绿脓假单胞菌IATS O11血清型脂多糖（LPS）特异性人单克隆抗体

摘要

本发明涉及一种对绿脓假单胞菌IATS O11血清型特异的人单克隆抗体、产生其的杂交瘤、其编码核酸、以及用其转染的宿主细胞。而且，本发明涉及产生所述单克隆抗体的方法。此外，本发明涉及包括至少一种抗体或至少一种编码所述抗体的核酸的药物组合物。

说明书

发明领域

本发明涉及一种绿脓假单胞菌IATS O11血清型特异性人单克隆抗 体、产生该抗体的杂交瘤、编码该抗体的核酸、和用该核酸转染的宿 主细胞。而且，本发明涉及产生所述单克隆抗体的方法。另外，本发 明涉及包括至少一种抗体或至少一种编码所述抗体的核酸的药物组合 物。

背景技术

绿脓假单胞菌是一种发现于淡水和土壤的普遍存在的革兰氏阴性 环境细菌。它是一种典型的条件致病菌，通常不会对免疫力完整的宿 主造成威胁，免疫力完整的宿主通过调理抗体和吞噬作用将其清除。 但囊性纤维化患者和免疫缺失个体——包括烧伤患者、ICU中被插管 的患者、癌症和AIDS患者以及接受器官移植的患者——发生医院内感 染的风险特别高。在全部医院内感染中绿脓假单胞菌与耐甲氧西林金 黄色葡萄球菌(MRSA)和万古霉素耐药肠球菌(VRE)所占的比例高达34 ％，医院内感染已经从1975年的7.2/1000患者·天增加至1995年的 9.8/1000患者·天。最经常观察到的医院感染的形式是血流感染和肺炎。

为防止囊性纤维化患者的慢性绿脓假单胞菌感染，已经建立了用 于主动免疫的由结合有绿脓假单胞菌脱毒毒素A的绿脓假单胞菌的8 种最相关的LPS血清型组成的八价结合疫苗。对该疫苗的长期研究已 经表明，18岁时临床感染的患者的比例从约72％降低至32％。但是， 主动免疫接种仅对于免疫力完整的患者以及在可预测的情况下才是有 可能进行的。因此，大多数绿脓假单胞菌患者不能用八价疫苗进行主 动免疫。由于这一点，并且由于大多数绿脓假单胞菌菌株耐受多种药 物这一事实，需要有一种可选择的治疗手段来治疗绿脓假单胞菌感染 患者。一种尝试是通过经典的杂交瘤技术或噬菌体展示抗体库克隆来 产生人单克隆抗体。

这两种方法及由此产生的抗体均表现出一些严重的缺陷。

经典的杂交瘤技术(“Kohler和Milstein”方法)基于通过用选择 的抗原主动免疫以及通过与骨髓瘤配体融合，从而产生具有所需特异 性的鼠B细胞。之后，需要通过基因工程对产生抗体的克隆的基因信 息进行人源化，并在合适的表达系统中产生抗体。同样，噬菌体展示 抗体库克隆需要复杂的抗体基因工程，并要建立合适的表达系统。

已知针对细菌LPS的鼠单克隆抗体能识别与人抗体不同的表位。 因此，在小鼠体内产生单克隆抗体之后进行人源化并非必然分离到其 特异性与人类应用相关的抗体。

因此，IgM同种型抗体由于与IgM关联的效应器机制对于抗细菌 免疫是最佳的，因而最为有效。但由于该分子复杂的五聚形式，迄今 尚未实现IgM抗体的重组表达。因此，通过噬菌体展示技术分离的抗 体的表达局限于IgM以外的同种型。

作为另外的选择方案，在产生绿脓假单胞菌LPS部分的人单克隆 抗体方面进行了不同的尝试。但是，或是产生所述抗体的方法没有优 势(由于类淋巴母细胞的不稳定性)，或是抗体表现出非人糖基化方式， 或是需要非常大量的抗体。而且，现有技术中描述的许多抗体缺乏效 应器功能，从而不具保护性。

发明内容

因此，本发明要解决的一个技术问题是提供一种对绿脓假单胞菌 特定血清型的LPS特异的人单克隆抗体，其中该抗体表现出很高的保 护能力，尤其是在体内。

人单克隆抗体解决的技术问题如下定义。

根据本发明，提供了对绿脓假单胞菌IATS O11血清型的LPS特异 的称为1BO11的人单克隆抗体，其中该抗体轻链的可变区包括CDR1 区中的SEQ ID NO：1、CDR2区中的SEQ ID NO：2和CDR3区中的SEQ ID NO：3中的至少一个，并且其中该抗体重链的可变区包括CDR1区中 的SEQ ID NO：4、CDR2区中的SEQ ID NO：5和CDR3区中的SEQ ID NO：5中的至少一个；或者其能够结合所述LPS的片段或衍生物。

本发明进一步提供能够产生单克隆抗体的杂交瘤和分别编码该抗 体轻链和重链的核酸。而且，本发明提供包括该核酸的载体和宿主细 胞。此外，提供了该单克隆抗体的生产方法。此外，提供了包括至少 一种抗体和/或至少一种核酸的药物组合物及其第二医药用途。

出人意料地，已经发现根据本发明的人单克隆抗体表现出很高的 保护能力。特别是人单克隆抗体证实在体外是可调理吞噬作用的。更 为重要的是，如实施例中所示，如通过在鼠烧伤模型中保护免受血流 感染以及在小鼠急性肺感染模型中保护免受呼吸道感染确定，根据本 发明的单克隆抗体表现出体内保护能力，。

与Collins等人描述的人单克隆抗体(Collins MS等人，1990. FEMSIM 64：263-268)相比，本发明的人单克隆抗体在低得多的剂量下 实现调理吞噬作用，并且保护能力更高。

