建立小麦指纹的AFLP－STS引物、以及使用SSR标记和AFLP－STS标记建立小麦指纹的方法

摘要

本发明涉及使用SSR和AFLP－STS两种分子标记建立小麦DNA指纹的方法，及一组用于建立小麦DNA指纹的AFLP－STS引物；该方法包括建立品种的SSR指纹代码、STS指纹代码和汇聚上述指纹代码步骤；STS标记与SSR标记分布于小麦基因组中不同区域，用两种标记建立品种的DNA指纹，可更加全面地反应品种的遗传多样性；STS标记试验步骤与SSR相同，试验费用低廉；与SSR标记相比，由STS引物扩增的STS标记的带型简单，易于识别和记录，且可根据各引物所扩增的产物长度，将几个引物的产物在一块凝胶上电泳，节省电泳时间和试验成本，既可保持AFLP标记多态性高的优势，又克服了SSR标记记录方法繁琐缺陷。

说明书

技术领域

本发明涉及一组用于建立小麦DNA指纹的AFLP-STS引物、以及使用SSR和AFLP-STS两种分子标记建立小麦DNA指纹的方法。

背景技术

科学准确地鉴别小麦品种及种质材料的遗传差异，对核心种质选拔、新品种鉴定、种子纯度检测具有重要意义。在长期的小麦育种过程中，鉴别品种及种质资源之间差异的主要方法是依靠对每个品种或材料表型的描述，例如株高、株型、穗长、穗型、叶色、叶型、粒型、粒色、以及生育期、分蘖力、冬春性和对病虫害的反应等性状。然而，由于上述农艺性状易受环境影响，在年度之间或不同生长条件下，有些性状会在一定的范围内发生变异，因此对于大量且不断增加的小麦品种或材料，仅靠表型或农艺性状区别和鉴别是非常困难的。DNA标记不受自然环境条件的影响，可以充分地表现和鉴别出品种间或材料间的遗传多样性，适宜于作为小麦品种或材料的指纹。

品种的DNA指纹可分商业用途和科研用途。商业用途主要指新品种鉴定，种子纯度和真伪的检测，因此要求每个品种的指纹应是独一无二的；作为指纹的标记应该清晰、可重复、多态性高；构成指纹的DNA标记数目不可过多，形成的指纹代码不可太大；作为指纹的标记应固定不变；分析指纹的技术应简单快捷、成本低廉。

在众多DNA标记中SSR(Simple sequence repeats)标记具有经济、快捷、分辨率高的优点，目前被认为是DNA指纹的最佳分析方法之一，被广泛地用于各种农作物、蔬菜、果树的遗传多样性分析以及DNA指纹构建。但是因为小麦是异源六倍体，越是多态性高、分辨率高的引物，其电泳图谱越是复杂而难以辨别。另外基因组SSR标记处于DNA的重复序列区域，为非编码区，仅用SSR标记作为品种的DNA指纹，不能全面地代表每个品种的遗传特点。AFLP(AmplificationFragment Length Polymorphism)标记多态性高、处于DNA的非重复序列区域，大量的工作证明一些AFLP标记与某些基因紧密连锁，可以作为基因的分子标记，也可以进行指纹分析。但是因为AFLP的试验步骤多、对DNA的质量数量的要求较高、试验成本较昂贵、PCR产物太多而不易辨认，不适于对大量样品进行DNA指纹分析。另外根据我们对一些AFLP片段的测序发现，有些AFLP片段长度相同，而DNA序列完全不同，证明这些多态性的片段不是来自同一个DNA位点，所以仅根据AFLP的多态性片段，尚不能准确地表示品种间的遗传多样性。然而将多态性的AFLP片段转换成STS标记(Sequence tagging site)，即保留了AFLP的多态性，又大大简化了试验步骤。将SSR标记与由AFLP片段转换成STS标记结合起来作为品种的DNA指纹，可以更加全面地代表品种的遗传多态性。

发明内容

为了解决上述问题而提出并完成了本发明。本发明开发了20对AFLP-STS引物，并将SSR标记和AFLP-STS标记相结合，为多个品种建立了独有的DNA指纹，提出了建立小麦品种DNA指纹的方法。

本发明的目的是提供一组用于建立小麦DNA指纹的AFLP-STS引物。

本发明的另一目的是提供一种将SSR标记和上述AFLP-STS标记相结合建立小麦DNA指纹的方法。

根据本发明的技术方案，本发明提供了一组用于建立小麦DNA的AFLP-STS引物，包括具有以下核苷酸序列的引物：

BHW1F：3’-ATTGCCTTTCACTTGCACGAC-5’R：3’-CTTAGTCCAATGCACGAACAC-5’

