供用于离体或在体内定位表达PSMA的细胞的方法(例如 应用可检测标记物，如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因 子)。可替代地，免疫偶联物通过将细胞毒素或放射性毒素靶向至 PSMA，也可以用来杀伤具有PSMA细胞表面受体的细胞，如表达PSMA 的肿瘤细胞，由此消除肿瘤细胞。
在另外一些实施方案中，可以另外用调节(例如增强或抑制) Fcγ或Fcγ受体的表达或活性的药物治疗受试者，例如用细胞因子治疗 受试者。在治疗过程中施用的优选细胞因子包括粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ (IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。
在另一实施方案中，可以对用本发明的抗体组合物治疗的患者另 外施用(在施用本发明的抗体之前、同时或之后)另一种治疗剂，如 增强或加强人抗体的治疗效果的细胞毒剂或放射性毒剂。抗体可以与 该治疗剂连接(作为免疫复合物)，或者可以与该治疗剂分开给药。 对于后者(分开给药)，抗体可以在治疗剂之前、之后或同时给药， 或者可以与其他已知治疗(如抗癌治疗，例如放射治疗)共同应用。 这些治疗剂特别包括，抗肿瘤剂，如多柔比星(阿霉素)、顺铂硫酸 博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、羟基脲，它们本身仅 在对患者具有毒性或亚毒性的水平时有效。顺铂以100mg/ml的剂量 静脉内给药，每4周1次，阿霉素以60-75mg/ml的剂量静脉内给 药，每21天1次。本发明的抗-PSMA抗体或其抗原结合片段与化疗剂 的共同给药提供了两种抗癌剂，它们通过对人肿瘤细胞产生细胞毒性 作用的不同机制起作用。这种共同给药能够解决由于发展耐药性或肿 瘤细胞抗原性改变(这将使它们对抗体没有反应性)引起的问题。
D.癌症的治疗
已经证明PSMA在肿瘤细胞如前列腺癌肿瘤细胞上表达，也已证 明在靠近癌细胞的血管内皮细胞如尿道上皮癌细胞、结肠癌细胞、直 肠癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞和肝转移性腺癌细胞上表达(见美 国专利No.6,136,311)。因此，本发明的抗体通过抑制表达PSMA 的肿瘤细胞的生长或者通过抑制靠近肿瘤细胞的血管内皮细胞的生 长，可以用来治疗癌症。因此，在另一实施方案中，本发明提供一种 抑制受试者中肿瘤生长的方法，其中该肿瘤的细胞或靠近该肿瘤的血 管内皮细胞是PSMA+，其中给受试者施用本发明的脱岩藻糖基化抗- PSMA抗体，使肿瘤的生长受到抑制。对于人类受试者，抗体优选是人 源化或人抗体。在一个优选实施方案中，肿瘤细胞是前列腺癌细胞。 在其他实施方案中，肿瘤细胞来自于诸如结肠癌、肾癌、直肠癌、尿 道上皮癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌或黑素瘤等癌。
本发明的治疗方法包括给受试者施用有效治疗或预防疾病的量的 本发明的抗体组合物。抗体组合物可以单独施用或与诸如细胞毒剂或 放射性毒剂等另一种治疗剂一起施用(与抗体偶联或与抗体一起施 用)，该另一种治疗剂与抗体组合物联合或协同起作用，以治疗或预 防与PSMA表达相关的疾病。
药盒
本发明的范围内还包括含有本发明的抗体和使用说明的药盒。该 药盒可以进一步含有一种或多种另外的药物，如免疫刺激剂、细胞毒 剂或放射性毒剂，或一种或多种本发明的其他抗体(例如，具有补充 活性的人抗体，它与PSMA抗原上与第一人抗体不同的表位结合)。药 盒一般包括标明该药盒内容物目标用途的标签。术语标签包括在药盒 上提供或与药盒一起提供或以其他方式随药盒提供的任何书面或记录 材料。
本发明进一步通过下面的实施例进行阐述，不应将这些实施例理 解为进一步的限制。全部附图和在本申请中引用的全部参考文献、专 利和公开专利申请的内容均在此引用作为参考。
实施例
实施例1：抗-PSMA单克隆抗体在嵌合鸡鸡蛋中的表达
在该实施例中描述了抗-PSMA人单克隆抗体7F12在嵌合鸡的鸡蛋 中的表达。在嵌合鸡的鸡蛋中表达包括抗体在内的蛋白质的一般方法 在PCT公开WO 2004/015123中描述，其内容引入本文作为参考。关 于在嵌合鸡的鸡蛋中表达抗体的其他信息在2005年2月18日提交的 题目为“Tissue Specific Expression of Antibodies in Chickens”、序号为11/062,325的美国申请中描述，其内容引入本 文作为参考。
在下面的实施例中，构建了含有包括启动子的内源蛋白调节序列 和外源免疫球蛋白轻链和重链基因的转基因，以在输卵管的管状腺细 胞中产生组织特异性抗体表达。这样表达的抗体分子然后沉积在转基 因鸡的蛋白中。在该实施方案中，由任何重排的免疫球蛋白基因编码 的抗体在含有输卵管壶腹(magnum)区管状腺细胞的组织中特异性表 达，并且能够从蛋白中分离。编码单克隆抗体的重排的免疫球蛋白基 因优先在输卵管中表达，基本排除在其它组织中表达，尽管也可能在 其他组织中的表达高于可检测的水平。
用于卵白蛋白衍生的单克隆抗体构建体的优选的转基因构建体在 图12中示出。这些转基因构建体被命名为Ov7.5和Ov15，具有位于 MAb编码区5’端序列处的分别为大约7.5kb和15kb的卵白蛋白启 动子，和位于编码区3’侧的15kb的15kb的启动子序列。编码区包 含轻链和重链的可变区、J-C内含子序列、κ轻链恒定区、IRES序列 和γ1同种型重链恒定区。该构建体的3’末端包含GFP基因和选择性 标记，在该例中为CX启动子驱动的嘌呤霉素抗性基因。位于单克隆 抗体编码区3’和5’侧的卵白蛋白启动子序列的长度仅是例子，类似 的构建体可以包括5’序列的25-100kb或更多，以及3’序列的不同长 度。本领域技术人员应当理解，GFP标记的存在只是用于在生理标本 中检测，可以除去而不背离转基因的应用。嘌呤霉素抗性标记可以替 换为具有选择已被转基因成功转化的胚胎干细胞的能力的任何标记。 几种类型的类似选择性标记在本领域众所周知，基本可以与该实施方 案的嘌呤霉素抗性基因互换使用。
用于表达人抗-PSMA mAb 7F12的转基因被称为Ov15mAb7F12，包 括卵白蛋白启动子的15kb的5’调节序列。另外，信号肽直接与VL 连接，以阻止它在mRNA加工过程中被除去。使用新产生的雌性cES细 胞系(如PCT公开WO 2004/015123所述制备)，因此高级嵌合体能够产 生鸡蛋。用Ov15MAb7F12载体转染雌性cES细胞系，通过PCR筛选稳定 转染的克隆。通过Southern印迹法进一步分析一个克隆(OVH)。显示只 有一个拷贝的Ov15MAb7F12转基因被整合到cES的基因组中，并且该转 基因至少含有10kb的5’Ov启动子序列。
由该OVH克隆产生嵌合鸡用于转基因分析。用10只嵌合鸡进行早 期雌激素诱导。收集来自包括输卵管壶腹部分、肌肉、脑、肝和肠在 内的各种组织的供体cES衍生的区域(GFP-阳性)。使用L和H链特异性 引物利用RT-PCR监测转基因的表达。在壶腹中检测到L和H链转录 物，但是在4只被诱导的母鸡中有3只(OV15-34、OV15-76和OV15-83) 的肌肉、脑和肝脏样品中未检测到。但是，在回肠、盲肠和结肠中也检 测到低水平表达。对来自雌激素诱导的壶腹的切片进行免疫组化，证 实单克隆抗体在GFP-阳性管状腺细胞中表达，但不在GFP-阳性上皮细 胞中表达。综上所述，这些数据证明Ov15MAb7F12载体引导转基因在输 卵管管状腺细胞中的表达。在肠中检测到低水平的异位表达，提示15 Kb的Ov的5′调节序列可能不足以使转基因位置独立地、组织特异性地 表达。
由带有Ov15MAb7F12的OVH cES细胞产生69个嵌合体，用于评价 全人MAb在鸡蛋中的沉积。使30只嵌合母鸡性成熟并开始产蛋。ELISA 分析表明，所有母鸡的鸡蛋在蛋白中含有MAb。鸡蛋中MAb的浓度和含 量在嵌合母鸡之间不同，这可能是由于壶腹中嵌合程度的不同所致。8 只嵌合母鸡产的蛋每只蛋含有1mg以上的MAb，30只嵌合体的最大水 平为每只蛋3.4mg MAb。4只嵌合母鸡产的蛋的平均MAb水平为每只蛋 1.2至1.6mg。6只嵌合母鸡产的蛋的平均MAb水平为每只蛋0.5至 1.0mg。
通过Western印迹法分析，使用识别H和L链的兔抗人IgG (H+L)，进一步分析蛋白中MAb的存在。来自野生型非嵌合白来杭鸡的 蛋白作为阴性对照。纯化的人IgG1，κ(Sigma)作为参照标准。在来自 5只嵌合母鸡(OV15-17、OV15-29、Ov15-71、OV16-34和OV16-42)的蛋 白样品中检测到全长L和H链。也见到完全装配的H2L2，尽管也存在少 量的装配中间体。
为了确定沉积在蛋白中的MAb浓度的差异，在3-4个月的期限内监 测5只不同嵌合母鸡(OV16-34，OV16-42，OV17-29，OV17-52和OV17- 83)的鸡蛋。在3只鸡中，MAb的量在前几周达到峰值，然后在接下来 的几个月中下降大约两倍，并保持稳定。在两只母鸡中，表达水平随时 间进程保持相对稳定。如果当鸡蛋通过输卵管壶腹部分时不是所有的 管状腺都分泌和沉积卵白蛋白，则由于这些母鸡的管状腺的嵌合性质， 当每只鸡蛋通过壶腹时在蛋白中沉积的MAb的量可能不同。