与现有技术中所描述的单克隆抗体相比(Harrison FJJ等人，1997. Hybridoma 16(5)：413-420；Zweerink HJ等人，1988.Infection and Immunity 56(8)：1873-1879)，根据本发明的人单克隆抗体进一步从用结 合疫苗主动免疫的健康个体的血液中产生。通常已知，由于缺乏T细 胞的辅助，针对多糖的抗体质量非常低(即亲和性低，效应器能力很 低)。仅通过使用结合疫苗，可以产生有价值的具有高活性、强效应器 能力的针对多糖靶标的抗体。而且，与现有技术中所描述的单克隆抗 体的产生速率相比(Zweerink等人，1988.Infection and Immunity 56(8)：1873-1879)，根据本发明的人单克隆抗体的产生速率较高。

现有技术中没有述及显示对绿脓假单胞菌所致肺感染有保护能力 的人单克隆抗体。

根据本发明，抗体对绿脓假单胞菌IATS O11血清型具有特异性， 并在低至0.1ng/ml的浓度下表现出调理吞噬的活性，如使用荧光-细菌 结合物进行测定。现有技术中没有报道在该低剂量下表现调理吞噬活 性的抗体。

根据本发明的单克隆抗体以很高的特异性识别临床分离株。使用 该抗体识鉴别了18-20份感染IATS O11血清型绿脓假单胞菌的患者的 标本。不拘泥于任何理论，推测单克隆抗体能够识别现有技术中已知 的所有IATS O11绿脓假单胞菌株。这一特性使该抗体尤其适用于诊断 和治疗。因此，根据本发明的抗体表现出难以超越的可靠性。

本文所用的术语“人单克隆抗体”包括任何部分或完整的人单克 隆抗体，不管单克隆抗体是从何来源获得的。优选通过杂交瘤产生人 单克隆抗体。还可以通过基因工程得到单克隆抗体，尤其是通过将背 景抗体的CDR区替换以权利要求中定义的特定CDR片段，将权利要 求中定义的CDR片段CDR移植在市售的单克隆抗体上。

术语“CDR区”是指抗体的互补性决定区，即决定抗体对特定抗 原的特异性的区域。轻链和重链上的3个CDR区(CDR1-CDR3)均 对抗原结合具有重要作用。

CDR区在重链中的位置如下：

CDR1区V_H外显子内的氨基酸31-35，

CDR2区V_H外显子内的氨基酸50-65，

CDR3区V_H外显子内的氨基酸95和随后的氨基酸。

CDR区的位置不依赖于抗体类型，即IgG的IgM、IgA。

CDR区在κ轻链中的位置如下：

CDR1区V_χ外显子内的氨基酸24-34，

CDR2区V_χ外显子内的氨基酸50-56，

CDR3区V_χ外显子内的氨基酸89和随后的氨基酸。

CDR区在λ轻链中的位置如下：

CDR1区Vλ外显子内的氨基酸24-34，

CDR2区Vλ外显子内的氨基酸50-56，

CDR3区Vλ外显子内的氨基酸89和随后的氨基酸。

V_H、V_χ和Vλ的氨基酸排列可以从V base index中得到 (http:www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok.php？menu＝901)。

术语“血清型”是指绿脓假单胞菌的任何已知血清型。目前用于 不同绿脓假单胞菌血清型的不同名称的索引表显示于说明书中的表I 中。

术语“片段”指任何能够结合LPS血清型的抗体片段。片段长 度至少为10个氨基酸，优选20个，更优选50个。优选片段包括抗体 的结合区。优选片段为Fab或F(ab’)₂片段或其混合物。

术语“衍生物”包括通过至少添加、缺失、和/或置换至少一个氨 基酸改变的人单克隆抗体的任何突变蛋白。优选地，衍生物为如下的 人单克隆抗体突变蛋白：其中突变蛋白在重链和/或轻链中的任意CDR 中携带至少一个保守置换，如权利要求所示。更优选，突变蛋白具有 不多于5个保守置换，特别优选不多于2个保守置换。抗体片段或衍 生物结合特定LPS血清型的能力通过直接ELISA测定，如材料和方法 章节中所描述：将特定LPS固定在ELISA板的固相上。将抗体片段或 抗体衍生物与固化的LPS一起孵育，结合的抗体或其衍生物通过合适 的酶联二抗进行显像。

根据本发明，术语“保守置换”是指将属于特定物化类别的一个 氨基酸替换成属于相同物化类别的氨基酸。物化类别定义如下：

非极性氨基酸类别包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异 亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。具有不带电极性侧 链的氨基酸类别包括：天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸和胱 氨酸。具有带正电极性侧链的氨基酸物化类别包括：赖氨酸、精氨酸 和组氨酸。具有带负电极性侧链的氨基酸物化类别包括：天冬氨酸和 谷氨酸，也称为天冬氨酸盐和谷氨酸盐。

根据本发明，提供了上文概述的对绿脓假单胞菌IATS O11血清型 的LPS特异的抗体。

根据本发明的另一实施方案，提供了对绿脓假单胞菌IATS O11血 清型的LPS特异的人单克隆抗体，其中该抗体轻链的可变区具有氨基 酸序列SEQ ID NO：7，重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO：8；或者 能够结合所述LPS的所述抗体的变体，其中该抗体轻链氨基酸序列的 可变区与SEQ ID NO：7的同源性至少为85％，并且抗体重链可变区的 氨基酸序列与SEQ ID NO：8的同源性至少为85％。

本领域技术人员已知的术语“同源性”是指两种或多种多肽分子 之间的关联程度，其通过序列之间的一致性来确定。从两个或多个序 列中同源区的百分比来发现“同源性”百分比，并考虑空隙或其它序 列特征。