BHW2F：3’-CTCTTCTACTGACTGCAACGA-5’R：3’-ATAAAACATACCTTACCTCCC-5’BHW3F：3’-AAACGTGATAATTTATTTGTGGG-5’R：3’-TTGTTTTGTCGATGGATGGC-5’BHW4F：3’-TACGGATCTGTATGTGACA-5’R：3’-ACCCAAAGAGTACTAAGGT-5’BHW5F：3’-AGGCAGCCCACATGAATAA-5’R：3’-TGGACAGCACCTCACAACT-5’BHW6F：3’-GCCTTTCAACTGAAGGAGC-5’R：3’-AGCGGTGGAAACAGTAGCT-5’BHW7F：3’-CGAGACCCGAAAACTGAGCAA-5’R：3’-ACCATTTTGGAGTCCCAGAGC-5’BHW8F：3’-GCAAGTGGCATGGTACTGAGA-5’R：3’-ACCCACAGAGGTAATCAGGCT-5’BHW9F：3’-TTCGTTCCTTGCCTCCAT-5’R：3’-TCAAGCGAATTGCTGTGC-5’BHW10F：3’-TTCATAGTTATTGGCGCACTG-5’R：3’-TGCTCAACAAATCAAAGGAGA-5’BHW11F：3’-ACCGAAGAGCAAAGATGGG-5’R：3’-ACAATTCCGGGTTCTCCAA-5’BHW12F：3’-CCCCATAATGATGAGTAAGTC-5’R：3’-GTAATCAGTGCAACTGAGTTT-5’BHW13F：3’-GGGGTGCATTTCGCTTTC-5’R：3’-TCGCTGCCTATGATTTGT-5’

BHW14F：3’-TAACCCGCACATCCGAGTGTA-5’R：3’-AGCAATCATTCAGCCTGACGA-5’BHW15F：3’-AGAGGTTACATGGTAGTCACT-5’R：3’-GAACAAGCATTTCAGATTTATA-5’BHW16F：3’-ATATTGTTGCACGGCCTGCG-5’R：3’-AGAAGATGGCGTCCCGGATC-5’BHW17F：3’-CAAATCTGCATTCAGGACAGC-5’R：3’-ACCTTTCTGGAGTTGCTGCTT-5’BHW18F：3’-TTATGCTACGTTTTATCTGGT-5’R：3’-TATTCCAAGTTTGTCAGTAAG-5’BHW19F：3’-CCGATGAAGAGCATAAAC-5’R：3’-TAAACGCATACAGTAGCA-5’BHW20F：3’-TACAGCAAGTTGGTCTCATAA-5’R：3’-CTGTAGATTCATTCATTTTGC-5’

本发明提供了一种建立小麦DNA指纹的方法，该方法包括以下步骤：

1)建立品种的SSR指纹代码，使用10～21对多态性信息指数均等于或大于0.7的SSR引物对被测试小麦品种进行PCR反应，所得PCR产物与对照样品的PCR产物一同电泳，根据对照样品的带型为被测试品种的各SSR带型编号，会聚被测试品种的各个带型编号，从而形成该品种的SSR指纹代码(有关论文发表在《麦类作物学报》2006年第4期164～168页，题目为“记录小麦SSR带型的快捷方法”)；

2)建立品种的STS指纹代码，使用上述各对AFLP-STS引物对被测试品种进行PCR反应，通过凝胶电泳，记录被测试品种的各STS带型，得到22个STS标记位点，按照各STS标记位点的固定顺序，汇聚被测试品种的各带型号码，从而形成各品种的STS指纹代码；

3)汇聚上述SSR和STS指纹代码，从而形成每个品种的指纹代码。

根据本发明的方法优选使用以下SSR引物：

引物名称正向引物反向引物gwm268AGGGGATATGTTGTCACTCCATTATGTGATTGCGTACGTACCCgwm339AATTTTCTTCCTCACTTATTAAACGAACAACCACTCAATCgwm120GATCCACCTTCCTCTCTCTCGATTATACTGGTGCCGAAACgwm155CAATCATTTCCCCCTCCCAATCATTGGAAATCCATATGCCgwm160TTCAATTCAGTCTTGGCTTGGCTGCAGGAAAAAAAGTACACCCgwm304AGGAAACAGAAATATCGCGGAGGACTGTGGGGAATGAATGgwm272TGCTCTTTGGCGAATATATGGGTTCAAAACAAATTAAAAGGCCCgwm617GATCTTGGCGCTGAGAGAGACTCCGATGGATTACTCGCACgwm334AATTTCAAAAAGGAGAGAGAAACATGTGTTTTTAGCTATCgwm44GTTGAGCTTTTCAGTTCGGCACTGGCATCCACTGAGCTG