来自26只嵌合母鸡和Barred Plymouth Rock(BPR)母鸡(阴性对 照)的血样通过ELISA分析其中人IgG的存在。18只母鸡在血液中具 有可检测到的水平的MAb，在母鸡OV17-83中观察到39ng/ml的最高 浓度。血液中MAb水平和蛋白中MAb浓度之间的相关系数(r)为0.67。 但是，不同组织中嵌合程度可能显著不同这一事实使这种比较复杂化。 例如，母鸡OV17-122在鸡蛋中具有极少的MAb(平均0.02mg/蛋)，但 是在血液中具有第二高的MAb浓度(36ng/ml)。我们推测血液中MAb的 存在可能不是从输卵管表达中泄露的结果，而是反映了异位表达(例 如，通过RT-PCR在雌激素诱导的嵌合体的肠中检测到异位表达)。
实施例2：抗体产物的纯化和蛋白质表征
如下从蛋白中纯化MAb 7F12。首先在室温下将蛋白以低剪切率混 合30分钟，然后通过本领域公知的方法沉淀卵粘蛋白。将一倍体积的 匀浆的蛋白悬液加至3倍体积的反渗水中，搅拌30分钟。使用0.5M 磷酸将稀释的悬浮液调节至pH 6.0，然后以12,100g离心20分钟。用 通过方法除去了约3％的含有大多数卵粘蛋白的蛋白蛋白质。使用0.5M 磷酸氢二钠将上清液调节至pH 7.4，用结晶盐调节至150mM氯化钠的 浓度。以120cm/h的线性流速在蛋白A-Sepharose FF柱(Amersham Biosciences)上纯化人IgG。用5倍体积的加样缓冲液(PBS，pH 7.4) 洗下吸附的人IgG，然后用3mM磷酸洗脱。用含有230mM NaCl的60 mM磷酸钠(pH7.5)将洗脱下来的人IgG级分调节至pH 7.5，达到终浓 度为40mM磷酸钠和150mM NaCl。然后将样品通过0.2μm注射器滤 器(Pall)过滤。
大多数纯化的材料是完全装配的MAb分子，纯度大于90％(通过 ELISA和A280测定)。在几个测定中将鸡中产生的MAb7F12与在常规 CHO细胞培养中产生的MAb7F12如下进行比较：
1.抗体的SEC-HPLC分析
使用4.6×300mm BioSep SEC S3000柱(Phenomenex)在Waters 2795HPLC上分析大约10μg IgG样品。在0.1M磷酸钠，0.15M NaCl，和0.1M硫酸钠，pH 7.2中以0.4ml/min的流速进行层析20 分钟。于A280监测分离。利用分子量标准(Bio-Rad)测定大致的分子 量。SEC-HPLC分析显示均为多于90％IgG单体。
2.蛋白质的Nano LC ESI MS/MS序列分析
将两种MAb制品(鸡蛋表达的和CHO细胞表达的)还原并烷基化， 透析过夜，在37℃下在25mM碳酸氢铵(PH 8)中用胰蛋白酶消化4小 时。在与QSTAR pulsar质谱仪(MDS Sciex，Concord，Ontario， Canada)通过界面连接的Nano HPLC系统(Dionex，Sunnyvale，CA)上对 两种胰蛋白酶消化物进行串联质谱分析，以阳离子模式操作，并且使用 碰撞诱导的解离(CID)来获得串联谱。注射各1μl等份样品，并用75 μm直径的Pepmap C18柱以250nl/min的流速分离。移动相是溶剂A (95％水，5％乙腈，0.5％甲酸)和溶剂B(20％水，80％乙腈，0.5％甲 酸)。该设备以信息依赖性的采集模式操作，使用7s的操作循环，记 录全光谱2s，然后选择最强离子在下一个5s中记录CID谱。用 Mascot(Matrix Science，London，UK)分析光谱。通过上述方法对两 种MAb制品的分析显示没有表达系统引起的序列差异。
3.LC-MS分析
通过将样品在60℃下温育90分钟，用25mM DTT还原在4M盐酸 胍中的IgG样品(50μg)。然后将样品在45mM碘乙酸中在室温下在暗 处烷基化15分钟，用22mM DTT终止反应。在LC-MS样品用1L 25 mM碳酸氢铵透析之前，使用装备有Micromass ZQ质谱仪的Waters 2795HPLC将各50μl样品注射到Poros R1/10 2.1×100mm柱 (Applied Biosystems)上，以阳离子模式分析。移动相为(A)0.1％甲酸 和0.01％三氟乙酸(TFA)和(B)100％CH3CN和0.1％甲酸和0.01％TFA。 用(B)在(A)中10-60％的线性梯度进行洗脱(0.25ml/min)，进行超过 100min。
L链的分析显示两种MAb制剂具有相同的质量(+/-3Da.)。
4.cIEF分析
IgG样品(各50μg，1.0mg/ml)用水透析，以在CE分析之前除去 盐。使用50μm内径和30cm有效长度的eCAP中性毛细管 (Beckman)，在正常极性的P/ACE MDQ CE系统(Beckman)上进行毛细管 电泳等电聚焦。通过20psi的压力注射注射样品60s。使用15kV分 离45min。毛细管的温度为20℃。阳极电解液为20mM磷酸，阴极电 解液为40mM氢氧化钠。漂洗溶液为10mM磷酸，使用提供的阴极移动 溶液(Beckman)。于A280监测分离。cIEF分析表明两者具有相似的等电 点(pI)，尽管CHO产生的MAb7F12的电荷异质性增加。
5.通过差示扫描量热法测定热稳定性
利用差示扫描量热法(DSC)获得在鸡和CHO表达系统中产生的 7F12的热稳定性，并与它们相应的在Fc结构域中脱糖基化的形式进 行比较。在与自动采样器组合的VP-毛细管DSC差示扫描微热量计平 台(MicroCal LLC，Northampton，MA，USA)进行熔解温度(Tm)的量 热学测量。样品细胞体积为0.144mL。关于抗体的糖基化和脱糖基化 形式的变性数据如下获得：将浓度为2.3μM的样品以1℃/min的速度 从30℃加热到95℃。蛋白质样品存在于pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)中。在参照细胞中使用相同的缓冲液，通过比较获得摩尔热 容。对观察到的热解曲线进行基线校正，使用Origin v7.0软件分析 标准化的数据。
CHO和鸡产生的抗体的解折叠谱非常不同，而Fc-脱糖基化抗体 的解折叠谱几乎相同。DSC数据表明CHO和鸡产生的Mab的热稳定性 不同，主要是由于在它们相应的CH2结构域中存在不同的糖基化模 式。在几个熔解转变点中，第一个是非常重要的，因为它决定抗体在 较低温度下的总体稳定性。鸡产生的抗体的Tm1测定为63.8℃，而CHO 表达的抗体的Tm1测定为62.7℃。由于鸡产生的抗体的Tm1高于CHO表 达的抗体的Tm1，可能鸡产生的抗体在室温下更稳定。
实施例3：鸡表达的抗-PSMA抗体的寡糖分析
在该实施例中，用多种不同技术分析鸡蛋表达的7F12抗体的糖基 化模式。
1.通过CE-LIF的寡糖表征
通过样品与12.5mU PNGaseF(Prozyme)在40℃下温育过夜，从 IgG样品(100μg)中释放寡糖。在使用的条件下，从在CHO细胞和鸡中 表达的HuMAbF1的Fc部分释放N-连接的聚糖。在乙醇沉淀除去MAb 蛋白后，通过真空离心干燥含有聚糖的上清液，并重悬浮在15％乙酸中 的19mM APTS(Beckman)和在THF(Sigma)中的1M氰基硼氢化钠中。 聚糖标记反应在40℃下继续过夜，然后用水25倍稀释样品。使用50 μm内径、50cm有效长度的涂覆N-CHO的毛细管(Beckman)，在具有反 极性的P/ACE MDQ CE系统(Beckman)上，对APTS-标记的聚糖进行激光 诱导荧光毛细管电泳。压力注射样品(8sec.)，在20℃下使用碳水化 合物分离胶缓冲液(Beckman)在25kV下分离20分钟。使用激光诱导 的荧光检测系统(Beckman)，利用3mW氩离子激光和488nm的激发波 长和520nm的发射波长监测分离。发现在鸡中产生的7F12的寡糖谱与 在CHO细胞中产生的7F12非常不同。
2.通过MALDI Q-TOF MS的寡糖表征
纯化的抗体(各100μg，1.0mg/ml)用4μl PNGaseF处理， PNGaseF是一种内切糖苷酶，切割N-连接的碳水化合物(Prozyme)。将 样品在37℃下温育过夜，然后用50mM碳酸氢铵(pH 8)透析过夜。通 过乙醇沉淀除去蛋白质。将释放的碳水化合物在来自Glygen Corp. (Columbia，MD)的micro carbon柱上脱盐，基本按照供应商的方案， 但是洗脱体积减至5μl。各1μl等份的聚糖样品与基质溶液(α-氰 基-4-羟基肉桂酸或2，5-二羟苯甲酸(Applied Biosystems)1∶1(v∶v) 混合，点样至MALDI靶板上，使之风干。利用MALDI-Q-TOF串联分析对 完整的糖偶联物进行分析。所有质谱都记录在配备有o-MALDI source 2的QSTAR pulsari质谱仪(MDS Sciex，Concord，Ontario，Canada) 上，其提供碳水化合物类别的质量(组成)。在对两种MAb进行聚糖序 列型分析后，研究每种聚糖中可能的糖苷键。高CID质谱记录在具有 TOF/TOf光学系统的4700蛋白质组分析仪(Applied Biosystems， Forster City，CA)上。对于高CID MSMS实验，将碰撞能设置为1 kV。在碰撞单元内部，以2×10-6托的压力用氩碰撞选择的寡糖离子。 通过MALDI TOF质谱法分析的在鸡产生的7F12中11种主要聚糖 的碳水化合物组成和可能的糖苷键总结在图13A和13B中。发现寡糖结 构含有高甘露糖类型、复合类型和杂合类型的N-聚糖。没有结构含有 岩藻糖残基。
