治疗心脑血管疾病的中药注射剂及其制法和质量控制方法

摘要

本发明涉及一种用于治疗心脑血管疾病的中药注射剂及其制法和质量控制方法；该中药注射剂由红景天和灯盏花素制成；该中药注射剂的质量控制方法包括：红景天苷和灯盏花素的鉴别，pH值、溶液颜色、蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐、钾离子、热原、炽灼残渣、重金、总固体、指标成分总含量为总固体量的百分率等检查，红景天苷和灯盏花素的含量测定。

说明书

技术领域

本发明涉及一种中药制剂，特别是一种用于治疗心脑血管疾病的中药注射剂及其制法 和质量控制方法。

背景技术

心脑血管疾病，具有发病急、病情重、变化快、可多次发病及病死率高等特点，严重 危害着人类身体健康特别是老年人的身体健康，给社会、家庭及患者个人均带来极为沉重 的负担。2006年9月20日中国专利公报公开了由本申请人申报的名称为“用于治疗心脑 血管疾病的中药制剂及其制备方法”、公开号为1569150的专利申请，可由红景天和灯盏 花素制备成中药注射剂。但是在实际应用过程中我们发现制备方法比较粗糙，效果不够理 想。在近两年的时间里，我们在原来的基础上，通过大量的实验摸索，找到了最佳的制备 工艺，科学地进行质量控制，临床药效学实验效果显著。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种疗效显著的治疗心脑血管疾病的中药注射剂及其制法和 质量控制方法。

本发明是这样实现的：

一、处方：

红景天(最粗粉)1000g，灯盏花素(按灯盏花乙素计)40g，制成5000ml(1000支) 注射液。

二、制法：

取处方量红景天最粗粉，加适量65％乙醇浸润后，置渗漉器中，再加65％乙醇适量浸泡 过夜，用65％乙醇以每公斤药材每分钟15ml流速渗漉，收集药材12倍量的漉液，回收乙醇， 浓缩至相对密度约1.2(60℃)左右，加6倍量水搅匀，煮沸溶解，冷藏过夜，滤过，滤液浓 缩至相对密度1.1(60℃)，冷至室温，用水饱和的等体积仲丁醇萃取3次，合并仲丁醇， 减压回收仲丁醇，浓缩至相对密度1.2(60℃)，加200g聚酰胺拌匀，干燥，装于层析柱(柱 径与柱高比1∶6～8)，用65％乙醇以每公斤药材每分钟15ml的流速洗脱，收集药材3倍量 的洗脱液，回收乙醇，浓缩至相对密度1.1(60℃)，加5倍量水搅匀，煮沸，冷藏过夜， 滤过，滤液浓缩至每1ml相当于药材10g的浓清膏，冷藏备用。

取红景天苷提取物，加处方量20％的注射用水煮沸溶解，冷藏过夜，取上清液，用0.85 μm微膜过滤澄明。调节pH至6.5左右。取灯盏花素，加处方量20％的注射用水搅匀，用 10％氢氧化钠溶液调节pH至约7.0，冷藏过夜，用0.85μm微膜过滤，与上述含红景天提取 物溶液混合，加热至80℃左右，加0.1％(W/V)活性炭搅匀，吸附约15min，期间搅拌2～3次， 用0.85μm微膜过滤，加水至全量，调节pH至6.5左右，滤过，灌封，灭菌即得。

三、性状：

本品为本品为棕红色澄明液体。

四、鉴别：

(1)取本品5ml加水稀释至10ml，用水饱和的仲丁醇提取3次，每次20ml，合并仲 丁醇液，于水浴蒸干，残渣加5ml水溶解，上D101大孔吸附树脂柱，以70ml水洗脱，弃 去洗脱液，再用70％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，于水浴蒸干，残渣加甲醇4ml溶解，即得 供试品溶液。另取红景天苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。 照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别 点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(13∶7∶1.5)为展开剂，展开，取出，晾干， 喷以1％三氯化铁-1％铁氰化钾(1∶1)的溶液至显色，置日光下观察，在与对照品色谱相应 的位置上，应显相同颜色的斑点。

(2)在红景天苷含量测定的色谱图中，供试品峰的保留时间应与对照品峰的保留时 间一致。

(3)取本品2ml，拌入适量硅藻土，置水浴上蒸干，加甲醇20ml，超声处理10分钟， 滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取野黄芩苷(灯盏花乙素) 对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000 年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液5μl、对照品溶液3μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以醋酸乙酯-甲酸-水(16∶1∶2)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％ 三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热数分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与 对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

(4)在灯盏花素含量测定项下的色谱图中，供试品峰的保留时间应与对照品峰的保 留时间一致。

五、检查：

pH值应为5.5～7.5(中国药典2000年版一部附录VIIG)。

溶液颜色取本品1ml，置于25ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，取10ml置于 纳氏比色管中，依法检查(中国药典2000年版一部附录XI第一法)，与黄色8号标准比 色液比较，不得更深。

蛋白质  取本品5ml，加水稀释至100ml，取1ml加鞣酸试液3滴，不得出现浑浊。

鞣质  取本品5ml，加水至100ml，取1ml加入稀醋酸1滴，再加明胶氯化钠溶液5 滴，不得出现浑浊或沉淀。

树脂  取本品5ml，加水至100ml，取5ml于分液漏斗中，加稀盐酸3滴，放置10min， 用10ml乙醚萃取，乙醚层用水(pH7)洗涤3次，每次10ml，乙醚层于水浴上蒸干，残渣 加无水乙醇5ml溶解，过滤，滤液水浴蒸干，残渣加冰醋酸2ml使溶解，置具塞试管中， 加水3ml，混匀，放置30分钟，应无絮状物析出。

