断开分子间的非共价结合相互作用的手段和方法

摘要

本发明涉及多聚蛋白质类分子，所述蛋白质类分子包含至少两个通过非共价相互作用区域互相结合的成员，其中第一个所述成员包含条件反应性基团，该基团当被活化时能切割所述第一成员当中的共价键。共价键的切割导致所述至少两个成员据以通过所述非共价相互作用区域互相结合的结合强度减少。结合强度的减少能导致各成员在温和条件下分离。

说明书

本发明涉及结合分子的领域。本发明具体涉及断开多聚蛋白质 类分子的各成员之间非共价相互作用的手段和方法。

非共价相互作用非常重要，特别是在生物学领域。非共价结合 将DNA双螺旋的两条链保持在一起(氢键)，将多肽折叠成诸如α螺 旋和β构象的二级结构，使酶能够结合其底物，使抗体能够结合其 抗原，使转录因子能够结合互相结合，使转录因子能够结合DNA， 使蛋白质(例如一些激素)能够结合其受体，使诸如核糖体、肌动蛋白 纤丝、微管等等的大分子体系得以装配。

非共价力主要有三种，即离子相互作用、疏水相互作用和氢键。

以蛋白质相互作用为例的离子相互作用

在任何特定pH下，蛋白质都具有带电荷基团，它们可参与进行 相互结合或结合到其它类型的分子。例如，天冬氨酸(Asp)和谷氨酸 (Glu)残基上的带负电荷的羧基被赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)残基上的 带正电荷的质子化氨基吸引。

离子相互作用对pH变化非常敏感。随着pH的下降，H+会结合 天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)的羧基(COO-)而中和它们的负电荷，且 H+会结合赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)的氨基(NH2)氮原子上的未占用 电子对而赋予它们正电荷。结果是：不仅分子上的净电荷发生变化(分 子变得更加阳性)，而且分子的侧链基团或主链基团所具有的与其它 分子和离子发生离子(静电)相互作用的许多机会也被改变了。随着pH 的上升，H+从Asp和Glu的COOH基团被除去而赋予它们负电荷 (COO-)，且H+从Lys和Arg的NH3+基团被除去而将它们的正电荷 除去。结果是：分子上的净电荷发生变化(分子变得更加阴性)，而且 分子的侧链基团或主链基团所具有的与其它分子或离子发生静电相 互作用的许多机会也被改变了。

离子相互作用也对盐浓度敏感。盐浓度增加会给带电荷的残基 提供竞争性离子，从而减少离子结合的强度。

以蛋白质相互作用为例的疏水相互作用

氨基酸如苯丙氨酸和亮氨酸的侧链(R基团)是非极性的，因此与 极性分子如水的相互作用差。因此，球状蛋白质中的大多数非极性 残基朝向分子的内部，而诸如天冬氨酸和赖氨酸的极性基团则在暴 露于溶剂的表面上。当在两种不同分子的表面处有非极性残基暴露 时，从能量上来说更有利的是它们的两个“油性”非极性表面紧密 靠在一起，而将它们之间的极性水分子排除掉。

疏水相互作用的强度并不明显受到pH变化和盐浓度变化的影 响。

以蛋白质相互作用为例的氢键

只要强电负性原子(例如氧、氮)接近与另一强电负性原子共价连 接的氢原子，就可形成氢键。

一些普通实例是：蛋白质中各个分离肽键的-C＝O基团与H-N- 基团之间的氢键(产生α螺旋和β构型)；-C＝O基团与蛋白质和糖类 中丝氨酸和苏氨酸残基的羟基(H-O-)及半胱氨酸的SH基团之间的氢 键。

非共价相互作用的特征是，它们单独弱小，但集体强大。所有 三种形式的非共价相互作用单独与共价键(键能为90-100kcal/摩尔)相 比是弱的(键能为5kcal/摩尔左右)。存在着中间键能(即15-70kcal/摩 尔之间)的键类型。对于本发明，这种类型的键如果它们本身在一定 环境中不足以使两个蛋白质类分子发生缔合，则认为是非共价键。 换句话说，非共价键是需要其大量的相互作用一齐发挥才能将结构 保持在一起的键。这些相互作用确实具有的有限强度要求相互作用 的基团能够紧密靠近在一起(一埃或更近的距离)。

因此，包含两个或更多个成员的多聚体在一方面如果其两个或 更多个成员通过至少3个、优选至少5个各自键能小于90-100 kcal/ 摩尔的键连接的话，则可以说是通过非共价键保持在一起。典型的 连接两条蛋白质链的半胱氨酸二硫键其键能为约65 kcal/摩尔。但是， 这个键的强度非常依赖于还原/氧化环境。因此对于本发明来说，当 将多聚体的两个或更多个成员链连接在一起的键其各自的键能小于 65 kcal/摩尔、通常小于20 kcal/摩尔时，则说该多聚体是通过非共价 键保持在一起的。通常每个所述键的结合能是5 kcal/摩尔左右。因此， 多聚体中通过非共价键保持在一起的两个或更多个成员具有的大量 非共价相互作用一齐发挥作用而将结构保持在一起，且其具有的表 面状况使得至少两个相互作用的表面的大部分面积能够相互紧密靠 近；也就是说，它们必须互相配合。