互相关联的多肽的同源性可以通过已知方法测定。通常，使用特 殊的计算机程序，其具有考虑到特殊要求的算法。优选地，测定同源 性的步骤首先在所考察的序列之间产生最大的一致性。测定两段序列 之间的同源性的计算机程序包括，但不限于，GCG程序包，其包括GAP (Devereux J等人，Nucleic Acids Research 12(12)：387(1984)；Genetics Computer Group University of Wisconsin，Madison(WI)；BLASTP， BLASTN和FASTA(Atschul S等人，J.Molec.Biol.215：403-410 (1990))。BLAST X程序可以获自National Centre for Biotechnology Information(NCBI)和其它来源(BLAST Handbook，Altschul S等人， NCB NLM NIH Bethesda MD 20894；Altschul S等人，J.Mol.215： 403-410(1990))。还可以使用公知的Smith Waterman算法来测定同源 性。

序列比较的优选参数包括以下：

算法：Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48(1970)，443-453

比较矩阵：BLOSUM62，出自Henikoff&Henikoff，PNAS USA 89 (1992)，10915-10919

空隙罚分：12

空隙长度罚分：2

GAP程序也适于使用上述参数。上述参数是氨基酸序列比较的标 准参数(缺省参数)，其中末端处的空隙不会降低同源性的数值。与参 比序列对比的序列非常小时，需要进一步将预期值增加至100,000，在 某些情况下是将字长(字节长度)降低至2。

可以使用其它模型算法、空隙开放罚分、空隙延伸罚分和比较矩 阵，其包括1997年9月的Program Handbook，Wisconsin Package，第9 版中所命名的那些。选择将取决于将要进行的对比，并进一步取决于 对比是否在序列对之间进行，这时优选GAP或Best Fit，还是在一个 序列和大的序列数据库之间进行，这时优选FASTA或BLAST。

上述算法测得一致性为85％则被称作同源性85％。更高程度的同 源性同样适用。

在优选的实施方案中，根据本发明的突变蛋白的同源性为85％或 更高，例如，高于90％或95％。

进一步优选根据本发明的人抗克隆抗体的轻链是κ型或λ型的。 特别优选地，轻链是κ型的。轻链可以是天然存在的链包括(天然重排 的)、基因修饰或合成型的轻链。如果根据本发明的对IATS O11特异 的抗体是κ型的，则优选轻链源自种系DPK18(http://www.mrc-cpe. cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php？menu＝901#VKEX)。

根据另一个优选实施方案，本发明的人单克隆抗体的重链选自所 有的人同种型，即IgM、IgA或IgG。优选地，重链为IgM型。如果抗 体是IgM型的，则其表现出对绿脓假单胞菌LPS亲和力高，与补体有 效结合，从而介导直接杀灭细菌和/或有效地调理细菌被吞噬的有利特 性。而且，IgM能耐受绿脓假单胞菌弹性蛋白酶的蛋白溶解降解作用， 而其它同种型如IgG或IgA则可以被降解。IgM抗体在很小的量下即 有效。在鼠烧伤创面脓毒症模型中1-4μg/鼠是完全有保护性的。

优选可变重链源自种系DP-53(http://www.mrc-cpe. cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php？menu＝901#VKEX)。轻链和重链可以共 价连接成单链抗体(例如二价scFv、双功能scFv和双特异性scFv)， 或者彼此非共价连接。

根据本发明的优选实施方案，人单克隆抗体完全由人氨基酸序列 组成。

“完全由人氨基酸序列组成”是指人单克隆抗体的氨基酸序列源 自人生殖种系。这可以通过不同方式来实现。例如，由人氨基酸序列 组成的人单克隆抗体可以通过杂交瘤获得，其中B-细胞是人B-细胞。 可选的方案是，人单克隆抗体可以通过将如权利要求所示的CDR区 CDR移植到市售的人单克隆抗体上获得，从而产生根据本发明的对绿 脓假单胞菌LPS血清型特异的人单克隆抗体。

人单克隆抗体完全是人氨基酸序列避免了有害副作用如排斥反应 或过敏性休克的发生。

进一步优选地，人单克隆抗体表现为基本上识别人抗原。“基本上 识别人抗原”是指根据本发明的人单克隆抗体的抗原识别基本上等同 于人类健康个体的抗原识别。具体来说，这要求人单克隆抗体轻链和 重链的Fc部分是人型的，以保证与人免疫系统的相互作用，并降低产 生所谓HAMA(人抗鼠抗体)的风险。

根据另一个优选实施方案，本发明的人单克隆抗体是从人B-细胞 或者将所述人B-细胞与骨髓瘤或杂合骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤获 得的。

人B-细胞可以通过如下方法得到：将健康个体或患者进行免疫， 随后抽取血液标本中，从中可通过已知方式分离B-细胞(Current Protocols in Immunology.Chapter 7.1.Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.Wiley&sons出版，JC Coligan 等人编著)。通过根据经典Kohler和Milstein方法的已知技术，可以将 人B-细胞与骨髓瘤或杂合骨髓瘤(heteromyeloma)融合，产生杂交瘤。 合适的骨髓瘤是P3X63的衍生物如P3X53Ag8.653(ATCC CRL-1580) 或SP2/0(ATCC CRL-1646)。生成的杂交瘤可以根据已知方法进行选 择。将杂交瘤在合适的培养基中进行培养，从上清液中回收产生的抗 体。

而且，本发明提供了分别编码本发明的人单克隆抗体的轻链和重 链的核酸。核酸可以是源自种系或者B-细胞中发生重排的天然核酸。 可选的方案是，核酸可以是合成的。合成核酸还包括具有修饰的核苷 酸间连接(包括硫代磷酸酯)以增加核酸对降解的耐受性的核酸。核 酸可以通过基因工程产生，或者完全通过核苷酸合成来人工制成。

本发明进一步提供如下载体：其包括至少一种编码本发明人单克 隆抗体轻链的核酸和/或至少一种编码本发明人单克隆抗体重链的核 酸。核酸可以存在于同一载体中，或者可以双元载体的形式存在。载 体优选地包括与核酸可操作地连接以促进编码轻链和/或重链的核酸表 达的启动子。优选地，载体还包括用于在宿主细胞内复制和维持的起 始点。载体也可包括位于编码轻链和/或重链的核酸5’的编码信号序列 的核苷酸序列。信号序列可以促进所编码的链分泌至培养基中。

