疱疹性口炎病毒、其载体和其免疫原性组合物的协同减毒

摘要

本发明广泛地涉及疱疹性口炎病毒(VSV)的协同减毒。更具体地，本发明涉及协同减弱哺乳动物中的VSV载体和其免疫原性组合物的致病性的组合突变类型的鉴别。

说明书

发明领域

本发明总的来说涉及病毒学、微生物学、传染病和免疫学领域。更具体地，本发明涉及疱疹性口炎病毒和其载体的协同减毒，这通过组合不同类型的突变来实现。

发明背景

疱疹性口炎病毒(VSV)是弹状病毒科(Rhabdoviridae)的一个成员，其具有未分段的、负义的、单链RNA基因组。它的11 kb基因组具有5个基因，后者编码该病毒的5种结构蛋白：核壳蛋白(N)，对于复制的RNA的壳体化以化学计量的量需要所述蛋白；磷蛋白(P)，它是依赖于RNA的RNA聚合酶(L)的辅因子；基质蛋白(M)和附着糖蛋白(G)(例如，见Gallione等，1981，Rose和Gallione，1981；Rose和Schubert，1987和Schubert等，1985；美国专利6,033,886；美国专利6,168,943)。

VSV是一种节肢动物传播的病毒，其可以传递给多种哺乳动物宿主，最常见牛、马、猪和啮齿类动物。VSV感染人类较罕见，且通常是无症状的或特征在于温和的流感样症状，其能在3-8天消退，且没有并发症。因为VSV未被视作人类病原体，且对VSV的预存免疫在人群体中很罕见，所以VSV衍生的载体的开发已经成为诸如免疫原性组合物和基因治疗的领域的焦点。例如，研究已经确定，VSV可以用作免疫原性组合物的高效载体，从而表达流感病毒血细胞凝集素(Roberts等，1999)、麻疹病毒H蛋白(Schlereth等，2000)和HIV-1 env和gag蛋白(Rose等，2001)。使它成为有吸引力的载体的VSV的其它特征包括：(a)在细胞培养物中强烈复制的能力；(b)不能整合进宿主细胞DNA中或经历遗传重组；(c)存在多种血清型，从而使基础-加强免疫策略成为可能；(d)可以将目标外来基因插入VSV基因组，并由病毒转录酶大量表达；和(e)用于从病毒基因组的cDNA拷贝拯救传染性病毒的高度特化的系统的开发(美国专利6,033,886；美国专利6,168,943)。

尽管在自然传染过程中几乎没有VSV神经学上受累的证据，大脑内(及在啮齿类动物的情况下鼻内)接种野生型病毒、小鼠脑传代的野生型病毒或细胞培养物适应的野生型病毒的动物(例如，灵长类动物、啮齿类动物、牲畜类动物)，可以发展疾病的临床症征，且通常在接种后2-8天死亡。因为这些观察，以及对生产具有异常的安全特征的用于人类的免疫原性组合物的载体的需要，所以在严格的灵长类动物和小动物神经毒力模型中，测试开发中的VSV载体。这些测试用于在考虑进一步的人临床试验之前检测减毒的VSV载体中的任何残余毒力。

原型的-VSV载体的减毒源自连续体外传代和基因组cDNA的合成和装配过程中贯穿病毒基因组中的多个核苷酸取代的积累。这些突变具有多效作用，所述作用使病毒在小鼠中比它所来源的实验室-适应的病毒具有更低的致病性(例如，见Roberts等，1998)。通过截短病毒G蛋白的胞质尾区，从而导致产生存在从受感染的细胞的质膜芽殖的缺陷的VSV突变体，还开发了原型的进一步减毒的VSV载体(Schnell等，1998)。

当在小动物和非人的灵长类动物神经毒力模型中测试时，现在已知的推定减毒或没有减毒的VSV载体，已经具有不可接受水平的残余毒力。用作例如免疫原性组合物的载体、基因治疗载体等的VSV载体的开发，需要在动物神经毒力模型中具有最低至不可检测水平的致病性的VSV载体。因而，本领域目前需要病毒载体，以鉴别基因修饰的、减毒的在哺乳动物中具有显著减少的(或消除的)致病性的VSV突变体。

发明概述

本发明广泛地涉及疱疹性口炎病毒(VSV)的协同减毒。更具体地，本发明涉及协同减弱哺乳动物中的VSV载体和其免疫原性组合物的致病性的组合突变类型的鉴别。

因而，在某些实施方案中，本发明涉及基因修饰VSV，其在它的基因组中包含至少2种不同类型的突变，其中该两种突变协同减弱VSV致病性。在一个特定的实施方案中，将VSV致病性进一步定义为神经毒力。在另一个实施方案中，突变的类型是温度敏感(ts)突变、点突变、基因改组突变、G-茎突变、非致细胞病变的M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变。

在一个特定的实施方案中，两种VSV突变是截短的G基因突变(在下文中，“G_(ct)”)和N基因改组突变(也就是说，N基因从它的野生型3′启动子-近侧的第一个位置，移动到在VSV的基因顺序中远侧的位置)。在另一个实施方案中，由截短的G基因编码的VSV G蛋白具有最后20个羧基末端氨基酸的缺失(在下文中，“G_(ct-9)”)。在另一个实施方案中，由截短的G基因编码的VSV G蛋白具有最后28个羧基末端氨基酸的缺失(在下文中，“G_(ct-1)”)。在另一个实施方案中，与野生型VSV基因组3′-NPMGL-5′相比，VSV N基因改组成3′-PNMGL-5′或3′-PMNGL-5，其中N是编码核壳蛋白的基因，P是编码磷蛋白的基因，M是编码基质蛋白的基因，G是编码附着糖蛋白的基因，且L是编码依赖于RNA的RNA聚合酶蛋白的基因。在某些实施方案中，VSV包含3′-PNMG_(ct-1)L-5′、3′-PNMG_(ct-9))L-5′、3′-PMNG_(ct-1)L-5′或3′-PMNG_(ct-9)L-5′的突变的基因组，其中N是编码核壳蛋白的基因，P是编码磷蛋白的基因，M是编码基质蛋白的基因，G_(ct-1)是编码附着糖蛋白的基因，所述附着糖蛋白具有由一个氨基酸组成的胞质尾区，G_(ct-9)是编码附着糖蛋白的基因，所述附着糖蛋白具有由9个氨基酸组成的胞质尾区，且L是编码依赖于RNA的RNA聚合酶蛋白的基因。在一个特定的实施方案中，突变的VSV基因组是3′-PMNG_(ct-1)L-5′。在另一个特定的实施方案中，突变的VSV基因组是3′-PNMG_(ct-1)L-5′。在另一个实施方案中，VSV还在它的基因组中包含第三类突变，其中该突变是ts突变、点突变、双义RNA突变、G-茎突变、G基因插入、基因缺失或非致细胞病变的M基因突变。

在某些实施方案中，在4-周龄雌性Swiss-Webster小鼠中颅内地注射的修饰的VSV的LD₅₀为在4-周龄雌性Swiss-Webster小鼠中颅内地注射的野生型VSV的100倍。在某些其它的实施方案中，在4-周龄雌性Swiss-Webster小鼠中颅内地注射的VSV的LD₅₀为在4-周龄雌性Swiss-Webster小鼠中颅内地注射的野生型VSV的1,000倍。在其它实施方案中，在4-周龄雌性Swiss-Webster小鼠中颅内地注射的VSV的LD₅₀为在4-周龄雌性Swiss-Webster小鼠中颅内地注射的野生型VSV的10,000倍。在其它实施方案中，在4-周龄雌性Swiss-Webster小鼠中颅内地注射的VSV的LD₅₀为在4-周龄雌性Swiss-Webster小鼠中颅内地注射的野生型VSV的100,000倍。

在本发明的其它实施方案中，两种VSV突变是截短的G基因突变和非致细胞病变的M基因突变。在某些实施方案中，由截短的G基因编码的G蛋白具有由一个氨基酸组成的胞质尾结构域(G_(ct-1))或由9个氨基酸组成的胞质尾结构域(G_(ct-9))。在其它实施方案中，M基因非致细胞病变的突变(在下文中，“M_(ncp)”)是M蛋白的位置33处的甲硫氨酸至丙氨酸的突变(M33A)和位置51处的甲硫氨酸至丙氨酸的突变(M51A)。在一个特定的实施方案中，VSV包含3′-NPM_(ncp)G_(ct-1)L-5′或3′-NPM_(ncp)G_(ct-9)L-5′的突变的基因组。在另一个实施方案中，VSV还在它的基因组中包含第三类突变，其中该突变是ts突变、双义RNA突变、基因改组突变、基因缺失突变、基因插入突变、G基因插入突变、G-茎突变或点突变。

如下面A.3部分所述，VSV G、M、N、P或L基因中的任一个的ts突变是分开的本发明的“突变类型”。因而，在本发明的某些实施方案中，两种VSV突变是ts N基因突变(在下文中，“N_(ts)”)和ts L基因突变(在下文中，“L_(ts)”)。在一个特定的实施方案中，VSV包含3′-N_(ts)PMGL_(ts)-5′的突变的基因组。在某些其它的实施方案中，VSV还在它的基因组中包含第三类突变，其中该突变是点突变、基因改组突变、G-茎突变、非致细胞病变的M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变或基因缺失突变。

在某些实施方案中，两种VSV突变是G-茎突变(在下文中，“G_(茎)”)和基因改组突变。在其它实施方案中，VSV还在它的基因组中包含第三类突变，其中该突变是点突变、ts突变、基因改组突变、非致细胞病变的M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变。

在另一个实施方案中，本发明涉及基因修饰VSV载体，其在它的基因组中包含至少2种不同类型的突变，和至少一个作为单独的转录单位的外来RNA序列，所述外来RNA序列插入或替换非复制必需的VSV基因组区域，其中该两种突变协同减弱VSV致病性。如在下文中所定义的，“外来RNA”序列是对于野生型VSV的基因组而言非内源的任何多核苷酸序列。在一个特定的实施方案中，将载体致病性进一步定义为神经毒力。在某些其它的实施方案中，将外来RNA定义为可读框(ORF)。在某些其它的实施方案中，突变类型选自：ts突变、点突变、基因改组突变、G-茎突变、非致细胞病变的M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变。

在一个特定的实施方案中，两种VSV载体突变是截短的G基因突变和N基因改组突变。在另一个实施方案中，由截短的G基因编码的G蛋白具有最后20个羧基末端氨基酸的缺失或最后28个羧基末端氨基酸的缺失。在某些其它的实施方案中，与野生型VSV基因组3′-NPMGL-5′相比，N基因VSV载体改组成3′-PNMGL-5′或3′-PMNGL-5′。在一个特定的实施方案中，VSV载体包含3′-PNMG_(ct-1)L-5′、3′-PNMG_(ct-9)L-5′、3′-PMNG_(ct-1)L-5′或3′-PMNG_(ct-9)L-5′的突变的基因组。在一个特定的实施方案中，突变的载体基因组是3′-PMNG_(ct-1)L-5′。在另一个实施方案中，突变的载体基因组是3′-PNMG_(ct-1)L-5′。

在其它实施方案中，VSV载体在它的基因组中还包含第三类突变，其中该突变是ts突变、点突变、双义RNA突变、G-茎突变、G基因插入突变、基因缺失突变或非致细胞病变的M基因突变。在某些其它的实施方案中，在4-周龄雌性Swiss-Webster小鼠中颅内地注射的VSV的LD₅₀为在4-周龄雌性Swiss-Webster小鼠中颅内地注射的野生型VSV的100倍。在其它实施方案中，在4-周龄雌性Swiss-Webster小鼠中颅内地注射的修饰的VSV的LD₅₀为在4-周龄雌性Swiss-Webster小鼠中颅内地注射的野生型VSV的1,000倍。在其它实施方案中，在4-周龄雌性Swiss-Webster小鼠中颅内地注射的VSV的LD₅₀为在4-周龄雌性Swiss-Webster小鼠中颅内地注射的野生型VSV的10,000倍。在另一个实施方案中，在4-周龄雌性Swiss-Webster小鼠中颅内地注射的VSV的LD₅₀为在4-周龄雌性Swiss-Webster小鼠中颅内地注射的野生型VSV的100,000倍。

在某些其它的实施方案中，插入或替换非复制必需的VSV基因组区域的外来RNA选自：HIV基因、HTLV基因、SIV基因、RSV基因、PIV基因、HSV基因、CMV基因、EB病毒基因、水痘-带状疱疹病毒基因、腮腺炎病毒基因、麻疹病毒基因、流感病毒基因、脊髓灰质炎病毒基因、鼻病毒基因、甲型肝炎病毒基因、乙型肝炎病毒基因、丙型肝炎病毒基因、诺沃克病毒基因、披膜病毒基因、甲病毒基因、风疹病毒基因、狂犬病病毒基因、马尔堡病毒基因、欧鲍拉病毒基因、乳头瘤病毒基因、多瘤病毒基因、间质肺炎病毒(metapneumovirus)基因、冠状病毒基因、霍乱弧菌(Vibrio cholera)基因、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)基因、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)基因、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)基因、脑膜炎萘瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)基因、淋病萘瑟氏球菌(Neisseria gonorrheae)基因、白喉棒杆菌(Corynebacteria diphtheria)基因、破伤风梭菌(Clostridium tetani)基因、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)基因、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)基因、嗜血菌属(Haemophilus)基因、衣原体属(Chlamydia)基因、大肠杆菌(Escherichia coli)基因、细胞因子基因、T-辅助表位、CTL表位、佐剂基因和辅因子基因。在一个特定的实施方案中，外来RNA是选自下述的HIV基因：gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、rev和vpu。在一个特定的实施方案中，HIV基因是gag，其中该gag基因插入在VSV基因组的位置1或位置5。在特定的实施方案中，突变的VSV载体的基因组是3′-gag₁-PNMG_(ct-1)L-5′、3′-gag₁-PNMG_(ct-9)L-5′、3′-gag₁-PMNG_(ct-1)L-5′、3′-gag₁-PMNG_(ct-9)L-5′、3′-PNMG_(ct-1)L-gag₅-5′、3′-PNMG_(ct-9)L-gag₅-5′、3′-PMNG_(ct-1)L-gag₅-5′或3′-PMNG_(ct-9)L-gag₅-5′。