本发明利用了这个特征：为通过非共价相互作用的区域保持多 聚蛋白质类分子中的结构，需要许多弱键。在本发明中，通过切断 至少一个多聚体成员中的至少一个共价键，多聚体中参与所述非共 价相互作用的所述至少一个成员被断开成至少两个新成员。切割一 个共价键会产生出比原始多聚体多一个成员的多聚体。切割两个共 价键则产生出多了两个成员的多聚体，依此类推。切割多聚体中的 至少一个共价键，会导致多聚体中每个成员的非共价相互作用数量 减少。在本发明中，该减少被用来使至少一个成员从多聚体上解离 下来。在本发明中，切割共价键用于减少多聚体中每个成员的非共 价键数量，使得非共价键不足以维持多聚体的完整性，或者切割共 价键用于改变其中发生该修饰的成员的构象，从而使至少一个成员 从多聚体上释放出来。释放出至少一个成员后，余下的各成员可以 是单体、多聚体或它们的组合。肽中共价键的切割可通过酶法、化 学法或物理法来实现。本发明所用的共价键切割优选为化学法或物 理法切割，即优选为非酶法切割。更优选的是通过化学法或光诱导 法来切割键。另外优选的是切割肽骨架中的共价键。优选切割的共 价键是位于肽键近邻的键(因此是氮原子另一侧的键)。

本文所用的术语多聚蛋白质类分子指含有两个或更多个通过非 共价相互作用区域互相缔合的成员的蛋白质类分子。至少有两个成 员只通过非共价相互作用而不是通过共价相互作用互相连接。多聚 蛋白质类分子和多聚蛋白质这两个术语在本文描述中可互换使用。 本发明的多聚蛋白质类分子通常含有至少一个多肽。

术语非共价相互作用区域指两个或更多个成员通过至少3个、 优选至少5个非共价键发生缔合和相互作用的区域。该非共价相互 作用区域优选不包含将所述两个或更多个成员互相连接在一起的共 价键。明确知道的是，并非所有的原子都参与所述区域中的非共价 相互作用。同样，如果该区域是两条(多)肽发生缔合的区域，并不要 求所有的氨基酸都参与该区域中的非共价相互作用。

单体在本文中用以指当所有的非共价键都被断开时其中的结构 单元仍共价缔合在一起的分子。多聚体中的超过一个的单体可以相 同或相互不同。

成员这个术语在本文中用以指与其另一成员非共价连接的多聚 体实体(entity)。这两个成员不通过共价键来连接。成员优选是但不一 定是蛋白质类分子。成员通常是但不一定是多肽。本发明的多聚蛋 白质类分子优选是多聚蛋白质。本发明的多聚蛋白质优选包含有包 含肽的第一成员和包含(多)肽和/或蛋白质的至少第二成员。所述肽优 选包含所述条件反应性基团(conditionally reactive group)。

蛋白质类分子包含至少两个通过肽键互相连接在一起的氨基 酸。它通常含有至少8个通过肽键互相连接在一起的氨基酸或其功 能等同物。

在本发明中，多肽含有至少50个通过肽键互相连接在一起的氨 基酸或其功能等同物。多肽在其非折叠状态通常是线性分子，但也 可是(部分)圆形的。肽通常含有至少4-49个通过肽键互相连接在一 起的氨基酸。优选地，肽含有3-49个氨基酸，优选3-30个，更优选 3-20个氨基酸。本发明所用的(多)肽可包含任何氨基酸或氨基酸链。 氨基酸可以是天然或合成氨基酸，例如α、β或γ或更高的(ω)氨基酸， 即氨基和羧酸之间间隔1、2、3或更多个碳。氨基酸(链)可以是天然 氨基酸(链)或合成氨基酸(链)或它们的组合。肽是天然肽或合成肽或 它们的组合。同样，肽在其非折叠状态通常是线性的，但也可以是(部 分)圆形的。肽通常不具有显著的三级结构。它通常适应多种三级结 构。本发明所用的肽通常容易溶解于各种溶剂中。这种溶剂例如是 生理溶液如生理氯化钠溶液。作为MHC-分子的配体的抗原肽通常具 有8-25个通过肽键连接的氨基酸。(多)肽可被修饰或不被修饰。典 型的修饰包括由细胞机制(cellular machinery)如聚糖添加和磷酸化产 生的修饰。但是，其它类型的修饰也在本发明的范围内。

氨基酸的功能等同物是能取代氨基酸链中的一个或多个氨基酸 的分子。功能等同物优选能够在两个单独的位置与氨基酸成键，以 至于它能构成(多)肽或模拟肽链的内在部分。功能等同物并不必须具 有天然对等物。这种功能等同物可掺入到本发明的肽或多肽中。

在本发明的一个方面，被切割的共价键优选是连接一个成员链 中的两个氨基酸或其衍生物/类似物的骨架键。共价键的切割优选通 过将条件反应性基团掺入到其中需要断开至少一个共价键的成员(优 选肽成员)中来实现。在本发明中，术语条件反应性基团用以指被掺 入到所述成员中的反应性基团。术语“条件性”用以表示反应性基 团能有条件地被活化，即响应信号或触发物而被活化。条件反应性 基团的数量可随意变化。条件反应性基团也可例如通过将其掺入到 新生(多)肽链中而放置在该成员的精确位置。在一个实施方案中，放 置所述一个或多个条件反应性基团，使得共价键在该成员与多聚体 中至少一个其它成员的非共价相互作用区域被断开。在另一个实施 方案中，放置所述一个或多个条件反应性基团，使得该配体(例如成 员)的优选构象被改变，以至于与多聚体的其它成员相互作用的亲和 力减少。