优选地，载体源自腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、SV40病毒、逆 转录病毒、植物病毒或细菌噬菌体例如λ衍生物或M13。特别优选的 载体是含有人Ig重链和人轻链的恒定区的载体，例如Persic等人描述 的用于免疫球蛋白真核表达的联合载体系统(Persic等人，1997.Gene. 187(1)：9-18)。

载体可以进一步包括编码His-标记的核苷酸序列，从而表达一种 构建物以产生特定的融合产物，该融合产物在人单克隆抗体轻链和/或 重链的N端处具有His-标记，这有助于在镍柱上通过螯合物的形成来 纯化蛋白质。

而且，本发明提供了包括载体和/或适合于表达该载体的核酸的宿 主细胞。本领域中已知有许多种原核和真核表达系统，其中优选真核 宿主细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞，例 如HEK293-细胞、PerC6-细胞、CHO-细胞、COS-细胞或HELA-细胞 及其衍生物。特别优选人生产细胞系。优选转染的宿主细胞将产生的 抗体分泌至培养基中。如果实现了细胞内表达，则根据标准方法进行 复性，所述方法例如Benetti PH等人，Protein Expr Purif Aug； 13：283-290，(1998)。

本发明还提供了产生人单克隆抗体的方法。在一个实施方案中， 通过培养上述的杂交瘤产生人单克隆抗体。产生的单克隆抗体分泌到 上清液中，并通过采用传统色谱技术从其中纯化。

可选的方案是，人单克隆抗体由包括根据本发明的载体的宿主细 胞产生，并将宿主细胞在适合于编码的抗体链的重组表达的条件下培 养。优选地，宿主细胞包括至少一种编码轻链的核酸和至少一种编码 重链的核酸，并且能够组装人单克隆抗体，使得产生的三维结构与人-B 细胞产生的人单克隆抗体的三维结构相同。如果轻链独立于重链产生， 则可以纯化两条链，随后将其组装，产生基本上具有人B-细胞所产生 的人单克隆抗体的三维结构的人单克隆抗体。

人单克隆抗体也可通过所编码轻链和/或重链的重组表达获得，其 中通过以已知方式分离编码人单克隆抗体的核酸，将编码权利要求中 定义的CDR的核酸序列移植在分离的核酸上，从而产生核酸。

根据另一个优选的实施方案，根据本发明的人单克隆抗体是被修 饰的。修饰包括单体形式的二聚、低聚或聚合，例如，通过使用二环 己基碳化二亚胺进行交联。由此产生的二聚体、低聚体或聚合物可以 通过凝胶过滤彼此分离。进一步修饰包括侧链修饰，例如，ε-氨基-赖 氨酸残基的修饰，或者氨基和羧基端的分别修饰。进一步修饰包括翻 译后修饰，例如，蛋白的糖基化和/或部分或全部去糖基化，以及二硫 键的形成。抗体也可与标记物如酶标记、荧光标记或放射性同位素标 记相结合。

本发明进一步提供了包括至少一种人单克隆抗体和/或至少一种编 码人单克隆抗体轻链和/或重链的核酸的药物组合物。

药物组合物可以进一步包括本领域已知的制药学可接受的成分。

优选地，药物组合物用于治疗绿脓假单胞菌感染引起的疾病，例 如血流感染、肺炎、慢性支气管炎、局部感染，其包括创口感染和关 节侵袭性感染，主要见于免疫受损患者和/或呼吸功能受损的患者。药 物组合物进一步用于，但不限于，预防和/或治疗医院内获得性(医院 内)感染。由于绿脓假单胞菌感染的主要受害者是囊性纤维化患者、 烧伤受害者、插管患者、手术室和/或重症监护室中的患者、癌症和AIDS 患者、免疫受损的患者、免疫抑制的患者、糖尿病患者，以及静脉内 药物滥用者，药物组合物尤其适用于预防和/或治疗所述类型患者中绿 脓假单胞菌所致的疾病。

药物组合物可以进一步包括抗生素药物，优选与新的单克隆抗体 结合。

药物组合物包括浓度范围为0.1-30mg/kg体重的新的单克隆抗体。

药物组合物可以通过任何已知方式给药，例如经静脉内、肌肉内、 真皮内、皮下、腹膜内、局部、鼻内给药，或者吸入喷雾给药。    

本发明还提供用于诊断绿脓假单胞菌感染的检测试剂盒，其包括 至少一种本发明的人单克隆抗体，任选进一步包括用于进行诊断检测 的合适成分。

检测试剂盒适用于绿脓假单胞菌感染的特异性可靠诊断。测定试 验可以基于液相或膜结合形式的传统ELISA试验。如本领域所知，检 测可以是直接或间接的，其中抗体任选地结合有酶标记、荧光标记或 放射性同位素标记。

以下实施例对本发明进行说明，但并非要限制本发明的范围。当 阅读说明书并参考公知常识时，其它实施方案对本领域技术人员来说 将是显而易见的。

附图说明

图1涉及1BO11重链可变区的DNA和氨基酸序列。

图2涉及1BO11κ轻链可变区的DNA和氨基酸序列。

图3a涉及单克隆抗体1BO11对IATS O11血清型的临床绿脓假单 胞菌分离株的识别图谱。图3b涉及单克隆抗体1BO11对其它血清型的 临床绿脓假单胞菌分离物的识别图谱，与对所述其它血清型特异的单 克隆抗体进行比较。与1BO11的结合通过全细胞ELISA检测。

图4涉及单克隆抗体1BO11针对绿脓假单胞菌IATS O11血清型 的调理吞噬活性。

图5涉及单克隆抗体1BO11在小鼠中的药代动力学。1BO11的体 内保护能力在鼠烧伤创面脓毒症模型中进行验证。将不同剂量的 1BO11通过腹腔注射或静脉注射给予NMRI小鼠。显示了免疫激发3 天后的生存率。