3.通过HPAE-DAD及HPLC的单糖分析
使用2N TFA(用于评价中性糖)或6N HCl(用于评价氨基糖)将 IgG样品(200μg)在100℃下酸解4小时。样品通过在室温下真空离心 干燥，用200μl水重建，之后通过HPAE-PAD(Dionex)分析。使用具有 前置柱Amino Trap和Borate Trap的CarboPac PA10 4×250mm柱 (Dionex)分离单糖。程序按照Dionex Technical Note 53进行。使用 单糖标准(Dionex)测定单糖峰身份和相对丰度。
鸡和CHO产生的7F12的单糖分析总结在下面的表1中。
表1：鸡和CHO产生的MAb 7F12的单糖分析
单糖分析揭示了碳水化合物组成的差异，并且显示在鸡产生的 7F12中存在N-乙酰葡糖胺残基、甘露糖残基和极低含量的半乳糖残 基。在鸡产生的7F12中没有检测到岩藻糖残基，与之相反，CHO表达 的抗体制品含有岩藻糖残基。
为鉴定末端糖残基通过CE和质谱法对聚糖进行糖苷外切酶分析， 证实在鸡管状腺细胞中产生的MAb7F12中不存在末端唾液酸和岩藻糖残 基。
总之，N-连接的寡糖谱的最显著的差异是，在鸡产生的抗体中存在 高甘露糖类型的N-聚糖，不存在岩藻糖，存在极低含量的半乳糖残 基。
实施例4：鸡表达的抗-PSMA抗体的功能分析
在该实施例中，检测了鸡蛋表达的7F12抗-PSMA抗体的功能性 质，包括结合亲和力、内化、体内血清半衰期和抗体依赖的细胞毒性 (ADCC)活性。
1.对PSMA的结合亲和力
通过流式细胞术使用LNCaP细胞(ATCC CRL-1740)上的PSMA作为抗 原测定抗体结合。细胞在含有10％FBS、10mM HEPES、2mM L-谷氨酰 胺和1mM丙酮酸钠的RPMI 1640培养基中生长。将在鸡管状腺细胞中 产生的7F12的抗原结合性质与在CHO细胞中产生的7F12相比较。 200,000细胞/孔与各种浓度的50μl等份抗体一式两份温育30分 钟。洗涤细胞两次，然后以50μl/孔加入1∶200稀释的山羊抗人IgG PE标记的抗体(Jackson ImmunoResearch)，在4℃下30分钟。用含有 1％BSA的PBS洗涤细胞两次，进行FACS分析。使用GraphPad Prism 3.0(GraphPad Software)由结合曲线确定MAb与LNCaP细胞上PSMA结 合的EC50值。
两种抗体制品对LNCaP细胞上表达的PSMA产生几乎相同的结合曲 线，具有类似的EC50值。数据证明尽管鸡产生的和CHO产生的抗体被不 同地糖基化，但是它们相同地识别并结合抗原。
2.抗体的内化
7F12mAb与PSMA的结合导致抗体的内化。在一种可能的应用中， MAb与细胞毒素偶联，以靶向或破坏表达PSMA的肿瘤细胞。与LNCaP 细胞上PSMA结合的抗体的内化通过将细胞与MAb和Hum-Zap (Advanced Targeting Systems)温育来测定。HumZap是与核糖体灭活 蛋白肥皂草毒蛋白(saporin)偶联的山羊抗人IgG抗体。当7F12 MAb/Hum-Zap复合体与细胞表面上的PSMA结合并被内化时细胞被杀 伤，而单独的抗体或Hum-Zap对LNCaP细胞没有毒性。LNCaP细胞 (10,000/孔)一式三份在含有300ng Hum-Zap和300ng 7F12MAb或 对照MAb的150μl培养基中在37℃下温育48小时。细胞增殖和存活 用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)测 定。也如下进行内化试验，将抗体在细胞培养基中的稀释液与10,000 个附着的LNCaP细胞/孔在4℃下温育2小时。轻轻除去抗体溶液，更 换为150μl含有200ng HumZap的培养基。在37℃下温育48小时后 测定细胞存活率。使用Prism 3.0(GraphPad Software)根据图形测定 抗体内化的EC50值。
鸡表达的和CHO表达的抗体制品都以相似的效率内化。当在一定抗 体浓度范围内检测时，鸡产生的和CHO产生的7F12MAb的内化的EC50值为0.49nM。
3.体内半衰期
在BALB/c小鼠中通过静脉注射放射性标记的抗体平行分析了鸡产 生的7F12MAb和CHO产生的抗体的体内半衰期。使用Iodobead法 (Pierce)用125I轻微碘化10μg MAb蛋白质(每个抗体少于1个I)。 在实验前通过饮用水给6周大的雌性BALB/c小鼠(Taconic Farms， Germantown，NY)喂以0.1mg/ml碘化钾，持续一周。每种蛋白质4只 小鼠向尾静脉内静脉注射约600,000cpm标记的MAb，在选定的时间使 用全身γ计数器(Wm.B.Johnson NaI晶体检测器，具有Ludlum scaler) 测量全身放射性。通过残余放射性的指数回归分析来计算半衰期。
鸡管状腺细胞产生的7F12MAb的清除半衰期(t1/2)为小 时，而CHO细胞产生的7F12MAb的清除更慢，半衰期为小时。
4.ADCC活性
利用改良的51Cr ADCC试验检测LNCaP-C42B细胞。通过标准 Ficoll-paque分离从肝素化的全血中纯化人外周血单核细胞。将细胞 重悬浮(1×106细胞/ml)在含有10％FBS和10U/ml人IL-2的RPMI1640 培养基中，并在37℃下温育过夜。次日，收集细胞，用培养基洗一 次，并以2×107细胞/ml的浓度重悬浮。二百万个靶LNCaP-C42b细 胞与200μCi 51Cr在1ml总体积中37℃温育1小时。将靶细胞洗一 次，重悬浮在1ml培养基中，再于37℃温育30分钟。最后一次温育 后，将靶细胞洗一次，使终浓度为1×105细胞/ml。对于最后的ADCC测 定，100μl标记的LNCaP细胞与50μl效应细胞和50μl抗体一起 温育。选择1∶100的最终靶：效比。在所有研究中还进行人IgG1同种 型对照并与CHO产生的抗-PSMA 7F12抗体相比较。包括的其他对照 有：a)靶细胞和效应细胞而不含抗体，b)靶细胞而没有效应细胞，c) 靶细胞和效应细胞，存在3％Triton X-100。在37℃温育4小时后， 收集上清液，用γ计数器(Cobra II auto-gamma，来自Packard Instruments)计数，读取窗口为240-400keV。将每分钟的计数作为 抗体浓度的函数作图，并使用Prism软件(San Diego，CA)利用非线性 回归S形剂量应答(可变斜率)分析这些数据。裂解百分比用以下方程 式来确定：
％裂解＝(样品CPM-无抗体CPM)/(TritonX CPM-无抗体CPM)X 100
我们发现在所有研究中既监测EC50值又监测％裂解是重要的。例 如，当比较两种抗体时，EC50或％裂解或两者都可能改变。
两个不同ADCC实验的结果显示在图14A(IL-2刺激的效应细胞)和 图14B(新鲜人外周血效应细胞)中。图14A显示CHO产生的MAb诱导 剂量依赖性的细胞裂解，当使用IL-2刺激的效应细胞时，在38％裂解 处达到稳定，EC50为0.11μg/ml。相反，鸡蛋产生的MAb更强更有效。 对于两种不同的抗体制剂，鸡蛋产生的MAb的最大％裂解为60％。比CHO 产生的MAb增强的能力也得到证明，因为该材料的EC50为0.018 μg/ml。即，鸡表达的抗体的EC50比CHO表达的抗体低约6倍。最后， 如预期的，同种型对照抗体不诱导细胞裂解。使用未刺激的效应细胞 (新鲜PBMCs)的ADCC显示EC50值有较大差异，但是总细胞杀伤较低 (图14B)。
CD16(FcγRIII)是介导ADCC的重要受体。使用抗CD16单克隆抗体 阻断靶细胞和效应细胞的内化显示了ADCC应答的特异性。抗CD16抗体 对ADCC活性的阻断按照上述ADCC测定来进行，但具有如下改变。在 存在或不存在5μg/ml抗-CD16抗体3G8或同种型对照抗体的条件下， 细胞与1μg/ml(饱和剂量)或0.01μg/ml(亚最适剂量)的(鸡或CHO 表达的)7F12抗-PSMA抗体一起温育。结果显示在图15中。对于CHO 产生的和鸡产生的抗体，在不存在抗-CD16时，1μg/ml的抗-PSMA抗 体分别诱导约15％和38％的裂解。在存在抗-CD16时该％裂解降至约4％， 而同种型对照抗体没有影响。
实施例5：脱岩藻糖基化抗-PSMA抗体在FUT8阴性宿主细胞中的制 备和表征
在该实施例中，在缺乏岩藻糖基转移酶的细胞系中表达完全人类 抗-PSMA单克隆抗体，因此该细胞系产生在其碳水化合物中缺乏岩藻糖 的蛋白质。使用多种化学分析技术，包括毛细管电泳、氨基酸序列比 较、通过质谱分析的质量差异、和通过毛细管等电聚焦的电荷差异， 相对于岩藻糖基化抗-PSMA抗体(在含有岩藻糖基转移酶的不同细胞系 中表达)检测脱岩藻糖基化抗体，来确定这两种抗体之间结构和特征的 差异。