在一个方面，本发明提供包含至少两个通过非共价相互作用区 域互相结合的成员的多聚蛋白质类分子，其中至少一个所述至少两 个成员包含条件反应性基团，该基团当被活化时能切割所述成员当 中的共价键，从而将所述成员切割成至少两个更小的成员，而这又 会减少所述区域中的非共价相互作用的强度。某成员中的共价键的 切割会导致所产生的链的折叠自由度更大，从而减少多聚体中所述 一个或多个所产生的链具有的任何非共价相互作用的强度。在一个 优选的实施方案中，所述成员在所述非共价相互作用区域当中被切 割。这会导致所述区域中的非共价相互作用的强度下降得最多。被 所述条件反应性基团切割的键可通过将该反应性基团适当安置在肽 链中来选择。所述成员的切割导致产生尺寸更小的肽链。优选最长 的所述所产生的肽比所述成员短至少20％，优选短至少30％。

本发明还提供包含至少两个通过非共价相互作用区域互相结合 的成员的多聚蛋白质类分子(多聚体)，其中至少一个所述至少两个成 员包含具有条件反应性基团的(多)肽链，且其中当所述反应性基团被 活化时，所述成员当中的共价键被断开，导致所述(多)肽被切割成至 少两个更小的(多)肽，从而减少所述非共价相互作用的强度。

在一个优选的实施方案中，所述条件反应性基团包含光敏感基 团或高碘酸盐敏感基团。在这些实施方案中，将反应性基团活化的 条件性步骤是存在着或不存在确定波长范围内的光线，或者是高碘 酸盐敏感基团暴露于高碘酸盐。在一个优选的实施方案中，所述光 敏感反应性基团是紫外光敏感基团。条件反应性基团优选被掺入到(多) 肽中。在一个优选的实施方案中，所述紫外光敏感基团包含3-氨基- 3-(2-硝基苯基)丙酸(Carlos J.Bosques和Barbara Imperiali.Journal of the American chemical society 2003第125卷第7530-7531页)。该氨 基酸可从Alpha Aesar市售获得(要用Fmoc保护基进行保护，以与固 相肽合成相容)，或者是邻硝基苯基甘氨酸(Alvie L. Davis，David R. Smith和Tommy J.Mc Cord.Synthesis and microbiological properties of 3-amino-1-hydroxy-2-indolinone and related compounds.Journal of Medicinal Chemistry 1973，第16卷第1043-1045页)，或者是这种分 子的功能等同物。3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸的功能等同物是3-氨基- 3-(4-硝基苯基)丙酸。邻硝基苯基甘氨酸的功能等同物是对硝基苯基 甘氨酸。

在另一个优选的实施方案中，所述高碘酸盐敏感基团包含1，2- 二羟基部分或其功能等同物。存在着与高碘酸盐和1，2-二羟基体系等 同的替代体系。这种体系是1-氨基-2-羟基体系和含有高碘酸盐可切 割位点的多元醇、碳水化合物、糖-氨基酸杂合物。二羟基乙烯肽电 子等排物描述于Suvit Thaisrivongs，Alfredo G.Tomasselli，Joseph B. Moon，John Hui，Thomas J.McQuade，Steve R.Turner，Joseph W. Strohbach，W.Jeffrey Howe，W.Gary Tarpley，Robert L. Heinrikson. Inhibitors of the protease from human immunodeficiency virus：design and modelling of a compound containing a dihydroxyethylene isostere insert with high binding affinity and effective antiviral activity(来自人免 疫缺陷病毒的蛋白酶的抑制剂：具高度结合亲和力和有效抗病毒活 性的含有二羟基乙烯电子等排物插入片断的化合物的设计和建模). Journal of Medicinal Chemistry 1991，第34卷第2344-2356页；Suvit Thaisrivongs，Steve R.Turner，Joseph W.Strohbach，Ruth E.TenBrink， W.Gary Tarpley，Thomas J.McQuade，Robert L. Heinrikson，Alfredo G. Tomasselli，Joseph B.Moon，John O Hui，W.Jeffrey Howe.Inhibitors of the protease from human immunodeficiency virus：synthesis，enzyme inhibition，and antiviral activity of a series of compounds containing the dihydroxyethylene transition-state isostere(来自人免疫缺陷病毒的蛋白 酶的抑制剂：含有二羟基乙烯过渡态电子等排物的一系列化合物的 合成、酶抑制和抗病毒活性).Journal of Medicinal Chemistry 1993，第 36卷第941-952页；和Iwao Ojima，Hong Wang，Tao Wang and Edward W.Ng.New approaches to the asymmetric synthesis of dipeptide isosteres via beta-lactam synthon method(通过β内酰胺合成子方法不对称合成 二肽电子等排物的新方法).Tetrahedron Letters 1998，第39卷第923- 926页。另一种高碘酸盐敏感化合物4-氨基-4-脱氧-L-苏糖酸(含二醇 的氨基酸结构单元)的合成描述于James A.Musich和Henry Rapoport. Synthesis of Anthopleurine，the alarm pheromone from anthopleura elegantissim，Journal of the American Chemical Society 1978，第100卷 第4865-4872页。

该技术可用于与蛋白质性质的配体(多聚体)发生相互作用的许多 不同的蛋白质类分子。在一个优选的实施方案中，本发明的多聚蛋 白质包含至少两个成员，其中第一成员包含有包含所述条件反应性 基团的肽，且其中第二成员包含有多肽，其中所述第一和所述第二 成员通过非共价相互作用区域互相结合。优选地，所述多聚蛋白质 是肽结合蛋白质，优选肽递呈蛋白质(peptide presenting protein)和结 合肽。这种肽结合蛋白质的优选实例是具有SH2-SH3结构域的蛋白 质、伴侣蛋白和主要组织相容性复合体分子。优选的伴侣蛋白是热 激蛋白。这些热激蛋白的实例是HSP70、gp96、gp100和钙网蛋白。 载有抗原(肽)的热激蛋白例如用于特异性刺激免疫系统。该特异性刺 激有助于抗击多种不同疾病，例如由乳头瘤病毒或癌症引起的各种 疾病(参见例如Parmiani等，2004)。优选的多聚体是主要组织相容性 复合体(MHC)分子或其功能部分、衍生物和/或类似物。MHC能被T 细胞识别。T细胞在人免疫系统中起到关键作用，已开发出多种策略 来增强该天然防御系统，增加对病原体或恶性肿瘤的免疫。T细胞能 识别已结合特异性配体的MHC分子，故用以产生已结合特异性配体 的MHC分子的方法具有重大价值。另外，MHC分子也能被一系列 的其它受体所识别，这为产生配体结合的MHC分子提供了另外的理 论基础。此外，有关能结合MHC分子的疾病相关配体的确定对于诊 断目的和治疗目的来说都具有价值。