在另一个实施方案中，外来RNA表达肿瘤特异抗原或肿瘤相关抗原，以诱导针对肿瘤(例如，恶性肿瘤)的保护性的免疫反应。这样的肿瘤特异抗原或肿瘤相关抗原包括，但不限于，KS 1/4 pan-carcinoma抗原；卵巢癌抗原(CA125)；前列腺酸式磷酸盐；前列腺特异性的抗原；黑素瘤相关抗原p97；黑素瘤抗原gp75；高分子量黑素瘤抗原和前列腺特异性的膜抗原。

在某些其它的实施方案中，两种VSV载体突变是G_(ct)突变和M_(ncp)突变。在某些实施方案中，由截短的G基因编码的G蛋白具有由一个氨基酸组成的胞质尾结构域(G_(ct-1))或由9个氨基酸组成的胞质尾结构域(G_(ct-9))。在其它实施方案中，M_(ncp)突变是M蛋白的位置33处的甲硫氨酸至丙氨酸的突变(M33A)和位置51处的甲硫氨酸至丙氨酸的突变(M51A)。在一个特定的实施方案中，突变的基因组是3′-NPM_(ncp)G_(ct-1)L-5′或3′-NPM_(ncp)G_(ct-9)L-5′。在另一个实施方案中，载体在它的基因组中还包含第三类突变，其中该突变是ts突变、点突变、基因改组突变、G-茎突变、双义RNA突变、G基因插入突变和基因缺失突变。在某些实施方案中，VSV载体包含选自下述的HIV基因：gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、rev或vpu。在-个特定的实施方案中，HIV基因是gag，其中突变的基因组是3′-gag₁-NPM_(ncp)G_(ct-1)L-5′、3′-gag₁-NPM_(ncp)G_(ct-9)L-5′、3′-NPM_(ncp)G_(ct-1)L-gag₅-5′或3′-NPM_(ncp)G_(ct-9)L-gag₅-5′。

在其它实施方案中，两种VSV载体突变是N_(ts)基因突变和L_(ts)基因突变。在一个特定的实施方案中，载体包含3′-N_(ts)PMGL_(ts)-5′的突变的基因组。在其它实施方案中，载体在它的基因组中还包含第三类突变，其中该突变是点突变、基因改组突变、G-茎突变、非致细胞病变的M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变。在某些实施方案中，VSV载体包含选自下述的HIV基因：gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、rev或vpu。在一个特定的实施方案中，HIV基因是gag，其中突变的基因组是3′gag₁-N_(ts)PMGL_(ts)-5′或3′-N_(ts)PMGL_(ts)-gag₅-5′。

如下面A.1部分所述，外来核酸序列(例如，HIV gag)向VSV基因组中N、P、M、G或L基因中的任一个的3′端的插入，会有效地导致“基因改组突变”。因而，在某些实施方案中，两种VSV载体突变是G_(茎)突变和基因改组突变。在一个实施方案中，突变的载体基因组是3′-gag1-NPMG_(茎)L-5′。在其它实施方案中，VSV载体在它的基因组中还包含第三类突变，其中该突变是点突变、ts突变、基因改组突变、非致细胞病变的M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变。

在另一个实施方案中，本发明涉及免疫原性组合物，其包含免疫原性剂量的基因修饰VSV载体，所述载体在它的基因组中包含至少2种不同类型的突变，和至少一个作为单独的转录单位的外来RNA序列，所述外来RNA序列插入或替换非复制必需的VSV基因组区域，其中该两种突变协同减弱VSV致病性。在另一个实施方案中，突变类型选自：ts突变、点突变、基因改组突变、G-茎突变、非致细胞病变的M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变。

在某些实施方案中，两种突变是截短的G基因突变和N基因改组突变。在特定的实施方案中，由截短的G基因编码的G蛋白具有由一个氨基酸组成的胞质尾结构域(G_(ct-1))或由9个氨基酸组成的胞质尾结构域(G_(ct-9))。在其它实施方案中，与野生型VSV基因组3′-NPMGL-5′相比，N基因改组成3′-PNMGL-5′或3′-PMNGL-5′。在某些实施方案中，免疫原性组合物的VSV载体包含3′-PNMG_(ct-1)L-5′、3′-PNMG_(ct-9)L-5′、3′-PMNG_(ct-1)L-5′或3′-PMNG_(ct-9)L-5′的突变的基因组。在一个特定的实施方案中，免疫原性组合物的突变的载体基因组是3′PMNG_(ct-1)L-5′。在另一个实施方案中，突变的载体基因组是3′-PNMG_(ct-1)L-5′。在其它实施方案中，免疫原性组合物的VSV载体在它的基因组中还包含第三类突变，其中该突变是ts突变、双义RNA突变、点突变、G-茎突变、G基因插入突变、基因缺失突变或非致细胞病变的M基因突变。

在某些其它的实施方案中，插入免疫原性组合物的基因修饰VSV载体中的外来RNA选自：HIV基因、HTLV基因、SIV基因、RSV基因、PIV基因、HSV基因、CMV基因、EB病毒基因、水痘-带状疱疹病毒基因、腮腺炎病毒基因、麻疹病毒基因、流感病毒基因、脊髓灰质炎病毒基因、鼻病毒基因、甲型肝炎病毒基因、乙型肝炎病毒基因、丙型肝炎病毒基因、诺沃克病毒基因、披膜病毒基因、甲病毒基因、风疹病毒基因、狂犬病病毒基因、马尔堡病毒基因、欧鲍拉病毒基因、乳头瘤病毒基因、多瘤病毒基因、间质肺炎病毒基因、冠状病毒基因、霍乱弧菌基因、肺炎链球菌基因、酿脓链球菌基因、无乳链球菌基因、脑膜炎萘瑟氏球菌基因、淋病萘瑟氏球菌基因、白喉棒杆菌基因、破伤风梭菌基因、百日咳博德特氏菌基因、幽门螺杆菌基因、嗜血菌属基因、衣原体属基因、大肠杆菌基因、细胞因子基因、T-辅助表位、CTL表位、佐剂基因和辅因子基因。在一个特定的实施方案中，外来RNA编码选自下述的HIV蛋白：gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、rev和vpu。在一个特定的实施方案中，HIV基因是gag，其中该gag基因在VSV基因组的位置1或位置5插入基因组。在另一个实施方案中，免疫原性组合物的VSV载体包含3′- gag₁-PNMG_(ct-1)L-5′、3′-gag₁-PNMG_(ct-9)L-5′、3′-gag₁-PMNG_(ct-1)L-5′、3′-gag₁-PMNG_(ct-9)L-5′、3′-PNMG_(ct-1)L-gag₅-5′、3′-PNMG_(ct-9)L-gag₅-5′、3′-PMNG_(ct-1)L-gag₅-5′或3′-PMNG_(ct-9)L-gag₅-5′的突变的基因组。

在某些其它的实施方案中，免疫原性组合物的VSV载体包含G_(ct)突变和M_(ncp)突变。在另一个实施方案中，由截短的G基因编码的G蛋白具有由一个氨基酸组成的胞质尾结构域(G_(ct-1))或由9个氨基酸组成的胞质尾结构域(G_(ct-9))。在另一个实施方案中，M_(ncp)突变是M蛋白的位置33处的甲硫氨酸至丙氨酸的突变(M33A)和位置51处的甲硫氨酸至丙氨酸的突变(M51A)。在一个特定的实施方案中，免疫原性组合物包含3′-NPM_(ncp)G_(ct-1)L-5′或3′-NPM_(ncp)G_(ct-9)L-5′的突变的VSV基因组。在其它实施方案中，免疫原性组合物的VSV载体在它的基因组中还包含第三类突变，其中该突变是ts突变、点突变、基因改组突变、G-茎突变、双义RNA突变、G基因插入突变和基因缺失突变。在其它实施方案中，插入免疫原性组合物的基因修饰VSV载体中的外来RNA选自：HIV基因、HTLV基因、SIV基因、RSV基因、PIV基因、HSV基因、CMV基因、EB病毒基因、水痘-带状疱疹病毒基因、腮腺炎病毒基因、麻疹病毒基因、流感病毒基因、脊髓灰质炎病毒基因、鼻病毒基因、甲型肝炎病毒基因、乙型肝炎病毒基因、丙型肝炎病毒基因、诺沃克病毒基因、披膜病毒基因、甲病毒基因、风疹病毒基因、狂犬病病毒基因、马尔堡病毒基因、欧鲍拉病毒基因、乳头瘤病毒基因、多瘤病毒基因、间质肺炎病毒基因、冠状病毒基因、霍乱弧菌基因、肺炎链球菌基因、酿脓链球菌基因、幽门螺杆菌基因、无乳链球菌基因、脑膜炎萘瑟氏球菌基因、淋病萘瑟氏球菌基因、白喉棒杆菌基因、破伤风梭菌基因、百日咳博德特氏菌基因、嗜血菌属基因、衣原体属基因、大肠杆菌基因、编码细胞因子的基因、编码T-辅助表位的基因、编码CTL表位的基因、编码佐剂的基因和编码辅因子的基因。在某些实施方案中，HIV基因选自：gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、rev或vpu。在一个特定的实施方案中，HIV基因是gag，其中突变的基因组是3′-gag₁-NPM_(ncp)G_(ct-1)L-5′、3′-gag₁-NPM_(ncp)G_(ct-9)L-5′、3′-NPM_(ncp)G_(ct-1)L-gag₅-5′或3′-NPM_(ncp)G_(ct-9)L-gag₅-5′。

在某些其它的实施方案中，免疫原性组合物包含N_(ts)基因突变和L_(ts)基因突变。在一个特定的实施方案中，免疫原性组合物包含3′-N_(ts)PMGL_(ts)-5′的突变的VSV基因组。在其它实施方案中，免疫原性组合物在它的基因组中还包含第三类突变，其中该突变是点突变、基因改组突变、G-茎突变、非致细胞病变的M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变。在其它实施方案中，插入免疫原性组合物的基因修饰VSV载体中的外来RNA选自：HIV基因、HTLV基因、SIV基因、RSV基因、PIV基因、HSV基因、CMV基因、EB病毒基因、水痘-带状疱疹病毒基因、腮腺炎病毒基因、麻疹病毒基因、流感病毒基因、脊髓灰质炎病毒基因、鼻病毒基因、甲型肝炎病毒基因、乙型肝炎病毒基因、丙型肝炎病毒基因、诺沃克病毒基因、披膜病毒基因、甲病毒基因、风疹病毒基因、狂犬病病毒基因、马尔堡病毒基因、欧鲍拉病毒基因、乳头瘤病毒基因、多瘤病毒基因、间质肺炎病毒基因、冠状病毒基因、霍乱弧菌基因、肺炎链球菌基因、酿脓链球菌基因、幽门螺杆菌基因、无乳链球菌基因、脑膜炎萘瑟氏球菌基因、淋病萘瑟氏球菌基因、白喉棒杆菌基因、破伤风梭菌基因、百日咳博德特氏菌基因、嗜血菌属基因、衣原体属基因、大肠杆菌基因、编码细胞因子的基因、编码T-辅助表位的基因、编码CTL表位的基因、编码佐剂的基因和编码辅因子的基因。在某些实施方案中，HIV基因选自：gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、rev或vpu。在一个特定的实施方案中，HIV基因是gag，其中突变的基因组是3′-gag₁-N_(ts)PMGL_(ts)-5′或3′-N_(ts)PMGL_(ts)-gag₅-5′。

在某些其它的实施方案中，免疫原性组合物包含G_(茎)突变和基因改组突变。在一个特定的实施方案中，免疫原性组合物包含3′-gag₁-NPMG_(茎)L-5′的突变的基因组。在其它实施方案中，免疫原性组合物在它的基因组中还包含第三类突变，其中该突变是点突变、ts突变、基因改组突变、非致细胞病变的M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变。

在另一个实施方案中，通过选自下述的任意的常规途径，施用本发明的免疫原性组合物：静脉内的、皮内的、皮下的、肌内的、腹膜内的、经口的、直肠的、鼻内的、口的、阴道的和离体(ex vivo)。

在另一个实施方案中，本发明涉及针对HIV感染免疫哺乳动物受试者的方法，包含给受试者施用免疫原性剂量的基因修饰VSV载体，所述载体在它的基因组中包含至少2种不同类型的突变，和至少一个作为单独的转录单位的HIV RNA序列，所述HIV RNA序列插入或替换非复制必需的VSV基因组区域，其中该两种突变协同减弱VSV致病性，且HIV RNA编码选自下述的抗原：gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、rev和vpu。在某些实施方案中，VSV载体是3′-gag₁-PNMG_(ct-1)L-5′、3′-gag₁-PNMG_(ct-9)L-5′、3′-gag₁-PMNG_(ct-1)L-5′、3′-gag₁-PMNG_(ct-9)L-5′、3′-PNMG_(ct-1)L-gag₅-5′、3′-PNMG_(ct-9)L-gag₅-5′、3′-PMNG_(ct-1)L-gag₅-5′、3′-PMNG_(ct-9)L-gag₅-5′、3′-gag₁-NPM_(ncp)G_(ct-1)L-5′、3′-gag₁-NPM_(ncp)G_(ct-9)L-5′、3′-NPM_(ncp)G_(ct-1)L-gag₅-5′、3′-NPM_(ncp)G_(ct-9)L-gag₅-5′、3′-gag₁-N_(ts)PMGL_(ts)-5′或3′-N(_ts)PMGL_(ts)-gag₅-5′。

在某些其它的实施方案中，本发明涉及针对细菌感染免疫哺乳动物宿主的方法，包含施用免疫原性剂量的基因修饰VSV载体，所述载体包含：(a)在它的基因组中的至少2种不同类型的突变，所述突变选自：ts突变、点突变、基因改组突变、G-茎突变、非致细胞病变的M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变，其中该两种突变协同减弱VSV致病性，和(b)至少一个外来RNA序列，所述外来RNA序列插入或替换非复制必需的VSV基因组区域，其中该RNA编码选自下述的细菌蛋白：霍乱弧菌蛋白、肺炎链球菌蛋白、酿脓链球菌蛋白、无乳链球菌蛋白、幽门螺杆菌蛋白、脑膜炎萘瑟氏球菌蛋白、淋病萘瑟氏球菌蛋白、白喉棒杆菌蛋白、破伤风梭菌蛋白、百日咳博德特氏菌蛋白、嗜血菌属蛋白、衣原体属蛋白和大肠杆菌蛋白。