草酸盐  取本品5ml，加水至100ml，取5ml，用稀盐酸调节pH值至1～2，放置30min 滤过，滤液调节pH值为5～6，放置10min过滤，滤液加3％氯化钙溶液3滴，放置10分 钟，不得出现浑浊或沉淀。

钾离子  取本品5ml，加水至100ml，取2ml，依法测定(中国药典2000年版一部附 录IXS)，应符合规定。

热原  取本品5ml加5％葡萄糖注射液稀释至50ml，照热原检验法(中国药典2000年版 一部附录XIIIA)，剂量按家兔体重每1kg注射6ml，应符合规定。

炽灼残渣  精密吸取本品2ml，依法检查(中国药典2000年版一部附录IX J)，炽灼 残渣不得过1.0％(g/ml)。

重金属  取炽灼残渣项下遗留的残渣，依法检查(中国药典2000年版一部附录IX E 第二法)，含重金属不得过百万分之十。

总固体  精密量取注射液10ml，置于恒重的蒸发皿中，于水浴上蒸干后，在105℃干 燥3小时，移置干燥器中冷却30分钟，迅速称定重量。计算出注射剂中含总固体的量 (mg/ml)，应符合规定。

本品含总固体不得过30.00mg/ml。

指标成分总含量为总固体量的百分率用指标成分总含量÷总固体量×100％加以计 算，应不得少于25％。

其他  应符合注射剂项下有关的各项规定(中国药典2000年版一部附录I U)。

六、含量测定：

红景天苷

照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-磷酸(20∶ 80∶0.2)为流动相；检测波长为223nm。理论板数按红景天苷峰计算应不低于1500。

对照品溶液的制备  取红景天苷对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml约含 0.15mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备  精密量取本品2ml，加流动相稀释至10ml，摇匀，滤过，取续滤 液，即得。

测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即 得。

本品每5ml含红景天苷(C14H2007)应不少于2.5mg。

灯盏花素  照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.5％冰醋酸 溶液(30∶70)为流动相；检测波长为335nm，理论板数按野黄芩苷峰计算应不低于1000。

对照品溶液的制备  取野黄芩苷(灯盏花乙素)对照品，用甲醇配制成约0.15mg/ml 的溶液作为对照品溶液。

供试品溶液的制备  精密量取本品1ml，加甲醇稀释至50ml，滤过，溶液作为供试品 溶液。

测定法  分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定， 即得。

本品含灯盏花素按灯盏花乙素(C21H18O12)计，应为标示量的95.0～105.0％。

七、功能与主治：

补气温阳，活血化瘀，通络止痛，用于缺血性脑中风和中风后遗症以及胸痹心痛证(冠 心病心绞痛)。

八、用法用量：

一次5ml～10ml，一日1次；或遵医嘱。临用前加入100～200ml 5％葡萄糖注射液或 10％葡萄糖注射液中静脉滴注。

主要药效学试验：为了进一步比较公开号为1569150的专利申请技术与本发明技术之 间的疗效差别，进行了下述的比较实验研究。将公开号为1569150的专利申请简称为原发 明。

实验一本发明治疗脑缺血性中风后遗症药效学试验

(1)犬大脑中动脉结扎所致脑缺血模型试验

1实验方法

草犬30只，随机分成5组，每组6只，雌雄兼用，腹腔注射3％戊巴比妥钠 1.0ml/kg(30mg/kg)麻醉，仰位固定于犬手术台上，然后在犬右外眼角与右耳根部1/2处(中 点)，用电刀切开皮肤，分离肌肉，用手术专用颅骨钻钻开颅骨，以咬骨钳扩大颅骨孔， 切开硬脑膜，找到大脑中动脉。先用多谱勒超声血流探测仪测定大脑中动脉血流速度，然 后股静脉滴注给药，给药剂量及分组见表1。给药15min后，再次同前法测定大脑中动脉 血流速度，随后立即将大脑中动脉结扎造成脑缺血。

大脑中动脉结扎6小时后，分离双侧颈总动脉并夹闭之，即刻从右侧颈总动脉夹闭处 的远心端灌注20ml龙胆紫饱和溶液对脑组织进行染色，然后处死动物，开颅取出脑组织， 称全脑重，遂切下未染色的脑组织(即缺血区脑组织)称重，求出其占全脑重量的百分率， 并进行病理组织学检查(按常规取脑组织，10％甲醛固定1周，H.E染色，石腊包埋切片， 光学显微镜下观察)，以判断其是否属于脑缺血性损伤，结果见表1～2。

2实验结果

表1  红灯注射液对实验性犬脑缺血的影响(x±SD)

组别 剂量×次数 (mg/kg×c)   犬数   (只)  全脑重(g)   脑缺血区重(g)     缺血区重/全脑重     (％) 对照组 原发明组 本发明大剂量组 本发明中剂量组 本发明小剂量组 5％葡萄糖              ×1 注射液 346.7×1 346.7×1 173.4×1 86.7×1     6     6     6     6     6  63.65±5.40  60.35±5.03  57.82±4.27  60.13±4.20  60.47±4.44   18.90±4.82   14.00±2.53^*  9.70±3.07^**△  12.03±4.74^*  15.87±3.55     29.50±6.32     23.17±3.54^*    16.98±6.07^**△    19.80±7.54^*    26.51±7.06

注：各给药组与对照组比较*P＜0.05 **P＜0.01，与原发明组比较，△P＜0.05。

表1结果显示，本发明大、中剂量组均能明显减少犬大脑中动脉结扎后的脑组织缺血 区重量和缺血脑组织百分率(P＜0.01和P＜0.05)。与原发明组比较，本发明大剂量组疗效 更为显著(P＜0.05)，中、小剂量组疗效相当。

