有氧运动能力相关的基因多态性及检测芯片和试剂盒

摘要

本发明公开了一类有氧运动能力相关的基因及其相关位点的多态性，本发明还公开了针对所述多态性位点的检测芯片和检测试剂盒。本发明为分析受试者的有氧运动能力提供了基于分子生物学水平的依据。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一类有氧运动能力相关的基因多态性，以及针对所述多态性位点的检测芯片和试剂盒。

背景技术

运动能力是人从事各种身体运动的能力，包括一般运动能力和特殊运动能力，如身高、体重等是身体形态性状，骨骼肌、心肌纤维、心脏结构功能等生理性状以及速度、力量、耐力等素质性状的综合体现，是由多基因控制的。总而言之，运动能力的遗传和变异具有连续性和相关性，这使许多研究者和教练从以往的经验判断“运动苗子”过渡到从分子遗传学进行科学选材。

已有的研究包括通过选用肢体长度、头围等指标预测身高，将体型与项目特点结合，对肌纤维类型、动态心功能、VO2max、跑节省化、通气无氧阈、无氧功、血乳酸值等机能指标与身体素质进行关联性研究等。目前，与运动能力相关基因的研究主要集中在与有氧代谢能力(耐力素质)和肌肉力量有关的方面，同时不同基因多态性与机体整体运动能力相关研究也很多。

有氧代谢能力(耐力素质)是运动能力的重要组成部分，也是运动能力相关基因研究最为活跃的领域，有氧能力的大小与耐力性项目的成绩密切相关。对于其它项目，有氧能力也是基础能力，出色的有氧能力有利于运动员更好地消除在训练或比赛中积累的疲劳，使机体能够承受更大的负荷，提高训练效果。因此，有氧能力是运动员重要的也是基本的运动能力之一，任何项目都不能忽视有氧训练。据报道，赛艇训练安排中约75-80％都是有氧训练。而我国国家游泳队优秀运动员有氧训练的内容如一般有氧训练、无氧阈训练和最大摄氧量训练等在某训练阶段的比例高达90％以上。这表明，近年来不同运动项目运动能力和成绩的提高与重视有氧训练和提高耐力素质关系密切。大量实验研究还表明，等位基因和基因型频率在耐力运动员和普通人之间存在显著的不同。

因此有必要对耐力素质相关的基因多态性进行深入研究，并且开发出相应的检测产品，以为通过分子遗传学手段科学地选择运动人才提供有效的途径，改变以往仅凭经验盲目选才的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一类有氧运动能力相关的基因多态性。

本发明的另一目的在于提供针对所述多态性位点的检测芯片。

本发明的另一目的在于提供针对所述多态性位点的检测试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种体外确定核酸样品是否存在变异的方法，所述的方法包括：

(1)对核酸样品进行检测，以确定是否存在以下变异：

β肾上腺素能受体基因，第265位A→G变异；并且，

(2)检测核酸样品中是否存在选自下组的至少1种变异：

线粒体高变区I基因，第16362位T→C变异；

血管紧张素基因，第11468位-11756位的插入/缺失(I/D)变异；

肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶基因，第18931位的A→G变异；

肌红蛋白基因，第12327位的G→A变异；或

PPARγ辅激活因子α基因，第94701位的C→T变异；

存在所述变异就表明该核酸样品存在变异。

在本发明的另一优选例中，在(2)中，同时检测2种、3种、4种、或5种所述的变异。

在本发明的第二方面，提供一种从人群中挑选候选者的方法，包括步骤：

(a)在体外，对所述人群的核酸样品进行检测，以确定是否存在以下变异：

β肾上腺素能受体基因，第265位A→G变异；

(b)将核酸样品中存在所述的变异的受试者作为候选者。

在本发明的另一优选例中，还包括检测选自下组的至少1种变异：

线粒体高变区I基因，第16362位T→C变异；

血管紧张素基因，第11468-11756位的插入/缺失(I/D)变异；

肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶基因，第18931位的A→G变异；

肌红蛋白基因，第12327位的G→A变异；或

PPARγ辅激活因子α基因，第94701位的C→T变异。

在本发明的另一优选例中，同时检测2种、3种、4种、5种、或6种所述的变异。

在本发明的另一优选例中，所述候选者具有以下特征：有氧运动能力强或潜在的有氧运动能力强。

在本发明的第三方面，提供一种基因芯片，包括：

固相载体，以及

固定于所述固相载体的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地针对以下变异位点：β肾上腺素能受体基因，第265位A→G变异。

在本发明的另一优选例中，所述的固相载体上还包括特异性地针对选自下组的至少1种变异位点的寡核苷酸探针：

线粒体高变区I基因，第16362位T→C变异；

血管紧张素基因，第11468-11756位的插入/缺失(I/D)变异；

肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶基因，第18931位的A→G变异；

肌红蛋白基因，第12327位的G→A变异；或

PPARγ辅激活因子α基因，第94701位的C→T变异。

在本发明的另一优选例中，所述的寡核苷酸探针具有10-60个连续的核苷酸(更优选的为15-30个)。

在本发明的另一优选例中，每个寡核苷酸探针的5’端还包含一段氨基修饰的1-30聚的聚脱氧胸苷酸(T)。

在本发明的第四方面，提供一种检测试剂盒，所述的试剂盒包含：

容器；以及

位于容器中的所述的芯片。

在本发明的另一优选例中，所述的试剂盒中还包含特异性扩增线粒体高变区I基因、β肾上腺素能受体基因、血管紧张素基因、肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶基因、肌红蛋白基因、或PPARγ辅激活因子α基因的基因的引物。

在本发明的另一优选例中，所述试剂盒中还包括(但不限于)：用于提取DNA、PCR、杂交、或显色的试剂；比如：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、或抗体。

在本发明的第五方面，提供一种同时确定样品中线粒体高变区I基因、β肾上腺素能受体基因、血管紧张素基因、肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶基因、肌红蛋白基因、和PPARγ辅激活因子α基因的基因型的方法，包括以下步骤：

(1)从样品中提取DNA；

(2)以步骤(1)中获得的DNA为模板，扩增获得包含线粒体高变区I基因、β肾上腺素能受体基因、血管紧张素基因、肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶基因、肌红蛋白基因、和PPARγ辅激活因子α基因中突变位点的扩增产物；

(3)标记步骤(2)中所得的扩增产物；

(4)将步骤(3)中所得经标记的扩增产物与所述的基因芯片杂交；

(5)检测基因芯片的杂交信号，从而确定样品中线粒体高变区I基因、β肾上腺素能受体基因、血管紧张素基因、肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶基因、肌红蛋白基因、和PPARγ辅激活因子α基因的基因型。

在本发明的另一优选例中，在步骤(2)中，分别在线粒体高变区I基因、β肾上腺素能受体基因、血管紧张素基因、肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶基因、肌红蛋白基因、和PPARγ辅激活因子α基因各自独立的扩增体系中扩增包含突变位点基因的扩增产物。

在本发明的第六方面，提供一种基因的用途，所述的基因包括β肾上腺素能受体基因，用于制备从人群中挑选有氧运动能力强或潜在的有氧运动能力强的候选者的试剂、芯片、或试剂盒。

在本发明的另一优选例中，所述的基因还包括选自下组的基因：

线粒体高变区I基因、血管紧张素基因、肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶基因、肌红蛋白基因、或PPARγ辅激活因子α基因。

本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了β2-AR基因A→G(Arg16/Gly)多态电泳图。lane M为PCR Marker；lanel，2，8为纯合子AA电泳带；lane4，6，9为杂合子AG电泳带；lane1，3，10为纯合子GG电泳带。

图2显示了夹心杂交的原理示意图。

图3显示了芯片的空白实验结果图。

图4-图6显示了由Array Doctor2.0软件输出的芯片检测结果的代表性例子。

图7显示了通过电泳检测ACE基因I/D多态性的结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，找到一类有氧能力相关的基因，这些基因的多态性与人的有氧运动能力密切相关。基于此完成了本发明。

如本文所用，“有氧运动能力”或“有氧能力”可互换使用，是指人体摄入氧气和利用氧气能力，同时长时间进行有氧工作的能力，它是运动能力的重要组成部分。有氧能力的大小与耐力性项目的成绩密切相关。

如本文所用，“有氧运动能力强”或“有氧能力强”可互换使用。以同年龄、同性别的人群为对象，有氧能力强者的有氧能力比该人群的有氧能力平均值高10％或更高，更优选的为高20％或更高。

具体地，本发明人提供的有氧能力相关的基因及其多态性位点描述如下：

1.线粒体基因(mtDNA)

尽管mtDNA遗传信息量较小，却控制着线粒体一些最基本的性质。mtDNA与运动能力存有一定关系，mtDNA多态性可引起个体在耐力素质及其训练敏感方面性的差异。由于人类运动能力的发展很大程度上依赖于能量代谢，而线粒体在能量代谢中占据着重要地位，是限制有氧能力的主要因素之一，提示其与有氧运动能力相关。

本发明人发现，线粒体高变区I基因第16362位(核苷酸位置编号基于GenBank登录号：J01415 gi113200490)T→C的变异与有氧运动能力密切相关，具有CC的基因型比具有TT基因型的人具有更强的有氧运动能力。