在一个特定的实施方案中，两种突变是G_(ct)突变和N基因改组突变。在某些实施方案中，由截短的G基因编码的G蛋白具有由一个氨基酸组成的胞质尾结构域(G_(ct-1))或由9个氨基酸组成的胞质尾结构域G_(ct-9)。在某些其它的实施方案中，与野生型VSV基因组3′-NPMGL-5′相比，N基因改组成3′-PNMGL-5′或3′-PMNGL-5′。在其它实施方案中，突变的VSV基因组是3′PNMG_(ct-1)L-5′、3′-PNMG_(ct-9)L-5′、3′-PMNG(ct-1)L-5′或3′-PMNG_(ct-9)L-5′。在一个特定的实施方案中，突变的基因组是3′PMNG_(ct-1)L-5′或3′-PNMG_(ct-1)L-5′。

在其它实施方案中，VSV还在它的基因组中包含第三类突变，其中该突变是ts突变、点突变、双义RNA突变、基因缺失突变、G-茎突变、G基因插入突变、基因插入突变或非致细胞病变的M基因突变。

在另一个实施方案中，本发明涉及针对病毒感染免疫哺乳动物宿主的方法，包含施用免疫原性剂量的基因修饰VSV载体，所述载体包含：(a)在它的基因组中的至少2种不同类型的突变，所述突变选自：ts突变、点突变、基因改组突变、G-茎突变、非致细胞病变的M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变，其中该两种突变协同减弱VSV致病性，和(b)至少一个外来RNA序列，所述外来RNA序列插入或替换非复制必需的VSV基因组区域，其中该RNA编码选自下述的病毒蛋白：HIV蛋白、HTLV蛋白、SIV蛋白、RSV蛋白、PIV蛋白、HSV蛋白、CMV蛋白、EB病毒蛋白、水痘-带状疱疹病毒蛋白、腮腺炎病毒蛋白、麻疹病毒蛋白、流感病毒蛋白、脊髓灰质炎病毒蛋白、鼻病毒蛋白、甲型肝炎病毒蛋白、乙型肝炎病毒蛋白、丙型肝炎病毒蛋白、诺沃克病毒蛋白、披膜病毒蛋白、甲病毒蛋白、风疹病毒蛋白、狂犬病病毒蛋白、马尔堡病毒蛋白、欧鲍拉病毒蛋白、乳头瘤病毒蛋白、多瘤病毒蛋白、间质肺炎病毒蛋白和冠状病毒蛋白。在一个特定的实施方案中，RNA是选自下述的HIV基因：gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、rev或vpu。

在某些实施方案中，两种突变是G_(ct)突变和N基因改组突变。在一个特定的实施方案中，突变的VSV基因组是3′-PNMG_(ct-1)L-5′、3′-PNMG_(ct-9)L-5′、3′-PMNG_(ct-1)L-5′或3′-PMNG_(ct-9)L-5′。在另一个实施方案中，HIV基因是gag，其中该gag基因在位置1或位置5插入VSV基因组，其中突变的基因组是3′-gag₁-PNMG_(ct-1)L-5′、3′-gag₁-PNMG_(ct-9)L-5′、3′-gag₁-PMNG_(ct-1)L-5′、3′-gag₁-PMNG_(ct-9)L-5′、3′-PNMG_(ct-1)L-gag₅-5′、3′-PNMG_(ct-9)L-gag₅-5′、3′-PMNG_(ct-1)L-gag₅-5′或3′-PMNG_(ct-9)L-gag₅-5′。在另一个实施方案中，VSV还在它的基因组中包含第三类突变，其中该突变是ts突变、点突变、双义RNA突变、基因缺失突变、G-茎突变、G基因插入突变、基因插入突变或非致细胞病变的M基因突变。

在针对病毒感染免疫哺乳动物宿主的方法的其它实施方案中，两种VSV突变是G_(ct)突变和M_(ncp)突变。在-个特定的实施方案中，突变的VSV基因组是3′-NPM_(ncp)G_(ct-1)L-5′或3′-NPM_(ncp)G_(ct-9)L-5′。在另一个实施方案中，突变的VSV基因组是3′-gag₁-NPM_(ncp)G_(ct-1)L-5′、3′-gag₁-NPM_(ncp)G_(ct-9)L-5′、3′-NPM_(ncp)G_(ct-1)L-gag₅-5′或3′-NPM_(ncp)G_(ct-9)L-gag₅-5′。在另一个实施方案中，VSV基因组在它的基因组中还包含第三类突变，其中该突变是ts突变、点突变、基因改组突变、G-茎突变、双义RNA突变、G基因插入突变和基因缺失突变。

在针对病毒感染免疫哺乳动物宿主的方法的其它实施方案中，两种VSV突变是N_(ts)基因突变和L_(ts)基因突变。在一个特定的实施方案中，突变的VSV基因组是3′-N_(ts)PMGL_(ts)-5′、3′-gag₁-N_(ts)PMGL_(ts)-5′或3′-N_(ts)PMGL_(ts)-gag₅-5′。在另一个实施方案中，VSV基因组在它的基因组中还包含第三类突变，其中该突变是点突变、基因改组突变、G-茎突变、非致细胞病变的M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变。

在针对病毒感染免疫哺乳动物宿主的方法的其它实施方案中，两种VSV突变是G_(茎)突变和基因改组突变。在一个实施方案中，突变的基因组是3′-gag₁-NPMG_(茎)L-5′。在另一个实施方案中，VSV基因组在它的基因组中还包含第三类突变，其中该突变是点突变、ts突变、基因改组突变、非致细胞病变的M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变。

从下面的详细描述、其优选实施方案和权利要求书，可以明白本发明的其它特征和优点。

附图简述

图1显示了野生型VSV(3′-NPMGL-5′)、N改组的VSV突变体(3′-PNMGL-5′[N2]、3′-PMNGL-5′[N3]和3′-PMGNL-5′[N4])、G蛋白胞质尾(ct)截短VSV突变体(3′-NPMG_(ct-9)L-5′[CT9]和3′-NPMG_(ct-1)L-gag₅-5′[CT1-GAG₅])和组合的VSV N改组的/G蛋白ct截短突变体(3′-PNMG_(ct-1)L-5′[N2CT1]、3′-PNMG_(ct-9)L-5′[N2CT9]、3′-PMNG_(ct-1)L-5′[N3CT1]和3′-PMNG_(ct-9)L-5′[N3CT9])的生长动力学(pfu/mL对时间)。在小图图例中显示的缩写“in”代表着VSV的印地安那(Indiana)株。

图2对比了N改组的VSV突变体(3′-PNMGL-5′、3′-PMNGL-5′和3′-PMGNL-5′)相对于野生型VSV(3′-NPMGL-5′)和G蛋白ct-1 VSV突变体(3′-NPMG_(ct-9)L-gag₅-5′)的生长动力学。

图3对比了组合的VSV N改组的/G蛋白ct-1突变体(3′-PNMG_(ct-1)L-5′和3′-PMNG_(ct-1)L-5′)相对于野生型VSV(3′-NPMGL-5′)和G蛋白ct-1 VSV突变体(3′-NPMG_(ct-1)L-gag₅-5′)的生长速度。

发明详述

在下文中描述的发明解决了本领域对疱疹性口炎病毒(VSV)载体的需要，所述载体在哺乳动物中具有显著减弱的致病性，尤其是减弱的神经病发生性，如在动物神经毒力模型中所揭示的。如上所述，VSV具有许多使它成为免疫原性组合物和/或基因治疗的有吸引力的载体的特征。例如，VSV感染人类较罕见，且是无症状的或特征在于温和的流感样症状，其能在3-8天消退，且没有并发症，且同样，VSV未被视作人类病原体。使它成为有吸引力的载体的VSV的其它特征包括：(a)在细胞培养物中强烈复制的能力；(b)不能整合进宿主细胞DNA中或经历遗传重组；(c)存在多种血清型，从而使基础-加强免疫策略成为可能；(d)可以将目标外来基因插入VSV基因组，并由病毒转录酶大量表达；(e)用于从病毒基因组的cDNA拷贝拯救传染性病毒的高度特化的系统的开发(美国专利6,033,886；美国专利6,168,943)，和(f)对VSV的预存免疫在人群体中很罕见。

在本领域描述的较早类型的减毒的VSV载体称作温度敏感(ts)突变体，其中ts突变体不会在限制性温度产生病毒体。例如，本领域已知各种VSV ts突变体(例如，见Holloway等，1970；Pringle等，1971；Evans等，1979；Pringle等，1981；Morita等，1987；Gopalakrishna和Lenard，1985)。另外，本领域还已经描述了其它类型的减毒的VSV突变体，且其包括VSV G蛋白截短的胞质尾(ct)突变(Schnell等，1998)、基因改组(或基因顺序重排)突变(Wertz等，1998；Ball等，1999；Flanagan等，2001；美国专利6,596,529)、G-茎突变(Jeetendra等，2003；Jeetendra等，2002；Robinson和Whitt，2000)、非致细胞病变的M蛋白突变(Jayakar等，2000；Jayakar和Whitt，2002)和双义RNA突变(Finke和Conzelmann，1997；Finke和Conzelmann 1999)。但是，如上所述，当在动物模型中测试时，当前可得到的减毒的VSV载体会保留残余毒力，且同样，不可能是用于进一步的人临床试验的载体候选物。

如本文详述的，本发明涉及意外的且令人惊奇的观察，即2种或更多种已知的减毒突变类型(基因改组突变、G蛋白插入和截短突变、ts突变和其它点突变、非致细胞病变的M基因突变、G-茎突变、双义RNA突变、基因缺失突变等)的组合，对得到的实现的致病性减弱水平具有协同效应(而不是加性效应)。例如，在本文中证实，当与改组的N基因突变体相组合时，VSV G蛋白截短突变体会发挥VSV生长(实施例2)和神经毒力(实施例3)的协同减弱。另外，本发明的某些实施方案涉及其它类型的突变的组合，其对VSV减毒也有协同效应。这样的类型包括，但不限于：ts突变、点突变、基因改组突变(包括N、P、M、G和L基因改组)、G-茎突变、G基因插入、非致细胞病变的M基因突变、截短的G基因突变(例如，ct突变体)、双义RNA突变和基因缺失突变。

因而，在某些实施方案中，本发明涉及基因修饰VSV载体，所述载体在它的基因组中包含至少2种不同类型的突变，和至少一个作为单独的转录单位的外来RNA序列，所述外来RNA序列插入或替换非复制必需的VSV基因组区域，其中该两种突变协同减弱VSV致病性。在某些其它的实施方案中，本发明涉及免疫原性组合物，其包含基因修饰VSV载体，所述载体在它的基因组中包含至少2种不同类型的突变，和至少一个作为单独的转录单位的外来RNA序列，所述外来RNA序列插入或替换非复制必需的VSV基因组区域，其中该两种突变协同减弱VSV致病性。

A.疱疹性口炎病毒突变类型

如上所述，本发明的基因修饰VSV载体在它的基因组中包含至少两种不同类型的突变。如在下文中所定义的，术语“突变类型”或“突变的类型”可互换地使用，且当单独使用时，指本领域已知的减弱VSV的突变。例如，本发明的“突变类型”包括，但不限于，VSV温度敏感N基因突变(在下文中，“N_(ts)”)、温度敏感L基因突变(在下文中，“L_(ts)”)、点突变、G-茎突变(在下文中，“G_(茎)”)、非致细胞病变的M基因突变(在下文中，“M_(ncp)”)、基因改组或重排突变、截短的G基因突变(在下文中，“G_(ct)”)、双义RNA突变、G基因插入突变、基因缺失突变等。如在下文中所定义的，“突变”包括本领域已知的突变，如插入、缺失、取代、基因重排或改组修饰。

如在下文中所定义的，术语“协同的”减毒指大于加性的VSV减毒水平。例如，根据本发明的VSV的协同减毒包含，在相同VSV基因组中组合至少两种类型的突变，从而导致远大于用每种单独的VSV突变类型观察到的加性减毒水平的VSV致病性减少。因而，在某些实施方案中，将VSV的协同减毒定义为至少大于用每种单独的突变类型观察到的加性减毒水平(即，两种突变类型的总和)的LD₅₀，其中在小动物神经毒力模型中测定减毒水平(即，LD₅₀)。

作为非限制性实例，如果等式(1)描述了VSV的“累加减毒”：

(1)Δa_LD50+Δb_LD50＝X_LD50；

其中Δa_LD50是在它的基因组具有第一种突变类型的VSV的LD₅₀，Δb_LD50是在它的基因组具有第二种突变类型的VSV的LD₅₀，且X_LD50是Δa_LD50和Δb_LD50的总和；那么等式(2)描述了本发明的VSV“协同减毒”，其具有至少大于用每种单独的突变类型观察到的加性减毒水平的LD₅₀：

(2)Δa，b_LD50＞(Δa_LD50+Δb_LD50)；

其中Δa，b_LD50是在它的基因组中具有两种突变类型的组合的VSV的LD₅₀，Δa_LD50是在它的基因组具有第一种突变类型的VSV的LD₅₀，且Δb_LD50是在它的基因组具有第二种突变类型的VSV的LD₅₀。因而，在某些实施方案中，相对于两种VSV构建体(每种VSV构建体在它的基因组中具有单一突变类型)的LD₅₀，描述了VSV减毒的协同作用(即，在相同VSV基因组中的两种突变类型)，其中将在它的基因组中具有两种突变类型的VSV的协同减毒定义为至少大于在它们的基因组中具有单一突变类型的两种VSV构建体的加性LD₅₀的LD₅₀(例如，见表7中的VSV LD₅₀值)。

在某些其它的实施方案中，相对于野生型VSV的LD₅₀，描述了VSV减毒的协同作用。因而，在一个实施方案中，将VSV的协同减毒定义为至少大于野生型VSV的LD₅₀的LD₅₀，其中在动物神经毒力模型中测定LD₅₀。在一个实施方案中，将VSV的协同减毒定义为至少是野生型VSV的LD₅₀的10倍的LD₅₀，其中在动物神经毒力模型中测定LD₅₀。在另一个实施方案中，将VSV的协同减毒定义为至少是野生型VSV的LD₅₀的100倍的LD₅₀，其中在动物神经毒力模型中测定LD₅₀。在另一个实施方案中，将VSV的协同减毒定义为至少是野生型VSV的LD₅₀的1,000倍的LD₅₀，其中在动物神经毒力模型中测定LD₅₀。在其它实施方案中，将VSV的协同减毒定义为至少是野生型VSV的LD₅₀的10,000倍的LD₅₀，其中在动物神经毒力模型中测定LD₅₀。在某些其它的实施方案中，将VSV的协同减毒定义为至少是野生型VSV的LD₅₀的100,000倍的LD₅₀，其中在动物神经毒力模型中测定LD₅₀。本领域的技术人员使用已知的测试方法和动物模型(例如，见实施例1)，能容易地确定特定VSV载体的50％致死剂量(LD₅₀)的测定。