图6涉及单克隆抗体1BO11在小鼠中的药代动力学。肺感染之后 1BO11介导从肺和脾中清除绿脓假单胞菌的能力在小鼠急性肺感染模 型中进行验证。在使用绿脓假单胞菌进行肺感染之前将1BO11经静脉 注射给药。感染之后的6、12、24和48小时，检验肺和脾中的荷菌量。

图7涉及单克隆抗体1BO11的补体活化。图中显示了体外试验的 结果，该试验测定了将1BO11与人正常血清混合时的补体成分C4d的 生成情况。产生的C4d通过ELISA进行检测。检测两种不同的血清浓 度100μg/mg和10μg/ml的两批1BO11。单独为血清的对照物记为0 μg/ml。

具体实施方式

材料和方法

实施例中使用如下材料和方法。

测定细胞上清液中的LPS-特异性和对IgM定量

为了对细胞培养物上清液中的抗体进行筛选和分析，如他处所述 进行ELISA(Cryz，S.J.等人，1987.J.Clin.Invest.80(1)：51-56)，并加 以一些变化。简言之，制备绿脓假单胞菌脂多糖(自制)LPS储存液， 其浓度为在2mg/ml(在36mM三乙胺中)。为进行涂层，将溶液在含有 0.02％叠氮化钠(PBS-Az)的PBS中稀释至10μg/ml。通过将该溶液与等 体积10μg/ml甲基化人血清白蛋白(HSA；如下自制：将2g冻干的 HSA溶解在200ml无水甲醇中。加入1.68ml 37.％HCl后，将溶液在 室温下在暗处、间或振荡的条件下存储至少3天。通过10min离心(4500 rpm，GS1转子)收集沉淀物，通过将沉淀团悬浮在溶剂中，将其用无 水甲醇洗涤两次，用无水乙醚洗涤两次。将沉淀在干燥器中干燥2小 时，干燥的沉淀团悬浮在H₂O中，以等份形式存储于-20℃下。蛋白浓 缩物为8.05mg/ml)在PBS-Az中混合，在室温下轻轻搅拌5分钟。将 NUNCELISA板涂以100μl/孔LPS-HSA溶液，在室温下过夜。将板 用300μl pH7.4的含有0.05％Tween 20(#93773；Fluka Chemie AG， Switzerland)的PBS(PBS-T)(自制)洗涤3次之后，将细胞培养上 清液在PBS中1∶2稀释，在37℃下孵育2小时。将板用PBS-T洗涤3 次之后，用含有5％(v/v)FCS的在PBS中1∶2000稀释的辣根过氧化 物酶-交联的羊抗人IgM抗体(#074-1003；KPL；Kirkegaard&Perry Laboratories，Inc.Gaithersburg，MD)来检测结合的抗体。将板在37℃ 下孵育1小时，用PBS-T洗涤3次。通过以100μl/孔加入含有0.0012 ％(V/V)H₂O₂底物溶液的OPD(在24mM柠檬酸和52mM磷酸氢 二钠中的0.4mg/ml邻苯二胺)，对抗体的结合进行显色。2-3分钟后以 50μl/孔加入1M HCl来终止显色反应。使用Softmax Pro软件在 ELISA读数器上读取490nm下的光密度。

为了对细胞培养物上清液中的IgM进行定量，将ELISA板涂以1 μg/ml未交联羊抗人IgM抗体/PBS，在4℃下过夜。将板用PBS-T洗 涤3次，将细胞上清液和标准品以2倍稀释液进行孵育。使用起始浓 度为0.5μg/ml的标准人血清(Behring)作为标准品。所有稀释液均使 用PBS-T来完成。将板在振动台上在室温下孵育2小时。将板用PBS-T 洗涤3次后，用在含有5％(v/v)FCS的PBS中以1∶2000稀释的辣根 过氧化物酶-交联的羊抗人IgM抗体(KPL)检测结合的抗体。将板在 振动台上在室温下孵育1小时，用PBS-T洗涤3次。以150μl/孔加入 OPD底物溶液，对抗体的结合进行显色。1分钟后以50μl/孔加入1M HCl终止显色反应。使用Softmax Pro软件在ELISA读数器上读取490 nm下的光密度。

序列分析

使用获自Qiagen的RNeasy-试剂盒分离杂交瘤细胞的RNA。通过 SMART技术(Becton Dickenson)合成cDNA。对于第二条链的PCR， 使用如下引物(表III)：(1)IgM反向恒定区(con μ)：5’-GCC ACG CTG CTC GTA TCC GAC G-3’(SEQ ID NO：11)；(2)κ反向恒定区(con κ)： 5’-AGC AGG CAC ACA ACA GAG GCA GTT CC-3’(SEQ ID NO：12)。 正向引物包括在SMART-试剂盒中。为进行测序，使用以下引物：(3) IgM序列(μ序列)：5’-GCT GCT CGT ATC CGA CGG-3’(SEQ ID NO： 13)和(4)Kappa序列(κ序列)：5’-CAC AAC AGA GGC AGT TCC-3’ (SEQ ID NO：14)。测序在Microsynth AG(Balgach，Switzerland)上 进行，并使用V-Base DNAplot软件(http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/ DNAPLOT.php？menu＝901)将序列与现有种系的序列进行比较。

表I

绿脓假单胞菌IATS血清型参考菌株

  IATS血清型  说明   O1   O2   O3   O4   O6   O7   O10   O11   O16  PA53(IT4)  E576(IT3)  6510(Habs3)  6511(Habs4)  PA220(IT1)  Fisher 6(IT6)  Fisher 5(IT5)  Fisher 2(IT2)  Fisher 7(IT7)

表II

绿脓假单胞菌IATS O11血清型的临床分离株

  分离株编号   分离株来源   2309.36   2309.38   2309.58   2309.60   2309.61   2309.65   2310.49   2310.55   2311.58   尿   耳   血   尿   尿   气管分泌物   尿   血   气管分泌物