包含所述多态性位点的线粒体高变区I基因的部分序列如下所示，其中矩形框表示多态性位点。其中，所述多态性位点上为T的序列见SEQ ID NO：5。

AATACCAACT ATCTCCCTAA TTGAAAACAA AATACTCAAA TGGGCCTGTC CTTGTAGTAT

AAACTAATAC ACCAGTCTTG TAAACCGGAG ATGAAAACCT TTTTCCAAGG ACAAATCAGA

GAAAAAGTCT TTAACTCCAC CATTAGCACC CAAAGCTAAG ATTCTAATTT AAACTATTCT

CTGTTCTTTC ATGGGGAAGC AGATTTGGGT ACCACCCAAG TATTGACTCA CCCATCAACA

ACCGCTATGT ATTTCGTACA TTACTGCCAG CCACCATGAA TATTGTACGG TACCATAAAT

ACTTGACCAC CTGTAGTACA TAAAAACCCA ATCCACATCA AAACCCCCTC CCCATGCTTA

CAAGCAAGTA CAGCAATCAA CCCTCAACTA TCACACATCA ACTGCAACTC CAAAGCCACC

CCTCACCCAC TAGGATACCA ACAAACCTAC CCACCCTTAA CAGTACATAG TACATAAAGC

CATTTACCGT ACATAGCACA TTACAGTCAA ATCCCTTCTC GCCCCATGG ATGACCCCCC

TCAGATAGGG GTCCCTTGAC CACCATCCTC CGTGAAATCA ATATCCCGCA CAAGAGTGCT

ACTCTCCTCG CTCCGGGCCC ATAACACTTG GGGGTAGCTA AAGTGAACTG TATCCGACAT

CTGGTTCCTA CTTCAGGGTC ATAAAGCCTA AATAGCCCAC ACGTTCCCCT TAAATAAGAC

2.肾上腺素能受体β2(ADRB2)基因

肾上腺素能受体β2(β2-AR)是与鸟嘌呤核苷蛋白耦联(G蛋白耦联)的、肽链至少要反复贯穿膜7次的受体家族成员之一。AR-β2在机体多种组织中均有表达，如心肌细胞、支气管和血管平滑肌细胞、脂肪细胞以及肾脏细胞。通过AR-β2激动剂的介导(如异丙肾上腺素、肾上腺素)后，表达血管扩张、支气管平滑肌松弛等生理效应。

人类β2-AR基因第265位(核苷酸位置编号基于GenBank登录号：NC000005，gi51511721)(即Rs1042713)A→G(Arg16/Gly)多态性是该基因最常见的单核苷酸多态性，近年有报道该位点多态性与血脂异常、肥胖、代谢综合征、高血压等心血管病危险因素相关。

然而，目前还未见到β2-AR基因第265位A→G(Arg16/Gly)多态性与运动能力相关联的报道。本发明人以优秀游泳、赛艇运动员等为研究对象，通过观察不同人群和不同水平运动员β2-AR基因A→G(Arg16/Gly)位点多态性的分布频率和特点，并与普通人进行比较研究，结果发现，在该位点上具有GG或AG基因型的人比具有AA基因型的人具有更强的有氧运动能力。

包含所述多态性位点的β2-AR基因的部分序列如下，其中矩形框表示多态性位点。其中，所述多态性位点上为A的序列见SEQ ID NO：1。

CGGCTTCTTC AGAGCACGGG CTGGAACTGG CAGGCACCGC GAGCCCCTAG CACCCGACAA

GCTGAGTGTG CAGGACGAGT CCCCACCACA CCCACACCAC AGCCGCTGAA TGAGGCTTCC

AGGCGTCCGC TCGCGGCCCG CAGAGCCCCG CCGTGGGTCC GCCCGCTGAG GCGCCCCCAG

CCAGTGCGCT CACCTGCCAG ACTGCGCGCC ATGGGGCAAC CCGGGAACGG CAGCGCCTTC

TTGCTGGCAC CCAATGAAG CCATGCGCCG GACCACGACG TCACGCAGGA AAGGGAGAGG

TGTGGGTGGT GGGCATGGGC ATCGTCATGT CTCTCATCGT CCTGGCCATC GTGTTTGGCA

ATGTGCTGGT CATCACAGCC ATTGCCAAGT TCGAGCGTCT GCAGACGGTC ACCAACTACT

TCATCACTTC ACTGGCCTGT GCTGATCTGG TCATGGGCCT GGCAGTGGTG CCCTTTGGGG

CCGCCCATAT TCTTATGAAA ATGTGGACTT

3.血管紧张素转换酶(ACE)基因

肾素-血管紧张素系统不仅可以增加心肌和血管的收缩力，而且还可以促进心血管细胞的生长繁殖。血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)是该系统反应的关键酶。ACE基因第16内含子中有一段289bp的重复序列为标记构成ACE的插入(insertion，I)和缺失(deletion，D)多态性，位于16内含子的第11468-11756位上(核苷酸位置编号基于GenBank登录号：NC000017，gi51511734)。该多态性与一些心血管疾病的易感性、严重性以及预后性呈显著相关。

本发明人的研究发现，ACE基因I/D多态性与人体运动能力存在关联，特别是与耐力性项目运动员的运动能力存在密切关系，II或ID基因型的人比DD基因型的人的具有更强的有氧运动能力。

包含所述多态性位点的ACE基因的部分序列如下，该序列中存在289个碱基的插入(I)/缺失(D)片段(方括号内，以斜体表示)。包含所述插入位点的序列见SEQ ID NO：2。

CAGGAGAAAC GGTTTTCCCA GGACAGGGTT TGGCCTACAA GTTGTGGATG TGGGTACCCA

TGCCAAGTGT GAGGGGAGGC TGGCCGGGTG TGGTGGCTCA TGCCTCTAAT CCCAGCACTT

TGGGAGGCCA AGGTGAGTAG ATCACTTGAG GCCGGGAGTT TGAGACCAGC CTGGCCAACA

TGGTGAAACC CCATCTGTAC TAAAAATACA AAAGTTAGCT GGGCGTGGTG GTAGATGCCT

GTAGTCCCAG CTACTTGGGA GGCTGAGGCA TGAGAATCGC TTGAGCCCAG CCAGGGCAAT

ACAGCAAGAC CCCGTCTCTA CAAATAAAAT ACAAAAAATT AGTTGGATGT GGTGGTGCAT

GCCTGTAGTC CTAGCTGCTA GGGAGGCTGA GATGGAAGGA TTGCTTGAGC CTGGGAGGTC

AAGGCTGCAG TGAGCCGAGA TGGCGCCACT GCACTCCAGC CTGGGCAACA GAGTGAGACC

CTGTCTCAGA AAGAAAAAAA AAAAAAAAGG AGAGGAGAGA GACTCAAGCA CGCCCCTCAC

AGGACTGCTG AGGCCCTGCA GGTGTCTGCA GCATGTGCCC CAGGCCGGGG ACTCTGTAAG

CCACTGCTGG AGACCACTCC CATCCTTTCT CCCATTTCTC TAGACCTGCT GCCTATACAG

TCACTTTT[TT TTTTTTTTTG AGACGGAGTC TCGCTCTGTC GCCCAGGCTG GAGTGCAGTG

GCGGGA TCTC GGCTCACTGC AAGCTCCGCC TCCCGGGTTC ACGCCA TTCT CCTGCCTCAG

CCTCCCAAGT AGCTGGGACC ACAGGCGCCC GCCACTACGC CCGGCTAATTTTTTGTA TTT

TTAGTAGAGA CGGGGTTTCA CCGTTTTAGC CGGGA TGGTC TCGA TCTCCT GACCTCGTGA

TCCGCCCGCC TCGGCCTCCC AAAGTGCTGG GA TTACAGGC GTGA TACAGTCACTTTT]ATG

TGGTTTCGCC AATTTTATTC CAGCTCTGAA ATTCTCTGAG CTCCCCTTAC AAGCAGAGGT

GAGCTAAGGG CTGGAGCTCA AGGCATTCAA ACCCCTACCA GATCTGACGA ATGTGATGGC

CACATCCCGG AAATATGAAG ACCTGTTATG GGCATGGGAG GGCTGGCGAG ACAAGGCGGG

GAGAGCCATC CTCCAGTTTT ACCCGAAATA CGTGGAACTC ATCAACCAGG CTGCCCGGCT

CAATGGTGAG TCCCTGCTGC CAACATCACT GGCACTTGGG TCCCTTCATT TTCCTCAAAG

AGGTGCTGTG AAACCCCAAG CCTAGGAAAA GGTAGATCCC TGGAGGAGGC AGGTAATGTG

GTGTTGGGAG AGCCTGGCTG TGTCCCCTCT GTAGGCTATG TAGATGCAGG GGACTCGTGG

AGGTCTATGT ACGAGACACC ATCCCTGGAG CAAGACCTGG AGCGGCTCTT CCAGGAGCTG

CAGCCACTCT ACCTCAACCT GCATGCCTAC GTGCGCCGGG CCCTGCACCG TCACTACGGG

GCCCAGCACA TCAACCTGGA GGGGCCCATT CCTGCTCACC TGCTGGGTAA GGGCACATGT

CGGGCCTTGA GGAGGGTAAA GACGGACCAC AGTGTGAGTG AGGGTTGGGA CAGGGCTGAC

TAGAGGGTAG GGAGCAGGCT GGGGACTGAG AGACTCCAGC CCTGTGGGGGATGGTTGCCC

AGGCTGGAGG GGGGTGGGCG CTGGGAGTGG GGAGCCCCCC ACTTGCATCT GGTGCCACAT

TCACTGCAGA TCTATGTC

4.肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶(CKMM)基因

肌型肌酸激酶(muscle-specific creatine kinase，CKMM)是一种组织特异性酶，主要在骨骼肌中表达，心肌中也有少量表达。其在细胞内的作用：一是在高能量需求时CK作为“暂时的能量缓冲系统”保持ATP/ADP的比率；二是CK可作为能量转运单位，将能量从产生部位转运到利用部位。人的CKMM基因位于19q13.2～q13.3的染色体区域，其长度约17.5kb，包含8个外显子和7个内含子。

本发明人认为，该基因与人体运动能力存在一定关联。因此，研究了该基因在运动员和普通人中的多态性的分布频率和特点，发现在其基因序列的第18931位(核苷酸位置编号基于GenBank登录号：AY：585238，gi：45934429)(即rs8111989)上存在单核苷酸多态性，该位点上具有AG型的人比具有AA型和GG型的人具有更强的有氧运动能力。