配体-MHC复合物的一个重要用途由以下事实得到说明：配体 占据的MHC分子的复合物在医疗领域中是非常有价值的工具，用于 鉴定和定量特异性T细胞群体及评估涉及疾病进展的有效细胞免疫 是否已建立。MHC复合物非常大的潜在用途在于对临床试验和获准 的治疗干预的免疫监测。另外，MHC复合物可应用于分离针对病原 体或恶性肿瘤进行细胞免疫治疗的特异性人T细胞，或者应用于从 骨髓移植物除去不需要的T细胞。此外，MHC复合物还可用于选择 性除去T细胞介导疾病中不需要的特异性T细胞群体。

占据有确定配体的MHC分子有效应用的一个主要障碍是目前的 生产方法效率低下。MHC分子特别是I类MHC分子当没有结合抗 原时其稳定性低。因此，MHC分子主要是在生产过程中配体结合的 过程中产生的。已运用过将该结合配体换成替代性配体，但这个过 程效率低下，因为在温和条件下(即接近中性pH和生理盐浓度)配体 解离慢。结合配体的解离可通过将MHC分子暴露于更为苛刻的条件 (例如酸性或碱性pH)来促进，但这也会导致MHC分子的去稳定化。 因此，现在最广为接受的产生重组MHC分子的技术是为每种单一配 体单独产生一批配体占据的MHC分子。这导致生产过程非常费时和 昂贵，产生的是只对一个应用有特异性的小批量。Bakker AH，Schumacher TN.MHC multimer technology：current status and future prospects.Curr Opin Immunol.2005年8月；17(4)：428-33综述。

MHC分子可分成两类：I类和II类MHC分子。这两种类型的 MHC分子都能结合肽并将其呈递给T细胞。视MHC分子而定，负 责结合肽的结构域具有不同的名称。通常需要两个结构域来特异性 地结合肽，例子是I类MHC分子的α1和α2结构域。这些结构域被 认为是MHC分子的功能部分。因此功能部分通常含有MHC分子中 参与肽结合的两个结构域。天然MHC分子通常含有几个其它的不直 接参与肽结合的结构域。这种结构域通常具有其它功能。例如，存 在着跨膜结构域或胞质结构域。另外，这种结构域可在肽结合结构 域的折叠构象的形成中起作用。其它结构域如肽结合结构域可以是 胞外的。所有这些其它结构域共有一个特征。它们不直接参与肽结 合。因此对于本发明，它们可存在于或不存在于MHC分子的某一部 分中，只要所述部分包含至少两个参与MHC分子中的肽结合的结构 域。优选地，所述MHC分子是可溶性MHC分子，优选如Garboczi DN，Hung DT，Wiley DC.HLA-A2-peptide complexes：refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides.Proc Natl Acad Sci USA.1992年4月， 15；89(8)：3429-33中所述。

在一个优选的实施方案中，MHC分子是MHC复合物分子。

MHC分子的功能衍生物是这样的分子，它不是从自然界衍生， 不过与MHC分子在性质上但并不一定在数量上共有至少某种肽结合 特性。例如，与天然MHC分子有一个或多个氨基酸差异但保持了肽 结合功能的修饰MHC分子，在本发明情形中是功能衍生物。类似地， 包含来自两个或更多个MHC分子的(部分)肽结合结构域且能够结合 肽的分子也被认为是功能衍生物。通常能容忍的修饰是不在肽结合 结构域的修饰。其它能容忍的突变或修饰在MHC分子的肽结合结构 域的可变结构域中。这种修饰通常会改变MHC分子的结合特异性(即 哪种肽被结合)。这种修饰因此也被认为是本发明的MHC分子的功 能衍生物。

有几种分子共有MHC分子的肽结合特性，但已进化成在细胞中 充当另外的用途。这种分子被认为是本发明的MHC分子的功能类似 物。参与多肽结合的结构域可与来自MHC分子的这种结构域结合。 MHC分子或其功能部分、衍生物和/或类似物还可含有通常不与MHC 分子有关的其它部分。这种其它部分可例如包括标签、标记物、缔 合和/或多聚化结构域和其它元件。

本发明的技术能用来特异性地使结合MHC分子或其功能部分、 衍生物和/或类似物的配体去稳定化。MHC结合配体的去稳定化然后 会导致产生无配体的MHC分子而不用暴露于苛刻条件。所产生的无 配体MHC分子然后可以无配体形式使用，或者可加载一个或多个选 择的配体。