使用抗PSMA完全人类单克隆抗体2A10。2A10重链的氨基酸和核苷 酸序列在图5A中显示，2A10轻链的氨基酸和核苷酸序列在图5B中显 示。将2A10重链和轻链可变区序列亚克隆到表达载体内。将包括其信 号序列和最佳Kozak序列的2A10κ可变区cDNA亚克隆为与人κ恒定区 在阅读框内。将包括其信号序列和最佳Kozak序列的2A10重链可变区 cDNA亚克隆为与人γ1重链恒定区在阅读框内。轻链和重链表达均由 SRα启动子引导。该表达载体在PCT申请PCT/US2004/028954中详细描 述，其内容引入本文作为参考。
通过DNA电穿孔将该表达载体转染到FUT8-/-宿主细胞系Ms704内。 通过使用两个置换载体定向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因，来产生 Ms704FUT8-/-细胞系，这在Yamane等人的美国专利申请20040110704 和Yamane-Ohnuki等人.(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22中更 全面地描述。Ms704细胞适合在添加了100μM次黄嘌呤和16μM胸 苷(Invitrogen#11067-030)和6mM L-谷氨酰胺(Invitrogen#25030- 081)的生长培养基EX-CELLTM 325PF CHO培养基(JRH#14335)中悬浮 培养生长。将要用于电穿孔的载体DNA经乙醇沉淀，并重悬浮在水中。 8次电穿孔中的每一次使用1.5μg DNA。通过在蔗糖缓冲溶液(SBS)中 洗涤细胞并将细胞以1×107细胞/ml SBS溶液的浓度重悬浮，来准备 Ms704细胞用于转染。400μl细胞与构建体DNA混合，使用250伏、 275微法拉第电容和25欧姆电阻的设置进行电穿孔(BTX Molecular Delivery Systems#630电细胞操作器)。从电穿孔杯中取出细胞，加 入20ml生长培养基。将细胞以每孔200μl细胞的密度加至96孔板 上，大约为4×104细胞/孔。电穿孔2天后，从每孔中除去150μl 培养基，更换为150μl选择培养基，即含400μg/ml G418 (Invitrogen#10131-035)的生长培养基。每3-7天，将每孔150μl 选择培养基更换为新鲜的选择培养基。
使用类似的程序用相同的2A10构建体对CHO DG44宿主细胞(FUT 8 +/+)进行电穿孔，建立表达含有岩藻糖基化碳水化合物的重组2A10抗 体的CHO DG44转染子。
将产量最高的Ms704和CHO DG44克隆扩增，通过蛋白A亲和层析 法从细胞培养上清液中纯化重组2A10抗体。
由Ms704产生的N-连接的寡糖和CHO DG44产生的抗PSMA单克隆 抗体样品的比较分析通过毛细管电泳激光诱导的荧光法(cLIF)来进行 (Chen和Evangelista(1998)Electrophoresis 15：1892)。通过加入 肽N-聚糖酶(Prozyme)并温育过夜来释放被纯化抗体的N-连接的寡糖。 乙醇沉淀该蛋白质，将含有碳水化合物的上清液转移到新的试管中，使 用Speedvac干燥。重悬浮该碳水化合物，在脱唾液酸化和岩藻糖残基 损失最小化的温和还原性胺化条件下用8-氨基芘-1，3，6-三磺酸酯 (APTS)进行衍生化。使用激光诱发的荧光检测器(Beckman Coulter)通 过毛细管电泳来分析反应加合物(Ma和Nashabeh(1999)Anal.Chem. 71：5185)。在从Ms704细胞系和从CHO DG44细胞系获得的抗体之间观 察到寡糖谱的差异，这与Ms704衍生的抗-PSMA抗体中不存在岩藻糖残 基相一致。使用Dionex-HPLC阴离子交换及脉冲电流检测的单糖分析证 实Ms704表达的抗体缺乏任何岩藻糖残基的表达。结果总结在下面的表 2中。
表2：来自FUT8-/-和FUT8+/+细胞的MAb 2A10的单糖分析
除了毛细管电泳和单糖分析所显示的寡糖的差异以外，Ms704和 CHO DG44产生的抗-PSMA抗体蛋白质样品基本上相同。N末端蛋白质序 列的分析显示N末端氨基酸序列相同。Ms704和CHO DG44产生的抗- PSMA抗体的轻链的质谱分析分别获得23,552和23,548的质量，这在 仪器的误差之内。还使用标准毛细管等电聚焦试剂盒试验(Beckman Coulter)检测了这两种抗体，显示这两种抗体样品具有相同的等电点。 这些研究表明，除了Ms704产生的抗体的脱岩藻糖基化以外，Ms704和 CHO DG44细胞产生的抗体样品的蛋白质成分基本上相同。碳水化合物 分析表明，该抗体的脱岩藻糖基化形式比该抗体的岩藻糖基化形式具有 更多的末端半乳糖残基。
实施例6：在FUT8阴性宿主细胞中表达的脱岩藻糖基化抗-PSMA抗 体的ADCC活性的评价
Ms7040产生的(脱岩藻糖基化)2A10抗体对LNCaP-C42B细胞的 (从ViroMed Laboratories，Minnetonka，MN获得)的细胞毒性利用 改良的51Cr ADCC试验来检测。通过标准Ficoll-paque分离法从肝素化 的全血中纯化人外周血单核细胞。将细胞重悬浮(1×106细胞/ml)在含有 10％FBS和10U/ml人IL-2的RPMI1640培养基中，并在37℃下温育 过夜。次日，收集细胞，用培养基洗一次，并以2×107细胞/ml的浓 度重悬浮。二百万个靶LNCaP-C42b细胞与200μCi51Cr在1ml总体 积中37℃温育1小时。将靶细胞洗一次，重悬浮在1ml培养基中，再 于37℃温育30分钟。最后一次温育后，将靶细胞洗一次，使终浓度为 1×105细胞/ml。对于最后一次ADCC测定，100μl标记的LNCaP细胞 与50μl效应细胞和50μl抗体一起温育。选择1∶100的最终靶： 效比。在所有研究中还包括人IgG1同种型对照，并与CHO DG44产生的 (岩藻糖基化)抗-PSMA 2A10抗体进行比较。包括的其他对照有：a) 靶细胞和效应细胞而不含抗体，b)靶细胞而没有效应细胞，c)靶细胞 和效应细胞，存在3％Triton X-100。在37℃温育4小时后，收集上 清液，用γ计数器(Cobra II auto-gamma，来自Packard Instruments) 计数，读取窗口为240-400keV。将每分钟的计数作为抗体浓度的函数 作图，并使用Prism软件(San Diego，CA)利用非线性回归S形剂量应 答(可变斜率)分析这些数据。裂解百分比用以下方程式来确定：
％裂解＝(样品CPM-无抗体CPM)/(TritonX CPM-无抗体CPM)X 100
三个分开的ADCC实验的结果显示在图16A、16B(IL-2刺激的效 应细胞)和16C(新鲜人外周血效应细胞)中。使用各种浓度的fuc- 2A10和defuc-2A10确定对于LnCaP细胞系的细胞毒性曲线，并且确 定EC50和％裂解值。分别对应于图16A、16B、16C的三个实验的结果 在下面的表3中显示。
表3：脱岩藻糖基化抗-PSMA mAb 2A10的细胞毒性能力
Ms704产生的(即脱岩藻糖基化的)2A10mAb与CHO DG44产生 的(即岩藻糖基化的)2A10b mAb相比增强的能力通过脱岩藻糖基化 形式抗体的较低的EC50值和较高的％裂解得到证明。例如，脱岩藻糖 基化形式的EC50值比岩藻糖基化形式大约低3倍至18倍。与IL-2 刺激的效应细胞相比，对未刺激的效应细胞(新鲜PBMC)的ADCC活 性显示EC50值有较大差异，但是总细胞杀伤较低(图16C)。
CD16(FcγRIII)是介导ADCC的重要受体。使用抗CD16单克隆抗体 阻断靶细胞和效应细胞的内化显示了ADCC应答的特异性。抗CD16抗体 对ADCC活性的阻断按照上述ADCC测定来进行，但是具有如下改变。 在存在或不存在5μg/ml抗-CD16抗体3G8或同种型对照抗体的条件 下，细胞与1μg/ml(饱和剂量)或0.01μg/ml(亚最适剂量)的 (Ms704或CHO DG44表达的)2A10抗-PSMA抗体一起温育。结果显示 在图17中。对于岩藻糖基化和脱岩藻糖基化抗体，在不存在抗-CD16 时，1μg/ml的抗-PSMA抗体分别诱导约12％和37％的裂解。在存在抗- CD16时该％裂解降至小于5％，而同种型对照抗体基本没有影响。
等同方案
仅仅应用常规实验，本领域技术人员就将认识到或者能够确定本 文描述的本发明特定实施方案的许多等同方案。这些等同方案包含在 下面的权利要求书中。
序列表概述
序列表
<110>米德列斯公司
<120>缺乏岩藻糖残基的抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)单克隆抗体
<130>MXI-335PC
<140>
<141>
<150>60/660,431
<151>2005-03-09
<160>89
<170>PatentIn Ver.3.3
<210>1
<211>119
<212>PRT
<213>人
<400>1
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Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