包含所述多态性位点的CKMM基因的部分序列如下，该序列存在A→G的多态性，矩形框表示多态性位点。其中，所述多态性位点上为A的序列见SEQ ID NO：6。

CTCCATCCTC TGGATTCTGG CCAATGAAAT ATCTCCCTGG CAGGGTCCTC TTCTTTTCCC

AGAGCTCCAC CCCAACCAGG AGCTCTAGTT AATGGAGAGC TCCCAGCACA CTCGGAGCTT

GTGCTTTGTC TCCACGCAAA GCGATAAATA AAAGCATTGG TGGCCTTAGC TTTGTGCGAT

AGTTATTGAG GGAGGACGTG CAATTGGCCA CTGTGTGGTC TCAGAGTGGT TTGTCCTGTC

TAGGCATGTA CTAAACATGT CTTATCCCGG GTCTAAAATG AGGCAAAGTT AGGTCACAGA

ATCTAGTCCA AAAATTAGAA GGCTCTATGG GGAATCTGAG ACCCAGAGAG ACACTGAGCC

CAGTGTCACT CACCCAAAGC ATGGGCCCTT TCCAACTATG GCTTTGAATT AGTCATGCTC

AGATCTCAAA CACGAGGTCC ACGCTGGGGA GGAATGCAGC CAAACGAAAT GTCTGAAACT

TGAATTTAGC CCAACGGTCT CCAGTTTTGA GACCTCCCAT GCAGCTCGTC ACATCTACCT

ATATTCTGCT TCTCAGTGGC CTCCTTCTGT CCCGTCTGAC TTCATCCCTC TGTAGCTGCT

GCCAGTCCCT TACTTTCTCA AGAACCTGCCTGGCTCCCC ATTTCTCCTA GAAAGCTTTT

CTGTTATTTT GCAACTCAAG GCCACACTGA AATGCATACC ATTTGCTGGA GGCTCACCTT

TCCAGTTCTT TCCCCATTAC TCCTCTGATT CTTTCACACC TGACACCCTC CAATTCCCAC

CTCAATGTCT TTGACCAAGC TGTTTCCCTC TCCAATCTGT GAGTCTGAGC ATCCCCATGA

AGTCTTTAGG GATAGGCCTT TTGGAGAACT CAGTCCCAGG AAGGAACAGG AAAGAGGTGT

GGTAGAGCAA TTGGTGGAGG GAGAAGAGTT AATAGAAGTC AAGCAGTAGC TGAACATGCA

TTGGGTGTTG GGCACGTCAA TCACCTCCAC CCAGTCAAAC AGGCCAATGT CTACGTTAAC

AAGGACACAG TCGGTGGGCC CCAAAAGACA AACGTTTTAG GGAAAAAAAA AAGTGAGGTG

GGAGTAAATG GAAGAACCGA CAAAGCCCTC AGGAACCTAA GGTGCTTTTT CAAACCTCAA

GAGTCACAGA GATTAAGGGC CCTTGTAGTT CAATCTGCCC TCTGTTTTAC AGAGGGGAAA

TTGAGGCCTA GGGATGTCCC CAAAAGTTCC CAGGGAGATT ACTACAAGGA AGGTTAGGAG

5.肌红蛋白基因

肌红蛋白(MB)是由一条包含153个氨基酸残基的多肽链和一个辅基血红素组成的单链球形蛋白，其功能是把血液中的氧通过细胞膜运输到肌细胞中，以氧合肌红蛋白的形式暂时储存，保证肌肉剧烈活动时对氧的需要。

人类肌红蛋白基因位于22q11.2-q13的染色体区域，长约10.5kb，包括3个外显子和2个内含子。肌红蛋白基因第2外显子编码该基因的主要功能部分，故其基因表达直接影响蛋白质的功能。在肌红蛋白基因第2外显子上存在单核苷酸多态(SNP)A79G。本发明人的研究发现，在其基因序列的第12327位(核苷酸位置编号基于GenBank登录号：NC：000022，gi：89161203)(即rs7293)上存在单核苷酸多态性，该位点上具有AA型的人比具有AG型和GG型人具有更强的有氧运动能力。

包含所述多态性位点的MB基因的部分序列如下，其中存在一个G→A的多态性位点，以矩形框表示。其中，所述多态性位点上为G的序列见SEQ ID NO：3。

ACAGCACCCC TGCAATAGTG AGCTGGTGAC TTTACGCCTC AGAACCTCGG TTTCCACATC

TGTAAAATGG GAATTATATG ACACTCACTA TGTGCCAGAC ACCCTGTTGG TACATAGCAC

ACACTATCTC ACTTAATCCT TCAAGTAGGG ACAAGTTATC CCCATCCCTT ATATGAGGAA

GCTGAGGCAC AGAGAGGTGA AGTGAATGGC CCAAGGTCAC ACAGCTGGGA AGACAGGGAG

CTAAACTTGA ACTCTAGTCT GGCTGCCCCC AGACCTCACA CCGCACCTCC CATGCCGACT

CCAGCCTTCC CTGTGCCCAC AGGCTCTTTA AGGGTCACCC AGAGACTCTG GAGAAGTTTG

ACAAGTTCAA GCACCTGAAG TCAGAGGACG AGATGAAGGCTCTGAGGAC TTAAAGAAGC

ATGGTGCCAC CGTGCTCACC GCCCTGGGTG GCATCCTTAA GAAGAAGGGG CATCATGAGG

CAGAGATTAA GCCCCTGGCA CAGTCGCATG CCACCAAGCA CAAGATCCCC GTGAAGTACC

TGGAGGTAGG AGCAGAGCCT GGGCAGGTGG GAGGATGCGG GGAAGGCCTC GGGTGGGGCA

ATGGGATCTG GGTTCGAGTC CAAGCTCAGC CACTAACTTG TGGGATGACC TATGCCACTC

TTCTCTGTGC CCCAGGTTTC TCATTTGTAA AGGGGACTGC CACCCACTTT GCCTTCCTCC

TGGGATTGTT GAGAATGAAC ACACTTAGCA TTTTTAATTT AGTATGCCAA ATTCACATCT

TATTACCAAA GAGGAAAGGG A

6.过氧化物酶体增殖受体γ辅激活因子α基因(PPARGC1A)

过氧化物酶体增殖受体γ辅激活因子α(peroxi some proliferators-activated receptorγcoactivator 1 alpha，PPARγ辅激活因子α，PPARGC1)是一个多核受体和转录因子的辅激活因子。长期耐力训练提高有氧运动能力，在很多组织引起一系列的适应性变化，如脂肪酸利用增加，线粒体生物合成增快、氧化磷酸化能力增强，I型肌纤维增多等。这些适应性的变化与PPARGC1的生物学功能类似，提示该基因是影响耐力表型的候选基因之一。

本发明人的研究发现，在其基因序列的第94701位(核苷酸位置编号基于GenBank登录号：NC000004 gi89161207)(即rs6821591)上存在单核苷酸多态性，该位点上具有TT型的人比具有CT型和CC型的人具有更强的有氧运动能力。

包含所述多态性位点的PPARγ辅激活因子α基因的部分序列如下，该序列中存在C→T的多态性，矩形框表示多态性位点。其中，所述多态性位点上为C的序列见SEQID NO：4。

GAGAGAGAGA GAGACAGGAT ATTAGTTCTA GGAACCTGTG GTTTCTTCAG GATTGTCATA

TAATCATTAC GTTATGAGAG AAAGCTTGCT TCAAGTTGAT TCTGCACTTT CTTAAAAAAA

CAGAGTACAA AGGCTGATGC CCAGACATCA GCGGCTGTCA TTTTAGGGTG GTTTGTGGTT

GGTTGGTTGG TTGGTTGGTT GTTAGTTTTC TTTCCTTTTT AATTTATATA TATATATATA

TATATATATA TTTTTCCTTT TGAATAGAAT ACGAACATTT TGAAGTTCTA GGTTTTAAG

GTGTCTTCAT GGAACTGCTG CCATTTGAAA TGGTTTGCCC TTGCGCATTC TGGTCAGGTG

CCCCCAGTCC TCACATGTAC CCACACATAC TTCCCCTAAA CCAAGCACAC ACACCACACA

CATACATACA CACACACATACATGCACACA CGCACACTCC ATCACCAAGA GACTCCAGGA

AAAGCAAAGC TGACACCCAT GAATAAACAT GTGCTTACTG GATATCATTC TGTCTCTTGC

CTCTTCAGCA GCTGTGTTCA TGTAAACCAT TGTTGTTATT GTTGTTGTTG

有氧运动能力的检测

基于本发明人的新发现，可以利用线粒体高变区I基因、β肾上腺素能受体基因、血管紧张素基因、肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶基因、肌红蛋白基因、或PPARγ辅激活因子α基因的上述多态性特点，来作为个体有氧运动能力强弱的判断标志。从而可用于从人群中选拔到适合于进行有氧类运动的人员。

因此，本发明提供了一种判断受试者有氧运动能力强弱的方法，所述的方法包括：检测受试者的β肾上腺素能受体基因是否存在核苷酸第265位A→G变异；在该位点上具有GG或AG基因型的人比具有AA基因型的人判断为具有更强的有氧运动能力。

优选的，在作出判断前，还包括：

检测受试者的线粒体高变区I基因是否存在核苷酸第16362位T→C变异，在该位点上具有CC的基因型比具有TT基因型的人判断为具有更强的有氧运动能力；和/或

检测受试者的血管紧张素基因是否存在核苷酸第11468-11756位的插入/缺失变异，在该位点上具有II或ID基因型的人比DD基因型的人判断为具有更强的有氧运动能力；和/或

检测受试者的肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶基因是否存在核苷酸第18931位的A→G变异，该位点上具有AG型的人比具有AA型和GG型的人判断为具有更强的有氧运动能力；和/或

检测受试者的肌红蛋白基因是否存在核苷酸第12327位的G→A变异，该位点上具有AA型的人比具有AG型和GG型人判断为具有更强的有氧运动能力；和/或

检测受试者的PPARγ辅激活因子α基因是否存在核苷酸第94701位的C→T变异，该位点上具有TT型的人比具有CT型和CC型的人判断为具有更强的有氧运动能力。

可以同时检测上述基因多态性位点的两种或多种，以更准确地选拔到适合于进行有氧类运动的人员。最优选的，同时检测上述六种基因的各自的多态性位点，同时存在所述的变异时，就表明该受试者的有氧运动能力强。

基因芯片

根据上述提供的基因的多态性，可设计出适合的探针，固定在微阵列(microarray)或基因芯片(又称为“DNA芯片”)上。

所述的基因芯片上包含针对至少一种所述的基因多态性位点的探针；更优选的，所述的基因芯片上包含针对两种或两种以上所述的基因多态性位点的探针；最优选的，所述的基因芯片上包含针对六种所述的基因多态性位点的探针。

本发明所述的基因芯片，包括固相载体和有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针由10-60个(更特别的为15-30个)连续核苷酸组成。为了增强检测信号的强度，提高检测结果的准确率，上述探针最好位于所在探针的中部。所述探针还可以在其5’端包含一段氨基修饰的1-30聚的聚脱氧胸苷酸(聚dT)。

所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基、异硫晴酸基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