因此在本发明的一个优选方面，MHC分子或其功能部分、衍生 物和/或类似物在其肽结合沟中包含肽抗原(也称配体)。可诱导的攻击 基团或条件反应性基团优选存在于肽抗原中，因为这样能保证肽抗 原从在其它方面不被修饰的MHC分子或其功能部分、衍生物和/或 类似物释放出来。所产生的无配体MHC分子然后可直接使用，或者 可加载一个或多个其它配体。为此，本发明还提供包含本发明的多 聚蛋白质的组合物。这种组合物可提供待加载到MHC分子上的配 体。因此，本发明进一步提供主要组织相容性复合体(MHC)分子或其 功能部分、衍生物和/或类似物，其中至少一个所述成员是在所述分 子的肽结合沟中的肽抗原，且其中所述肽抗原包含所述可诱导可切 割基团或条件反应性基团。组合物还可包含另外的肽。在一个优选 的实施方案中，所述另外的肽是能够在所述MHC分子的肽结合沟结 合的抗原肽，即所述MHC分子的配体。肽的攻击基团可被诱导，从 而导致从多聚体释放出肽片断。如果组合物中还存在该另外的肽， 该肽此时可代替离去的片断。所产生的MHC分子或其功能部分、衍 生物和/或类似物由此加载上该另外的肽。因此组合物含有新加载的 MHC分子(或其功能部分、衍生物和/或类似物)和离去肽的片断。

在另一个方面，本发明提供产生MHC分子或其功能部分、衍生 物和/或类似物或者包含另外的肽的MHC分子复合物的方法，所述 方法包括产生包含具有可诱导可切割基团或条件反应性基团的临时 肽的MHC分子，所述基团当被活化时会将所述临时肽切割成至少两 个显示出对所述MHC分子的结合亲和力减少的更小肽。所述临时肽 优选存在于所述MHC分子或其功能部分、衍生物和/或类似物的肽 结合沟中。所述方法优选还包括使所述可切割基团或条件反应性基 团活化。由于活化，临时肽或离去肽被切成更小的肽(或氨基酸)，从 而减少非共价相互作用区域中的非共价相互作用的强度。这使得离 去肽(或其片断)容易从MHC分子或其功能部分、衍生物和/或类似物 中除去。除去操作并不要求苛刻的条件，因此不会或只最低程度地 干扰分子的活性。可将所需的肽提供给游离的MHC分子。使用本发 明的方法，可以产生出大量的具有离去肽的MHC分子。该制品随后 可用来按本发明的方法产生包含各种不同配体(抗原肽)的MHC分 子。这仅需要对可切割基团进行活化(诱导)，其切割离去肽以便与所 需的抗原肽交换。可切割基团或条件反应性基团的诱导、离去肽片 段的解离和所需肽与MHC分子或其功能部分、衍生物和/或类似物 的缔合可在一个步骤中进行。因此本发明还提供这样的本发明方法， 其进一步包括将所述MHC分子或其功能部分、衍生物和/或类似物 与所述所需的肽在能有效地将被切割的临时肽从所述MHC分子中除 去的条件下进行温育。还提供了这样的本发明方法，其进一步包括 检测所述所需的肽与所述MHC分子的结合情况。这个方面例如可用 于诊断目的。结合情况可用各种方式来检测，例如通过对在所述MHC 分子的背景中呈递的所述肽具有特异性的T细胞受体或抗体来检测。 结合情况优选通过检测与所述肽有关的标记物来检测。这可通过将 所述肽标记上随后可通过例如标记链霉亲和素或其类似物显示的特 异性结合分子如生物素来进行。在一个优选的实施方案中，所述肽 包含所述标记物。这样，任何与所述MHC分子结合的肽都可直接检 测。对结合情况的检测优选出于筛选目的来进行，优选在高通量环 境中进行。优选的筛选目的是筛选能影响所述肽与所述MHC分子的 结合的化合物。例如，试验肽或者小分子能竞争所述肽与所述MHC 分子的结合。竞争情况可通过检测所述肽结合的减少来检测出。检 测所述肽与所述MHC分子的结合的优选方法是借助荧光各向异性来 进行测量。这样就可减少对其中进行所述结合的样品的操纵。样品 操纵的减少是高通量环境所需的特性。检测所述肽的结合的其它优 选方法是监测放射性或者监测MHC构象依赖性结合体(binding body)，优选抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物的结合情况。其 它优选方法包括使用对所述肽和MHC分子的组合具有特异性的T细 胞受体。在一个优选的实施方案中，测量对所述肽与所述MHC分子 的结合的抑制情况或增强情况。在一个优选的实施方案中，所述方 法用来测定在试验或参考化合物存在下所述所需的肽的结合情况。

本发明还提供可通过本发明方法获得的MHC分子。此外，本发 明提供包含本发明的MHC分子的组合物，其中所述组合物含有包含 肽或其衍生物(包含条件反应性基团)的MHC分子复合物和包含另外 的肽的MHC分子复合物。本发明的多聚体可进一步掺入到更大的结 构中，这些结构另外称为MHC多聚体的复合物或者称为MHC四聚 体，以与本发明的多聚体相区别。这种复合物比单个MHC多聚体对 携带T细胞受体的颗粒和细胞具有更高的亲和力。这种复合物因此 是T细胞群体的分析中的重要工具。本发明因此进一步提供包含至 少两个本发明多聚体或者至少两个本发明MHC分子或其功能部分、 衍生物和/或类似物或者这两者组合的复合物。用以产生含有两个、 三个、四个和五个MHC分子或其功能部分、衍生物和/或类似物的 复合物的手段和方法是本领域可获得的。因此本发明进一步提供包 含两个、三个、四个和五个MHC分子或其功能部分、衍生物和/或 类似物的复合物。在一个优选的实施方案中，所述复合物包含具有 相同T细胞受体特异性的MHC分子。但是不必总是如此。鉴于用本 发明方法可相对容易地给MHC分子提供不同的肽，包含两种或更多 种T细胞受体特异性的复合物在本发明的范围内。本发明进一步提 供包含至少两种本发明多聚体、本发明组合物或本发明MHC分子或 其功能部分、衍生物和/或类似物的固体表面。在一个优选的实施方 案中，为所述固体表面提供本发明的复合物，优选包含与相同疾病 或病原体有关的单个肽或多个肽的复合物。固体表面可以是珠粒。 固体表面可以是玻璃或金属表面。表面在涂敷本发明的多聚体、组 合物或复合物前可进行过预处理。这种预处理可包括但不限于Soen 等(PLoS biology；2003：第1卷第429-438页)所描述的聚丙烯酰胺镀 膜。本发明进一步提供包含本发明的多聚体、组合物或复合物的微 阵列。用以产生包含偶联到抗原肽的MHC分子复合物的(微)阵列的 手段和方法由以上提到的Soen等描述。技术人员可参考上述文献获 得有关产生本发明的(微)阵列的指导。