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Trp Ile Gly Trp Ala Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
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<210>2
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Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Phe
20 25 30
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Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
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65 70 75 80
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<210>5
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Ser
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<400>9
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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85 90 95
Ala Arg Ala Val Pro Trp Gly Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>10
<211>108
<212>PRT
<213>人
<400>10
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Leu Met
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>11
<211>108
<212>PRT
<213>人
<400>11
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Leu Met
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>12
<211>108
<212>PRT
<213>人
<400>12
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asp Trp Leu Met
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>13
<211>100
<212>PRT
<213>人
<400>13
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys
1 5 10 15
Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys
20 25 30
Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
50 55 60
Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Gly Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys
85 90 95
Val Asp Ile Lys
100
<210>14
<211>100
<212>PRT
<213>人
<400>14
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
1 5 10 15
Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys
20 25 30
Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
50 55 60
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Gly Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys
85 90 95
Val Asp Ile Lys
100
<210>15
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>15
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Tyr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>16
<211>108
<212>PRT
<213>人
<400>16
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
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<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>17
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ile Lys
100 105
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<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>18
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>19
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1 5
<210>20
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>20
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1 5
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<212>PRT
<213>人
<400>21
Ser Tyr Trp Ile Gly
1 5
<210>22
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>22
Asn Tyr Trp Ile Gly
1 5
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<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>23
Asn Tyr Trp Ile Gly
1 5
<210>24
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>24
Ser Asn Trp Ile Gly
1 5
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<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>25
Asn Tyr Trp Ile Gly
1 5
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<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>26
Ser Asn Trp Ile Gly
1 5
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<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>27
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1 5
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<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>28
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Gly
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<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>29