本发明的基因芯片的制备可采用生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后点样仪将其点在修饰玻片或硅片，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。如果寡核苷酸探针不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of gene expressionon a genomic scale.Science，1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

作为一个方面，本发明提供了一种通过基因芯片技术确定样品中线粒体高变区I基因、β肾上腺素能受体基因、血管紧张素基因、肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶基因、肌红蛋白基因、和PPARγ辅激活因子α基因中一种或几种基因的基因型的方法，包括以下步骤：

从样品中提取DNA；以该DNA为模板，扩增获得包含线粒体高变区I基因、β肾上腺素能受体基因、血管紧张素基因、肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶基因、肌红蛋白基因、和PPARγ辅激活因子α基因中突变位点的扩增产物；标记前述所得的扩增产物；将前述所得经标记的扩增产物与所述的基因芯片杂交；检测基因芯片的杂交信号，从而确定样品中线粒体高变区I基因、β肾上腺素能受体基因、血管紧张素基因、肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶基因、肌红蛋白基因、和PPARγ辅激活因子α基因的基因型。

制备用于PCR扩增的染色体DNA的方法很多，可以从全血中制备、也可以从发根中制备，还可以从口腔粘膜的脱落物中制备。具体方法可参阅文献(丁振诺，苏明权主编，《临床PGR基因诊断技术》，世界图书出版公司。1998年第一版)。

用PCR方法扩增染色体基因特定片段的方法已经是本领域公知技术。其中的关键在于引物设计，有关引物设计的方法、软件均可以从商业途径获得。本发明涉及的线粒体高变区I基因、β肾上腺素能受体基因、血管紧张素基因、肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶基因、肌红蛋白基因、和PPARγ辅激活因子α基因的变异位点的扩增引物和体系可根据上述各种方法及有关文献(KB穆里斯，F·费里，R·吉布斯等主编《PCR聚合酶链式反应》)记载的方法由使用者独立完成。

对扩增产物进行标记可以通过采用5’端带标记基团的引物进行扩增的方法，也可通过在扩增过程中掺入带标记基团的单核苷酸的方法，或通过在杂交时加入与扩增产物特异性结合的检测探针的方法实现，所述标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生生物分子(FITC等)、其他荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术，也可以参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔主编，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002年；马立人，蒋中华主编。生物芯片。北京：化学工业出版社，2000，1-130。

带标记的扩增产物与基因芯片杂交前，可先将扩增产物变性。此时，可采用常规变性方法变性PCR扩增产物。此类方法例如将扩增产物加热至94～98℃，并保温2～10min，然后迅速置冰上。或者，也可采用碱变性然后中和的方法。如果突变位点分多管进行扩增，可将这些管的扩增产物先混和，然后在一起变性，也可以先一起变性，再混和。

将上述扩增产物与基因芯片进行杂交时，可以先将基因芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。

本发明扩增产物与基因芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔主编，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002年。

然后根据标记信号在基因芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等)获取待测信息。

作为本发明的一种优选方式，基因芯片的设计如图2所示：探针的5’端与固相载体相连，扩增产物可与相应的特异性探针互补，其5’端与检测探针(带有标记，如Biotin标记)互补。

检测试剂盒

本发明还提供一种用于测定线粒体高变区I基因、β肾上腺素能受体基因、血管紧张素基因、肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶基因、肌红蛋白基因、或PPARγ辅激活因子α基因的基因型的试剂盒。所述的试剂盒可用于检测受试者有氧运动能力。所述的试剂盒中可包括本发明所述的芯片。

更优选的，它还含有选自下组的试剂：(a)特异性扩增上述基因的引物；或(b)识别上述基因的相应的变异位点的限制性内切酶。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。所述的芯片图像分析软件比如：BaiO公司的BaiO ArrayDoctor2.0，Media Cybernetics公司的Arraypro4.0。

本发明的主要优点在于：首次找到一类与有氧运动能力密切相关的基因多态性，为分析受试者的有氧运动能力提供了基于分子生物学水平的依据。并且，本发明人还利用所述的基因多态性特点，开发了可直接用于检测受试者有氧运动能力的基因芯片和检测试剂盒，所述的基因芯片和试剂盒检测灵敏度高、再现性好、准确性可达到99％以上，芯片样品经上海市测试中心检测，效果良好。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1β2肾上腺素能受体基因Arg16/Gly多态性与有氧能力关联研究

一、耐力运动员β2肾上腺素能受体基因Arg16/Gly多态性的研究

研究对象主要分为两组，即运动员组和普通人组。

运动员组：主要以耐力性项目(游泳、赛艇和水球)和速度力量类项目(柔道)为主，主要包括：游泳运动员：90名汉族优秀运动员(男性49名，女性41名)，其中国际健将8名，国家健将47名，一级运动员35名。赛艇运动员：优秀运动员94名(男性36名，女性58名)，其中国际健将6名，健将27名，一级运动员61名；来自上海、江苏、浙江、山东等地区。水球运动员：国家男子水球队优秀运动员23名，全部为国家健将级运动员；来自上海、广东、广西和湖南等。柔道运动员：国家柔道队优秀运动员40名，其中国家健将级运动员22名，一级运动员18名；运动员主要来自东北、内蒙古和华东地区。以上优秀运动员共计247名。

普通人组：主要选择与本次优秀运动员年龄相当的普通人90名(男43名，女性47名)，身体健康，无遗传性疾病。严格按照随机抽样的原则进行，均无专业运动训练史。

1.DNA提取

取肝素抗凝管外周静脉血5ml，低渗溶血法破裂红细胞，采用经典的蛋白酶K消化，饱和酚/氯仿抽提法提取白细胞DNA，DNA溶于TE溶液中备用。

2.β2-AR基因+46位多态位点目的片段的扩增

采用PCR技术扩增目的片段。引物1(FP2Arg16)：5′-CGCCTTCTTGC TGGCACGCAAT-3′(SEQ ID NO：33)(引入错配碱基G，从而创造一个BseMI内切酶酶切位点)；引物2(RP2Gly16)：5′-CCA GTGAA GTGA TGAA GTA GTT-3′(SEQ ID NO：34)。采用PE-9700扩增仪进行扩增反应。

50μl PCR反应体系：DEPC水15.5μl；d NTP2.5μl；pfu聚合酶缓冲液2.5μl；pfu聚合酶0.5μl；ADRβ2FP0.5μl；ADRβ2RP0.5μl；DNA3.0μl；总25μl。

PCR反应液配置好以后放入PCR仪中进行扩增反应。PCR扩增条件为：①94℃5min；②94℃30S；③60℃30S；④72℃30S；⑤72℃5min；其中从②→④共循环35次，耗时约90分钟。

PCR产物用含EB的2％琼脂糖凝胶，在电压100V、1×TAE缓冲液中电泳20min，应用凝胶成像分析系统观察扩增结果(dN TP、MgCl2、10×Buffer、pfu polymerase聚合酶均来自华美生物工程公司)。PCR产物片段长度为203bp，4℃保存。

3.基因型的测定

采用限制性内切酶法，每管反应体积20μl，取8μl PCR产物，BseMI内切酶4U，10×Buffer2μl，剩余体积以灭菌去离子超纯水补足，置于55℃水浴箱中酶切过夜。

次日早拿出，酶切产物用含EB的4％进口琼脂糖凝胶电泳，在70V电压、1×TAE缓冲液中电泳30min，观察酶切结果。因为G(Gly16)型等位基因者存在BseMI内切酶酶切位点(5′-GCAATGNN↓-3′)，酶切后产生147bp、56bp两个片段；而A(Arg16)型等位基因不存在酶切位点，故酶切反应后仍为203bp。因此，A(Arg16)纯合型为一个片段(203p)，AG(Arg16/Gly)杂合型有3个片段(203bp、147bp和56bp)，G(Gly16)纯合型有2个片段(147bp、56bp)，具体结果见图1。

4.统计学处理

采用SPSS11.0统计软件进行数据处理。基因计数法计算基因频率、基因型频率，通过卡方检验(X²)计算基因型频率是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。通过r×c列联表卡方检验计算与其它地区人群或其他种族的基因型分布差异。检验显著性水平定为P<0.05，极显著水平为<0.01。

研究结果

游泳、赛艇、水球、柔道等各项目运动员和普通人组的β2-AR基因A→G(Arg16/Gly)的3种基因型和等位基因频率的分布经卡方检验符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05)，具有群体代表性。

游泳、赛艇、普通人三组人群男女间三种基因型和A、G等位基因频率均无显著性差异(P>0.05)。但不同项目运动员与普通人比较存在差异。其中，赛艇项目运动员与普通人的三者基因型和A、G等位基因频率比较均存在显著性差异(P<0.05)。赛艇运动员中GG型频率明显高于普通人(P<0.05)；水球运动员的A、G等位基因频率与普通人女子比较存在显著性差异(P<0.05)。虽然其它项目与普通人比较在基因型和等位基因频率上均无显著差异，但GG基因型的频率均高于普通人，G等位基因的频率也高于普通人。以上结果表明，在β2-AR基因A→G(Arg16/Gly)多态性中，等位基因G的与运动能力存在关联。同时，运动项目不同，其β2-AR基因A→G(Arg16/Gly)多态性也存在差异。

运动员与普通人比较还发现：(1)游泳项目中国际健将、一级运动员和普通人比较在基因型分布频率上存在明显差异(P<0.05)；(2)赛艇项目中，国际健将、健将及以上和总体与普通人比较在基因型分布频率上存在明显差异(P<0.05)。因此，β2-AR基因A→G(Arg16/Gly)多态性普通人与优秀耐力性项目运动员比较存在较大差异。

不同等级、不同项目运动员基因型和等位基因频率比较发现：(1)在90名游泳运动员中，国际健将8名，基因型为AG型为7名，AA型的1名，AG型的比例高达87.5％；在94名赛艇运动员中，国际健将6名，AG型为4名，占66.7％，GG型3名，占33.3％。在全部14国际健将中，AG占到11名(78.6％)，具有很明显的趋高性。(2)在耐力性为主的游泳、赛艇、和水球三个项目中，运动员水平越高，基因型AG型和等位基因G的比例就越高，而基因型AA型和等位基因A的比例就越低，表现出明显的变化趋势，而柔道运动员正好相反。(3)在基因型方面，游泳国际健将和健将运动员中，AG型频率明显高于游泳一级运动员和普通人(P<0.05)；赛艇国际健将运动员中，AG和GG型明显高于普通人(P<0.05)。