表2本发明对犬大脑中动脉血流速度的影响

组别 剂量×次数 (mg/kg×c)   犬数   (只)  血流速度(cm/s，x±SD)  给药前   给药后15min  峰值流速   平均流速   峰值流速   平均流速 对照组 原发明组 本发明大剂量组 本发明中剂量组 本发明小剂量组 5％葡萄糖             ×1 注射液 346.7×1 346.7×1 173.4×1 86.7×1   6   6   6   6   6 20.58±4.81  21.45±6.94  22.47±5.47  21.57±10.05  17.95±9.42   9.70±1.02   10.43±5.05   9.43±5.10   10.72±6.44   9.83±4.67   21.38±5.01   27.02±8.51   33.05^*±7.35   31.82^*±16.46   20.87±12.47   9.70±3.01   7.38^**±5.13   20.27^**±6.20   14.98^*±9.37   11.75±6.43

注：各给药组与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

表2结果显示，本发明大、小剂量组与原发明组均能明显增加血流速度(P＜0.01 或P＜0.05)，其中本发明大、中剂量组作用更为显著。

(2)大鼠颈内动脉注射血栓局部脑缺血模型试验

1实验方法

取SD种大鼠50只，雌雄各半，体重200～250g，随机分为5组，每组10只，按表 6所示药物和剂量尾静脉注射给药，1次/日，连续3天。于末次给药后30min，左侧颈 内动脉注射血凝块直径小于0.1mm的血栓混悬液0.4ml造模，此后于第2，6，12和24h 采用0-3级评分标准(见表3)评定每只大鼠的意识和运动能力。在处死前，又以0-3 级标准(见表4)进行神经行为学的评分。随后颈总动脉注射龙胆紫染色，处死动物， 开颅取出脑组织，称全脑重，遂切下未染色的脑组织(即缺血区脑组织)称重，求出其占 全脑重量的百分率，并将其进行病理组织学检查(按常规取脑组织，10％甲醛固定1周， H.E染色，石腊包埋切片，光学显微镜下观察)，判断其是否属于脑缺血性损伤，结果 见表3～7。

表3大鼠的意识和运动能力评分标准

    评分     标准     0分     1分     2分     3分     正常活动     自发活动+/-     触觉刺激不能唤醒     疼痛刺激不能唤醒，无自发活动

表4大鼠神经行为学的评分标准

    评分     标准     0分     1分     2分     3分     观察到行为缺陷     前肢弯曲     抵抗侧推力量下降，但无旋转     抵抗侧推力下降，但有旋转

表5本发明改善颈动脉注射血栓所致局部脑缺血大鼠意识和运动能力的作用

组别   剂量×天   (mg/kg×d)     鼠数     (只)   大鼠的意识和运动能力评分   2h   6h   12h  24h 模型组 原发明组 本发明大剂量组 本发明中剂量组 本发明小剂量组   --   693.4×3   693.4×3   346.7×3   173.4×3     10     10     10     10     10   1.8±0.42   1.0±0.00^**  1.0±0.00^**  1.0±0.00^**  1.3±0.48^*  1.4±0.52   0.7±0.48^**  0.3±0.48^**△△  0.4±0.52^**△  1.0±0.00^*  1.0±0.0   0.3±0.48^**  0.1±0.32^**△△  0.0±0.00^**△△  0.6±0.52^* 1.0±0.0  0.1±0.32^** 0.0±0.00^**△△ 0.0±0.00^**△△ 0.0±0.00^**△△

注：各给药组与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与原发明组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

表5结果显示，本发明各剂量组(693.4～173.4mg/kg)与原发明组均能显著或明 显改善局灶性脑缺血大鼠2～24h的意识和运动能力(P＜0.01或P＜0.05)，其中在局灶 性脑缺血大鼠6～24h实验中，本发明各剂量组与原发明组比较均具有不同程度的显著 性差异，具有更好的疗效。

表6本发明改善颈动脉注射血栓所致局部脑缺血大鼠神经行为学评分结果

组别     剂量×天     (ml/kg×d)     鼠数     (只)     大鼠神经行为学评分     (分，X±SD) 模型组 原发明组 本发明大剂量组 本发明中剂量组 本发明小剂量组     -     693.4×3     693.4×3     346.7×3     173.4×3     10     10     10     10     10     2.00±0.00     0.40±0.52^**    0.00±0.00^**    0.00±0.00^**    0.40±0.52^**

注：各给药组与模型组比较**P＜0.01。

表6结果显示，693.4～173.4mg/kg的本发明与原发明组均能显著改善局灶性脑缺 血大鼠的神经行为学症状(P＜0.01)，两者疗效相当。

表7本发明减少大鼠脑缺血百分率作用(X±SD)

组别  剂量×天  (mg/kg×d)     鼠数     (只)   全脑重量   (g)   缺血区重量   (g)     大鼠脑缺血百分     率     (％) 模型组 原发明组 本发明大剂量组 本发明中剂量组 本发明小剂量组  --  693.4×3  693.4×3  346.7×3  173.4×3     10     10     10     10     10   1.76±0.09   1.63±0.10   1.72±0.11   1.81±0.12   1.63±0.09   0.97±0.33   0.49±0.25^**  0.28±0.05^**△  0.52±0.24^**  0.56±0.29^**    55.51±18.36     29.92±13.93^**    16.25±2.73^**△    28.29±12.50^**    34.19±17.05^**