  2312.25   V02610   VA1014   VA26939   VA28/1   VA2813   VA3348   VA3805   VA4156/1   VA695   VA843   气管分泌物   胆囊   耳   肺(BAL)   创面   创面   肺(BAL)   眼   创面   创面   气管分泌物   FT-2   参考菌株

全细胞ELISA

将来自不同临床分离株(见表II)的细菌在Luria肉汤培养基中在 37℃下培养至600nm下的光密度为1，并用37％福尔马林(福尔马林 最终浓度：0.5％)在37℃下固定过夜。将固定的细菌以PBS 1∶50稀释， 并在ELISA板上固定化。将板用含有5％(v/v)胎牛血清封闭后，将 单克隆抗体1BO11与固定的细菌一起在37℃下孵育2小时。可选的方 案是，对其它血清型的分离株进行上述培养，并与单克隆抗体1BO11 孵育，或者与对各个血清型特异的单克隆抗体孵育(图3b，血清型特 异的阳性对照单克隆抗体，统称为“阳性对照”)作为阳性对照。将板 用PBS-T洗涤3次以后，用在含有5％(v/v)FCS的PBS中1∶2000 稀释的辣根过氧化物酶-交联的羊抗人IgM抗体(#074-1003；KPL； Kirkegaard&Perry Laboratories，Inc.Gaithersburg，MD)来检测结合的抗 体。将板在37℃下孵育1小时，用PBS-T洗涤3次。通过以100μl/ 孔加入含有0.0012％(V/V)H₂O₂底物溶液的OPD(在24mM柠檬酸 和52mM磷酸氢二钠中的0.4mg/ml邻苯二胺)，对抗体的结合进行显 色。2-3分钟后以50μl/孔加入1M HCl来终止显色反应。使用Softmax Pro软件在ELISA读数器上读取490nm下的光密度。

调理吞噬作用测定

为了测定生物活性，对单克隆抗体1BO11的调理吞噬活性进行检 测。为此目的，将根据表I的绿脓假单胞菌IATS O11血清型在TSBG (30g/l含有1％(w/v)葡萄糖的胰蛋白酶大豆肉汤)培养基中培养过 夜。将细菌用冷PBS洗涤两次之后，将细菌沉淀团重新悬浮在5ml 0.1 M的碳酸氢盐缓冲液中，加入pH8.0的50μl 5-(和-6)-羧酸荧光素、琥 珀酰亚胺基酯(5(6)-FAM，SE；Molecular Probes，Eugene，OR；二甲亚砜 中10mg/ml)，在37℃下孵育1小时。加入100μl 37％福尔马林将细 菌固定，在37℃下孵育过夜。为去除未结合的染料，通过将在20ml 冷无菌PBS中的再悬浮液离心，将细菌洗涤6次。将标记的细菌在4 ℃下储存备用。为进行检测，将等份细菌稀释至550nm下的光密度为 1，然后以HBSS-BSA(含有0.1 BSA的Hanks平衡盐溶液)进行1∶50 稀释。将20μl细菌分别与10μl含有单克隆抗体1BO11的杂交瘤细胞 培养物上清液的不同稀释液，或与非特异性单克隆对照抗体混合。在 37℃下孵育30分钟后，加入10μl仔兔血清(Charles River Laboratories， Germany)作为补体源，将探针在37℃下继续孵育30分钟。向受调理 的细胞中加入40μl分化的HL-60细胞(通过将细胞在添加了10％(v/v) 胎牛血清和100mM二甲基甲酰胺的Iscoves Modified Dulbecco’s培养 基(IMDM；Sigma)中孵育，前髓细胞细胞系HL-60分化成粒细胞)， 得到的最终浓度为1.25×10⁶细胞/孔。在振荡器上在37℃下孵育90分 钟后，转移至2ml细胞冲洗缓冲液(含有0.02％(v/v)叠氮化物的 PBS；Becton Dickenson)收获细胞。在250xg下离心5分钟之后，将 细胞沉淀团重新悬浮在150μl细胞冲洗缓冲液中，通过流式细胞术进 行分析。通过与背景染色对比分析HL-60细胞的绿色荧光来检测阳性 的调理吞噬活性。通过将荧光素结合的细菌在存在补体的条件下与 HL-60细胞孵育，测定背景染色。

感染绿脓假单胞菌的小鼠的体内保护

小鼠烧伤创面模型

1BO11的体内保护能力在鼠烧伤创面脓毒症模型中进行测定。 NMRI-小鼠(18-20g；Charles River Laboratories)在免疫激发之前的4 小时静脉内接受0.16-10μg(对应于大约0.4-0.006mg/kg体重)体积为 0.1ml的单克隆抗体1BO11。作为对照，注射0.1ml非特异性抗体上 清液。为进行免疫激发，将每组10只的雌鼠用1大气压的3-氯-1，1，2- 三氟乙基-二氟甲基醚(Ethrane，Abbott Lab.，Chicago，IL)麻醉。对小 鼠背部2cm²的部位进行10秒乙醇灼烧。将悬浮在0.5ml PBS中的激 发生物体(绿脓假单胞菌IATS O11；临床分离株2310.55，见表2)以 2×10⁷cfu/鼠立刻皮下注射到烧伤部位中。对动物观察7天。作为保护 作用的指标，显示了免疫激发3天后的生存率。

急性肺感染模型

为了评价1BO11针对绿脓假单胞菌感染的保护能力，使用急性肺 感染模型。将10μg(0.4mg/kg)1BO11静脉下注射给BALB/c小鼠。 之后，在深度麻醉下使用弯的珠头针(bead-tipped needle)将40μl 4.0×10⁷/ml菌株2310.55(表2)的溶液(对应于1.6×10⁶/鼠)经气管内 应用于左下支气管。选取该剂量是由于其仅引起很低的死亡率。在6、 12、24和48小时之后，将小鼠处死，在无菌条件下摘除肺和脾。将器 官悬浮在3ml PBS中，用搅拌器在冰上匀浆45秒。将连续稀释的组织 匀浆(0.1ml)在Modified Conradi Drigalski′s琼脂上点板，测定CFU/ 肺或CFU/脾。