优选地，根据本发明的方法在建立品种的SSR指纹代码的步骤之前，包括使用建立SSR指纹所用的SSR引物对被测试品种的种子进行纯度检测的步骤。

根据对有关文献的查询检索，SSR标记是建立小麦指纹研究中被采用最多的分子标记。SSR标记具有多态性高、重复性好、实验周期短、费用较低等优点，但是多数SSR位点在基因组中的功能尚不清楚，只用SSR标记建立指纹不能全面地代表品种遗传特点。本发明设计的AFLP-STS标记与SSR标记分布于小麦基因组中不同区域，用两种标记建立品种的DNA指纹，可以更加全面地反应品种的遗传多样性。STS标记的试验步骤与SSR相同，试验费用低廉。与SSR标记相比，STS引物扩增的STS标记的带型简单，易于识别和记录，而且可以根据各引物所扩STS标记的带型简单，易于识别和记录，而且可以将几个引物的产物在一块凝胶上电泳，进一步节省了电泳时间和试验成本，即保持了AFLP标记多态性高的优势，又克服了SSR标记记录方法繁琐的缺陷。小麦品种的DNA指纹相当于每个品种的身份证，对保护育种者的知识产权和规范种子经营的市场秩序均具有重要意义。本发明筛选到10对SSR核心引物，并开发了20对AFLP-STS引物，以上30对引物可以检测38个DNA位点、186个等位位点。使用上述引物，可以为我国近年推广的105个小麦品种建立各自独有的DNA指纹，为建立我国小麦DNA指纹探索出了一条可行的途径。

附图说明

图1显示了单位点SSR标记(Xgwm120)的9种带型，9个品种为复壮30、绵阳26、兴农2号、济麦2号、9331、淮麦18、农林10、烟农15、鄂恩6号。

图2显示了兼有单/双位点的SSR标记(Xgwm339)的14种带型，14个品种为中育8号、蚌农家种、京花1号、燕大1817、靖麦8号、兴农2号、云麦42、农大3753、安麦1号、川育64002、京冬8号、豫麦24、中优9507、周麦9号。

图3显示了17个品种的4批PCR样品在一块凝胶上的电泳图谱。17个品种为中育6号、豫麦24、豫麦70、豫麦18、偃展4110、济麦2号、济麦3号、郑农16、豫麦34、中育8号、泽优1号、临优145、济宁13、鲁麦16、鄂恩1号、阎麦8911、小偃503。图4显示了本发明的20对AFLP-STS引物(BHW1～20)PCR产物电泳图谱。

图5显示了AFLP-STS引物BHW16的电泳图谱，图下方1～41为样品号，箭头下的1、2、3为带型号，箭头1、2、3所指分别为品种“扬麦13、扬麦5号、扬麦15。

具体实施方式

以下，根据具体实施例详细说明本发明，但是本发明的保护范围不限于此。

实施例

1、筛选SSR引物

用于筛选SSR引物的小麦品种为近年我国推广品种105个(品种名称刊登在中国农业科技出版社出版的《全国农作物审定品种名录》上)、国家冬小麦区试品种260个(品种名称刊登在全国农业技术推广服务中心印发的2004-2005和2005-2006年度国家冬小麦品种区域试验实施方案中)，其中20个品种被用于筛选AFLP-STS引物。150对SSR引物由德国慕尼黑技术大学植物栽培育种实验室Marion S.Roder博士等设计(Genetics，1998，149：2007～2023，“A MicrosatelliteMap ofWheat”)。

用上述Marion S.Roder博士设计的150对SSR引物分析了365个小麦品种，根据带纹清晰、多态性高的原则，筛选出分布于不同染色体上的10对SSR引物(见表1)。这10对引物的多态性信息指数均等于或大于0.7，证明他们的多态性较高。所述10对SSR引物产生的标记包括4个单位点标记和6个兼有单/双位点的标记，形成了129种带型，可以检测16个位点、133个等位位点。单位点引物在品种中只扩增一组SSR带纹，电泳图谱上只有1个多态区，兼有单/双位点的引物在有些品种中只扩增一组SSR带纹，在另一部分品种中可以扩增两组SSR带纹。如Xgwm339的14种带型中，带型1～8为双位点的产物，带型9～14为单位点产物。