本发明意外地在H5N1流感毒株发现新的流感A核蛋白T细胞 表位。有趣的是，该新表位的免疫原性比H5N1毒株和许多其它流感 A毒株中所见的经典表位要大得多。此外，该新表位为前几年的各 H5N1毒株所共有，但与较老的流感A毒株不同，这使得它成为比经 典表位更适合于目前和将来的诊断和治疗目的的表位。本发明提供 包含所述H5N1表位序列的肽。本发明因此提供包含氨基酸序列 AMDSNTLEL的分离和/或合成肽。此外，本发明提供包含氨基酸序 列AMDSNTLEL的分离和/或合成肽在疫苗中的用途。还提供包含氨 基酸序列AMDSNTLEL的分离和/或合成肽用于制备抗流感疫苗的用 途。本发明的肽例如在包含所述肽和免疫增强剂的疫苗中呈递给个 体的免疫系统。在一个实施方案中，本发明提供使个体免疫以抵抗 流感的方法，所述方法包括给所述个体提供包含氨基酸序列 AMDSNTLEL的分离和/或合成肽和任选的免疫增强剂和/或合适的添 加剂。本文所用的“使个体免疫”是指个体发展出抵抗所述肽的免 疫反应。本发明还提供含有包含氨基酸序列AMDSNTLEL的肽的融 合蛋白。本发明还提供编码所述AMDSNTLEL肽或所述融合蛋白的 核酸。

本发明在一个实施方案中提供含有包含氨基酸序列 AMDSNTLEL的分离和/或合成肽的本发明MHC分子。在本发明的 一个实施方案中，所述本发明MHC分子用于检测表位特异性T细胞。 所述流感优选是H5N1。待诊断的流感病毒优选是流感病毒的现行变 体。在一个实施方案中，本发明提供本发明的MHC分子用于制备流 感诊断用组合物的用途。在又一个实施方案中，本发明提供诊断个 体中的流感的方法，所述方法包括给所述个体的血液样品提供本发 明的MHC分子，并分析所述MHC分子与所述血液样品中细胞的结 合。所述血液样品中的所述细胞优选是T细胞。在一个优选的实施 方案中，诊断个体中的流感的方法还包括检测T细胞反应。

实施例

方法

MHC多聚体和MHC多聚体的复合物(MHC四聚体)的产生：

I类MHC复合物(MHC多聚体)按先前的描述制备，略有改动(1)。 HLA-A2.1-肽多聚体用以下三种肽产生：流感A基质蛋白58-66(序 列GILGFVFTL)及两种流感A基质蛋白58-66变体GIL^*FVFTL和 GILGFVF^*L，其中^*为3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸。随后将I类MHC- 肽多聚体纯化，用BirA生物素化，纯化并在16％甘油中-20℃下保 藏。

紫外线诱导的肽释放和肽交换：

将含有野生型流感A基质蛋白58-66表位或者此表位的G4^*或 T8^*变体的MHC多聚体或在指明情况下MHC多聚体的四聚复合物， 在20mM Tris-HCl，pH7.0/150mM NaCl/0.5mM二硫苏糖醇(DTT) 中，在I类MHC结合肽存在或者不存在下，暴露于紫外光(CAMAG， 366nm)1小时。随后，将复合物暴露于37℃15-45分钟，以诱导无 肽的I类MHC复合物的解离(2)。然后将样品进行凝胶过滤色谱分析 以测定MHC解离情况，或者与藻红素标记的链霉亲和素温育以产生 MHC多聚体的四聚复合物(MHC四聚体)。将MHC四聚体进行凝胶 过滤色谱纯化，在16％甘油中-20℃下保藏备用。

MHC四聚体染色：

将解冻的外周血单核细胞(PBMC)样品和CTL克隆与PE标记的 MHC四聚体在37℃下温育5分钟，加入FITC标记的抗CD8抗体， 继续在室温下温育15分钟。细胞在进行FACS分析前，先用碘化丙 锭染色，以便能够排除(gate out)死细胞。用FACScalibur和CellQuest 软件(Becton Dickinson)对样品进行流式细胞术分析。用前向散射和侧 向散射参数定义淋巴细胞群体。