此外，本发明人还针对其它测试指标：包括最大摄氧量(VO₂max)、相对最大摄氧量(VO₂max/Kg)、最大二氧化碳排出量(VCO₂max)、最大呼吸商(RQmax)、最大通气量(VEmax)、O2-plusemax最大呼吸频率(BFmax)、最大心率(HRmax)、达到最大功率(Pmax)、最大运动时间(Tmax)、最大负荷阶段的工作时间(Wmax-T)等，对运动员以及普通人进行了测试。结果，①耐力性项目游泳和赛艇运动员中，β2-AR基因A→G(Arg16/Gly)GG型的运动员，其三大系统间的协调能力、心肺功能，氧运输、氧利用的能力等，也就是机体的综合机能水平要优于其它两种基因型的运动员，而GG和AG型间的差别要小于GG型与AA型之间的差别，但游泳运动员中不同基因型差别要大于赛艇运动员。②不同运动项目中，β2-AR基因A→G(Arg16/Gly)不同基因型的运动员表现出了较明显的项目特点：游泳和赛艇运动员中的GG型的总体运动能力要优于AA型的运动员，GG型和AG型无明显差异，这说明拥有这两种基因型的运动员具有较强训练适应能力和更好的训练效果；但柔道运动员三种基因型见无明显差异。

实施例2线粒体高变区I基因T16362C位点多态性与有氧能力关联研究

研究对象分为3组，优秀游泳运动员组、优秀赛艇运动员组和普通人组。游泳运动员组：54名(男性28名，女性26名)优秀运动员，其中国际健将4名，健将26名，一级运动员24名。赛艇运动员：优秀运动员55名(男性26名，女性29名)，其中国际健将4名，健将24名，一级运动员27名；全部为汉族；来自上海、江苏、浙江、山东等地区。普通人组：主要选择与本次优秀运动员年龄相当的普通人71名(男36名，女性35名)，身体健康，无遗传性疾病。严格按照随机抽样的原则进行。

1.DNA的提取

从肘静脉取2ml全血注入肝素(10U/ml)抗凝试管，然后立即离心(1500rpm，10min)。溶解全血中的红细胞后，转至1.5ml管中，制备成白细胞沉淀保存于-80℃备用。使用经典法DNA抽提试剂盒(上海申能博采生物科技有限公司)从白细胞沉淀中抽提总DNA。

2.引物设计

引物设计根据Anderson mtDNA剑桥序列进行设计；选择合适的序列范围：HVR-I选择L链中15978-15996之间的序列为上游引物(FP)，H链中16407-16427之间的序列为下游引物(RP)，采用Primer select5.0引物设计软件，引物由美国赛百盛生物工程公司合成。其引物序列如下：

引物1：5’CAC CAT TAG CAC CCA AAG C3’(SEQ ID NO：35)

引物2：5’GGG ATA TTG ATT TCA CGG AGG3’(SEQ ID NO：36)

3.PCR反应(50μl)

采用Takara DRR031A试剂盒，总反应体系为50μl。含DNA(20ng/ul)提取产物5μl，H₂O32μl、10×buffer5μl、2.5mM dNTPs5μl、20μM primer For1μl、20μM primerRev1μl、Ex taq1μl。

初期预变性95℃，5min、变性95℃30sec、退火60℃30sec、2-4×35cycles延伸72℃60sec、最后延伸72℃10min、4℃10min。在GeneAmp2400(Perkin Elmer，美国)型DNA扩增仪上完成扩增。

PCR产物经用QIA quick PCR纯化试剂盒纯化，然后直接进行测序。

4.mtDNA HVR-I序列多态性分析

应用DNASTAR6.10版(美国DNASTAR公司)序列分析软件进行对mtDNAHVR-I的序列进行编辑，修正、核对等工作，同时对不同运动项目运动员的序列多态性进行分析，并与剑桥序列进行比对(Anderson S.等，Sequenceand Organization oftheHuman Mitochondrial Genome.Nature，1981，290(9)：457～465)，确定多态位点、类型及频率；选取的SNPs在该群体中分布频率大于10％的位点进行分析。

5.数据处理

采用SPSS11.0统计软件进行数据处理，结果用百分率(％)表示。通过卡方检验(X2)分析和比较不同项目间mtDNA HVR-I序列多态性在组间分布差异。VO2max等指标的结果以平均数±标准差(X±SD)表示，不同SNPs位点和序列间选用independt-SamplesT Test进行统计处理，检验显著性水平定为P<0.05，极显著水平为<0.01。

6.结果

结果显示，与剑桥序列(剑桥标准序列来自：Anderson S.，Bankier A.T.，G.BarrellB.等，Sequenceand Organization of the Human Mitochondrial Genome.Nature，1981，290(9)：457～465，剑桥序列是目前世界公认的mtDNA HVR-I的标准序列)比对，54名优秀游泳运动员mtDNA高变区I SNPs频率大于10％的位点共有15个，其中SNPs频率大于20％的位点有6个(G16129A、C16167A、A16183C、T16189C、C16223T和T16362C)；而55名赛艇运动员mtDNA高变区I SNPs频率大于10％的位点共有10个，其中SNPs频率大于20％的位点有6个，与游泳运动员完全相同。同时，在游泳和赛艇运动员中，16167A、C16223T和T16362C三个位点多态性频率明显高于其它位点。

在普通人中，SNPs频率大于10％位点共有13个，而SNPs频率大于20％位点有7个(G16129A、C16167A、C16168A、A16183C、T16189C、C16223T和T16362C)，其中4个的频率明显高于其它位点，它们是C16167A(49.3％)、C16168A(38.0％)C16223T(57.7％)和T16362C(38.0％)；而位点C16168A为普通人所独有。

本发明人把游泳和赛艇运动员mtDNA高变区I SNPs频率大于10％的位点进行统计后，在以上每一个位点，将运动员按照剑桥序列和非剑桥序列进行分类，并对分类后运动员的VO₂max/kg、VEmax、O₂-pluse_max、Blamax、HR、Pmax、Tmax等指标进行统计和比较。

结果发现，无论是游泳还是赛艇运动员，拥有位点T16362C的非剑桥序列(即该位点上为C)的运动员的VO₂max/kg、VEmax、O₂-pluse_max、Pmax和Tmax等指标均显著的高于剑桥序列(即该位点上为T)的运动员，这样的结果再次提示，mtDNA高变区I序列多态位点T16362C与汉族优秀耐力运动员的最大有氧能力存在关联，可作为运动训练高敏感的SNPs标记，同时也是一个非常重要的遗传标记。

实施例3血管紧张素(ACE)基因I/D多态性和有氧能力关联的研究

采用如实施例1或2类似的方法，本发明人还研究了ACE基因I/D多态性和有氧能力的相关性，结果如下：

①85名游泳运动员中有国际健将7名，全部为II型；87名赛艇运动员有国际健将4名，其中3名为II型，1名为DD型，在总数不多的国际健将中以II型占主体，表现出较高的一致性。

②不同项目不同水平运动员间ACE基因I/D多态性分布频率存在着明显差异提示：具有II基因型或I等位基因的游泳和水球运动员经过多年运动训练，具有成为优秀运动员的可能，特别是II基因型的运动员成为优秀运动员的可能性更大；而与游泳和水球不同，赛艇和柔道项目具有ID基因型的运动员成为优秀运动员的可能更大。

③不同基因型的游泳运动员的VO2max、VO2max/kg、VCO2max、VEmax、O2-plusemax、Wmax和Tmax等指标均表现为II型>DD型>ID型，II型明显优于ID型，而赛艇运动员则表现为ID型>II型>DD型，ID明显优于DD型。

④游泳项目中具有II基因型或I等位基因的运动员，而赛艇项目中具有ID基因型或I等位基因的运动员可能属于运动训练敏感的高反应群体，所以经过多年系统科学的训练，成为优秀运动员的可能性很高。

因此，ACE基因I/D多态性可作为运动训练和选材中高敏感的、非常重要的遗传标记之一。

实施例4肌红蛋白基因、PPARγ辅激活因子α基因、肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶基因多态性与有氧能力关联研究

采用如实施例1和2类似的方法，本发明人还研究了肌红蛋白基因、PPARγ辅激活因子α基因、肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶基因的上述多态性与有氧能力的相关性，结果如下：

肌红蛋白基因：

以汉族优秀游泳运动员90名、赛艇运动员92名，中国柔道国家队40名运动员、国家男子水球队23运动员，汉族71名普通人为研究对象，对其多态性及与有氧能力关联研究。

结果发现：(1)游泳和赛艇两项目中，国际健将和健将运动员AA基因型的频率显著高于普通人，等位基因A的频率也显著高于普通人；也就是运动员水平越高，AA基因型和A等位基因的频率就越高。(2)游泳运动员中，运动员的VO2max/kg、VEmax、O2-plusemax、Wmax和Tmax等指标表现为AA型>GG型>AG型，AA基因型的运动员上述指标比其它两种基因型的运动员高出5.35％～11.2％；而赛艇和柔道运动员则表现为AA型>AG型>GG型，AA型的运动员上述指标比其它基因型的运动员高出6.15％～13.2％。

以上结果表明，游泳、赛艇和柔道项目中具有AA基因型或A等位基因的运动员属于运动训练敏感的高反应群体，所以经过多年系统科学的训练，更有成为优秀运动员的可能。

PPARγ辅激活因子α：

以汉族优秀游泳运动员90名、赛艇运动员91名，中国柔道国家队40名运动员、国家男子水球队23运动员，汉族80名普通人为研究对象，对其多态性及与有氧能力关联研究。

结果发现：(1)游泳、赛艇、柔道和水球四个运动项目运动员中，运动员的基因型频率分布表现为：TT型>TC型>CC型；运动员水平越高，TT基因型的频率就越高；游泳、赛艇项目中，国际健将TT基因型的频率明显高于普通人，健将的也要高于普通人；(2)游泳和赛艇项目中，运动员的VO2max/kg、VEmax、O2-plusemax、Wmax和Tmax等指标表现为TT型>CC型>CT型，TT基因型的运动员上述指标比其它两种基因型的运动员高出5.33％～14.1％，同时，运动员水平越高，上述指标数值越大，表明有氧能力越强；而柔道运动员则表现为CT型>CC型>TT型，CT型的运动员上述指标比其它基因型的运动员高出4.58％～8.42％。上述结果表现出一定的项目差异。