表110对SSR引物及其实验条件

引物名称染色体位置等位位点数带型数目退火温度(℃)PCR循环次数电泳时间(h)gwm268gwm339gwm120gwm155gwm160gwm304gwm2721BL2AL2BL3AL4AL5AS5DL191710910168161610910151060506563605855353535353535353.02.02.52.52.53.02.0

gwm617gwm334gwm446AL6AS7DM1318131317136250603535352.52.03.0

DNA提取采用CTAB提取液提取DNA；氯仿：异戊醇(24∶1)抽提非核酸物质；异丙醇沉淀DNA。

在SSR分析中，PCR反应体系为20μL：10ng/μL模板DNA6μL，10×buffer2μL，10mM dNTP0.4μL，1.25μM SSR引物4μL，2u/μl Taq酶0.5μL，H2O7.1μL，dNTP和Taq酶均为北京鼎国生物技术有限责任公司产品。PCR反应条件：(1)94℃5min，(2)94℃DNA变性0.5min，(3)退火1min，(4)72℃延伸0.5min，(5)返回(2)，重复34或44个循环，(6)72℃5min，(7)4℃保存。3μL PCR产物在6％聚丙烯酰胺变性胶中电泳，电压2000V，硝酸银染色。

2、将AFLP标记转换为STS引物

AFLP引物和接头的序列选自有关研究报告(B.A.Barrett and K.K.Kidwell.AFLP-Based Genetic Diversity among Wheat Cultivars from the Pacific Northwest，Crop Science，1998，Vol.38：1261-1271.和Huang X Q，Fridrich J.Zeller，Sai L K.Hsam，Gerhard Wenael and Volker Mohler.Chromosomal location of AFLP markers incommon wheat utilizing nulli-tetrasomic stocks，2000，Genome43：298-305.)。AFLP接头和引物由上海生工生物工程有限公司合成(表1和表2)。预扩增所用的PCR引物3’末端只加上一个选择性碱基，选择性扩增的PCR引物是在预扩增引物的3’末端再加上1～2个选择性碱基。选择性扩增引物包括48对EcoR I/Mes I引物组合和36对Pst I/Mse I引物组合。

表2AFLP接头序列

接头编号接头序列Mad-1Mad-2Ead-15’-GAC GAT GAG TCC TGA G-3’3’-TACTCAGGACTCAT-5’5’-CTC GTA GAC TGC GTA CC-3’

Ead-2Pad-1Pad-23’-CAT CTGACG CAT GG TTAA-5’5’-CTC GTA GAC TGC GTA CAT GCA-3’3’-CAT CTG ACG CAT GT-5’

Mad：Mse I酶切位点接头，Ead：EcoR I酶切位点接头，Pad：Pst I酶切位点接头

表3AFLP分析的预扩增及选择性扩增引物序列

引物3’末端选择性碱基引物碱基序列(5’-3’)备注Ep-APp-AMp-CAACGTA GAC TGC GTA CCA ATT CAGAC TGC GTA CAT GCA GAGAC GAT GAG TCC TGA GTA ACEcoR I端预扩增引物Pst I端预扩增引物Mse I端预扩增引物E01E02E03E04ACAACTAGAAATGAC TGC GTA CCA ATT CAC AGAC TGC GTA CCA ATT CAC TGAC TGC GTA CCA ATT CAG AGAC TGC GTA CCA ATT CAA TEcoR I端选择性扩增引物P01P02P03AAACAGGAC TGC GTA CAT GCA GAAGAC TGC GTA CAT GCA GACGAC TGC GTA CAT GCA GAGPst I端选择性扩增引物M01M02M03M04M05M06M07M08M09M10M11M12CAACCACCTCCGCCCCTACGGCACCGCCGACAGCTGGAT GAG TCC TGA GTA ACA AGAT GAG TCC TGA GTA ACC AGAT GAG TCC TGA GTA ACC TGAT GAG TCC TGA GTA ACC GGAT GAG TCC TGA GTA ACC CGAT GAG TCC TGA GTA ACT AGAT GAG TCC TGA GTA ACG GGAT GAG TCC TGA GTA ACA CGAT GAG TCC TGA GTA ACG CGAT GAG TCC TGA GTA ACG AGAT GAG TCC TGA GTA ACA GGAT GAG TCC TGA GTA ACT GMse I端选择性扩增引物