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Gly
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<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>30
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
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Gly
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<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>31
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Gly
<210>32
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>32
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210>33
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>33
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1 5 10 15
Gly
<210>34
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>34
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210>35
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>35
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210>36
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>36
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>37
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>37
Ala Asn Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210>38
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>38
Ala Asn Ser Ser Phe Trp Asn Phe Asp Leu
1 5 10
<210>39
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>39
Ala Asn Pro Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210>40
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>40
Ala Asn Pro Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210>41
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>41
Ala Asn Ser Ser Phe Trp Asn Phe Asp Leu
1 5 10
<210>42
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>42
Gln Thr Gly Phe Leu Trp Ser Ser Asp Leu
1 5 10
<210>43
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>43
Pro Gly Tyr Thr Ser Ser Trp Thr Ser Phe Asp Tyr
1 5 10
<210>44
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>44
Gln Thr Gly Phe Leu Trp Ser Phe Asp Leu
1 5 10
<210>45
<211>15
<212>PRT
<213>人
<400>45
Ala Val Pro Trp Gly Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210>46
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>46
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210>47
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>47
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210>48
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>48
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210>49
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>49
Thr Cys Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
1 5 10
<210>50
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>50
Thr Cys Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
1 5 10
<210>51
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>51
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210>52
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>52
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210>53
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>53
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210>54
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>54
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210>55
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>55
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210>56
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>56
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210>57
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>57
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210>58
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>58
Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser
1 5
<210>59
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>59
Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser
1 5
<210>60
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>60
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210>61