以上结果表明，游泳和赛艇项目中具有TT基因型的运动员的有氧能力要强于其它基因型的运动员，而且水平越高有氧能力越强；柔道运动员中CT基因型的运动员的有氧能力强于其它基因型的运动员，但三种基因型运动员有氧能力的差异要小于游泳和赛艇运动员，表现出一定项目差异。

因此，游泳和赛艇项目中具有TT基因型的运动员属于运动训练敏感的高反应群体；柔道项目中，具有CC基因型的运动员属于运动训练敏感的高反应群体。

肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶：

以汉族优秀游泳运动员89名、赛艇运动员97名，中国柔道国家队40名运动员、国家男子水球队23运动员，汉族91名普通人为研究对象，对其多态性及与有氧能力关联研究。

结果发现：(1)游泳、赛艇、柔道和水球四个运动项目运动员中，AA基因型和等位基因A的频率要低于普通人，AG基因型和等位基因G的频率要高于普通人；运动员水平越高，AA基因型的比例略高，AG基因型的频率略低。(2)游泳和柔道运动员中，运动员的VO2max/kg、VEmax、O2-plusemax、Wmax和Tmax等指标表现为AG型>GG型>AA型，AG基因型的运动员上述指标比其它两种基因型的运动员高出4.35％～12.23％；而赛艇运动员则表现为GG型>AG型>AA型，GG型的运动员上述指标比其它基因型的运动员高出5.55％～14.33％。

以上结果表明，游泳和柔道项目中具有AG基因型或G等位基因的运动员的有氧能力要强于其它基因型的运动员，而赛艇运动员中GG基因型或具有等位基因G的运动员的有氧能力强于其它基因型的运动员。

因此，肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶基因可作为运动员训练敏感的高反应遗传基因之一，同时，上述结果提示我们，不同运动项目中，基因型不同运动员有氧能力也不相同，但具有等位基因G的运动员对有氧能力训练具有更高的敏感性。

实施例5 基因芯片的制备

1.合成探针和引物

采用Primer Priemer 5.0软件设计所有的探针和引物，见表1和表2。相关的探针和引物委托上海生工生物工程服务有限公司合成。

表1相关基因扩增引物

扩增液编号引物编号序列SEQ IDNO：包含位点11-FP15’ccc atc ctt tct ccc att tc 3’7ACEI/D1-FP25’-aaaaaagcgggcgcaaaagc ggc cat cac att cgt cag at 3’81-RP5’acg gag tct cgc tct gtc g 3’922-FP5’cca acg gtc tcc agt ttt ga 3’10CKMM18931A/G2-RP5’-aaaaaagcgggcgcaaaagc aag gtg agc ctc cag caa a 3’1133-FP5’ctt taa ggg tca ccc aga gac tc 3’12MB12327G/A3-RP5’-aaaaaagcgggcgcaaaagc ggg gat ctt gtg ctt ggt g 3’1344-FP5’tgt gct tgg ttt agg gga ag 3’14PPARα94701C/T4-RP5’-aaaaaagcgggcgcaaaagc tca ttt tag ggt ggt ttg tgg 3’1555-FP5’cac cac agc cgc tga atg 3’16β2-AR265G/A5-RP5’aaaaaagcgggcgcaaaagc cag gcc agt gaa gtg atg aag 3’1766-FP5’gag gga ggt cat cca tga gg 3’18线粒体高变区I，16362(T/C)6-RP5’-aaaaaagcgggcgcaaaagc cac cca tca aca acc gct at 3’19

表2相关位点探针序列

基因编号探针序列SEQ IDNO：ACE1-INH₂-5’-ttttttttttttttttttttttttt ggat ctc ggc tca ctg caa g 3’201-DNH₂-5’-tttttttttttttttttttttttta gcc tat aca gtc act ttt atg tgg 3’21CKMM2-ANH₂-5’-ttttttttttttttttttttttttt gaa cct gcc atg gct cc 3’222-GNH₂-5’-ttttttttttttttttttttttttt aac ctg ccg tgg ctc c 3’23MB3-ANH₂-5’-ttttttttttttttttttttttttt agat gaa ggc atc tga gga ct 3’243-GNH₂-5’-ttttttttttttttttttttttttt gat gaa ggc gtc tga gga ct 3’25

PPARγα4-CNH₂-5’-ttttttttttttttttttttttttt cat gaa gac acg ctt aaa acc t 3’264-TNH₂-5’-tttttttttttttttttttttttta cca tga aga cac act taa aac ct 3’27β2-AR5-GNH₂-5’-ttttttttttttttttttttttttt cac cca atg gaa gcc atg 3’285-ANH₂-5’-ttttttttttttttttttttttttt gca ccc aat aga agc cat g 3’29线粒体高变区I6-TNH₂-5’-tttttttttttttttttttttttta cca tga gga cga gaa ggg 3’306-CNH₂-5’-tttttttttttttttttttttttta cca tga ggg cga gaa gg 3’31Uni-P5’Biotin-ttttttcgcccgcgttttcg 3’32

2.基因芯片的点样

采用美国Affymetrix公司的GMS417基因芯片点样仪，根据该点样仪使用说明书记载的方法进行点样。采用上海百傲科技有限公司的BaiO点样缓冲液作为缓冲液试剂。简述如下：

①根据芯片设计原则，编制如表3点样模式的点样程序：

表3 阵列表

标志列阳性阳性阳性阳性标志列1-I1-D2-A2-G标志列3-G3-A4-C4-T标志列5-G5-A6-T6-C标志列阴性阴性阴性阴性

②将合成好的检测合格的探针用TE溶解并稀释至100μmol/L；

③将稀释好的探针溶液与BaiO点样缓冲液以1∶10比例混合，然后按照点样程序加入到384孔板的指定位置；

④将醛基修饰的基片依次放置在点样仪的点样平台上；

⑤将上述点样板置于点样仪中，启动点样仪的点样程序，自动完成点样过程。

⑥点样效果的质检：将点样后的基片依次置于体视显微镜下观察点样效果，重点是有无漏点，各点之间是否均匀、整齐。

实施例6 有氧运动能力相关基因芯片测试

1.样品收集、DNA抽提和扩增

采集受试者的静脉全血或末稍血约500ul，EDTA抗凝，不少于100～200ul，置于含50ul的2％EDTA溶液的无菌1.5ml离心管中，混匀。

采用常规的方法提取血样中的DNA，进行PCR扩增。

PCR扩增体系为：10×Buffer 2.5μl；2.5mM dNTP2μl；25mM MgCl₂1.5μl；DMSO1.5μl；20mg/ml BSA1μl；DDW10.5μl；引物1+1μl；Taq1μl；模板(Temp)3μl。

扩增条件：95℃4min；然后按94℃25sec，56℃25sec，72℃25sec做40个循环，最后72℃5min。

2.基因芯片的杂交

采用上海百傲科技有限公司的寡核苷酸基因芯片杂交专用的杂交缓冲液。经过大量的实验研究，确定用于本发明的基因芯片的最佳杂交温度约为42℃。

取阴性阳性扩增液，1，3号扩增液各5μL，其余PCR扩增液各10μL(共计50μL)，加入到同一个0.2ml的薄壁管中，98℃热变性5分钟，取出后迅速放入冰盒，-20℃放置5分钟。

取出基因芯片，在杂交舱中加入预杂交液溶液220μl，于42℃静置5分钟，吸除该缓冲液；

取无菌的1.5ml离心管(自备)，从杂交缓冲液瓶中吸出180μl杂交缓冲液(含Biotin标记的探针)，加入已变性的PCR扩增产物混合物，混匀，将液体全部加入到杂交舱中(加液时应注意无气泡产生)；

将基因芯片迅速放入42℃恒温箱中，保温30分钟。同时取1.5ml离心管，从洗液1瓶中吸出700μl洗液1，于42℃恒温箱中预热；

从恒温箱中取出基因芯片，吸除杂交舱中溶液；

在杂交舱中加入220μl已预热的洗液1，42℃保温5分钟，然后吸除。再重复此步骤两次。

3.显色(所用试剂均为上海百傲科技有限公司产品)

在杂交舱中加入洗液2溶液220μl，室温放置2分钟；

吸除杂交舱中溶液，向杂交舱中加入抗体液溶液220μl，室温放置20分钟；

吸除杂交舱中溶液，向杂交舱中加入洗液2溶液220μl，室温静置5分钟。再重复此步骤一次；

吸除杂交舱中溶液，向杂交舱中加入洗液3溶液220μl，室温放置2分钟；

吸除杂交舱中溶液，向杂交舱中加入显色液溶液220μl，42℃避光放置40分钟。

4.检测

吸除杂交舱中溶液，小心揭除杂交舱，将显色载玻片显色区小心用蒸馏水冲洗一下，置42℃烘干；

将显色载玻片面朝下扣在BaiOBE-2.0生物芯片识读仪(Cat#BSE 01011)的片槽上检测，具体操作见仪器使用说明。

检测图像经Array Doctor2.0软件分析可自动输出检测结果。

5.有氧运动能力相关基因芯片测试和验证结果

A.空白实验

空白实验的目的是考察各探针的本底值，说明探针的特异性。具体实验方法见前述，仅加入变性后的阳性扩增液做杂交实验。结果见图3，空白实验的结果显示各探针的空白值与背景一样，表明本芯片设计的探针特异性很强。