(1)筛选多态性AFLP片段

分别用EcoR I/Mse I和Pst I/Mse I双酶切20个小麦品种(20个品种为北农6号、鄂恩1号、丰抗8号、凤麦24、高优503、京冬8号、济麦20、京花1号、冀麦9号、晋麦53号、洛麦1号、荔垦2号、农林10、绵阳26、小白冬麦、扬麦158、烟辐188、扬辐麦2号、中优9507、中旱110)的DNA。限制性内切酶EcoR I为Promega产品，Mse I、Pst I和T4连接酶均为New England Biolabs产品。各个酶切体系(25μL)见表4。酶切在37℃进行3h；75℃酶灭活15min。25μL酶切产物全部进行连接，反应体系(50μL)见表5。连接反应在室温进行3h；65℃灭活酶15min。酶切-连接产物保存在-20℃备用。连接反应后将连接产物和超纯水按1∶5稀释作为预扩增反应的模板。预扩增反应体系为50μL，各组分及浓度见表6。预扩增和选择性扩增反应所用的dNTP(10mM)和Taq酶(2U/μL)均购自北京鼎国生物技术有限责任公司。预扩增反应程序：(1)94℃5min；(2)94℃30sec；(3)50℃1min；(4)72℃1min；(5)回到(2)，重复29次；(6)72℃5min；(7)4℃保存。预扩增产物经1％的琼脂糖电泳分离、溴化乙锭染色，检测酶切-连接以及预备扩增反应是否成功。将预扩增产物和超纯水按1∶25稀释后，作为选择性扩增的模板。选择性扩增的反应体系(20μL)见表7。选择性扩增的反应程序：(1)94℃2min30s；(2)94℃30s；(3)65℃30s；(4)72℃45s；(5)回到(2)，重复12次(降低0.7℃/每循环)；(6)94℃30s；(7)55℃30s；(8)72℃45s；(9)回到(6)，重复23次；(10)72℃10min；(11)4℃保存。选择性扩增产物通过6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，在硝酸银溶液中染色，电泳结果照相并做记录。按以上步骤用84对AFLP引物组合从20份小麦品种中筛选出的166个多态性片段，从凝胶上切下多态性片段，经过纯化，利用克隆载体pMD18-T(购自宝生物工程有限公司，TakaRa)克隆多态性AFLP片段，并转化大肠杆菌DH5α。

表4双酶切反应体系

成分及浓度EcoR I/Mse I酶切体系各成分用量(μL)PstI/Mse I酶切体系各成分用量(μL)DNA(50ng/μL)H₂O10×NEB缓冲液2100×BSAMse I(10U/μL)516.252.50.250.5516.52.50.250.5

EcoR I(12U/μL)Pst I(20U/μL)0.50.25

表5连接反应体系

成分及浓度EcoR I/Mse I组合反应体系各成分用量Pst I/Mse I组合反应体系各成分用量H₂O10×T4缓冲液T4DNA连接酶(400U/μL)Mse I接头(25uM)EcoR I接头(2.5uM)PstI接头(2.5uM)消化的DNA(25μL)18.42.50.172.02.02518.42.50.172.02.025

表6预扩增反应体系

组分及浓度各组分用量(μL)连接DNAEcoR I接头+A(引物50ng/μL)或者Pst I接头+A(引物50ng/μL)Mse I接头+C(引物50ng/μL)dNTP(10mM)Taq(2U/μL)10×BufferH₂O3.02.02.01.00.55.036.5

表7选择性扩增的反应体系

组分及浓度各组分用量(μL)预扩增产物EcoR I接头+ANN(引物10ng/μL)或者Pst I接头+ANN(引物10ng/μL)Mse I接头+CNN(引物50ng/μL)dNTP(10mM)Taq(2U/μL)10×bufferH₂O5330.40.52.06.1

(2)设计AFLP-STS引物

用84对AFLP引物组合对20个小麦品种进行AFLP分析，克隆到166个多态性AFLP片段，通过DNA测序获得了AFLP片段的序列，根据AFLP片段的DNA序列，采用引物设计软件Primer5，设计了174对STS引物，从中筛选出20对可以扩增出多态性的引物(表8)，共检测22个DNA位点、53个等位位点。

20对STS引物产生的22个STS标记中，14个为显性标记、7个共显性标记和1个兼有显性和共显性的标记(图4、表9)。显性标记在品种中只有两种等位变异，在凝胶上一种有带另一种无带。7个共显性标记的等位位点数量不等，BHW6、BHW13、BHW15、BHW21均有两个等位位点，BHW16有3个等位位点，BHW20有4个等位位点，BHW8有5个等位位点，BHW19为双位点标记，1个位点的为显性标记，另一个为显性兼共显性标记。