因而，在某些实施方案中，本发明涉及基因修饰VSV，其包含至少两种下述的不同类型的突变。

1.基因改组突变

在某些实施方案中，本发明的基因修饰VSV在它的基因组中包含基因改组突变。如本文所定义的，术语“基因改组”、“改组的基因”、“改组的”、“改组”、“基因重排”和“基因移位(genetranslocation)”可互换地使用，指野生型VSV基因组的顺序的变化(突变)。如本文所定义的，野生型VSV基因组具有下述的基因顺序：3′-NPMGL-5′。

本领域已知，VSV基因相对于3′启动子的位置决定表达和病毒减毒的水平(美国专利6,596,529和Wertz等，1998，各自在本文中具体地引作参考)。本领域已知编码VSV G、M、N、P和L蛋白的核苷酸序列(Rose和Gallione，1981；Gallione等，1981)。例如，美国专利6,596,529描述了基因改组突变，其中N蛋白的基因从它的野生型启动子-近侧的第一个位置逐次移位(改组)到基因组上更远侧的位置(例如，3′-PNMGL-5′、3′-PMNGL-5′、3′-PMGNL-5′，分别称作N2、N3和N4)。因而，在某些实施方案中，基因修饰VSV在它的基因组中包含基因改组突变。在一种类型的突变中，在一个特定的实施方案中，基因修饰VSV包含基因改组突变，所述突变包含N基因的移位(例如，3′-PNMGL-5′或3′-PMNGL-5′)。

在本文中应当指出，外来核酸序列(例如，HIV gag)向VSV基因组中N、P、M、G或L基因中的任一个的3′端的插入有效地导致如上定义的“基因改组突变”。例如，当将HIV gag基因插入VSV基因组的位置1时(例如，3′-gag₁-NPMGL-5′)，N、P、M、G和L基因各自从它们的野生型位置移动到基因组上更远侧的位置。因而，在本发明的某些实施方案中，基因改组突变包括外来核酸序列向VSV基因组中N、P、M、G或L基因中的任一个的3′端的插入(例如，3′-gag₁-NPMGL-5′、3′-N-gag₂-PMGL-5′、3′-NP-gag₃-MGL-5′等)。

2.G蛋白插入和截短突变体

在某些其它的实施方案中，本发明的基因修饰VSV包含突变的G基因，其中编码的G蛋白在它的胞质结构域(羧基末端)被截短，该胞质结构域也称作G蛋白的“胞质尾区”。本领域已知，截短胞质结构域的羧基末端的G基因突变影响VSV芽殖和减毒病毒生产(Schnell等，1998；Roberts等，1999)。野生型VSV G蛋白的胞质结构域包含29个氨基酸(RVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK-COOH；SEQ ID NO：1)。

在某些实施方案中，本发明的截短的VSV G基因编码G蛋白，其中缺失胞质结构域的最后28个羧基末端氨基酸残基(仅保留SEQID NO：1的29个氨基酸野生型胞质结构域的精氨酸)。在某些其它的实施方案中，本发明的截短的VSV G基因编码G蛋白，其中缺失胞质结构域的最后20个羧基末端氨基酸残基(相对于SEQ ID NO：1的29个氨基酸野生型胞质结构域)。

在某些其它的实施方案中，本发明的截短的VSV G基因编码G蛋白，其在它的胞质结构域(胞质尾区)包含单个氨基酸，其中该单个氨基酸是任意的天然产生的氨基酸。在其它实施方案中，本发明的截短的VSV G基因编码G蛋白，其在它的胞质结构域(胞质尾区)包含9个氨基酸，其中该9个氨基酸是任意的天然产生的氨基酸。在某些其它的实施方案中，本发明的突变的VSV基因编码G蛋白，其含有代表外来表位的插入。这样的突变体是本领域已知的(例如，见Schlehuber和Rose，2003)。

如本文所定义的，将编码G蛋白的G基因突变体称作“G_(ct-1)”，所述G蛋白与SEQ ID NO：1的野生型序列相比缺失胞质结构域的最后28个羧基末端氨基酸残基，其中G_(ct-1)的胞质结构域具有(R-COOH)的氨基酸序列。如本文所定义的，将编码G蛋白的G基因突变体称作“G_(ct-9)”，所述G蛋白与SEQ ID NO：1的野生型序列相比缺失胞质结构域的最后20个羧基末端氨基酸残基，其中G_(ct-9)的胞质结构域具有(RVGIHLCIK-COOH；SEQ ID NO：2)的氨基酸序列。因而，在本发明的某些实施方案中，本发明的基因修饰VSV包含突变的G基因，其中编码的G蛋白是G_(ct-1)或G_(ct-9)。

3.温度敏感和其它点突变

如在下文中所定义的，VSV“温度敏感”(“ts”)突变是限制VSV在非许可温度生长的VSV基因组突变。例如，本发明的VSV ts突变体在许可温度(例如，31℃)正常生长，并达到高效价，但是它们的生长或繁殖会在非许可温度(例如，37℃或39℃)受到限制。通过化学的和定点诱变产生ts突变体是本领域众所周知的(例如，见Pringle，1970；Li等，1988)；且已经表征和描述了许多ts突变体(例如，见Flamand和Pringle，1971；Flamand和Bishop，1973；Printz和Wagner，1971；Gopalakrishna和Lenard，1985；Pringle等，1981；Morita等，1987；Li等，1988；Rabinowitz等，1977；Lundh等，1988；Dal Canto等，1976；Rabinowitz等，1976)。在某些实施方案中，本发明的基因修饰VSV在它的基因组中包含ts突变，其中该ts突变是编码G、M、N、P或L蛋白的核酸序列的一个或多个突变。

如本文所定义的，任一个VSV G、M、N、P或L基因的ts突变是本发明的分开的“突变类型”。例如，在本发明的某些实施方案中，在它的基因组中包含至少2种不同类型的突变(其中该两种突变协同减弱VSV致病性)的基因修饰VSV包含一个或多个作为第一类突变的ts N基因突变(在下文中，“N_(ts)”)和一个或多个作为第二类突变的ts L基因突变(在下文中，“L_(ts)”)。作为非限制性实例，包含诸如3′-N_(ts)PMGL_(ts)-5′的基因组的基因修饰VSV包含两类突变(即，(1)N_(ts)基因突变和(2)L_(ts)基因突变)，而包含诸如3′-gag₁-N_(ts)PMGL_(ts)-5′的基因组的基因修饰VSV包含三类突变(即，(1)N_(ts)基因突变，(2)L_(ts)基因突变和(3)通过gag₁插入，基因改组突变)。

在某些其它的实施方案中，本发明的基因修饰VSV在它的基因组中包含点突变，其中所述点突变是编码G、M、N、P或L蛋白的核酸序列的一个或多个突变，其中所述突变会赋予减毒表型，例如冷适应、降低的融合或致细胞病变效率(例如，见Fredericksen和Whitt，1998；Ahmed和Lyles，1997)。例如，Fredericksen和Whitt(1998)描述了G基因的3种减毒点突变(例如，D137-L、E139-L或DE-SS)，其融合活性具有变化的pH阈值。Ahmed和Lyles(1997)描述了M基因的减毒点突变(N163D)，它在抑制宿主基因表达方面是高度缺陷的，且比野生型M蛋白周转更迅速。因而，在某些实施方案中，本发明的基因修饰VSV在它的基因组中包含一个或多个点突变。

4.非致细胞病变的M基因突变

在某些其它的实施方案中，本发明的基因修饰VSV包含M基因中的非致细胞病变的突变。VSV(印地安那血清型)M基因编码229个氨基酸的M(基质)蛋白，其中NH₂-末端的前30个氨基酸包含富含脯氨酸的PPPY(PY)基序(Harty等，1999)。VSV M蛋白的PY基序位于VSV印地安那(Genbank登记号X04452)和新泽西(NewJersey)(Genbank登记号M14553)血清型的氨基酸位置24-27。Jayakar等(2000)证实，PY基序中的突变(例如，APPY、AAPY、PPAY、APPA、AAPA和PPPA)通过阻断病毒芽殖的晚期阶段来减少病毒产量。因而，在某些实施方案中，本发明的基因修饰VSV包含M基因中的非致细胞病变的突变，其中该突变是在编码的M蛋白的PPPY基序中的。

最近已经报道，M mRNA还能编码2种其它的蛋白，称作M2和M3(Jayakar和Whitt，2002)。M2和M3蛋白是从编码229个氨基酸的M蛋白(称作M1)的相同读框中的下游甲硫氨酸合成的，且缺少M1蛋白的前32个(M2蛋白)或50个(M3蛋白)氨基酸。已经观察到，感染了表达M蛋白(但不表达M2和M3)的重组VSV的细胞表现出延迟的致细胞病变作用的发作(在某些细胞类型中)，然而产生正常的病毒产量。因而，在某些实施方案中，本发明的基因修饰VSV包含M基因中的非致细胞病变的突变，其中所述M基因突变产生不表达M2或M3蛋白的病毒(例如，见Jayakar和Whitt，2002)。

本文中也预期Irie等(2004)描述的M蛋白PSAP(PS)基序中的氨基酸突变(例如，缺失、取代、插入等)。

5.G-茎突变

在某些实施方案中，本发明的基因修饰VSV包含G基因中的突变，其中编码的G蛋白具有G蛋白胞外结构域的膜-近侧茎区(称作G-茎蛋白)中的突变。G-茎区包含G蛋白的氨基酸残基421至462。最近的研究已经证实，通过G蛋白的G-茎中的插入和/或缺失(例如，截短)突变来减弱VSV(Robinson和Whitt，2000；Jeetendra等，2002；Jeetendra等，2003)。因而，在某些实施方案中，基因修饰VSV包含G-茎插入、缺失、取代或其组合。在一个特定的实施方案中，包含G-茎突变的本发明的基因修饰VSV载体(和其免疫原性组合物)包含3′-gag₁-NPMG_(茎)L-5′的基因组。

6.双义RNA突变

在某些实施方案中，本发明的基因修饰VSV包含双义RNA突变，其中5′反基因组启动子(AGP)被替换为3′基因组启动子(GP)的拷贝。VSV以及其它的未分段的、负链RNA病毒的5′AGP起强复制启动子的作用，而3′GP起转录启动子和弱复制启动子的作用。在VSV感染的正常过程中，存在基因组拷贝超过反基因组拷贝的3-至4-倍超优势；对于狂犬病病毒，即弹状病毒科的另一个成员，该比率甚至更高(Finke和Conzelmann，1999)。以前的狂犬病病毒的工作证实，用一个拷贝的GP替换5′AGP(称作双义RNA突变)在感染的细胞中导致等水平的基因组和反基因组RNA拷贝。另外，从位于基因组的5′末端的GP拷贝表达外来基因。当在培养的细胞中连续传代时，含有双义RNA突变的狂犬病病毒始终如一地复制至重组的野生型狂犬病病毒的效价的1/10-至1/15(Finke和Conzelmann，1997)。这样的突变在VSV载体中用于减弱病毒复制和表达外来基因。因而，在某些实施方案中，基因修饰VSV包含双义RNA突变。

7.基因缺失

在某些其它的实施方案中，本发明的基因修饰VSV包含从基因组中缺失了VSV基因(例如G或M)的病毒。例如，Roberts等(1999)描述了一种VSV载体，其中缺失了编码G蛋白的整个基因(ΔG)，并替换为流感血细胞凝集素(HA)蛋白，其中VSV载体(ΔG-HA)证实了减弱的发病机理。

B.重组的疱疹性口炎病毒载体

在某些实施方案中，本发明提供了基因修饰(重组的)VSV载体，其在它的基因组中包含至少2种不同类型的突变，和至少一个外来RNA序列，所述外来RNA序列作为单独的转录单位插入或替换非复制必需的VSV基因组区域。

在本领域中，将生产重组的RNA病毒的方法称作“拯救”或“反求遗传学”方法。示例性的VSV的拯救方法描述在美国专利6,033,886、美国专利6,596,529和WO 2004/113517，各自在本文中引作参考。通过作用于核糖核蛋白核心(核壳)的多聚体蛋白复合物的酶促活性，实现负义的、单链的、未分段的RNA病毒基因组的转录和复制。裸基因组RNA不能用作模板。相反地，只有当这些基因组序列被N蛋白完全壳体化进核壳结构时，它们才会被识别。只有在该背景下，基因组的和反基因组的末端启动子序列才会被识别，以启动转录或复制途径。

将克隆的VSV基因组的DNA等同物置于合适的依赖于DNA的RNA聚合酶启动子(例如，T7 RNA聚合酶启动子)和自切割核酶序列(例如，δ肝炎核酶)之间，它插入在合适的转录载体(例如，可增殖的细菌质粒)中。该转录载体会提供可容易地操作的DNA模板，RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶)从该模板可以忠实地转录VSV反基因组(或基因组)的单链RNA拷贝，所述拷贝具有精确的或近乎精确的5′和3′末端。VSV基因组DNA拷贝和侧翼启动子和核酶序列的定向，决定着是反基因组还是基因组RNA等同物被转录。新的VSV后代的拯救，也需要将裸单链VSV反基因组或基因组RNA转录物壳体化进功能性的核壳模板所需的VSV-特异性的反式作用支持蛋白：病毒核壳(N)蛋白、聚合酶-相关的磷蛋白(P)和聚合酶(L)蛋白。这些蛋白包含活性病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶，其必需接合该核壳模板，以实现转录和复制。

因而，根据本领域已知的拯救方法，生产了本发明的基因修饰和减毒的VSV，其在它的基因组中包含至少2种不同类型的突变(例如，见A部分)。例如，在足以允许这些载体的共表达和重组的VSV的生产的条件下，在宿主细胞中，使用(1)转录载体，其包含分离的核酸分子，所述核酸分子包含编码VSV的基因组或反基因组的多核苷酸序列，和(2)至少一种表达载体，其包含至少一种分离的编码壳体化、转录和复制必需的反式作用N、P和L蛋白的核酸分子，生产基因修饰VSV载体，所述载体在它的基因组中包含至少2种不同类型的突变。根据本发明，可以使用任何合适的VSV株或血清型，包括，但不限于，VSV印地安那、VSV新泽西、VSV Chandipura、VSV Isfahan、VSV San Juan、VSV Glasgow等。