B.准确性和敏感性实验

准确性和敏感性实验目的主要是考察该芯片对已知基因型的样品进行认证实验，确认芯片测试的准确性和敏感性。

选择14例已知基因型的样品，通过不同的方法对6个基因位点进行测试。提供样品的DNA采用赛百盛抽提试剂盒进行抽提，浓度为20ng/uL。

芯片检测过程同前，测试结果见表4。

表4已知基因型样品和基于芯片测试结果的比较统计表

编号测试类型123456ACEI/DCKMM18931A/G肌红蛋白12327G/APPARγα94701C/Tβ2-AR265G/AmtDNA16362T/CP1已知基因型IDAAGGTTAATT芯片检测IDAAAATTAATTP3已知基因型IIGGAGCTAATT芯片检测IIAGGACTAATTP5已知基因型IDAGAGCTAGTC芯片检测IDAGGACTGATCP8已知基因型IIAAAATTAGTT芯片检测IIAAAATTGATTP11已知基因型DAAAATTAACC芯片检测DDAAAATTAACCP13已知基因型IIAAGGTTAGTT芯片检测IIAAGGTTGATTP15已知基因型IDAGAATTGGCC芯片检测IDAGAATTGGCCP18已知基因型IDAAAGCTGGtt芯片检测IDAAGACTGATTP24已知基因型IDAAAATTAATT芯片检测IDAAGATTAATTP33已知基因型IDAAAATTAAtt芯片检测IDAAAATTAATTP46已知基因型IIAAAGCTAATT芯片检测IIAAGACTAATTP53已知基因型IIAAAACTGGtt芯片检测IIAAAACTGGTTP74已知基因型IDAAAATTAACC芯片检测IDAAAATTAACCP58已知基因型IDGAGACTGAcc芯片检测IDAAGACTGACC

从表4可见，不同样品已知基因型和芯片检测结果存在一定差异。主要表现为：(1)ACE基于I/D芯片测试结果与已知基因型完全一致；(2)CKMM中，编号为P3和P58的样品芯片测试结果与已知基因型不同；(3)肌红蛋白中，编号P1和P24的样品芯片测试结果与已知基因型不同；(4)PPARγα测试结果与已知基因型完全相同；(5)β2-AR中，编号P18的样品芯片测试结果与已知基因型不同；(6)mtDNA中，测试结果完全相同。

由Array Doctor2.0软件输出的检测结果的代表性例子见图4-图6。

为了验证基因芯片测试的准确性和敏感性，本发明人对于有争议的位点再次进行测序验证，同时对部分位点相同的样品也进行了测序验证。PCR产物经用QIA quickPCR纯化试剂盒纯化，然后直接进行测序。

结果发现，不同位点已知基因型和芯片测试基因型不同的个别位点，再次进行测序的结果与芯片测试结果相同(即：已知基因型或客户提供的基因型信息有误)，如CKMM基因，样品P3和P58。与已知基因型结果相同的位点，测序结果均与芯片的测试结果相同，也即本次采用芯片进行基因型测试的准确率为100％。

上述结果表明，本发明的基因芯片具有很高的准确性和敏感性。

C.重复实验结果

重复实验的目的主要是考察该芯片对同一样品反复测试能力，通过对一定数量样品两次测试重复程度的验证，确认该芯片测试的重复性。

在上海自行车队随机选择15名优秀男子运动员，体重67.3±9.1kg；身高177.6±6.5cm；年龄22.4±4.1岁。抽取血样、PCR扩增等步骤与前述类似。

从表5可见，本发明人针对六个位点，每个位点15个样品进行测试结果发现，所有位点两次测试结果完全相同，重复率为100％。以上测试结果表明，本发明的芯片测试重复性非常高。

表5两次重复测试结果

样本编号测试次数123456ACEI/DCKMM18931A/G肌红蛋白12327G/APPARγα94701C/Tβ2-AR265G/AmtDNA16362T/C1第1次IIAAGACTAATT第2次IIAAGACTAATT2第1次IIAAAATTAACC第2次IIAAAATTAACC3第1次IIAAGATTGATT第2次IIAAGATTGATT4第1次IIAGAACCGATT第2次IIAGAACCGATT5第1次IIAAGGCTGACC第2次IIAAGGCTGACC6第1次IIAAAATTGATT第2次HAAAATTGATT7第1次IDAGAACTGATT第2次IDAGAACTGATT8第1次IDAAGATTAATT第2次IDAAGATTAATT9第1次IDAGAATTGACC第2次IDAGAATTGACC10第1次IDAAGATTGGTT

第2次IDAAGATTGGTT11第1次IDAGAATTAATT第2次IDAGAATTAATT12第1次IIAAAACTGGTT第2次HAAAACTGGTT13第1次IDAAAACCAATT第2次IDAAAACCAATT14第1次IIAAAACTGATT第2次IDAAAACCAATT15第1次IDAAAATTGACC第2次IDAAAATTGACC

D.对未知基因型的样品测试验证

本部分的目的是考察该芯片对未知基因型的样品测试结果进行验证，进一步确认芯片测试结果的精确性和特异性。

每个位点选择15个样品，用本发明的基因芯片进行测试。在测试结果中，(1)ACE基因I/D这一位点全部样品采用PCR产物进行电泳，然后进行基因型的验证分析；(2)其它五个位点，每个位点随机选择8个样品，采用PCR产物纯化后测序的方法验证各位点基因型。结果见表6。

表6验证检测结果一览表

编号ACEI/DCKMM18931A/G肌红蛋白12327G/APPARγα94701C/Tβ2-AR265G/AmtDNA16362T/C芯片测试电泳芯片测试测序芯片测试测序芯片测试测序芯片测试测序芯片测试测序1IIIIAAAAGAGACTAATT2IIIIAAAAAATTTTAACCCC3IIIIAAAAGAGATTGAGATT4IIIIAGAGAACCCCGATTTT5IIIIAAAAGGGGCTCTGACCCC6IIIIAAAAAATTGAGATTTT7IDIDAGAGAACTCTGAGATT8IDIDAAGAGATTTTAAAATT9IDIDAGAGAAAATTTTGACCCC10IDIDAAGAGATTGGTT11IDIDAGAGAAAATTAAAATT12IIIIAAAAAACTCTGGGGTTTT13IDIDAAAACCCCAAAATT14IIHAAAACTGATT15IDIDAAAATTGACCCC

由表6可见，所有基因不同位点验证结果的准确率为100％，表明该基因芯片特异性和精确性非常高，其检测结果的具有很高可靠性和有效性。

由图7显示，位点ACE基因I/D多态性采用PCR产物电泳的方法的测试结果表明，所有样品测试结果与芯片测试结果完全相同。

实施例7有氧运动能力基因型检测芯片试剂盒

本实施例提供一种基于基因芯片检测技术的试剂盒，可方便地检测人染色体中ACE等基因的多态性。

本实施例中，所述的试剂盒的设计的规格为：1人份/张芯片，12人份/盒。

为方便贮存和使用，本产品由试剂盒(1)和试剂盒(2)两部分组成，见表7。

表7试剂盒的组成

试剂盒(1)试剂盒(2)名称体积数量(瓶)名称体积数量(支)抽提液1抽提液2预杂交液杂交缓冲液洗液1洗液2洗液3显色液基因芯片说明书4ml1ml3ml3ml9ml9ml3ml3ml1111111112张1份Taq酶TY扩增液1TY扩增液2TY扩增液3TY扩增液4TY扩增液5TY扩增液6阳性扩增液阳性对照液阴性扩增液阴性对照液抗体液100μl20μl20μl20μl20μl20μl20μl20μl10μl20μl10μl1ml1121212121212121212123

本实施例提供的试剂盒适用于EDTA抗凝的全血样本。采集被检者静脉血0.5ml，用一次性无菌注射针头抽取，收集于含50μl的2％EDTA溶液的无菌1.5ml离心管中，盖上管盖，上下颠倒数次使混匀。

抽提液1、抽提液2、预杂交液、杂交缓冲液、洗液1、洗液2、洗液3、显色液、阳性扩增液、阳性对照液、阴性扩增液、阴性对照液、抗体液由“上海百傲科技有限公司”提供。Taq酶，10×缓冲液：TaKaRa；dNTP由“上海生工生物工程技术服务有限公司”提供。

TY扩增液1-6的组成，主要是每个扩增液的引物的区别，分别为本芯片六个基因探针的引物，具体探针和引物见表2和表1。TY扩增液1-6的具体配方如下：10X Buffer2.5μl，2.5mM dNTP2μl，25mM MgCl21.5μl，DMSO1.5μl，20mg/ml BSA1μl，DDW10.5μl，引物1+1μl，Taq1μl，模板3μl。

试剂盒的使用方法如下：

(1)抽提：取无菌的1.5ml离心管(自备)，向其中加入混匀的待检全血100μl和抽提液1溶液300μl，充分混匀，温静置8分钟；将离心管置离心机中，6000g离心1分钟；取出离心管，倾去上清液，离心管底部可见少量白色沉淀；向离心管中加入抽提液2溶液60μl，充分振荡使沉淀溶解；沸水浴中15分钟；取出离心管，置离心机中，12,000g离心15分钟。离心后上清液可直接用于PCR扩增。

(2)PCR扩增：从试剂盒中取出阴性扩增液管、阳性扩增液管、TY扩增液1管、TY扩增液2管、TY扩增液3管、TY扩增液4管、TY扩增液5管、TY扩增液6管和Taq酶管，高速离心数秒，使液体流回管底；分别在每管中加入Taq酶管溶液1μl；在阴性扩增液管中加入阴性对照管溶液3μl，混匀；在阳性扩增液管中加入阳性对照管溶液3μl，混匀；分别在扩增液1-6管中各加入抽提好的样品上清液3μl，混匀；将各管放入PCR仪中，按下列条件扩增：94℃，4min，然后按94℃25sec，56℃25sec，72℃25sec做40个循环，最后72℃5min；取阴性、阳性扩增产物，TY1、3扩增产物各5μL，其余PCR扩增产物各10μL(共计60uL)，加入到同一个0.2ml的薄壁管中(自备)，98℃热变性5分钟，取出后迅速放入冰盒，-20℃放置5分钟。

(3)杂交：取出基因芯片，做好样品编号，在杂交舱中加入预杂交液溶液220μl，于42℃静置5分钟，吸除该缓冲液；取无菌的1.5ml离心管(自备)，从杂交缓冲液瓶中吸出200μl杂交缓冲液，加入已变性的PCR扩增产物混合物，混匀，将液体全部加入到杂交舱中(加液时应注意无气泡产生)；将基因芯片迅速放入42℃恒温箱中，保温30分钟。同时取1.5ml离心管(自备)，从洗液1瓶中吸出700μl洗液1，于42℃恒温箱中预热；从恒温箱中取出基因芯片，吸除杂交舱中溶液；在杂交舱中加入220μl已预热的洗液1，42℃保温5分钟，然后吸除。再重复此步骤两次。