AFLP标记的试验步骤包括(1)基因组DNA双酶切，(2)连接接头，(3)PCR预扩增，(4)选择性扩增，(5)电泳分离PCR产物，(6)记录结果。STS标记的试验步骤与SSR标记相同，只需要(1)PCR扩增，(2)电泳分离PCR产物，(3)记录结果。STS标记的带型比SSR带型简单，根据每对引物的PCR产物长度，可以将2～5批PCR样品按先后顺序上样，在一块胶上同时电泳，上述20对引物的产物可以形成50多个多重电泳组合，图3为4批PCR样品的多重电泳图谱。由此可见，这22个STS标记即保持了AFLP标记的多态性，又具有SSR标记试验方法简单、成本低的优点。

表820对AFLP-STS引物序列

引物号引物名称引物序列BHW12-5-2FATTGCCTTTCACTTGCACGAC2-5-2RCTTAGTCCAATGCACGAACACBHW219-6-2FCTCTTCTACTGACTGCAACGA19-6-2RATAAAACATACCTTACCTCCCBHW324-2-1FAAACGTGATAATTTATTTGTGGG

24-2-1RTTGTTTTGTCGATGGATGGCBHW430-23FTACGGATCTGTATGTGACA30-23RACCCAAAGAGTACTAAGGTBHW533-9-1FAGGCAGCCCACATGAATAA33-9-1RTGGACAGCACCTCACAACTBHW645-5FGCCTTTCAACTGAAGGAGC45-5RAGCGGTGGAAACAGTAGCTBHW750-2FCGAGACCCGAAAACTGAGCAA50-2RACCATTTTGGAGTCCCAGAGCBHW851-3FGCAAGTGGCATGGTACTGAGA51-3RACCCACAGAGGTAATCAGGCTBHW954-2-1FTTCGTTCCTTGCCTCCAT54-2-1RTCAAGCGAATTGCTGTGCBHW1058-10FTTCATAGTTATTGGCGCACTG58-10RTGCTCAACAAATCAAAGGAGABHW1159-1FACCGAAGAGCAAAGATGGG59-1RACAATTCCGGGTTCTCCAABHW1261-21FCCCCATAATGATGAGTAAGTC61-21RGTAATCAGTGCAACTGAGTTTBHW1363-22-1FGGGGTGCATTTCGCTTTC63-22-1RTCGCTGCCTATGATTTGTBHW1474-1FTAACCCGCACATCCGAGTGTA74-1RAGCAATCATTCAGCCTGACGABHW1579-1FAGAGGTTACATGGTAGTCACT

79-1RGAACAAGCATTTCAGATTTATABHW1685-2-3FATATTGTTGCACGGCCTGCG85-2-3RAGAAGATGGCGTCCCGGATCBHW1788-1-2FCAAATCTGCATTCAGGACAGC88-1-2RACCTTTCTGGAGTTGCTGCTTBHW1889-1-4FTTATGCTACGTTTTATCTGGT89-1-4RTATTCCAAGTTTGTCAGTAAGBHW1999-2FCCGATGAAGAGCATAAAC99-2RTAAACGCATACAGTAGCABHW20130-3-2FTACAGCAAGTTGGTCTCATAA130-3-2RCTGTAGATTCATTCATTTTGC

表920对STS引物参数

引物编号引物名称退火温度(℃)PCR循环次数PCR产物长度(bp)标记特点BHW12-5-25535180显性标记BHW219-6-25045约105双位点显性标记约200BHW324-2-1654554显性标记BHW430-235845约300显性标记BHW533-9-16035148共显性标记BHW645-5584567显性标记BHW750-26045115-125共显性标记BHW851-35845约170显性标记

BHW954-2-1584581显性标记BHW1058-105835149显性标记BHW1159-16535101显性标记BHW1261-215035102共显性标记BHW1363-22-1633552显性标记BHW1474-1634584显性标记BHW1579-16345115共显性标记BHW1685-2-35845约150显性标记BHW1788-1-2584581双位点，BHW17-1为显性标记BHW17-2兼有显性和共显性标记约125BHW1889-1-45535151共显性BHW1999-2583592共显性标记BHW20130-3-25845151显性标记