除了编码减毒形式的VSV的多核苷酸序列外，多核苷酸序列也可以编码一种或多种异源的(或外来的)多核苷酸序列或可读框(ORF)(例如，见C部分)。异源的多核苷酸序列可以随需要而变化，且包括，但不限于，辅因子、细胞因子(例如白细胞介素)、T-辅助表位、CTL表位、限制标记、佐剂或不同微生物病原体(例如病毒、细菌、寄生物或真菌)的蛋白，尤其是能引起希望的免疫反应的蛋白。在某些实施方案中，异源的ORF含有HIV基因(例如，gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、rev或vpu)。在一个特定的实施方案中，HIV基因是gag，其中该gag基因插入VSV基因组的位置1(3′-gag₁-NPMGL-5′)或位置5(3′-NPMG-gag₅-L-5′)。异源的多核苷酸也用于提供在基因治疗中使用的试剂。在另一个实施方案中，异源的多核苷酸序列还编码细胞因子，例如白细胞介素-12，选择所述细胞因子来改善重组的VSV的预防或治疗特征。

在某些实施方案中，通过常规方法，例如化学诱变，来突变本发明的基因修饰和减毒的VSV。例如，在病毒在细胞培养物中生长的过程中，加入化学诱变剂，随后：(a)选择已经在亚适温度传代的病毒，以选择温度敏感和/或冷适应的突变，(b)鉴别在细胞培养物中产生小噬斑的突变病毒，和(c)在异源宿主中传代，以选择宿主范围突变。在其它实施方案中，减毒突变包含，使用定点诱变(例如，见A部分)，产生预定的突变，然后拯救含有这些突变的病毒。如前所述，本发明的基因修饰VSV在它的基因组中包含至少两种类型的突变。在某些实施方案中，一种或多种类型的突变还包含多个突变，例如具有双重突变(例如，缺失、插入、取代等)、三重突变等的G-茎突变类型。然后，针对它们的毒力的减弱在动物模型中筛选这些减毒的VSV载体(例如，见实施例1和实施例3)。

一般的(尽管不一定排它的)拯救环境包括合适的哺乳动物细胞环境，其中存在T7聚合酶，以驱动从含有病毒基因组cDNA的转录载体转录反基因组的(或基因组的)单链RNA。在共转录时或此后短时间内，该病毒反基因组(或基因组)RNA转录物被核壳蛋白壳体化进功能模板，并被需要的聚合酶组分接合，所述组分从共转染的编码需要的病毒-特异性的反式作用蛋白的表达质粒同时生成。这些事件和过程导致病毒mRNA的必须预先具备的转录，新基因组的复制和扩增，且从而导致新VSV后代的生成，即拯救。

转录载体和表达载体一般是设计用于在宿主细胞中表达的质粒载体。包含至少一个分离的编码壳体化、转录和复制必需的反式作用蛋白的核酸分子的表达载体从相同表达载体或至少2个不同的载体表达这些蛋白。从基本的拯救方法，通常可以知道这些载体，且它们不需要经过改变，即可用于本发明的改良方法中。

用于拯救病毒例如VSV的其它技术描述在美国专利6,673,572和美国临时专利60/477,389中，其特此引作参考。

在VSV的拯救中使用的宿主细胞是允许从载体表达生产重组的VSV必需的必要组分的那些宿主细胞。可以从原核细胞或真核细胞，且优选脊椎动物细胞，选择这样的宿主细胞。通常，宿主细胞源自人细胞，例如人胚肾细胞(例如，293)。Vero细胞，以及许多其它类型的细胞，也用作宿主细胞。下面是合适的宿主细胞的非限制性实例：(1)人二倍体原代细胞系(例如WI-38和MRC5细胞)；(2)猴二倍体细胞系(例如FRhL-胎儿猕猴肺细胞)；(3)准-原代传代细胞系(Quasi-Primary Continues Cell Line)(例如AGMK-非洲绿猴肾细胞)；(4)人293细胞和(5)其它潜在的细胞系，例如，CHO、MDCK(Madin-Darby犬肾)、原代鸡胚成纤维细胞。在某些实施方案中，加入转染促进试剂，以增加细胞的DNA摄入。本领域已知许多这样的试剂(例如，磷酸钙)。Lipofectace(Life Technologies，Gaithersburg，MD)和Effectene(Qiagen，Valencia，CA)是常见的实例。Lipofectace和Effectene都是阳离子脂质。它们都包被DNA，并增强细胞的DNA摄入。Lipofectace形成围绕DNA的脂质体，而Effectene包被DNA，但是不形成脂质体。

然后，首先通过体外方式，测试拯救的减毒的VSV的所需的表型(温度敏感性、冷适应、噬斑形态学和转录和复制减弱)。还使用小型复制子(minireplicon)系统测试突变，其中需要的反式作用壳体化和聚合酶活性由野生型或疫苗辅助病毒提供，或由表达携带基因-特异性的减弱突变的N、P和不同的L基因的质粒提供。还在动物神经毒力模型中，体内测试减毒的VSV的协同减毒。例如，为检测神经毒力，确立了小鼠和/或雪貂模型。简而言之，给10只小鼠的组颅内地(IC)注射跨预期的LD₅₀剂量(使50％动物致死的剂量)的一定范围的病毒浓度中的每一个浓度。例如，以10²、10³、10⁴和10⁵pfu的病毒进行IC接种，其中病毒的预期的LD₅₀在范围10³-10⁴pfu内。通过在PBS中系列稀释纯化的病毒原液，制备病毒制剂。然后，通过颅骨的顶部，给小鼠注射必要的剂量，在50-100μl PBS中。每天一次监控动物的体重减轻、发病率和死亡。然后，从在测试的浓度范围的小鼠累积死亡，计算病毒载体的LD₅₀。

C.异源的核酸序列和抗原

在某些实施方案中，本发明提供了协同减毒的VSV，其还包含作为单独的转录单位的外来RNA序列，所述外来RNA序列插入或替换非复制必需的基因组位点，其中所述外来RNA序列(它是负义的)指导能在VSV感染的宿主细胞中表达的蛋白的生产。通过将编码蛋白的外来DNA插入VSV cDNA，原始生成该重组的基因组。在某些实施方案中，分离编码免疫原性抗原的任意的DNA序列，并将其整合进在本发明的免疫原性组合物中使用的VSV载体中，当单独地或与由相同或不同VSV表达的其它抗原相组合地，在本发明的重组的协同减毒的VSV中表达为融合或非融合蛋白时，所述免疫原性抗原产生针对疾病或障碍的预防性或治疗性免疫。

在某些实施方案中，协同减毒的重组的VSV对抗原的表达诱导针对病原微生物的免疫反应。例如，抗原可以表现出在作为疾病或障碍的病原体的细菌、寄生物、病毒或真菌上发现的抗原的免疫原性或抗原性。在一个实施方案中，使用表现出人病原体的抗原或其它目标抗原的抗原性或免疫原性的抗原。

为了通过检测与抗体的结合来确定免疫原性或抗原性，使用了本领域已知的各种免疫测定，包括但不限于，使用下述技术的竞争性的和非竞争性的测定系统，例如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、原位免疫测定(使用例如胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白印迹、免疫沉淀反应、凝集测定(例如，凝胶凝集测定、血细胞凝集测定)、补体结合测定、免疫荧光测定、A蛋白测定和免疫电泳测定、中和测定等。在一个实施方案中，通过检测第一抗体上的标记，测量抗体结合。在另一个实施方案中，通过测量第二抗体或试剂与第一抗体的结合，检测第一抗体。在另一个实施方案中，第二抗体被标记。本领域已知许多检测免疫测定中的结合的方式。在检测免疫原性的一个实施方案中，通过标准方法，例如，体外或体内细胞毒性测定、四聚物测定、酶联免疫斑点(elispot)测定或体内迟发型超敏反应测定，测定T细胞-介导的反应。

表达可由协同减毒的VSV表达的表位(抗原决定簇)的寄生物和细菌(其中外来RNA指导寄生物或细菌的抗原或它的含有其表位的衍生物的生产)包括但不限于表1列出的那些。

表1

表达可由VSV表达的表位的寄生物和细菌

寄生物疟虫属物种(plasmodium spp.)艾美球虫属(Eimeria spp.)线虫血吸虫(schisto)Leshmania细菌霍乱弧菌肺炎链球菌无乳链球菌脑膜炎萘瑟氏球菌淋病萘瑟氏球菌白喉棒杆菌破伤风梭菌百日咳博德特氏菌嗜血菌属物种(例如，流感)衣原体属物种肠产毒性大肠杆菌幽门螺杆菌分枝杆菌

在另一个实施方案中，抗原包含线虫抗原的表位，以保护免受由这样的蠕虫造成的障碍。在另一个实施方案中，分离编码疟虫表位的任何DNA序列，以用于插入根据本发明的VSV(-)DNA中，当由重组的VSV表达时，该DNA序列在脊椎动物宿主中是免疫原性的。用作DNA来源的疟虫物种包括但不限于，人疟疾寄生物恶性疟虫(P.falciparum)、三日疟虫(P.malariae)、卵形疟虫(P.ovale)、间日疟虫(P.vivax)和动物疟疾寄生物贝氏疟虫(P.berghei)、约氏疟虫(P.yoelii)、诺氏猴疟虫(P.knowlesi)和犬疟虫(P.cynomolgi)。在另一个实施方案中，抗原包含霍乱毒素的β-亚基肽。

表达可由协同减毒的VSV表达的表位的病毒(其中外来RNA指导病毒的抗原或它的含有其表位的衍生物的生产)包括但不限于表2列出的那些，表2按科列出了这样的病毒，以用于方便和非限制性的目的。

表2

表达可由VSV表达的表位的病毒

I.小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒脊髓灰质炎病毒柯萨奇病毒欧可病毒鼻病毒甲型肝炎病毒II.嵌杯状病毒科(Caliciviridae)诺沃克组病毒III.披膜病毒科(Togaviridae)和黄病毒科(Flaviviridae)披膜病毒(例如，登革病毒)甲病毒黄病毒(例如，丙型肝炎病毒)风疹病毒IV.冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒V.弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒VI.线状病毒科(Filoviridae)马尔堡病毒欧鲍拉病毒

VII.副粘病毒科(Paramyxoviridae)副流感病毒腮腺炎病毒麻疹病毒呼吸道合胞病毒间质肺炎病毒VIII.正粘病毒科(Orthomyxoviridae)正粘病毒(例如，流感病毒)IX.布尼病毒科(Bunyaviridae)布尼病毒X.沙粒病毒科(Arenaviridae)沙粒病毒XI.呼肠病毒科(Reoviridae)呼肠病毒轮状病毒环状病毒XII.反录病毒科(Retroviridae)人T细胞白血病病毒I型人T细胞白血病病毒II型人免疫缺陷病毒(例如，I型和II型)猴免疫缺陷病毒慢病毒XIII.Papoviridae多瘤病毒乳头瘤病毒XIV.细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒XV.疱疹病毒科(Herpesviridae)单纯疱疹病毒EB病毒巨细胞病毒

水痘-带状疱疹病毒人疱疹病毒-6人疱疹病毒-7猕猴疱疹病毒-1(B病毒)XVI.痘病毒科(Poxviridae)痘病毒XVIII.嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)乙型肝炎病毒XIX.腺病毒科(Adenoviridae)

在特定的实施方案中，由在用减毒的VSV对宿主进行感染后表达的外来序列编码的抗原表现出流感病毒血细胞凝集素、人呼吸道合胞体病毒G糖蛋白(G)、麻疹病毒血细胞凝集素或单纯疱疹病毒2型糖蛋白gD的抗原性或免疫原性。

由减毒的VSV表达的其它抗原包括，但不限于，表现出下述抗原的抗原性或免疫原性的那些：脊髓灰质炎病毒I VP1；HIV I的包膜糖蛋白；乙型肝炎表面抗原；白喉毒素；链球菌24M表位，SpeA，SpeB，SpeC或C5a peptidease；和淋球菌菌毛蛋白。

在其它实施方案中，由减毒的VSV表达的抗原表现出如下物质的抗原性或免疫原性：假狂犬病病毒g50(gpD)、假狂犬病病毒II(gpB)、假狂犬病病毒gIII(gpC)、假狂犬病病毒糖蛋白H、假狂犬病病毒糖蛋白E、传染性胃肠炎糖蛋白195、传染性胃肠炎基质蛋白、猪轮状病毒糖蛋白38、猪细小病毒衣壳蛋白、猪痢疾小蛇菌(Serpulinahyodysenteriae)保护抗原、牛病毒性腹泻糖蛋白55、新城病病毒血细胞凝集素-神经氨酸酶、猪流感血细胞凝集素或猪流感神经氨酸酶。

在某些实施方案中，由减毒的VSV表达的抗原表现出源自犬或猫病原体的抗原的抗原性或免疫原性，所述病原体包括，但不限于，猫白血病病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬细小病毒等。

在某些其它的实施方案中，由减毒的VSV表达的抗原表现出源自下述的抗原的抗原性或免疫原性：猪痢疾小蛇菌、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、非洲猪瘟病毒、猪肺炎枝原体(Mycoplasmahyopneumoniae)、传染性牛鼻气管炎病毒(例如，传染性气管炎牛鼻病毒糖蛋白E或糖蛋白G)或传染性喉气管炎病毒(例如，传染性喉气管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白I)。

在另一个实施方案中，抗原表现出下述病毒的糖蛋白的抗原性或免疫原性：La Crosse病毒、新生犊腹泻病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、Punta Toro病毒、鼠白血病病毒或小鼠乳腺瘤病毒。

在其它实施方案中，抗原表现出人病原体抗原的抗原性或免疫原性，所述人病原体包括但不限于人疱疹病毒、单纯疱疹病毒-1、单纯疱疹病毒-2、人巨细胞病毒、EB病毒、水痘-带状疱疹病毒、人疱疹病毒-6、人疱疹病毒-7、人流感病毒、人免疫缺陷病毒(1型和/或2型)、狂犬病病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、恶性疟虫和百日咳博德特氏菌。

通过各种标准，例如抗原在中和病原体的感染性中的参与，类型或组特异性，患者的抗血清或免疫细胞的识别，和/或对抗原特异性的抗血清或免疫细胞的的保护作用的显示，可以鉴别出潜在有用的抗原或其衍生物，以用作由减毒的VSV表达的抗原。