注：各给药组与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与原发明组比较，△P＜0.05。

表7结果显示，693.4～173.4mg/kg本发明与原发明组均能显著降低局灶性脑缺血 大鼠缺血区重量和脑缺血百分比(P＜0.01)，其中本发明大剂量组与原发明组比较具有 更好疗效(P＜0.05)。

实验二全脑缺血模型试验

(1)沙土鼠颈动脉结扎法所致脑缺血模型试验

1实验方法

选取体重45～55g的沙土鼠60只，雌雄各半，按体重随机分为6组。按表8所示 药物和剂量于手术前尾静脉注射连续给药10天，于第10天末次给药后30min开始手术。 各组动物均在乙醚麻醉下分离双侧颈总动脉，除假手术组外各组用血管夹夹闭双侧颈总 动脉，40min后开夹使血流再通，60min后断头取脑，称重。将脑均分为2份。一份取 大脑皮层测定水含量，并做病理切片观察海马CA1区锥体神经元，以2个视野下的存活 锥体神经元数总和来表示海马损伤的程度。另一份用0.5mol/L、PH＝7.8的磷酸盐缓冲 水溶液冰浴下制备10％脑组织匀浆，按试剂盒操作步骤测定匀浆中MDA、GSH-PX及LDH 的含量，试验结果见表8～11。

2实验结果

表8本发明对夹闭再灌注脑损伤沙土鼠脑组织GSH-PX和LDH活力的影响(X±SD)

组 别  剂量×天数  (mg/kg×d)     鼠数     (只)   GSH-PX活力   (酶活力单位)   LDH活力   (U/L) 假手术组 模型组 原发明组 本发明大剂量组 本发明中剂量组 本发明小剂量组  --  --  693.4×10  693.4×10  346.7×10  173.4×10     10     10     10     10     10     10   9.08±1.59   6.49±1.58^△△  9.00±1.23^*  10.15±2.33^**  7.07±1.57   6.34±2.11   1.36±0.27   0.60±0.13^△△△  1.34±0.36^***  1.25±0.15^***  0.96±0.20^**  0.72±0.25

注：①模型组与假手术组比较△△P＜0.01，△△△P＜0.001；②各给药组与模型组比 较  ***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。

表8结果显示，693.4mg/kg本发明有极显著升高脑缺血再灌注沙土鼠的GSH-PX和 LDH活力的作用(P＜0.01和P＜0.001)，346.7mg/kg本发明也能显著升高模型动物的LDH 活力(P＜0.01)，与原发明组比较疗效相当。

表9本发明夹闭再灌注脑损伤沙土鼠脑组织MDA含量和大脑皮层含水量影响(X±SD)

组 别  剂量×天数  (mg/kg×d)  鼠数  (只)  MDA含量  (％)   大脑皮层含水量   (％) 假手术组 模型组 原发明组 本发明大剂量组 本发明中剂量组 本发明小剂量组  --  --  693.4×10  693.4×10  346.7×10  173.4×10  10  10  10  10  10  10  3.39±1.65  3.92±1.74  5.16±2.73  4.15±1.08  3.22±0.82  2.70±1.52   60.25±7.79   68.51±7.81^△  60.06±6.96^*  59.23±9.98^*  66.85±6.69   64.6±8.01

注：①模型组与假手术组比较△P＜0.05②各给药组与模型组比较*P＜0.05

表9结果显示，693.4mg/kg本发明有明显降低脑缺血再灌注沙土鼠的大脑皮层含 水量(P＜0.05)，疗效与原发明组相当。

表10本发明对沙土鼠脑缺血再灌注后海马CA₁区神经元密度的影响(X±SD)

组 别  剂量×天  (mg/kg×d)     鼠数     (只) 神经元密度 (个/2高倍视野) 假手术组 模型组 原发明组 本发明大剂量组 本发明中剂量组 本发明小剂量组  --  --  693.4×10  693.4×10  346.7×10  173.4×10     10     10     10     10     10     10 223.00±16.51 116.90±12.73^△△139.20±16.47^**172.80±18.52^***#159.10±16.60^***159.00±10.80^***

注：①模型组与假手术组比较△△P＜0.01②各给药组与模型组比较**P＜0.01，***P＜0.001； ③与原发明组比较，#P＜0.05。

表10结果显示，693.4～173.4mg/kg本发明分别能极显著和显著减轻沙土鼠全脑 缺血再灌注后海马CA₁区神经元的损伤，增加其存活率(P＜0.001、P＜0.001和P＜0.01)， 其中本发明大剂量组与原发明组比较具有显著性差异(P＜0.05)。

(2)小鼠断头法全脑缺血模型试验

1实验方法

取昆明种小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，每组10只。按表11所示药物和 剂量尾静脉注射给药，每天1次，连续5天，于末次给药后15min，将小鼠逐只断头， 记录断头后张口喘气次数，结果见表11。

2实验结果

表11  本发明对小鼠断头法全脑缺血试验的影响(X±SD)

组别     剂量×次数     (mg/kg×c)     鼠数     (只)     张口喘气次数     (次) 模型组 原发明组 本发明大剂量组 本发明中剂量组 本发明小剂量组     5％葡萄糖注射液×5     693.4×5     693.4×5     346.7×5     173.4×5     10     10     10     10     10     8.70±2.63     11.60±2.17^**    12.40±2.63^**    11.40±2.32^*    10.00±1.83

注：给药组与模型组比较*p＜0.05 **p＜0.01。

表11结果显示，693.4和346.7mg/kg本发明分别有显著和明显增加断头小鼠张口 喘气次数的作用(p＜0.01和p＜0.05)，效果与原发明组相当。

实验三对戊巴比妥钠所致小鼠记忆获得障碍的改善作用(跳台法)