实施例1为10个在我国大面积种植的品种建立独有的DNA指纹代码

1、建立小麦品种SSR指纹代码

首先用上述10对SSR引物对每个品种的种子进行纯度检测，淘汰杂株以确保试验样品的正确性。随后，每个品种的每对SSR引物的PCR产物和每对引物所产生的各种带型的对照样品一起电泳，依据对照样品的带型编号为每个品种的SSR带型编号(表10，表中所用的SSR带型编号是本文作者提出的一种快速准确记录SSR带型的方法，参见《麦类作物学报》2006年4期164～168页，题目为“记录小麦SSR带型的快捷方法”)，按照10对SSR引物的固定顺序，汇聚被测试品种的各个带型编号，从而形成品种的SSR指纹代码。

表1010个品种10个SSR位点的带型编号

品种名称Xgwm268Xgwm339Xgwm120Xgwm155Xgwm160Xgwm304Xgwm272Xgwm617Xgwm334Xgwm44扬辐麦2号17520010670926525210扬麦1532521911670926225210扬麦5号26850010674026524311扬麦9号17520011670926524307扬麦1126810010670926525210扬麦1326811011671926524507扬麦15826520010670926525210淮麦1817811511671714484615淮麦1917810009671915503514淮麦2017811511671714483414

2、建立品种的STS指纹代码

上述20对STS引物所产生的标记有显性标记也有共显性标记，显性标记在凝胶上只有有带和无带两种情形，记录电泳结果时有带记作“1”，无带记作“0”，如BHW22(图3)。共显性标记的带型有2～5种，分别记作1、2、3、4、5，如BHW16共有3种带型(3种等位变异)，分别记作1、2、3(图5)。依据以上方法记录每个品种的STS带型。按照22个位点的固定顺序，汇聚被测试品种的各个带型号码，从而形成品种的STS指纹代码。

表1110个品种的22个STS位点的带型编号

品种名称BHW1BHW4BHW6BHW10BHW12BHW13BHW18BHW19BHW21BHW20BHW17BHW22BHW16BHW???BHW2BHW3BHW15BHW5BHW8BHW9BHW14BHW11扬辐麦2号1110110111113011111110扬麦151011110111113010011111扬麦5号1011110111112011111111扬麦9号1010110111113011111100扬麦111010110111113001111110扬麦130011110111011000111101扬麦1581010110111113001111110淮麦181120111213102101012010淮麦190011110013112011112101淮麦201120111113112101202000

3、为10个品种建立独有的DNA指纹代码

汇聚每个品种的SSR和STS指纹代码，形成每个品种的指纹代码(表12)。

表1210个品种的DNA指纹代码

品种名称品种指纹代码扬麦15扬麦5号扬麦13扬麦11扬麦158淮麦18淮麦20淮麦19扬麦9号扬辐麦2号325219116709262252101011110111113010011111268500106740265243111011110111112011111111268110116719265245070011110111011000111101268100106709265252101010110111113001111110265200106709265252101010110111113001111110178115116717144846151120111213102101012010178115116717144834141120111113112101202000178100096719155035140011110013112011112101175200116709265243071010110111113011111100175200106709265252101010110111113011111110

实施例2检测品种特异性

采用与实施例1相同的方法为2005～2006年国家冬小麦区域试验的140个品种建立了DNA指纹代码，140个区试品种(品种名称刊登在全国农业技术推广服务中心印发的2005-2006年度国家冬小麦品种区域试验实施方案中)和105个(品种名称刊登在中国农业科技出版社出版的《全国农作物审定品种名录》上)审定品种的每个品种与其余244个品种进行比对，发现以下7对品种的DNA指纹代码相同或近似。为了计算每对品种的遗传相似系数，增加SSR位点进行进一步检测，每对品种合计检测了98个DNA位点，根据遗传相似系数的计算公式GS_ij＝2N_ij/(N_i+N_jj)，计算了每对品种的遗传相似系数(N_ij是两品种相同的等位变异，N_i、N_j是两品种分别的等位变异总数)，7对品种的遗传相似系数均等于或大于0.95，证明10对品种相似。

表137对指纹相似的品种

品种名称组合名称共检测位点数多态位点数遗传相似系数冀曲麦12号(区试品种)邯5316(审定品种)邯5316/千稳1号邯7808/CA8059//85中479820.98邯00-5030(区试品种)邯5316(审定品种)临远207/冀麦36邯7808/CA8059//85中479830.97邯00-5030(区试品种)冀曲麦12号(区试品种)临远207/冀麦36邯5316/千稳1号9830.97沧麦119(区试品种)沧核038(区试品种)8341699/CA8694Tai轮回选择9820.98西农961(区试品种)长武134(审定品种)Q104-355/Amidom长武131/小黑麦代96//长武131///京花3号/NS27619840.96渝03271(区试品种)渝01047(区试品种)宛抗42/97-3[墨444/(87-79/Ha673-6)1]/(9370/89-86)F69840.96山东016016(区试品种)晋麦47(审定品种)92-18/临汾545412057//旱52/K379850.95