在另一个实施方案中，减毒的VSV的外来RNA指导包含表位的抗原的生产，当将减毒的VSV导入所需宿主时，该表位诱导免疫反应，所述免疫反应保护免受由含有该表位的实体造成的状况或障碍。例如，抗原可以是肿瘤特异抗原或肿瘤相关抗原，以用于诱导针对肿瘤(例如，恶性肿瘤)的保护性的免疫反应。这样的肿瘤特异抗原或肿瘤相关抗原包括，但不限于，KS 1/4 pan-carcinoma抗原；卵巢癌抗原(CA125)；前列腺酸式磷酸盐；前列腺特异性的抗原；黑素瘤-相关抗原p97；黑素瘤抗原gp75；高分子量黑素瘤抗原和前列腺特异性的膜抗原。

插入减毒的VSV DNA的非必需位点的编码抗原的外来DNA，还任选地包含编码细胞因子的外来DNA序列，所述细胞因子能在由减毒的VSV感染的宿主中表达，并刺激免疫反应。例如，这样的细胞因子包括但不限于白细胞介素1α、1β、2、4、5、6、7、8、10、12、13、14、15、16、17和18、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子α和β。

D.免疫原性的和药物组合物

在某些实施方案中，本发明涉及免疫原性组合物，其包含免疫原性剂量的基因修饰VSV载体，所述载体在它的基因组中包含至少2种不同类型的突变，和至少一个插入或替换非复制必需的VSV基因组区域的外来RNA序列，其中该两种突变协同减弱VSV致病性。

配制本发明的协同减毒的VSV载体以用于施用给哺乳动物受试者(例如，人)。这样的组合物一般包含VSV载体和药学上可接受的载体。如在下文中使用的，表述“药学上可接受的载体”意在包括与药物施用相容的任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药物活性物质的这样的介质和试剂的应用是本领域众所周知的。除了任意的常规的介质或试剂与VSV载体不相容以外，在本发明的免疫原性组合物中使用这样的介质。也可以将补充的活性化合物掺合进组合物中。

因而，将本发明的VSV免疫原性组合物配制成与它的预期施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外的(例如，静脉内的、皮内的、皮下的、肌内的、腹膜内的)和粘膜的(例如，经口的、直肠的、鼻内的、口的、阴道的、呼吸的)。用于肠胃外的、皮内的或皮下的应用的溶液或悬浮液包括下述组分：无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、固定油类、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和张力调节剂例如氯化钠或右旋糖。用酸或碱调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。可以将肠胃外制剂包装在用玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂小瓶中。

适用于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(这时是水溶性的)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、制菌水、Cremophor EL^TM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，且应当是达到存在容易的可注射性(Syringability)的程度的流体。它必须在生产和保藏条件下是稳定的，且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用地储存。载体是溶剂或分散介质，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其合适的混合物。维持适当的流动性，例如，通过使用包衣例如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持需要的粒子大小，和通过使用表面活性剂。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对羟苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸等，实现微生物作用的预防。在许多情况下，优选地在组合物中包含等渗剂，例如，糖，多元醇例如甘露糖醇，山梨糖醇，氯化钠。通过在组合物中包含能延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，实现可注射组合物的延迟的吸收。

根据需要通过将需要量(或剂量)的VSV载体掺合进具有上述成分的一种或组合的合适的溶剂中，然后通过过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物掺合进无菌载体中，所述载体含有基本分散介质和需要的来自上述成分的其它成分，来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其能产生活性成分加来自其以前无菌过滤的溶液的任何其它需要的成分的粉末。

对于吸入施用，以来自含有合适的推进剂(例如，气体例如二氧化碳，或喷雾器)的受压容器或分配器的气溶胶形式，来送递化合物。全身施用可以是通过粘膜的或经皮的方式。对于粘膜的或经皮的施用，在制剂中使用适用于要渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的，且包括，例如，对于粘膜施用，去污剂、胆盐和梭链孢酸衍生物。通过使用鼻喷雾剂或栓剂，完成粘膜施用。也可以将化合物制备成用于直肠送递的栓剂(例如，具有常规的栓剂基质例如可可脂和其它甘油酯)或保留灌肠剂的形式。

在某些实施方案中，有利地以剂量单位形式配制经口的或肠胃外的组合物，以便于施用和剂量的一致性。如在下文中使用的，剂量单位形式指适用作待治疗的受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有预定量的进行计算以产生需要的治疗效果的活性化合物和需要的药物载体结合。本发明的剂量单位形式的技术要求，取决于且直接依赖于活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果，以及本领域固有的制备这样的用于治疗个体的活性化合物的限制。

在本文中引用的所有专利和出版物，都特此引作参考。

D.实施例

除了另有详细描述的情况外，使用本领域的技术人员众所周知的和常规的标准技术，进行下面的实施例。下面的实施例用于阐明的目的，且不应当以限制本发明的范围的任何方式进行理解。

实施例1

材料和方法

VSV G蛋白胞质尾突变体

用于产生本发明的G蛋白胞质尾突变体的方法是本领域已知的，且由Schnell等(1998)详细描述。与野生型VSV印地安那株的29个氨基酸胞质尾结构域(SEQ ID NO：1)相比，这些G蛋白突变体在G胞质尾结构域中保留单个氨基酸(G_(ct-1))或9个氨基酸(G_(ct-9))。通过将翻译终止密码子移动到真正的终止密码子上游60核苷酸或84核苷酸(分别即9氨基酸胞质尾和1氨基酸胞质尾)，并导致G蛋白的截短，来产生胞质尾截短。

VSV N基因改组的突变体

通过将N基因重新放置为从病毒基因组3′末端开始的第2、第3或第4个基因，产生N基因移位突变体(N改组)。例如，将野生型VSV的真正的基因顺序3′-NPMGL-5′，突变成3′-PNMGL-5′和3′-PMNGL-5′。进一步远离独特的3′RNA转录启动子的N基因的移位造成N基因表达水平成比例的下降(例如，见美国专利6,596,529，其在本文中整体引作参考)。受感染的细胞中N蛋白水平的下降减缓病毒核壳形成，从而最终降低基因组复制速率和病毒颗粒形成。下面描述了用于N基因移位的方法。

对于产生N基因改组的第一步，从全长病毒基因组cDNA完全去除N基因，结果是，使P基因紧挨着病毒前导序列，以替代N基因。为了删除N基因，使用全长基因组cDNA作为模板，制备了两种PCR产物。第一种PCR产物含有从T7启动子上游的天然BsaAI位点延伸至病毒前导序列末端的序列和附加的下游BsmBI位点。第二种PCR产物含有从P基因的天然XbaI位点延伸至临近附加的上游BsmBI位点的P基因的转录起始信号的序列。以能无缝地连接(在消化和连接后)两种PCR产物的方式，排列BsmBI位点，以产生含有紧挨着P基因的病毒前导序列的单个的DNA片段。然后，将该DNA片段连接进全长基因组cDNA的XbaI/BsaAI位点，从而从病毒基因组有效地消除N基因。

在产生N基因改组的下一步中，将N基因插入缺失N的基因组cDNA的P和M基因之间，或M和G基因之间，或G和L基因之间。为了将N基因插入P和M基因之间，用全长基因组cDNA作为模板，制备了3种PCR产物。第一种PCR产物含有从P基因的天然XbaI位点延伸至具有附加的侧翼BsmBI位点的M基因的转录起始信号的序列。第二种PCR产物含有从N基因的转录起始信号延伸至具有附加的侧翼BsmBI位点的临近N基因的3′-AAAAAAA-多腺苷酸化信号的保守TATG序列的序列。第三种PCR产物含有从G基因开始处的天然MluI位点延伸至具有附加的侧翼BsmBI位点的P基因的保守TATGAAAAAAA多腺苷酸化信号的序列。然后，用BsmBI消化所有3种片段，并重新连接，以形成单个的DNA片段，其具有侧接P基因和M基因的部分的N基因。然后，用XbaI和MluI消化该DNA片段，并连接进δ-N病毒基因组的XbaI/MluI位点，以形成3′-PNMGL-5′cDNA。

为了产生3′-PMNGL-5′基因组cDNA，制备了2种分开的PCR产物。第一种PCR产物含有从P基因的天然XbaI位点延伸至具有附加的侧翼BsmBI位点的G基因的转录起始信号(5′-AACAG-3′)的序列。第二种PCR产物含有完整的N基因序列，其从具有附加的侧翼上游BsmBI位点的转录起始信号，至N基因转录终止/多腺苷酸化信号，后者具有从G转录起始信号延伸至G基因中的天然MluI位点的侧翼序列。将G基因特异性的序列加入N基因序列，作为PCR引物之一的一部分。用BsmBI消化两种PCR产物，并连接以形成单个的DNA片段，然后用XbaI和MluI消化，并连接进缺失N的基因组cDNA的XbaI/MluI位点，以形成5′- PMNGL-3′基因排列。

为了产生5′-PMGNL-5′基因组cDNA，从完整的基因组cDNA模板，制备了3种PCR产物。第一种PCR产物含有从G基因的天然SwaI位点延伸至侧接附加的BsmBI位点的L基因的转录起始信号的序列。第二种PCR产物含有整个N基因的序列，其从转录起始信号至转录终止信号，后者在两个末端侧接附加的BsmBI位点。第三种PCR产物含有从侧接附加的BsmBI位点的L基因转录起始延伸至L基因的天然HpaI位点的序列。用BsmBI消化所有3种PCR产物，并连接以形成单个的DNA片段，然后用SwaI和HpaI消化，并连接进缺失N的基因组cDNA的SwaI/HpaI位点，从而形成5′-PMGNL-3′基因排列。在所有3种重排的基因组中，每个基因的序列完整性和侧翼调节序列都与未改变的病毒相同，只是N基因的位置不同。

G蛋白胞质尾突变和N改组突变的组合

N基因改组和G蛋白胞质尾截短的组合产生双重突变的基因组(即，两种突变类型)，例如3′-PNMG_(ct-9)L-5′、3′-PNMG_(ct-1)L-5′和3′-PMNG_(ct-9)L-5′、3′-PMNG_(ct-1)L-5′。通过用上述的截短的G_(ct-1)或G_(ct-9)基因交换N改组的基因组中的天然G基因，构建双重突变基因组cDNA。通过用MluI和HpaI消化供体cDNA(5′-NPMG_(ct-1)L-3′和5′-NPMG_(ct-9)L-3′)，然后将纯化的、截短的G基因连接进N改组的cDNA基因组的MluI/HpaI位点，来进行交换。从cDNA拯救这些双重突变体，通过如下所述的噬斑大小和生长动力学，在细胞培养物中纯化、扩增和表征三重噬斑。

非致细胞病变的M基因突变

VSV M基因编码病毒基质(M)蛋白，和2种更小的框内多肽(M2和M3)。M2和M3多肽从与M蛋白相同的可读框(ORF)翻译，且分别缺少前33和51个氨基酸。如下所述生成包含非致细胞病变的M基因突变的重组VSV载体(即，也不表达M2和M3蛋白的VSV载体)，且所述载体另外包含一种或多种其它的突变，从而产生在细胞培养物和动物中高度减毒的VSV载体。

使用基于PCR的克隆策略，其中将必要的核苷酸取代(AUG至GCT)整合进PCR引物(Jayakar和Whitt，2002；Jayakay等，2000)，生成非致细胞病变的M基因突变(M_(ncp))，其导致甲硫氨酸33和51向丙氨酸的转变(M33A、M51A)。然后，将得到的含有M33，51A突变的PCR产物克隆进全长VSV cDNA基因组，从而允许不表达M2和M3多肽的病毒的拯救。

通过交换XbaI-MluI片段(跨整个M基因和部分P基因)，将存在于Jayakar和Whitt设计的重组VSV载体cDNA中的M33，51A突变，转移到VSV载体cDNA。cDNA片段交换不会导致除M33，51A突变之外的任何其它的氨基酸编码变化。

G蛋白胞质尾突变和非致细胞病变的M基因突变的组合

G蛋白胞质尾截短和非致细胞病变的M基因突变的组合产生双重突变的基因组(即，两种突变类型)，例如3′- NPM_ncpG_ct-1L-5′或3′-NPM_ncpG_ct-9L-5′。通过将含有产生非致细胞病变的表型的突变的M基因cDNA交换进含有G_(ct-1)或G_(ct-9)突变的全长基因组cDNA，构建双重突变基因组cDNA。在每种情况下，交换的cDNA片段从P基因的独特的Xba I位点延伸至G基因的5′非翻译区中的独特的Mlu I位点，且包含整个非致细胞病变的M基因序列。

如前所述，非致细胞病变的M蛋白与它替换的M蛋白的不同之处在于仅仅2个氨基酸取代(M33A和M51A)，后者产生非致细胞病变的表型。然后，通过将HIV-1 gag基因插入在基因组的位置5处的G和L基因之间，进一步修饰这些双重突变的基因组，以允许用于免疫原性研究的gag蛋白的表达。至于其它病毒rVSV载体，将gag基因克隆进在基因组cDNA的位置5处的独特的Xho I/Nhe I位点。

VSV N基因温度敏感突变和/或VSV L基因温度敏感突变

通过用源自已知的生物衍生的VSV温度敏感(ts)突变体的同源编码序列替代N基因和/或L基因(Pringle，1970)，修饰来自病毒基因组中的第一个3′顺反子的编码HIV Gag蛋白的重组的VSV(rVSV)(rVSV-Gag₁)。得到的载体，(i)rVSV-Gag₁tsN(即，3′-gag₁-N_(ts)PMGL-5′)含有来自VSV株ts41的ts N基因，(ii)rVSV-Gag₁tsL(即，3′-gag₁-NPMGL_(ts)-5′)含有来自VSV株ts11的L基因，和(iii)rVSV-Gag₁tsN+L(即，3′-gag₁-N_(ts)PMGL_(ts)-5′)含有来自VSV株ts41的ts N基因和来自VSV株ts11的L基因。VSV株ts41和ts11在本领域也分别称作tsG41和tsG11。

在对实验室-适应的VSV(印地安那血清型的Glasgow株)进行化学诱变后，Pringle分离了生物衍生的ts基因-供体株(Pringle，1970)。Pringle还绘制了N或L基因的ts突变的图谱。