1实验方法

给药：取健康昆明种小鼠60只，雌雄各半，鼠龄8周，体重18～22g，，按体重随 机分为6组，每组10只，按表16所示药物和剂量连续给药10天。

训练：给药1小时后开始训练，训练前10分钟各组小鼠分别腹腔注射戊巴比妥钠 20mg/kg。每批实验各组分别有一只小鼠给药，平行操作，十分种后第2批小鼠给药， 以此类推。训练时将第一批小鼠放入跳台仪的格子内，先适应环境3分钟，然后通电， 小鼠遭电击后，多数跳上跳台，逃避电击。此后小鼠也会再次跳下时触电，视为错误反 应，训练5分钟，并记录5分钟内触电次数，24小时后重新测试。

测试：24小时后，先将小鼠放在跳台上，同时开动秒表，记录小鼠5分钟内跳下次 数(即错误次数)，作为记忆指标。统计分析采用T检验法，分别将各组记忆指标与模 型组进行比较，试验结果见表12。

2实验结果

表12本发明对戊巴比妥钠所致小鼠记忆获得障碍的影响(x±SD)

    组别     剂量×天     (mg/kg×d)     鼠数     (只)     错误反应次数     正常对照组     模型组     原发明组     本发明大剂量组     本发明中剂量组     本发明小剂量组     --     --     693.6×10     693.6×10     346.7×10     173.4×10     10     10     10     10     10     10     1.44±0.49     3.63±0.663^△△    1.52±0.50^**    0.70±0.64^***#    2.10±1.22^**    1.40±1.36^**

注：①模型组与对照组比较△△P＜0.01②各给药组与模型组比较***P＜0.001，**P＜0.01； 与原发明组比较，#P＜0.05。

表12结果显示，模型组与空白组比较，模型组5分钟内错误次数显著增多(P＜0.01)， 说明戊巴比妥钠腹腔注射已造成记忆获得障碍。693.6和346.7mg/kg本发明和原发明组 均能显著减少该模型动物5分钟内错误次数(P＜0.01)，其中本发明与原发明组比较具 有显著性差异(P＜0.05)，其它剂量与原发明组疗效相当。

实验四  冠心病药效学试验

(1)抗心肌缺血试验

1.1犬冠状动脉前降支结扎法所致心肌梗塞模型试验

1实验方法

健康犬30只，雌雄兼用，用戊巴比妥纳30mg/kg静脉麻醉后气管插管(备 作开胸时人工呼吸用)，分离左侧颈总动脉，插入适当口径的聚乙稀管(内充满肝 素生理盐水)，连接压力换能器测定外周血压(AP)，股静脉插管接输液管以备给 药，同时测定心电图(ECG II)。从胸骨左缘沿第四或第五肋间开胸，切开一根 肋骨并用撑开器撑开使全心充分暴露。剪开心包作心包吊篮，插入适当口径的聚 乙稀管(内充满肝素生理盐水)，连接压力换能器测定左室内压(LVP)，左心室舒 张未期压(LVEDP)及左心室内压最大上升速率(LV+dp/dt)和最大下降速率 (LV-dp/dt)；分离深主动脉根部，用多谱勒超声血流探测仪测定主动脉血流速度(用 于折算心输出量CO)。除直接测取上述参数外，按公式1^[1]计算，间接测定左心室 心肌耗氧量。以上指标均同步记录于泰盟BL-420型生物机能信号系统上，等各 项指标稳定后，按表12所示药物和剂量经静脉恒速滴注，注射容量均为2ml/ kg，注射前、注射后15min两个时间点，均记录上述各项参数一次。然后于左冠 状动脉前降支(LAD1/3处，供应心室前壁及心尖部的第一级血管分支起始部)双 重结扎，结扎后5、10、15、30、60和120分钟分别开机记录上述各项参数。并 在结扎LAD前和结扎后3小时，取静脉血测定乳酸脱氢酶(LDH)和磷酸肌酸激酶 (CPK)含量；然后迅速放血摘取心脏，NBT染色法称重并计算心室梗塞范围(按公 式2计算)用配对T检验对模型组给药前后差异进行显著性比较，用组间T检验 对各试验组间结扎LAD增减比率(按公式3计算)进行显著性比较，结果见表13。

公式1：左心室心肌耗氧量

${\mathrm{MVO}}_2=K_1(\mathrm{BPs}\times \mathrm{HR})+K_2\frac{(0.8\mathrm{BPs}+0.2\mathrm{BPd})\times \mathrm{HR}\times \mathrm{SV}}{\mathrm{BW}}+1.43$

MVO₂＝左心室心肌耗氧量(ml 0₂/min/100g)，

K₁＝4.08×10^-4，K₂＝3.25×10^-4，

BPs＝收缩压(mmHh)，BPd＝舒张压(mmHh)，

HR＝心率(bats/min)，SV＝每搏输出量(ml/beat)，BW＝体重(kg)

公式2：心室梗死范围

公式3：结扎LAD增减比率

2实验结果

2.1本发明对心肌缺血酶学指标及左室梗塞范围的影响

表13对麻醉犬结扎LAD心肌缺血酶学指标及左心室梗塞范围的影响(X±SD，N＝6)

  组别 剂量 (mg/kg)  LDH(U/L)     CPK(U/L)  左室梗塞范围  (％)  结扎前 结扎后     结扎前 结扎后   5％葡萄糖组   原发明组   本发明大剂量组   本发明中剂量组   本发明小剂量组 5％葡萄糖注射液 346.7 346.7 173.4 86.70 43.00±16.80  46.83±1.60  48.83±13.48  46.83±16.34  44.83±13.57 335.50±106.27 257.00±55.54 114.00±19.65**^#121.33±18.21**^#329.33±105.32     64.17±13.57     71.00±21.68     82.00±17.65     97.67±49.73     69.83±15.59 307.17±63.01 218.67±54.80* 139.67±19.53**^#204.33±40.71** 264.33±153.32  15.70±2.15  12.85±2.12*  11.04±2.01**  11.76±1.83**  13.56±3.81