测定单克隆抗体活化的经典补体途径

为了测定下游进程中形成的IgM-聚集体最终自行触发的经典补体 途径，将预定浓度的1BO11抗体在37℃下在来自健康捐赠者的血清中 孵育30分钟。然后在10mM EDTA中终止反应，补体活化片段C4d 通过市售的ELISA(Quidel Corp，San Diego)进行检测。作为阳性对照， 使用由1BO11抗体及其同族LPS抗原组成的IgM-抗原复合物。

实施例

实施例1：1BO11的DNA和氨基酸序列

抗体特异性分别通过DNA-和氨基酸序列测定。测定重链和轻链的 可变片段的DNA序列。简言之，分离杂交瘤细胞的总RNA，并用 SMART技术(Becton Dickinson)将其逆转录到完整的cDNA中。通 过该方法，在cDNA的5′端加上通用引物。使用该引物和表III中所述 的Cκ和Cμ-特异性引物，通过PCR对IgM和κ可变区和部分恒定区 进行扩增。然后通过从琼脂凝胶中切除，获得PCR片段，作为用表III 所述引物测序的模板。

表III

用于PCR扩增以及1BO11 IgM重链和κ轻链可变区测序的引物

  引物 序列   用途   Conμ   Conκ   μ序列   κ序列 5′-GCC ACG CTG CTC GTA TCC GAC G-3’(SEQ ID NO：11) 5′-AGC AGG CAC ACAACA GAG GCA GTT CC-3′(SEQ ID NO：12) 5′-GCT GCT CGT ATC CGA CGG-3′(SEQ ID NO：13) 5′-CAC AAC AGA GGC AGT TCC-3’(SEQ ID NO：14)   PCR   PCR   测序   测序

随后将可变区的序列与Vbase Index比较。与种系序列比较的结果 表示为“置换和沉默”突变数(R∶S)，如表IV所示。DNA序列和氨 基酸序列描绘于图1和图2。

表IV

从种系序列得到的置换沉默突变比

  重链   轻链   种系   R∶S   种系   R∶S   1BO11   DP-53   17∶3   DPK-18   0∶2

实施例2：单克隆抗体1BO11对绿脓假单胞菌IATS O11血清型临床 分离株的识别

通过将健康志愿者用八价OPS-Toxin A疫苗免疫，产生1BO11。 疫苗含有IATS O11参考株FT-2。为了研究针对该菌株LPS产生的 1BO11是否也会识别IATS O11血清型的其它分离株，从不同医院中收 集了大量的临床分离株(见表2)。所有分离株的血清型使用市售的血 清型凝集试剂盒测定。通过PCR确认血清型。然后通过全细胞ELISA 对IATS O11血清型(图3a)以及其它血清型(图3b)的不同临床分 离株进行1BO11结合试验。

除由于这些分离株表面上LPS的低表达产生的两个弱反应之外， 1BO11与所有被检测的IATS O11分离株均呈强烈反应。而且，只有 在IATS O11血清型中观察到结合，在O1、O2、O3、O6或O10血清 型的多种分离株中均没有发生结合。使用针对各个血清型的其它单克 隆抗体作为阳性对照，以确保这些分离株的完整性。

实施例3：1BO11的体外活性：调理吞噬活性

使用基于流式细胞术的调理吞噬作用测定评价1BO11的体外生物 学活性。将FITC-结合的绿脓假单胞菌IATS O11血清型与连续稀释的 1BO11在正常家兔血清作为补体源的情况下孵育。经调理的细胞与分 化的HL-60细胞孵育(前髓细胞系，ATCC：CCL-240；加入0.1M二 甲基甲酰胺，3天完成向单核细胞的分化)。通过FACS分析调理吞噬 作用。通过与背景染色(在不存在血清但存在补体的情况下HL-60细 胞和FITC-结合细胞的染色)对比分析HL-60细胞的绿色荧光来测定 阳性调理吞噬活性。结果示于表4。

1BO11介导的绿脓假单胞菌IATS O11血清型的吞噬作用是剂量依 赖方式的(实心圆圈)。如果使用热灭活的补体，则观察不到吞噬作用 (空心圆圈)。1BO11的调理吞噬活性(OA₅₀)定义为导致FITC-阳性 HL-60细胞的半数最大百分比的浓度，其为0.1ng/ml。如此低剂量下 的活性表明1BO11的效应器能力很高。

实施例4：单克隆抗体1BO11的体内保护能力

1BO11的体内保护能力在鼠烧伤创面脓毒症模型中进行验证。将 不同剂量的1BO11腹腔或静脉内给予NMRI小鼠。3小时后，造成2× 2cm的烧伤创面，在烧伤的皮肤部位皮下注射2×10⁷CFU绿脓假单胞 菌菌株2310.55(O11)。整个实验过程中小鼠施以麻醉。监控生存情况 每天3次。免疫激发后3天的生存率显示于图5。包括了来自4项独立 实验(标记为A-D)的综合数据。

剂量≥0.2mg/kg体重对70-100％的假单胞菌全身激发产生了保护 作用。给药剂量减少导致生存率降低。死亡是假单胞菌感染的直接结 果，因为有烧伤创面但未感染假单胞菌的小鼠生存率为100％。这些数 据证明了1BO11在体内针对绿脓假单胞菌全身感染的功效。

实施例5：急性呼吸系统激发之后细菌从肺和脾的清除增加

为了评价1BO11是否能够清楚呼吸系统的绿脓杆菌感染，使用小 鼠急性肺感染模型。为此目的，在用绿脓假单胞菌株2310.55进行气管 内肺激发之前，静脉内给予1BO11(0.4mg/kg体重)。选取该激发剂 量仅是为了达到最小的死亡率。之后，选择细菌从肺中的清除率作为 评价参数。