从受感染细胞RNA，克隆ts41 N和ts11 L基因。简而言之，在许可温度(31-32℃)，用ts11或ts41感染BHK细胞。允许进行感染，直到致细胞病变作用在超过75％细胞单层中是明显的，在该时刻提取和纯化总RNA。然后，使用基因-特异性的引物，逆转录RNA，以指导cDNA合成，此后通过PCR扩增cDNA。然后，将扩增的cDNA克隆进rVSV载体基因组cDNA，并通过序列分析进行验证。

确定ts11、ts41和它们的祖先株(Glasgow)的完整基因组序列，以鉴别促成ts表型的编码变化。通过对比来自rVSV载体背景、Pringlets突变体和Glasgow祖先病毒的编码序列，可能预测哪个编码变化会促成rVSV-Gag₁tsN、rVSV-Gag₁tsL和rVSV-Gag₁tsN+L载体的ts表型。

表3对比了N蛋白氨基酸序列。从数据可以明显看出，用ts41同源物替代rVSV载体N基因导致4个氨基酸取代。这些变化中的任一种都可能影响载体遗传背景下的N蛋白功能，并促成ts表型。应当注意，仅仅一个变化(位置74处的Tyr至Cys，以斜体显示的残基)，将ts41与它的祖先病毒(Glasgow)区分开，表明该取代可能是关键的ts决定因素。

表3

VSV N蛋白的对比

氨基酸编号    病毒株  XN2   ts41  Glasgow    14  Val    Ile    lle    74  Tyr    Cys    Tyr    128  Ser    Arg    Arg    353  Asn    Ser    Sar

类似地，表4提供了L蛋白对比。用ts11相似物替代rVSV载体中的L基因导致13个氨基酸编码变化。如上面关于N基因所述，这些编码变化中的任一种都可能促成观察到的由L基因的替代所产生的ts表型，但是这些编码突变中的几种(以斜体显示)更令人感兴趣，因为它们也将ts11与它的Glasgow祖先病毒区分开，从而潜在地将这些氨基酸取代鉴别为ts表型的关键成因。

表4

VSV L蛋白的对比

氨基酸  编号             病毒株    XN2    ts11    Glasgow    87    Pro    Ser    Ser    88    Thr    Ala    Thr    202    Ile    Leu    Leu    203    Arg    Lys    Lys    268    Tyr    His    Tyr    367    Thr    Ala    Ala    1112    Pro    Ser    Pro    1374    Ala    Val    Val    1519    Ile    Leu    Leu    1792    Leu    Val    Val    1793    Ile    Val    Ile    2042    Leu    Ser    Leu    2075    Arg    Lys    Lys

G-茎突变和G-茎/基因改组突变

在某些实施方案中，本发明的基因修饰VSV包含G基因中的突变，其中编码的G蛋白具有G蛋白胞外结构域的膜-近侧茎区(称作G-茎蛋白)的突变。通过用修饰的编码G-茎的G基因替代VSV XN载体遗传背景中的G基因(Schnell等，1996)，导入G-茎突变。G-茎(Robison，2000)由512个G蛋白氨基酸中的108个组成，包括：1)G蛋白的前17个氨基酸，其包含将多肽靶向膜插入的信号序列；2)称作茎的膜-近侧胞外结构域的42个氨基酸；3)20个氨基酸的跨膜结构域；和4)29个氨基酸的羧基末端胞内尾。G-茎多肽的该构型含有足以介导病毒颗粒的成熟的G蛋白序列，但是缺少发挥细胞附着蛋白作用所必需的序列。结果，感染了G-茎载体的细胞会表达病毒蛋白和编码的外来抗原，但是会生成非感染性的后代病毒颗粒，因为G-茎载体不能编码全功能G蛋白。

为了生成含有感染靶细胞所需的功能性G蛋白的G-茎载体颗粒，必须反式提供全长G蛋白。这可以在病毒拯救和随后的通过下述方法之一的疫苗生产过程中实现：1)可以开发表达G蛋白的细胞系；2)可以采用表达G蛋白的互补病毒载体，例如腺病毒、MVA或VEE；或3)可以用编码G蛋白的质粒DNA载体或mRNA转染用于生产的细胞。

现在，通过在设计用于表达G蛋白的质粒转染的细胞中的瞬时互补，生产G-茎载体。这可以避免对生成表达G蛋白的细胞系的需要，所述细胞系难以生产，因为G蛋白是有毒的，且也能避免将生物试剂(如辅助病毒)导入生产过程中。在G-茎载体的一些构型中，已经将编码病毒蛋白的顺反子改组至下游，以允许外来基因插入第一个基因组位置。这会减毒病毒，并将外来抗原基因置于启动子近侧，从而确保高水平的表达。

如上面A1部分所述，HIV gag基因(或任何其它基因)向VSV基因组的位置1的插入(3′-gag₁-NPMGL-5′)有效地导致基因改组突变，其中所述N、P、M、G和L基因各自从它们的野生型位置移动到基因组上更远的位置。因而，G_(茎)突变和gag向VSV基因组的位置1的插入(gag₁)的组合产生双重突变的基因组3′-gag₁-NPMG_(茎)L-5′。

293细胞中的疱疹性口炎病毒的拯救

根据下面的修正的规程，使用国际申请WO 2004/113517(在本文中具体引作参考)所述的基本的热激/质粒-T7系统，从293细胞成功地拯救VSV。

材料

质粒 DNA：1)全长病毒基因组cDNA，2)pT7-N，3)pT7-P，4)pT7-L，5)pT7-M，6)pT7-G和7)pCI-Neo-bcl-T7(p0061)。

磷酸钙转染试剂：1)2X BES-缓冲盐水：50mM BES(pH 6.95-6.98)，280mM NaCl，1.5mM Na₂HPO₄，2)2.5M CaCl₂和3)Hepes-缓冲盐水洗涤溶液(HBS)：20mM hepes(pH7.0-7.5)，140mM KCl，1mM MgCl₂。

细胞培养溶液：1)补加了10％证明合格的、热灭活的FBS的DMEM(DMEM/FBS)，2)补加了10％证明合格的、热灭活的FBS的Iscoves改良的最小必需培养基(IMEM)(IMEM/FBS)，3)聚-L-赖氨酸：0.01％，溶于H₂O中，4)PBS和5)猪胰蛋白酶/EDTA。

方法

293细胞培养：293细胞难以培养，且有许多不同的处理它们的方法。本方法已经成功地用作VSV和修饰的VSV载体构建体的拯救系统的一部分。

常规传代培养：

1)去除培养基，并用5ml温PBS洗涤汇合的单层(10cm平板)；沿着皿的侧面轻轻移液，以预防细胞的脱附(在室温放置过久或在变成碱性(红色)的培养基中的293细胞会脱附)。

2)轻轻加入2ml胰蛋白酶，并摇动平板，以覆盖整个单层。抽吸胰蛋白酶，并允许平板在室温放置约1分钟。以45度角倾斜平板，在通风橱的工作表面上轻打它，以使细胞脱附。如果细胞没有脱附，则在室温另外培养1分钟(确保细胞在该阶段脱附，从而可以避免剧烈移液)。

3)轻轻加入5ml DMEM/FBS，并缓慢地上下移液，以分散细胞。

4)将1ml细胞加给含有9ml DMEM/FBS的平板。

5)在37℃，5％CO₂培养。

转染前的传代培养：

1)用聚-L赖氨酸包被需要数目的平板。每个平板加入约3-4ml 0.001％聚-L赖氨酸，并允许其在室温放置至少30分钟。抽吸聚-L赖氨酸溶液。用5ml培养基冲洗平板。

2)如上所述胰蛋白酶消化细胞。使用次日会产生50-75％汇合的平板的分离(split)比(1∶3至1∶6)。

3)使细胞脱附后，加入IMEM/FBS，并将细胞转移到含有9mlIMEM/FBS的包被的平板。在转染前，分离细胞并允许其在IMEM/FBS中过夜生长似乎是重要的。

4)在37℃，5％CO₂培养。

转染：

1)在转染前1-3小时，给细胞饲喂9ml IMEM/FBS，并在设定为3％CO₂的32℃培养箱中培养细胞。

2)如下制备磷酸钙-DNA转染混合物：

a)在5ml聚丙烯管中，合并下述的DNA：(i)8μg T7-N，

(ii)4μg T7-P，(iii)1.2μg T7 L，(iv)1.0μg T7-M，(v)1.0μg T7-G，(vi)10μg病毒基因组cDNA克隆和(vii)10μg hCMV-T7表达载体。

b)用水将体积调节至450μl的终体积。

c)加入50μl 2.5M CaCl₂。

d)在轻轻涡旋管的同时，加入500μl 2XBBS，然后允许管在室温放置15-20分钟。

3)从培养箱取出细胞，并向培养基中缓慢加入磷酸钙-DNA混合物，且轻轻旋转，以分配沉淀。立即将细胞返回32℃-3％CO₂培养箱。

4)开始转染后3小时，将培养皿密封在塑料袋中，并完全浸没在设定为43℃的水浴中2小时，以诱导细胞热激反应。

5)热激后，将细胞返回32℃-3％CO₂培养箱，并继续培养过夜。

6)次日，用HBS洗涤细胞2次，并给细胞饲喂10ml IMEM/FBS。在37℃，5％CO₂培养。

7)在开始转染后48-72小时，设立足够的T150瓶，其中含有20ml DMEM/FBS，用于将转染的细胞转移至更大容器中。1个T150瓶用于转染的每个10cm平板。

8)通过轻轻移液单层上的培养基以将它从细胞表面移去，来转移转染的293细胞。避免剧烈移液，并使用刚好足够的力，以移去细胞。移去细胞后，上下移液约5次，以减小细胞块的尺寸，然后将培养基和细胞转移到含有20ml IMEM/FBS的T150瓶。

9)4-6小时后，用补加了10％FBS的新鲜的DMEM替换培养基(注意：如果细胞未粘附到平板上，则该步骤可以延迟直到24小时。同样，已经成功地跳过该步骤)。

10)监控细胞5-7天，以检测致细胞病变效应的证据。

11)当CPE表现为明显时，将50ul培养基上清液转移到6孔平板的孔中，所述孔含有培养基和确立的Vero细胞单层。如果已经发生拯救，则在次日会看到CPE(注意：该步骤是重要的，因为293细胞有时候的确从T150瓶的表面脱附，并在它们实际上没有被感染时，表现出VSV-感染)。

12)将小量样品转移到Vero细胞单层后，从T150瓶收获细胞和培养基，并在-70冷冻。通常，可以通过移液单层上的培养基以使细胞脱附，来收获293细胞。

Vero细胞中的疱疹性口炎病毒的拯救

溶液

通常，下面的溶液可以用于宿主细胞转染：

1)280mM NaCl[16.4g NaCl(或56ml 5M NaCl)]，50mMBES[10.7g BES(游离酸形式)]和1.5mM磷酸钠[0.21g Na₂HPO₄]的2XBBS(每L)溶液(2XBES-缓冲盐水)。用NaOH将BBS溶液调节至pH 6.95-6.98。然后，将溶液过滤除菌，并冷冻保藏。

2)制备每100ml总体积36.8g的2.5M CaCl₂溶液，并在-20℃保藏。使用硝酸纤维素，将溶液过滤除菌。应当避免使用乙酸纤维素过滤器，因为它们会阻塞。或者，将转染溶液高压灭菌。但是，后一种方法可能不甚理想，因为2XBBS溶液可能在高压灭菌过程中略有变化。

通常，下面的溶液可以用作培养基：

1)补加了10％热灭活的且证明合格的FBS和10-20μg/ml(任选地最高达50μg/ml)庆大霉素的DMEM的DMEM+FBS溶液(含有谷氨酰胺的高葡萄糖；Gibco/BRL，[Grand Island，NY])。

2)MEM的MEM+FBS溶液(补加了谷氨酰胺、非必需氨基酸、10％热灭活的且证明合格的FBS和10-20μg/ml(任选地最高达50μg/ml)20-25mM Hepes缓冲液；Gibco/BRL)(Grand Island，NY)，且任选地包含1X两性霉素)。

3)Hepes-缓冲盐水洗涤溶液，20mM hepes，pH 7.0，150mMNaCl，1mM MgCl₂的HBS溶液。

方法

可以从分离的Vero细胞选择通常有用的宿主细胞，所述Vero细胞在转染前一天置于DMEM+FBS中，从而它们在次日会是约50％汇合的[对于RSV，80-90％](在6孔平板或12.5cm²瓶中)。更高的细胞密度具有更低的效率。次日，将每种培养物在转染前用4.5mlDMEM+FBS饲喂1-4小时。然后，将细胞转移到设定在3％CO₂和32℃的CO₂培养箱。可以使Vero细胞生长超过过夜的时间，只要它们在转染时是约50％汇合的。

如下得到CaCl₂/磷酸盐沉淀：在开始之前，在室温维持BBS和CaCl₂。在含有250μl总体积的5ml聚丙烯管中，用共2-20μg质粒DNA和25μl CaCl₂，制备DNA混合物。用于全长拯救的DNA包含5μg VSV的全长cDNA构建体、400ng N蛋白、300ng P蛋白、100-200ng L蛋白和5-10μg pCI-Neo-Bcl-T7质粒(SEQ ID NO：1；图2)。Vero细胞中的拯救效率较低，从而每种待拯救的全长构建体转染3-6孔。

制备所有的DNA/CaCl₂溶液后，加入2XBBS。这通常如下实现：通过连续的低速涡旋，轻轻搅拌管，并沿着管的侧壁，逐滴加入250μl2XBBS。对于所有管，重复该步骤，允许所述管在室温放置另外的15-20分钟，以允许形成DNA-磷酸钙沉淀。室温温育后，将沉淀逐滴加入细胞培养基中，并通过摇动平板，使其均匀地分布。然后，在设定在3％CO₂的培养箱中，温育培养基3小时。3％CO₂的水平对于BBS/CaCl₂转染技术是重要的；5％CO₂工作得非常差，如果其可工作的话。3％CO₂控制着培养基的pH，并允许在培养基中形成有效的磷酸钙-DNA沉淀。

然后，任选地进行热激操作，例如在开始转染后3小时。将细胞转移到设定在44℃的水浴。将细胞密封在塑料保藏袋中，从而可以将培养物完全浸没在水中。在44℃进行3小时后，将细胞转移回设定在3％CO₂的32℃培养箱，并继续培养过夜。

次日，取出转染培养基，并用HBS洗涤细胞2次。洗涤后，加入2ml新鲜的DMEM+FBS。对于洗涤步骤，PBS和Hank氏缓冲液工作较差，可能是因为这些缓冲液中的磷酸盐会造成更多的CaCl₂从转染培养基中沉淀出来。