注：各给药组与5％葡萄糖组比较*P＜0.05  **P＜0.01；与原发明组比较，#P＜0.05。

由表13可见，本发明大、中剂量组静脉给药后，可使左心室梗塞范围分别显著和明显缩小(P＜0.01)、可显著降低模型动物 的LDH和CPK(P＜0.01)。与原发明组比较，本发明大剂量组具有更为显著降低模型动物的LDH和CPK(P＜0.01)的疗效(P＜0.05)。

1.2本发明对对麻醉犬结扎LAD心肌缺血模型心脏功能的影响

表14对麻醉犬结扎LAD心肌缺血模型的心外膜电图的影响(X±SD，n＝6)

 指标   组别     剂量     (mg/kg)   对照   结扎LAD增减比率   药前   药后15min   5min  10min  15min     30min   60min 120min  E_piECC  ST位移  (mv)   5％葡萄   糖组   原发明   本发明   大剂量   本发明   中剂量   本发明   小剂量     --     346.7     346.7     173.4     86.7   0.09±0.05   0.11±0.03   0.11±0.04   0.13±0.04   0.16±0.09   0.10±0.05   0.11±0.04   0.11±0.55   0.12±0.04   0.15±0.08   0.71±2.01   0.30±0.15   -0.08±0.34^**#  0.02±0.20^**#  0.32±0.55  0.88±1.81  0.38±0.17^* 0.1±0.22^**# 0.20±  0.10^*# 0.41±0.70^* 0.17±0.24  0.52±0.29  -0.04±0.20  0.26±0.26  0.17±0.31     0.88±1.00     0.54±0.28     0.01±0.30^**##    0.07±0.15^**##    0.16±0.24^**##  0.30±1.04   0.72±0.25   0.08±0.30^*##  0.46±0.24   0.13±0.41 0.79±2.18 0.77±0.62 0.10±0.84^**##0.29±0.14^**##0.28±0.37^**##

注：各给药组与5％葡萄糖组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与原发明组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

表14结果显示，大剂量本发明组可明显或显著缓解结扎冠状动脉前降支后心肌缺血所致ST段抬高(P＜0.01)，可持续10分钟， 与原发明组比较，本发明各剂量组均有不同程度的显著性差异，具有更好的疗效。

1.3对心肌缺血模型动物心脏收缩和舒张功能及耗氧指数的影响见表15～19。

表15本发明对麻醉犬结扎LAD心肌缺血LV+dp/dt的影响(X±SD，n＝6)

    指标     组别     剂量     (mg/kg     )     对照 结扎LAD增减比率     药前     药后15min 5min     10min   15min     30min     60min   120min     LV+dp/dt     (mmHg     /sec)     5％葡萄     糖组     原发明     本发明     大剂量     本发明     中剂量     本发明     小剂量     --     346.7     346.7     173.4     86.7     2112.83     ±751.45     1581.33     ±419.65     1327.33     ±541.79     1615.33     ±415.79     1433.67     ±534.45     1621.00     ±375.91     1471.33     ±181.33     1099.83     ±456.62     1488.50     ±325.83     1370.50     ±602.59 -0.36 ±0.13 -0.17 ±0.18^*0.12 ±0.48^**0.02 ±0.14^**##0.11 ±0.65^**##    -0.29     ±0.45     -0.14     ±0.09^*    0.07±     0.37^***##    -0.01     ±0.13^**#    -0.07     ±0.51^**  -0.45   ±0.15   -0.35   ±0.20   0.02   ±0.41^**##  -0.08   ±0.14^**#  -0.02   ±0.55^**#    -0.33     ±0.42     -0.25     ±0.27     0.07     ±0.35^***##    -0.04     ±0.15^**#    -0.09     ±0.41^**    -0.37     ±0.23     -0.30     ±0.24     -0.05     ±0.42^*#    -0.11     ±0.19^*    0.02     ±0.51^**##  -0.50   ±0.21   -0.34   ±0.12   -0.09   ±0.29^*#  -0.21   ±0.31   -0.14   ±0.49^*

注：各给药组与5％葡萄糖组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与原发明组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

表16本发明对麻醉犬结扎LAD心肌缺血LV-dp/dt的影响(X±SD，n＝6)

  指标     组别     剂量     (mg/kg)     对照   结扎LAD增减比率     药前     药后15min   5min     10min   15min   30min     60min     120min   LV-dp/dt   (mmHg/sec)     5％葡萄     糖组     原发明     本发明大     剂量组     本发明中     剂量组     本发明小     剂量组     --     0.75     346.7     173.4     86.7     1783.17     ±796.19     1581.33     ±419.65     1424.50     ±480.05     1249.17     ±221.26     1272.00     ±504.15     1230.50     ±446.25     1471.33     ±181.33     1331.17     ±313.04     1206.50     ±174.55     1135.00     ±319.23   -0.36   ±0.21   -0.30   ±0.17   -0.05   ±0.22^**##  -0.01   ±0.30^**##  -0.14   ±0.39^*#    -0.33     ±0.37     -0.17     ±0.17^*    0.00     ±0.20^**#    0.16     ±0.30^***##    -0.15     ±0.32   -0.44   ±0.27   -0.38   ±0.19   -0.14   ±0.13^*#  -0.15   ±0.26^*#  -0.14   ±0.33^*#  -0.27   ±0.56   -0.28   ±0.27   0.01   ±0.16^**#  -0.26   ±0.23   -0.13   ±0.32^*    -0.36     ±0.27     -0.30     ±0.30     -0.07     ±0.37^*#    -0.22     ±0.28     -0.17     ±0.37     -0.50     ±0.30     -0.58     ±0.46     -0.19     ±0.50^*#    -0.26     ±0.19^*#    -0.23     ±0.30^*#