结果：

可任意解离的肽-MHC多聚体的形成

为试验产生其结合肽可随意释放的MHC多聚体的可行性，我们 用野生型流感A基质蛋白58-66表位或者其中氨基酸4或8被紫外 线敏感β氨基酸3(图1)取代的两种此表位变体来产生HLA-A2.1多 聚体。对于所有三种肽，I类MHC多聚体形成都有效，将所形成的 多聚体进行凝胶过滤色谱纯化。为评估所产生的肽-MHC多聚体是否 会被诱导解离，将三种类型的多聚体暴露于紫外线，在37℃下温育 以诱导剩余的无肽I类MHC分子的解离，然后通过凝胶过滤色谱进 行分析。含有亲本流感A表位的肽-MHC多聚体对紫外线暴露完全 不敏感(图2A上小图)，而含有G4^*表位(数据未显示)或T8^*表位(图 2A下小图)的I类MHC多聚体的暴露则导致所回收的MHC复合物 数量大大减少。此外，剩余的材料极有可能至少部分由游离的I类 MHC重链而不是肽-I类MHC多聚体组成，该点由剩余材料的洗脱 时间略大于原料的事实所暗示。

添加HLA A2.1结合肽对I类MHC解离的保护

为评估I类MHC结合配体的添加是否能保护紫外线敏感MHC 复合物在暴露于紫外线时免于解离，在两种不同HLA A2.1-结合肽 (HY 311-319；MART I 26-35(A2L突变体)之一或HLA A3-结合肽 GP100(614-622)存在下，进行相同的反应。含有亲本流感A表位的I 类MHC分子不管是否暴露于紫外线，将任何三种肽添加到这种多聚 体都不影响其回收，这符合此亲本MHC多聚体在两种条件下都稳定 (数据未显示)的见解。重要的是，虽然添加预期不会与HLA-A2.1发 生相互作用的HLA A3-结合肽并不导致含紫外线敏感G4^*肽(未显示) 或T8^*肽(图2B)的MHC多聚体的回收率极大提高，但添加HLA A2.1 结合肽却导致回收率大大增加(图2B)。这些数据符合以下见解，即 含G4^*或G8^*的MHC多聚体暴露于紫外线时所产生的无肽MHC分 子能有效地结合已知的HLA-A2.1配体，却不能结合对照肽。

从紫外线敏感MHC多聚体产生的MHC多聚体功能四聚复合物

为直接确定已通过添加HLA-A2.1配体保护的紫外线敏感I类 MHC多聚体是否已结合这些配体，将在MART I 26-35(A2L突变体)、 流感A基质蛋白58-66、HY(SMCY)311-319或CMV pp65 495-503 肽存在下产生的MHC多聚体进行纯化，转化成MHC多聚体的四聚 复合物。所产生的MHC四聚体随后用来染色来自供体的MART 1特 异性T细胞克隆(图3)或外周血单核细胞，其具有CMV pp65 495-503 和流感A基质蛋白58-66特异性CD8+T细胞(图4)。在所有试验的 情况中，与常规MHC四聚体相比在肽交换后产生的MHC四聚体结 合抗原特异性T细胞的灵敏度和特异性相等。这些实验提供了正式 的证据，证明通过肽交换产生的MHC多聚体与常规的肽-MHC多聚 体在结构上不能区别，能被用来探测pMHC-TCR相互作用(在该情况 下是在寡聚化之后)。

从紫外线敏感MHC四聚体产生的功能MHC四聚体

为确定肽交换是否也能在I类MHC多聚体的紫外线敏感四聚复 合物上进行，将含T8^*的MHC多聚体转化成四聚复合物，随后在CMV pp65 495-503、MART I26-35(A2L突变体)或HY(SMCY)311-319肽 存在下暴露于紫外线。所产生的四聚MHC复合物随后不经进一步纯 化即用来染色CMV阳性供体的外周血单核细胞。引人注目的是，通 过将含T8^*的MHC四聚体在CMV pp65 495-503表位存在下进行紫 外线暴露所产生的MHC四聚体，能以与常规的CMV pp65 495-503 特异性MHC四聚体相等的频率和类似的强度检测CMV特异性T细 胞(图5)。该结合的特异性得到了以下事实的有力支持：在平行反应 中用MART I26-35(A2L突变体)或HY(SMCY)311-319肽制备的 MHC四聚体并不显示出与此供体的CD8+淋巴细胞有可测量的结 合。

MHC交换技术的其它方面

用紫外线交换技术来产生对携带标记物的配体的结合有接受力 的MHC分子。MHC交换反应在已用四甲基罗丹明染料标记的肽配 体存在下进行。如图6所示，随后对这些反应进行的分析揭示，此 技术可用来使标记配体(在这个情况下是荧光肽)的结合得以发生。因 此，MHC交换技术也可用来筛选能增强或干扰这种结合的化合物(例 如肽和其它小分子)。图7概述了这种筛选的原理，在这里用荧光各 向异性作为例子。

对已知的MHC结合肽的修饰使得可以产生对化学切割敏感的配 体，产生出其中掺入了含二醇结构单元的流感A基质蛋白58-66肽 的变体。这种修饰配体的一个实例在图8中给出。如图9所例示， 将这种修饰配体暴露于高碘酸盐会导致这些配体被切割。

讨论：

现有数据描述了产生被选择的肽占据的MHC复合物的新方法。 产生这种复合物的主要限制因素曾在于无肽MHC分子的不稳定性。 因此，现在广为接受的产生重组MHC分子的技术是为每种单一配体 单独产生一批配体占据的MHC分子。这导致生产过程非常费时和昂 贵，只产生具体针对一个应用的小批量。这里我们证明，可通过对 MHC分子原先结合的配体进行选择性释放，通过暴露于不直接影响 MHC复合物本身的稳定性的条件，来产生被选择的配体占据的MHC 分子。在目前的实验组中，通过使用光敏感肽变体实现了MHC结合 配体的解离。但显然的是，这种解离肯定同样可通过使用对其它确 定条件敏感的肽变体来实现。具体的说，用对化学切割敏感的肽变 体开发肽-MHC复合物在这方面来说似乎是有用的。另外，也可不通 过肽切割，而是通过化学或光诱导的修饰诱导结合配体对MHC的亲 和力减少来实现解离。此外，虽然进行配体交换的方法在这里是为I 类MHC分子开发的，但这个方法应同样可用于制备配体占据II类 MHC分子或非经典的MHC分子(以CD1和QaI分子为例)。