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>61
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210>62
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>62
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210>63
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>63
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210>64
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>64
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Leu Met Tyr Thr
1 5 10
<210>65
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>65
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Leu Met Tyr Thr
1 5 10
<210>66
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>66
Gln Gln Arg Ser Asp Trp Leu Met Tyr Thr
1 5 10
<210>67
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>67
Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe Thr
1 5
<210>68
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>68
Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe Thr
1 5
<210>69
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>69
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210>70
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>70
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Phe Thr
1 5 10
<210>71
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>71
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210>72
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>72
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210>73
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>73
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210>74
<211>94
<212>PRT
<213>人
<400>74
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp
85 90
<210>75
<211>97
<212>PRT
<213>人
<400>75
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Gly Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe
85 90 95
Thr
<210>76
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>76
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210>77
<211>95
<212>PRT
<213>人
<400>77
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro
85 90 95
<210>78
<211>372
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(372)
<400>78
cag gtg caa ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt agc tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
gct atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca gtt ata tca tat gat gga aac aat aaa tac tac gca gac tcc gtg 192
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg aac agc ctg aga gct gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga gcc gtc ccc tgg gga tcg agg tac tac tac tac ggt atg gac 336
Ala Arg Ala Val Pro Trp Gly Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 372
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>79
<211>357
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(357)
<400>79
gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt acc agt aac 96
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn
20 25 30
tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc 192
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tac 240
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg agg caa act ggt ttc ctc tgg tcc tcc gat ctc tgg ggc cgt ggc 336
Ala Arg Gln Thr Gly Phe Leu Trp Ser Ser Asp Leu Trp Gly Arg Gly
100 105 110
acc ctg gtc act gtc tcc tca 357
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>80
<211>363
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(363)
<400>80
gag gtg cag ctg gtg cag tct gga tca gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt acc aac tac 96
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc 192
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tat 240
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg agt ccc ggg tat acc agc agt tgg act tct ttt gac tac tgg ggc 336
Ala Ser Pro Gly Tyr Thr Ser Ser Trp Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 363
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>81
<211>357