注：各给药组与5％葡萄糖组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与原发明组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

表17本发明对麻醉犬结扎LAD心肌缺血模型LVP的影响(X±SD，n＝6)

  指标   组别     剂量     (mg/kg)     对照   结扎LAD后增减比率     药前   药后15min   5min     10min     15min     30min     60min     120min   LVP   (mmHg)   5％葡萄   糖组   原发明   本发明   大剂量组   本发明   中剂量组   本发明   小剂量组     --     346.7     346.7     173.4     86.7     60.30     ±15.50     70.90     ±16.14     67.30     ±12.52     63.60     ±13.41     55.40     ±17.65   57.18   ±13.35   68.00   ±14.55   60.83   ±7.17   61.93   ±15.72   49.90   ±13.77   -0.06   ±0.16   -0.19   ±0.22   -0.05   ±0.18   -0.02   ±0.28   -0.05   ±0.36     -0.18     ±0.13     -0.20     ±0.19     -0.03     ±0.11^*#    -0.12     ±0.29     -0.05     ±0.30^*#    -0.20     ±0.13     -0.30     ±0.17     -0.04     ±0.09^*##    -0.11     ±0.27^#    -0.06     ±0.30^#    -0.23     ±0.14     -0.30     ±0.21     -0.03     ±     0.07^**##    -0.16     ±0.24     -0.07     ±0.26^*#    -0.24     ±0.20     -0.34     ±0.16     -0.05     ±0.14^**##    -0.14     ±0.25^#    -0.09     ±0.31^*#    -0.27     ±0.13     -0.35     ±0.13     -0.15     ±0.24^#    -0.12     ±0.15^*#    -0.10     ±0.22^*#

注：各给药组与5％葡萄糖组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与原发明组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

表18本发明对麻醉犬结扎LAD心肌缺血模型LVEDP的影响(X±SD，n＝6)

  指标   组别   剂量   (mg/kg)   对照     结扎LAD后增减比率   药前   药后   15min     5min   10min   15min   30min   60min   120min   LVEDP   (mmHg)   5％葡萄   糖组   原发明组   本发明大   剂量组   本发明中   剂量组   本发明小   剂量组   --   346.7   346.7   173.4   86.7   3.62   ±1.67   4.25   ±1.48   3.12   ±1.55   3.20   ±1.04   3.48   ±1.96   3.05   ±2.05   4.13   ±1.11   3.43   ±2.17   3.40   ±0.86   3.37   ±1.62     0.75     ±1.66     0.29     ±0.57^*    -0.17     ±0.46^***#    0.14     ±0.20^**    0.09     ±0.41^**  -0.02   ±0.78   0.26   ±0.51   -0.13   ±0.32   0.13   ±0.15   0.06   ±0.32   0.02   ±0.78   0.55   ±1.03   -0.04   ±0.28^*##  0.26   ±0.32^#  0.09   ±0.29^##  0.10   ±0.85   0.13   ±0.28   -0.22   ±0.22^*#  0.14   ±0.29   -0.02   ±0.27^*#  1.07   ±1.88   0.09   ±0.35   -0.20   ±0.21^*#  0.22   ±0.47^*  0.12   ±0.43^*  0.56   ±0.86   0.42   ±0.98   0.25   ±0.37^*  -0.14   ±0.49^**##  0.58   ±0.82

注：各给药组与5％葡萄糖组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与原发明组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

表15～18结果显示，本发明各剂量组对结扎冠状动脉前降支后心肌收缩能力(LVP和LV+dp/dt)的下降有明显或显著的改善作 用(P＜0.05或P＜0.01)，可持续30min；对缺血心肌的舒张能力(LVEDP和LV-dp/dt)的下降也有明显或显著的改善作用(P＜0.05或 P＜0.01)。本发明多项考察指标与原发明组比较具有不同程度的显著性差异，具有更好的疗效。

表19本发明对麻醉犬结扎LAD心肌缺血耗氧指数的影响(X±SD，n＝6)

    指标   组别   剂量   (mg/kg)   对照     结扎LAD后增减比率   药前   药后15min     5min   10min   15min   30min     60min     120min     MVO₂    (mlO₂/     min/100g)   5％葡萄   糖组   原发明组   本发明   大剂量组   本发明   中剂量组   本发明   小剂量组   --   346.7   346.7   173.4   86.7   12.64   ±4.65   15.31   ±4.51   17.43   ±2.85   18.85   ±2.29   17.29   ±3.22   13.29   ±4.62   13.96   ±2.85   15.09   ±2.14   17.59   ±2.17   15.81   ±3.04     -0.03     ±0.07     -0.11     ±0.16     -0.22     ±0.16^*#    -0.14     ±0.12     -0.09     ±0.07   -0.01   ±0.13   -0.14   ±0.13^*  -0.21   ±0.16^**#  -0.20±   0.09^**#  -0.17   ±0.03^**  -0.10   ±0.10   -0.21   ±0.16^*  -0.22   ±0.24^*  -0.20   ±0.09^*  -0.16   ±0.04   -0.14   ±0.14   -0.25   ±0.12^*  -0.26   ±0.23^*  -0.25   ±0.10^*  -0.26   ±0.05^*    -0.18     ±0.25     -0.31     ±0.12^*    -0.32     ±0.28^*    -0.33     ±0.14^*    -0.28     ±0.08^*    -0.26     ±0.22     -0.35     ±0.10     -0.37     ±0.21     -0.36     ±0.13     -0.34     ±0.12