应用1BO11能够迅速地将绿脓假单胞菌从肺中清除(图6)。这一 发现是出人意料的，因为IgM抗体一般不会渗透入肺组织中。48小时 后细菌被完全清除，而这时在未经处理的动物中感染仍在进行。与人 绿脓假单胞菌肺炎的进程类似，细菌感染可发展成为全身性的，在该 实验中反映为脾中出现绿脓假单胞菌。全身感染的完全消退由1BO11 介导的，而未经处理的小鼠中仍存在细菌(图6)。这些结果说明了 1BO11具有治疗呼吸系统绿脓假单胞菌感染如医院性肺炎的能力。

实施例6：单克隆抗体1BO11对人的组织的交叉反应性

为了排除不希望发生的1BO11与人组织的非特异性结合，根据 “FDA Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use(FDA对用于人的单克隆抗体产品的 制造和检测的观点)(1997)”和“The Rules Governing Medicinal Products in the European Community(欧盟医药产品管理条例)Vol.3a(1994)” 对1BO11进行交叉反应性检测。所用的组织列于下表。组织均获自3 名不相关的捐赠者，以尽量减小捐赠者的特殊因素对抗体结合的影响。

表5

用于检测潜在1BO11交叉反应性的人体组织

肾上腺 骨髓 结肠 回肠(胃肠道) 淋巴结 腮腺 前列腺 胃 甲状腺 膀胱 乳房 眼 肾(肾小球，小管) 卵巢 末梢神经 皮肤 横纹肌 扁桃体 血细胞 小脑 输卵管 肝 胰腺 垂体 脊髓 睾丸 输尿管 血管(内皮) 大脑皮层 心脏 肺 甲状旁腺 胎盘 脾 胸腺^*子宫(宫颈，子宫

内膜)

^*仅有来自一名捐赠者的组织可用

没有观察到与这些组织中任一个的交叉反应性(数据未显示)。基 于这些结果，似乎不会在体内发生非特异性结合，因此引起的炎性副 作用很小。

实施例7：单克隆抗体1BO11的补体活化

体内给予的人抗体可以通过补体的自发活化引起不良反应。这种 经典补体途径的活化可以通过体外试验来检测，该体外试验测定当 1BO11与人正常血清混合时补体成分C4d的生成情况并通过市售的 ELISA(Quidel Corp.，San Diego)来检测C4d。在GMP条件下产生两 批次1BO11(称为“第1批”和“第2批”)，以在血清中的不同浓度 (100μg/ml和10μg/ml)来进行检验。单独血清的对照物记为0μg/ml。 结果显示于图7。

在血清中1BO11没有触发C4d的自发生成(白色条)，而在存在 10μg/ml绿脓假单胞菌IATS O11血清型LPS的情况下产生了水平很 高的C4d(黑色条)。这些结果表明，当用于人时，1BO11表现的自发 性炎性副作用的程度将是最小的。

                   序列表

<110>肯塔生物技术有限公司(Berna Biotech AG)

<120>绿脓假单胞菌IATS O11血清型脂多糖(LPS)特异性人单克隆抗体

<130>PA52984JPHV017pau

<140>未指定

<141>2006-02-13

<150>PCT/EP2006/001289

<151>2006-02-13

<150>EP 05 003 095.6

<151>2005-02-14

<160>14

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>16

<212>PRT

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>轻链CDR1

<400>1

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ash

1               5                   10                  15

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>轻链CDR2

<400>2

Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser

1           5

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>轻链CDR3

<400>3

Met Gln Gly Thr His Trp Pro Leu Thr

1               5

<210>4

<211>5

<212>PRT

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>重链CDR1

<400>4

Pro Tyr Trp Met His

1               5

<210>5

<211>16

<212>PRT

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>重链CDR2

<400>5

Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1               5                   10                  15

<210>6

<211>8

<212>PRT

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>重链CDR3

<400>6

Asp Arg Tyr Tyr Gly Pro Glu Met

1               5

<210>7

<211>112

<212>PRT

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>轻链可变区

<400>7

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1               5                   10                  15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser

            20                  25                  30

Asp Gly Ash Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

        35                  40                  45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro

    50                  55                  60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65                  70                  75                  80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly

                85                  90                  95

Thr His Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105                 110

<210>8

<211>116

<212>PRT

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>重链可变区

<400>8

Glu Glu Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

            20                  25                  30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val

        35                  40                  45

Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

    50                  55                  60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu

65                  70                  75                  80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Arg Asp Arg Tyr Tyr Gly Pro Glu Met Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

            100                 105                 110

Thr Val Ser Ser

        115

<210>9

<211>336

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>轻链可变区

<400>9

gatgttgtga tgactcagtc tccgctctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc     60

atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta tatagtgatg gaaacaccta cttgaattgg    120

tttcagcaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc taaccgggac    180

tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc    240

agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaggtac acactggcct    300

ctcactttcg gcggagggac caaggtggag atcaaa                              336

<210>10

<211>348

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>重链可变区

<400>10

gaggagcagg tggtggagtc cgggggaggc tttgttcagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt ccatactgga tgcactgggt ccgccaagct    120

ccagggaagg ggctggtgtg ggtctcacgt attaatagtg atgggagcac atactacgcg    180

gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagaeaacg ccaggaacac actgtatctg    240

caaatgaaca gtctgagage cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcaag agatcgatac    300

tatggccccg aaatgtgggg ccaagggaca atggtcaccg tctcttca                 348

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR-引物

<220>

<221>misc_feature

<223>人工序列的描述：PCR-引物

<400>11

gccacgctgc tcgtatccga cg        22

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR-引物

<400>12

agcaggcaca caacagaggc agttcc    26

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：测序-引物

<400>13

gctgctcgta tccgacgg             18

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：测序-引物

<400>14

cacaacagag gcagttcc              18