(4)显色：在杂交舱中加入洗液2溶液220μl，室温放置2分钟；吸除杂交舱中溶液，向杂交舱中加入抗体液溶液220μl，室温放置20分钟；吸除杂交舱中溶液，向杂交舱中加入洗液2溶液220μl，室温静置5分钟；再重复此步骤一次。吸除杂交舱中溶液，向杂交舱中加入洗液3溶液220μl，室温放置2分钟；吸除杂交舱中溶液，向杂交舱中加入显色液溶液220μl，42℃避光放置40分钟。

(5)检测：吸除杂交舱中溶液，小心揭除杂交舱，将基因芯片显色区小心用蒸馏水冲洗一下，置42℃烘干；将基因芯片面朝下扣在BaiO^生物芯片识读仪的片槽上检测，具体操作见仪器使用说明。检测图像经Array Doctor软件分析可自动输出检测结果。

(6)结果判断：由软件自动输出。

实施例8多态性位点与有氧运动能力相关性的验证

研究对象：分别选择汉族优秀游泳运动员10名，其中国际健将2名，健将4名，一级运动员4名；年龄18.2±3.2岁，体重69.6±9.7kg；身高177.1±6.3cm。

汉族普通人12名，均未经过任何专业或业余的体育训练，年龄20.5±1.2岁，体重65.3±7.2kg；身高167.1±6.3cm。

1.DNA的提取

从肘静脉取2ml全血注入肝素(10U/ml)抗凝试管，然后立即离心(1500rpm，10min)。溶解全血中的红细胞后，转至1.5ml管中，制备成白细胞沉淀保存于-80℃备用。使用经典法DNA抽提试剂盒(上海申能博采生物科技有限公司)从白细胞沉淀中抽提总DNA。

2.不同基因型测试

通过前述制备的基因型检测芯片来完成，具体方法见前面。

3.有氧运动能力测试

采用功率自行车递增负荷的运动方式；确定男女运动员和普通人开始负荷为功率50W，转速50～70rdm，男子每2min增加功率40W，女子增加功率30W，转速不变，直至力竭。

4.测试方法和仪器：采用一口气接一口气法(Breath by breath)测试；测试仪器为CORTEX Biophysik MetaMax^Portable CPX system(德国产)心肺功能测试仪和Monark839功率自行车(瑞典产)。

5.测试指标与方法：相对最大摄氧量(VO₂max/Kg)、最大二氧化碳排出量(VCO₂max)、最大通气量(VEmax)、最大氧脉搏(O2-plusemax)、最大心率(HRmax)、达到最大功率(Pmax)、最大运动时间(Tmax)。测定方法：在整个测试过程中，每10秒连续记录气体代谢的各项指标。

6.数据处理：采用SPSS11.0统计软件进行数据处理，结果用百分率(％)表示。VO2max等指标的结果以平均数±标准差(X±SD)表示。

7.结果

表8为10名优秀游泳运动员测定六个基因相关位点的基因型和表示有氧运动能力的主要指标测试结果。

表8 10名优秀游泳运动员六个基因基因型和有氧运动能力相关指标统计

编号性别六个基因基因型有氧运动能力相关指标ACEI/DmtDNACKMMMBAR16PPARVO₂max/Kg(ml/min/kg)O₂-pluse_max(ml/b)Pmax(W)Tmax(S)s1男IICAAAAAGTT68.329.6894101082s2男IICAGAGGGTT78.5329.74101084s3女IICAAAAAGTT72.5228.9290990S4女IDTAAGGAGCT53.4822.3230747s5女IDCGGAAAGCC60.3419.3230845s6女IDTAGAGGGTT58.8418.542290970s7男IDCAGAGAATT64.1625.1583701098s8女DDTAAAGAACT62.6119.048220930s9女DDTAAAAAACT57.3419.946230781s10男DDTAAAGAGCT59.7627.74501213平均数(X)63.624.02313974标准差(SD)7.64.7188.9150.5

表9为12名普通人测定六个基因相关位点的基因型和表示有氧运动能力的主要指标测试结果。

表9 12名普通人六个基因基因型和有氧运动能力相关指标统计

编号性别六个基因基因型有氧运动能力相关指标ACEI/DmtDNACKMMMBAR16PPARVO₂max/Kg(ml/min/kg)O2-pluse_max(ml/b)Pmax(W)Tmax(S)P1男IITAAAAGGTT50.5119.4240575P2女IICAGAAAGCT51.2919.5220511P3女IICAGAGAGCT50.2218.6210493P4男IITAAAAGGCT56.0321.5240542P5女IDCAGAGAACT42.8215.6220505P6女IDCAGAGAGTT46.7718.8232582P7男IDCAAGGAATT38.9918.1240616P8男IDCAAAAAGTT38.6316.2250582P9男DDTAAAAGGCT40.0615.3240556P10女DDTGGAAAATT37.4714.4210506P11男DDCAAAAGGTT38.9815.3230542P12女DDTGGGGAACT36.8413.8180435平均数44.117.2226.7537.2标准差6.582.4118.949.7

从表8和表9测试结果统计发现，优秀游泳运动员的VO2max/Kg比普通人高出44.2％，O2-plusemax比普通人高39.7％，Pmax比普通人高38.1％，Tmax比普通人高81.3％。从上述测试结果我们可以看到，运动员的有氧能力相关的指标均显著高于普通人。

本发明人对优秀游泳运动员和普通人各基因位点不同基因型所测试得到的有氧运动能力的相关指标进行统计分析，具体结果见表10，可见：

(1)在mtDNA16362这一位点，非剑桥序列的(具有碱基C)的运动员的VO2max/Kg和O2-plusemax分别比剑桥序列的运动员(具有碱基T)的运动员高出15.60％和11.40％。同样，在普通人中，非剑桥序列的VO2max/Kg比剑桥序列的高出14.3％。

(2)β2肾上腺素能受体基因265这一位点表现为，运动员组GG基因型的有氧运动能力最强，AA型最差，其中GG型运动员的VO2max/Kg、O2-plusemax和Pmax分别比AA型高出11.9％、26.6％、28.1％；同样，在普通人中，GG型和AG型表现出的有氧运动能力基本相同，但均明显高于AA，其中VO2max/Kg和O2-plusemax分别高出AA型18.9％、16.1％和19.7％和18.1％，这与运动员组的表现基本相同。

(3)血管紧张素(ACE)基因I/D多态性与有氧能力关系表现为，运动员和普通人中，具有II基因型的其有氧能力明显高于其它两种基因型(ID型和DD型)，表现出很明显的特征。从表10可见，运动员组II基因型者，其VO2max/Kg、O2-plusemax、Pmax和Tmax分别比ID型者高出23.5％、38％、32.1％和15％，比DD型者高出22.1％、32.4％、23.3％、7.93％。而普通人也表现出同样的趋势，如II基因型的四项指标分别比ID型者高出24.7％、15.10％、2.61％、7.74％，比DD型者高出35.70％、34.30％、2.91％和12.10％。

(4)在肌红蛋白(MB)基因12327这一位点不同基因型有氧能力表现为，在运动员组和普通人组中，AA基因型和AG基因型的有氧能力基本相同，但要均高于GG型。其中，VO2max/Kg这一指标，普通人中AA型比GG型高17.94％，AG型比GG型高22.93％，这要高于运动员组的14.6％和13.7％。

(5)肌肉组织特异性磷酸肌酸激酶(CKMM)基因的18931这一位点不同基因型中，运动员组中AG型的有氧能力最强，但与其它两种基因型比较，VO2max/Kg、O2-plusemax、Pmax和Tmax略高。而普通人中，同样是AG型的有氧能力最强，虽略高于AA型者，但却明显高于GG型者，VO2max/Kg和O2-plusemax分别高出28.57％和28.20％。

(6)PPARγ辅激活因子α基因94701这一位点中，运动员和普通人均表现为TT基因型者的有氧能力最强，CT型最差，其中，运动员组TT型者的VO2max/Kg、O2-plusemax、Pmax和Tmax等明显高于，分别为15.70％、18.78％、25.31％和10.82％，同样，普通人中TT型的四项指标也高于CT型，分别为14.85％、19.94％、6.64％和9.18％。

表10 游泳运动员和普通人各基因不同基因型有氧运动能力比较

运动员普通人基因名称基因型VO₂max/Kg(ml/min/kg)O2-plusemax(ml/b)Pmax(W)Tmax(S)VO₂max/Kg(ml/min/kg)O2-plusemax(ml/b)Pmax(W)Tmax(S)mtDNAT58.7222.73314961.841.86416.896234523.04C68.4625.33332986.247.8417.44230.88547.28C-T(％)15.60％11.40％0.64％2.54％14.3％3.22％1.36％4.64％AR16AA61421.4273.3936.339.015.4226.6515.6AG64.225.73221013.646.718.2230.0542.2GG68.727.1350102746.417.9238.0553.8GG-AA(％)11.9％26.6％28.1％9.69％18.9％16.1％5.01％18.9％GG-AG(％)7.01％5.45％8.7％1.32％AG-AA(％)19.7％18.1％1.48％5.15％ACEI/DII73.129.4370105252.019.8236.0571.4ID59.221.328091541.817.2230.0530.4DD59.922.2300974.738.314.7229.4509.8II-ID(％)23.5％38％32.1％15％24.7％15.10％2.61％7.74％II-DD(％)22.1％32.4％23.3％7.93％35.70％34.30％2.91％12.10％MBAA65.324.65290947.344.717.4234.3545.0AG64.824.03318105946.617.6224.0526.7GG57.0122.223084737.916.0208.0525.6

AA-GG14.6％11％26.1％11.8％17.94％8.96％12.64％3.70％AG-GG13.7％8.24％38.3％25％22.93％10.51％7.69％0.20％CKMMAA62.9424.58305973.8343.917.6208.0488.9AG67.1824.47356.671050.6747.818.1224.0514.8GG63.1720.0523093637.214.1216.0470.8AG-AA6.74％-0.45％16.94％7.89％8.92％2.63％7.69％5.29％AG-GG6.35％22.04％55.07％12.25％28.57％28.20％3.70％9.35％PPARCC63.220.1230936CT59.222.2282.5942.7541.0115.65220512.9TT68.526.43541044.847.118.77234.6560TT-CT15.70％18.78％25.31％10.82％14.85％19.94％6.64％9.18％TT-CC8.40％31.64％53.91％11.62％

综上所述，对比运动员和普通人各基因不同基因型运动员有氧能力差异表明，本发明选择的六个基因中，不同位点、不同基因型与有氧能力存在关联。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。