注：与5％葡萄糖组比较，*P＜0.05 **P＜0.01；与原发明组比较，#P＜0.05。

表19结果可见本发明大、中剂量组对缺血心肌耗氧量有明显或显著的降低作用(P＜0.05或P＜0.01)，可持续30min。表明本品有 降低心肌耗氧量的作用。与原发明组比较，在10min内有显著性差异，具有更好疗效。

(2)药物法所致心肌缺血模型试验

1实验方法

健康草犬50只，体重8.5～13.5kg，雌雄兼用，分为5组，每组10只。经用戊巴比妥纳30mg/kg静脉麻醉，背位固 定后用泰盟BL-420型生物机能信号系统记录一段正常II导联ECG，然后iv垂体后叶素1u/kg，在给药后15s、30s、1min、 2min、3min、4min、5min、10min、15min、20min分别记录II导联ECG，并以其中任何一时间的T波或ST段升高0.1mv或

下降0.05mv作为心肌缺血阳性动物数，试验结果用Fisher精确检验进行组 间显著性差异比较，结果见表20。

2实验结果

表20本发明对犬由垂体后叶素诱发急性心肌缺血的影响

    组别     药物剂量     (mg/kg/d)   动物数   (只)     心肌缺血动物数     P     阳性数     阴性数     模型组     原发明组     本发明大剂量组     本发明中剂量组     本发明低剂量组     5％葡萄糖×1     346.7×1     346.7×1     173.4×1     86.7×1   10   10   10   10   10     10     3     4     5     7     0     7     6     5     3     ＜0.01     ＜0.01     ＜0.05     ＞0.05

表20结果显示，本发明大、中剂量组能显著和明显对抗垂体后叶素诱发的 急性心肌缺血(P＜0.01和P＜0.05)，且346.7～86.7mg/kg本发明有明显的量效关 系。与原发明组比较，相同剂量下疗效相当。

(3)抗低糖低氧对培养心肌细胞损伤的保护作用

1实验方法

选用Wistar大鼠乳鼠，在无菌操作下取心室肌剪碎至1mm³，Hanks液冲洗后 用胰蛋白酶多次消化、离心、沉淀后，用15％小牛血清悬浮、计数，调整浓度为 3×10⁶/培养瓶(25ml)，37℃5％CO₂孵箱培养4～6天，铺满呈单层细胞后备用。试 验分为六组，每组10瓶：①正常对照组(用有糖有氧的DMEM培养液培养)；②模 型对照组(用不含葡萄糖的DMEM培养液培养)；③心得安注射液组；④～⑥分别为 红灯注射液高、中、低三个剂量实验组。除①外，其余各组每一个细胞培养瓶内 加3ml充氮药液并充氮30秒(流量1L/分)，旋紧瓶盖。封闭培养6小时后，取上 清液按照LDH、AST和CK测试盒说明进行样品处理，用Beckman DU640型紫外可见分光 光度计，分别在440nm、565nm和660nm下测定光密度，计算心肌细胞损伤后释放至培 养基中的LDH、AST和CK含量。并用T检验比较组间差异，结果见表21。

表21本发明对缺氧缺糖条件下心肌细胞LDH、AST和CK的影响(n＝10，X±SD)

组别     药物剂量     (mg/ml)   LDH   (u/L)     AST     (u/L)     CK     (u/L) 正常对照组 缺氧缺糖模型组 原发明组 本发明大剂量组 本发明中剂量组 本发明小剂量组     -     -     20.8     20.8     2.08     0.208   1221.73±103.81   2968.38±391.50^△△△  2377.80±205.95^*  1259.96±148.20^***#  1563.31±76.35^***#  1784.39±535.48^**    12.36±2.06     23.50±2.05^△△△    23.06±1.81     13.25±1.62^*#    13.26±1.93^*#    20.86±1.31     10.13±1.21     24.63±1.60^△△△    20.53±2.32     11.45±2.08^**#    13.08±0.18^**#    16.43±1.4^*

注：①模型组与对照组比较△△△P＜0.001②各给药组与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，*** P＜0.001③与原发明组比较，#P＜0.05。

表21结果显示，缺氧缺糖模型组LDH、AST和CK较正常对照组均极显著升高 (P＜0.001)，说明缺氧缺糖模型组心肌细胞已经受到损伤。与模型组比较，20.8～ 0.208mg/ml本发明的LDH和CK均有不同程度的显著性降低，其中与原发明组比较，本 发明的大、中剂量组具有显著性差异(P＜0.05)，具有更好的疗效；本发明的大、中剂 量组对AST分别亦有显著降低(P＜0.05)，与原发明组比较，也有显著性差异，具有更 好的效果。20.8～0.208mg/ml本发明有明显量效关系(P＜0.05)，20.8mg/ml本发明的 AST和CK已恢复至正常。表明本发明20.8～0.208mg/ml剂量对体外培养心肌细胞缺氧 缺糖性损伤有直接的保护作用。

药理对比实验总结：通过上述的治疗脑中风后遗症和抗冠心病两大药效学试验的结 果可以看出，本发明和原发明在相同剂量给药的情况，在多项实验指标上均具有明显的 优越性，达到了显著性差异，还有小部分的实验指标疗效相当，甚至本发明的剂量比原 发明小一个等级的情况，也存在多项实验指标具有明显疗效的情况，由此可以看出，本 发明的药效综合起来比较，比原发明具有突出的优越性，比原发明有着意想不到的效果。