                                              sequence[2]

<110>北京市农林科学院

<160>60

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>1

attgcctttc acttgcacga c                                                      21

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>2

cttagtccaa tgcacgaaca c                                                      21

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>3

ctcttctact gactgcaacg a                                                       21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>4

ataaaacata ccttacctcc c                                                      21

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>5

aaacgtgata atttatttgt ggg                                                    23

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>6

ttgttttgtc gatggatggc                                                       20

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>7

tacggatctg tatgtgaca                                                       19

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>8

acccaaagag tactaaggt                                                       19

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>9

aggcagccca catgaataa                                                       19

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>10

tggacagcac ctcacaact                                                       19

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>11

gcctttcaac tgaaggagc                                                       19

<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>12

agcggtggaa acagtagct                                                       19

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>13

cgagacccga aaactgagca a                                                    21

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>14

accattttgg agtcccagag c                                                    21

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>15

gcaagtggca tggtactgag a                                                  21

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>16

acccacagag gtaatcaggc t                                                  21

<210>17

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>17

ttcgttcctt gcctccat18

<210>18

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>18

tcaagcgaat tgctgtgc18

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>19

ttcatagtta ttggcgcact g                                                  21

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>20

tgctcaacaa atcaaaggag a                                                     21

<210>21

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>21

accgaagagc aaagatggg                                                       19

<210>22

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>22

<acaattccgg gttctccaa                                                      19

<210>23

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>23

ccccataatg atgagtaagt c                                                   21

<210>24

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>24

gtaatcagtg caactgagtt t                                                   21

<210>25

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>25

ggggtgcatt tcgctttc                                                         18

<210>26

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>26

tcgctgccta tgatttgt                                                         18

<210>27

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>27

taacccgcac atccgagtgt a                                                    21

<210>28

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>28

agcaatcatt cagcctgacg a                                                    21

<210>29

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>29

agaggttaca tggtagtcac t                                                    21

<210>30

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>30

gaacaagcat ttcagattta ta                                                   22

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>31

atattgttgc acggcctgcg                                                      20

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

400>32

agaagatggc gtcccggatc                                                      20

<210>33

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>33

caaatctgca ttcaggacag c                                                     21

<210>34

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>34

acctttctgg agttgctgct t                                                    21

<210>35

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>35

ttatgctacg ttttatctgg t                                                    21

<210>36

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>36

tattccaagt ttgtcagtaa g                                                    21

<210>37

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>37

ccgatgaaga gcataaac                                                        18

<210>38

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>38

taaacgcata cagtagca                                                         18

<210>39

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>39

tacagcaagt tggtctcata a                                                     21

<210>40

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AFLP-STS引物

<400>40

ctgtagattc attcattttg c                                                    21

<210>41

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>41

aggggatatg ttgtcactcc a                                                    21

<210>42

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>42

ttatgtgatt gcgtacgtac cc                                                   22

<210>43

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>43

aattttcttc ctcacttatt                                                      20

<210>44

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>44

aaacgaacaa ccactcaatc                                                      20

<210>45

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>45

gatccacctt cctctctctc20

<210>46

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>46

gattatactg gtgccgaaac                                                      20

<210>47

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>47

caatcatttc cccctccc                                                       18

<210>48

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>48

aatcattgga aatccatatg cc                                                   22

<210>49

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>49

ttcaattcag tcttggcttg g                                                   21

<210>50

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>50

ctgcaggaaa aaaagtacac cc                                                    22

<210>51

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>51

aggaaacaga aatatcgcgg                                                      20

<210>52

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>52

aggactgtgg ggaatgaatg                                                     20

<210>53

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>53

tgctctttgg cgaatatatg g                                                    21

<210>54

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>54

gttcaaaaca aattaaaagg ccc                                                 23

<210>55

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>55

gatcttggcg ctgagagaga                                                       20

<210>56

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>56

ctccgatgga ttactcgcac                                                       20

<210>57

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>57

aatttcaaaa aggagagaga                                                       20

<210>58

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>58

aacatgtgtt tttagctatc                                                      20

<210>59

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>59

gttgagcttt tcagttcggc                                                      20

<210>60

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SSR引物

<400>60

actggcatcc actgagctg                                                      19