通过化学或光诱导肽释放产生的重组MHC分子，对于产生目前 用于临床和临床前研究的一大批MHC复合物来说是极为有用的。另 外，能够通过简单交换产生被所需配体占据的MHC配体的该能力， 对试图产生可用于选择性进行抗原特异性T细胞排除或富集的GMP 级MHC分子的努力应会有极大的促进作用。最后，能够对预形成的 MHC复合物进行肽交换的该能力，构成了据以产生被一大批肽抗原 占据的MHC复合物微阵列的可行策略。这种MHC微阵列可形成用 于对抗原特异性T细胞库(repertoire)进行高通量分析的有用工具(3)。

参考文献

1.Altman，J.D.，Moss，P.A.，Goulder，P.J.，Barouch，D.H.， McHeyzer-Williams，M.G.，Bell，J.I.，McMichael，A.J.，and Davis，M. M.Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes(抗原特异性T 淋巴细胞的表型分析).Science，274：94-96(1996).

2.Schumacher，T.NM.，Heemels，M-T，Neefjes，J.J.，Kast，W.M.， Melief，C.J.M.and Ploegh，H.L.Direct binding of peptide to empty MHC class I molecules on intact cells and in vitro(肽与空I类MHC分子在完 整细胞上和体内的直接结合).Cell 62；563-567(1990).

3.Soen Y，Chen DS，Kraft DL，Davis MM，Brown PO.Detection and Characterization of Cellular Immune Responses Using Peptide-MHC Microarrays(使用肽MHC微测定的细胞免疫反应的检测和鉴定). PLoS Biol.1：E65：pp 429-438(2003).

4.Parmiani G，Testori A，Maio M，Castelli C，Rivoltini L，Pilla L， Belli F，Mazzaferro V，Coppa J，Patuzzo R，Sertoli M.R.，Hoos A， Srivastava P.K.and Santinami M.Heat shock proteins and their use as anticancer vaccines(热激蛋白及其作为抗癌疫苗的用途).Clinical Cancer Research，10；8142-8146(2004).

附图简述

图1.光切割策略：1A).未修饰的流感A 58-66表位I的结构。1B). 光切割反应。1C).T8^*修饰的光可切割流感A 58-66表位III的结构。

图2.紫外线诱导的肽交换的生化分析。2A).含有紫外线敏感配 体的MHC多聚体对紫外线暴露敏感。2B).暴露于紫外线的紫外线 敏感MHC多聚体可通过添加MHC结合肽而得到稳定化。

图3.从紫外线敏感MHC多聚体产生的MHC四聚体将抗原特异 性CTL克隆染色。将紫外线敏感MHC多聚体在指定肽的存在下暴 露于紫外线，转化成MHC多聚体的四聚复合物。因此所产生的含有 HY(SMCY)311-319肽(左下小图)或MART I26-35(A2L突变体)肽(右 下小图)的四聚体被用来染色MART I26-35特异性CTL克隆。作为 对照，相同的克隆用含有相同表位的经典I类MHC四聚体(上小图) 染色。

图4.从紫外线敏感MHC多聚体产生的MHC四聚体将抗原特异 性外周血T细胞染色。将紫外线敏感MHC多聚体在指定肽的存在下 暴露于紫外线，转化成MHC四聚体。因此所产生的含有CMV pp65 495-503肽(左下小图)或流感A基质蛋白58-66肽(右下小图)的四聚 体被用来染色来自供体的外周血单核细胞(PBMC)，其具有CMV pp65 495-503和流感A基质蛋白58-66特异性CD8+T细胞。作为对照， 相同的PBMC用含有相同表位的经典I类MHC四聚体(上小图)染色。

图5.从紫外线敏感MHC多聚体产生的MHC四聚体将抗原特异 性外周血T细胞染色。将紫外线敏感MHC四聚体在指定肽的存在下 暴露于紫外线，并不经进一步纯化即用来染色抗原特异性T细胞。 含有CMV pp65 495-503肽(第二左小图)或MART I26-35(A2L突变 体)或HY(SMCY)311-319肽(两个最右边小图)的MHC四聚体被用 来染色来自具有CMV pp65 495-503 CD8+T细胞的供体的外周血单 核细胞。作为对照，相同的PBMC用含有CMV pp65 495-503肽的 经典I类MHC四聚体(上小图)染色。

图6.光不稳定肽/HLA A2.1复合物在照射前(1)、不加拯救的照 射后(2)、在肽FLPSDC^*FPSV(其中C^*用四甲基罗丹明染料标记)存 在下照射后(3)的凝胶过滤谱。左小图)在230 nm处的紫外线检测， 右小图)荧光检测(激发530nm，发射550nm)。

图7.荧光各向异性筛选。无肽的MHC分子通过切割条件性配 体来产生。荧光表位的结合通过测量荧光各向异性测量或荧光检测 来监测。通过这个方法，可鉴定出能干扰或促进这种结合的肽配体 或非肽配体。

图8.基于二醇的化学可切割条件性肽和相应的切割产物。含二 醇的单元加框表示。

图9.NaIO₄对MHC-结合肽的切割。在8位(上)或4位(未显示)具 有含二醇结构单元的HLA-A2.1结合M1肽的肽变体通过化学合成来 产生。然后在暴露于1 mM NaIO₄达1小时之前(下)或之后(上)，通过 LC-MS对肽进行分析。