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(357)
<400>81
gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agt ttt acc agc aac 96
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn
20 25 30
tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc 192
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tac 240
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ctg cag tgg aac agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288
Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga caa act ggt ttc ctc tgg tcc ttc gat ctc tgg ggc cgt ggc 336
Ala Arg Gln Thr Gly Phe Leu Trp Ser Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
100 105 110
acc ctg gtc act gtc tcc tca 357
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>82
<211>321
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(321)
<400>82
gcc atc cag ttg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag ggc att agc agt gct 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
tta gcc tgg tat cag cag aaa tca ggg aaa gct cct aag ctc ctg atc 144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
ttt gat gcc tcc agt ttg gaa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192
Phe Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag ttt aac agt tat cct ctc 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 321
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>83
<211>321
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(321)
<400>83
gcc atc cag ttg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag gac att agc agt gct 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala
20 25 30
tta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg aaa gct cct aag ctc ctg atc 144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
tat gat gcc tcc agt ttg gaa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
tat gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc aac agc ctg cag cct 240
Tyr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag ttt aat agt tac ccg ctc 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 321
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>84
<211>324
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<400>84
gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc tac 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc 144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc agg ttc agt ggc 192
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc cta gag cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag cgt agc aac tgg ccc cta 288
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
ttc act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat atc aaa 324
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210>85
<211>327
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(327)
<400>85
gcc atc cag ttg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag gac att agc agt gct 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala
20 25 30
tta gcc tgg tat cag cag aaa ccg ggg aaa gct cct aag ctc ctg atc 144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
tat gat gcc tcc agt ttg gaa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag ttt aat agt tac ccg ctc 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa atc aaa 327
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ile Lys
100 105
<210>86
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>86
Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
1 5 10 15
Thr Val Ser Ser
20
<210>87
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>87
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
1 5 10
<210>88
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>88
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210>89
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成Gly-Ser连接体
<400>89
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
机译： 抗岩藻糖基残基中前列腺特异性膜抗原（PSMA）缺乏的单克隆抗体。
机译： 岩藻糖基残基缺乏针对前列腺特异性膜抗原（PSMA）的单克隆抗体
机译： 抗藻糖基残基中前列腺特异性膜抗原（PSMA）缺乏的单克隆抗体