然后，任选地进行共培养操作。在转染后48-72小时，通过将它们刮入培养基中，并将细胞加培养基转入含有50％汇合的Vero细胞单层的T25瓶，来收获转染的细胞。开始该共培养后6小时，用4ml MEM+FBS替代培养基。然后，温育培养物5天。如果培养基在该温育阶段开始表现出耗尽，则取出2ml培养基，并用新鲜的MEM+FBS替换。不推荐替换所有的培养基，以保存在拯救过程中生成的可能在培养基中的任何小量的病毒。在该共培养阶段期间，CPE可能变得明显，但是经常并非如此。如果CPE不明显，则可以继续拯救。

开始共培养后5天，收获细胞。首先，将0.5ml 2.18M蔗糖，37.6mMKH₂PO₄，71.0mM K₂HPO₄，49.0mM谷氨酸钠加入培养基，并通过摇动瓶来进行混合。然后，将细胞刮入培养基，上下移液以进行混合，然后等分试样进入运输用的冷冻管中，且然后在干冰/乙醇浴中快速冷冻，并在-80℃中保藏。

VSV载体纯化

从转染的细胞的上清液，噬斑-纯化拯救的VSV载体。噬斑纯化3个连续轮次后，在BHK细胞上扩增病毒，以生产种子原液，又将其在BHK细胞上进一步扩增，以生产病毒工作原液。为了制备大量的用于动物实验的病毒，以0.5-1.0噬斑形成单位(pfu)/细胞的感染复数(MOI)，使用工作原液感染10-20个T-150瓶的汇合的BHK细胞。在32℃进行48小时后，通过在4,000xg离心，澄清感染的细胞上清液。然后，通过在10％蔗糖垫层中，在25,000rpm、在SW 28转子中离心1小时，从上清液中浓缩病毒。将病毒沉淀重新悬浮在磷酸缓冲盐水(PBS)中，并在乙醇/干冰浴中骤冻。然后，在Vero细胞单层上，滴定浓缩的病毒原液，以确定制剂中传染性颗粒的数目。

病毒滴定

通过标准的噬斑测定，确定病毒制剂中传染性病毒颗粒的数目。简而言之，用病毒制剂的10倍系列稀释液感染6孔平板中的新汇合的过夜Vero细胞单层。为此，从细胞单层抽吸生长培养基，并将在DMEM中的每种病毒稀释液的100μl等分试样一式三份地转移到细胞单层的中心。为了预防细胞脱水，再将400μl DMEM加入每个细胞单层，并将平板在室温维持15分钟，然后在间断摇动下，在37℃，5％CO₂温育30分钟。然后，取出病毒接种物，并给每个细胞单层覆盖3ml溶于DMEM中的0.8％琼脂糖。然后，在37℃，5％CO₂温育平板1-4天，以允许噬斑形成。然后，取出琼脂糖塞，并在室温，用结晶紫(溶于50％甲醇中的2％结晶紫)将细胞染色10分钟。然后，去除多余的染料，并用水彻底冲洗细胞单层。然后，显现细胞单层中的病毒噬斑，它们是没有染成蓝色的小孔。

通过实时PCR定量病毒RNA

使用定量实时PCR(RT/PCR)测定，检测和定量动物组织中的VSV基因组。测定使用2-步RT/PCR方法，其能特异性地检测负义病毒基因组RNA，并使用整个扩增子的合成寡核苷酸来形成标准曲线。简而言之，将来自猴、雪貂和小鼠的脑组织匀浆成溶于SPG中的20％W/V浆液。在3,000xg离心浆液15分钟，以沉淀颗粒物质。然后，在14,000xg进一步离心上清液，并从得到的上清液提取总RNA。使用该RNA作为使用病毒特异性的引物的反转录的模板，然后，将产物用于实时PCR测定。

测定VSV载体在小鼠中的50％致死剂量(LD₅₀)

将小鼠LD₅₀模型用作VSV载体的相对减毒的度量。将野生型VSV、3′-NPMG_(ct-1)L-5′、3′-PNMG_(ct-1)L-5′和3′-PMNG_(ct-1)L-5′的几种log-倍(log-fold)稀释液，颅内地注射进4.5周龄雌性Swiss Webster小鼠(6-10小鼠/组)。然后观察小鼠的体重减轻、瘫痪和死亡(LD₅₀)，持续3周。通过Reed和Muench的方法，从累积百分比死亡率，计算LD₅₀。

小鼠免疫原性研究

用1×10⁷pfu的标示的实施例4所述的VSV载体(印地安那血清型)，肌肉内地免疫小鼠(n＝15)。启动(priming)后7天，在效应阶段峰值，从一组小鼠(“基础”，n＝5)分离脾细胞。用1×10⁷pfu标示的VSV载体(NJ-G-转变版本)，加强2组小鼠(n＝10)。加强后5天，在效应阶段峰值，从一组小鼠(“加强”，n＝5)分离脾细胞。加强后30天，在记忆阶段过程中，从另一组小鼠(记忆，n＝5)分离脾细胞。通过四聚物染色，确定Gag特异性的CD8 T细胞频率。用gag免疫显性的肽刺激过夜后，通过ELISPOT确定Gag特异性的IFN-γ分泌。

实施例2

VSV突变体的表征

观察了实施例1所述的组合的两种突变类型VSV载体(N改组的/G蛋白ct截短)相对于单一类型突变VSV载体的噬斑大小的实质差异(表5)。一般，单一类型突变VSV载体在24小时噬斑测定中形成可计数大小的噬斑，而一些N改组的/G蛋白ct截短载体需要3-4天来形成等同大小的噬斑。VSV载体的噬斑大小的相对差异也与在细胞培养的生长动力学研究过程中观察到的相对差异类似(图1至图3)。

表5

VSV载体的相对噬斑大小

实施例3

VSV神经毒力研究

在一系列的小鼠、雪貂和猴神经毒力研究中，评价了与单一类型VSV突变载体相比，包含2种或更多种突变类型的组合的VSV的协同减毒，其方法描述在实施例1中。小鼠高度允许VSV复制，且该性质允许它们用于区别病毒生长和减毒的不同水平。对于不同的VSV载体，在小鼠中观察到了不同梯度的致病性/减毒(表6和表7)。例如，颅内接种3′-NPMGL-5′、3′-NPMG_(ct-1)L-5′、3′-PNMG_(ct-1)L-5′或3′-PMNG_(ct-1)L-5′的小鼠的LD₅₀(表6)表明了下面的相对减毒梯度：3′-PMNG_(ct-1)L-5′(LD₅₀＝2x10⁵)＞3′-PNMG_(ct-1)L-5′(LD₅₀＝1x10⁴)＞3′-NPMG_(ct-1)L-5′(LD₅₀＝14.5)＞3′-NPMGL-5′(LD₅₀＝3.2)。

表6

死亡的或瘫痪的小鼠的数目

                                IC剂量(pfu)    载体    1    10    100    1000    10000    100000  3′-NPMG_(ct-1)L-5′  (LD₅₀＝14.5pfu)  ND3个死亡的5个死亡的6个死亡的6个死亡的ND  3’-PNMG_(ct-1)L-5’  (LD₅₀＝1×10⁴pfu)  ND2个瘫痪的3个死亡的1个瘫痪的1个死亡的1个瘫痪的1个死亡的1个瘫痪的ND  3′-PMNG_(ct-1)L-5’  (LD₅₀＞2×10⁵pfu)  NDND1个死亡的1个瘫痪的1个瘫痪的3个瘫痪的2个死亡的4个瘫痪的  3′-NPMGL-5′(wt)  (LD₅₀＝3.2pfu)  1个  死亡的5个死亡的6个死亡的6个死亡的NDND

给6只小鼠颅内(IC)接种每种上述载体。

下面的表7显示的具有0(野生型VSV)、1、2、3和4种(gag基因插入)突变类型的颅内注射VSV载体的小鼠中的LD₅₀也表现出类似的减弱梯度。而且，颅内注射VSV载体3′-gag₁-PMNG_(ct1)L-5′、3′-gag₁-N_(ts)PMGL_(ts)-5′、3′-gag₁-NPMGL_(ts)-5′、3′-gag₁-NPM_(ncp)G_(ct1)L-5′、3′-gag₁-PMNG_(ct9)L_(ts)-5′和3′-gag₁-NPMG_(茎)L-5′的小鼠，没有表现出死亡率。

表7

VSV载体在小鼠中的颅内神经毒力

    载体  LD₅₀  (pfu)  突变类型的  数目 3’-NPMGL-5’(VSV wt)3.2    0 3’-NPMGL-5’(rVSV)10    0 3’-NPMG-gag₅-L-5’10    1 3’-PNMGL-5’12    1 3’-PMNGL-5’14    1 3’-NPMG_(ct-1)L-5′14.5    1 3’-NPMG_(ct-1)-gag₅-L-5′24    2 3′-gag₁-NPMGL-5′115    1 3’-PNMG_(ct-1)L-5’1×10⁴    2 3’-PMNG_(ct-1)L-5’2×10⁵    2 3′-gag₁-PMNG_(ct-9)L-51×10⁶    3 3′-gag₁-PNMG_(ct-1)L-5′1×10⁶    3 3′-NPM_(ncp)G-gag₅-L-5′＞1×10⁶    2 3′-gag₁-N_(ts)PMGL-5′8×10⁶    2 3′-PMNG_(ct-1)-gag₅-L-5′1×10⁷    3 3′-NPM_(ncp)G_(ct-1)-gag₅-L-5′＞1×10⁷    3 3′-gag₁-PMNG_(ct-1)L-5′＞1×10⁷    3 3′-gag₁-N_(ts)PMGL_(ts)-5′＞1×10⁷    3 3′-gag₁-NPMGL_(ts)-5′＞1×10⁷    2 3′-gag₁-NPM_(ncp)G_(ct-1)L-5′＞1×10⁷    3 3′-cgag₁-PMNG_(ct-9)L_(ts)-5′＞1×10⁷    4 3′-gag₁-NPMG_(stem)L-5′＞1×10⁷    2

来自丘脑内(intrathalamically)接种相同系列的载体的猕猴的组织病理学数据表明非常类似的减毒梯度。2组动物数据得到了来自一系列雪貂神经毒力研究的结果的进一步证实，其中分别通过噬斑测定和实时PCR，周期性地测量颅内接种的动物的脑中存在的传染性病毒和基因组RNA的水平。这些数据共同证实，两种或更多种突变类型的组合，具有充分大于单一突变类型VSV载体的减毒水平。小鼠LD₅₀效价强烈表明，通过在相同VSV载体中组合两种不同类型的突变，会存在强烈的减毒协同作用。

实施例4

减毒的VSV载体的增强的免疫原性

将减毒的VSV载体3′-gag₁-NPM_(ncp)G_(ct1)L-5′、3′-gag₁-PMNG_(ct9)L-5′和3′-gag₁-N_(ts)PMGL_(ts)-5′的免疫原性与VSV原型载体3′-NPMG-gag₅-L-5′和3′-NPMGL-5′进行了对比。如实施例1所述，用上述的VSV载体之一免疫小鼠。减毒的VSV载体诱导免疫反应，其大于由原型VSV-gag₅载体(3′-NPMG-gag₅-L-5′)诱导的那些反应。最值得注意的是3′-gag₁-PMNG_(ct9)L-5′，当在启动和加强后、以及在反应的记忆阶段过程中评估时，其会诱导统计学显著的比原型诱导的更高的Gag特异性的T细胞频率(表8)。

表8

GAG特异性的CD8 T细胞频率

   Gag四聚物阳性的   CD8 T-细胞的百分比    载体基础加强记忆 3’-NPMGL-5’0.24 0.15 0.21 3’-NPMG-gag₅-L-5’1.46 2.29 0.92 3’-gag₁-NPM_(ncp)G_(ct1)L-5′0.96 3.42 2.25 3’-gag₁-PMNG_(ct9)L-5’2.29^* 8.68^* 3.13^* 3’-gag₁-N_(ts)PMGL_(ts)-5’0.66 3.59 0.21

^*＝显著高于用3’-NPMG-gag₅-L-5’看到的反应

(斯氏t检验，p＜0.05)。

3′-gag₁-PMNG_(ct9)L-5′也诱导IFN-γ分泌，其倾向高于由原型3-NPMG-gag₅-L-5′诱导的(表9)。对3′-gag₁-NPM_(ncp)G_(ct1)L-5′和3′-gag₁-N_(ts)PMGL_(ts)-5′的反应，也倾向高于由原型3′-NPMG-gag₅-L-5′诱导的那些(表9)。

表9

GAG IFN-γ ELISPOT

  IFN-γ斑点/1×10⁶  脾细胞    载体基础加强记忆 3’-NPMGL-5’0 1 0 3’-NPMG-gag₅-L-5’680 887 196 3’-gag₁-NPM_(ncp)G_(ct1)L-5’372 984 668^* 3’-gag₁-PMNG_(ct9)L-5’908 1,552 496 3′-gag₁-N_(ts)PMGL_(ts)-5’129 632 413

^*＝显著高于用3’-NPMG-gag₅-L-5’看到的反应

(斯氏t检验，p＜0.05)。

实施例5

给猕猴肌内和鼻内送递表达

HIV gag的减毒的V5V载体的免疫原性

下面的研究设计用于测量用表达HIV gag蛋白的减毒的VSV载体免疫后，在猕猴中引起的免疫反应。

用共24只未经遗传选择的雄性猕猴，进行表10所述的研究，其中以1×10⁷(pfu)的剂量，用下述的VSV载体之一，肌内或鼻内地免疫每组动物(即，组1-6)：3′-gag₁-N_(ts)PMGL_(ts)-5′(TsN+L)、3′-gag₁-PMNG_(ct9)L-5′(N4CT9)或3′-NPMG-gag₅-L-5′(Gag5)。

用共24只未经遗传选择的雄性猕猴，进行表11所述的研究，其中以1×10⁷(pfu)的剂量，用下述的VSV载体之一，肌内或鼻内地免疫每组动物(即，组1-8)：3′-gag₁-NPM_(ncp)G_(ct1)L-5′(MncpCT1)、3′-gag₁-NPMG_(茎)L-5′(G茎)、3′-gag₁-PMNG_(ct1)L-5′(N4CT1)或3′-NPMG-gag₅-L-5′(Gag5)。

通常，使用下面的测定检查每只动物的全身的和体液免疫反应和VSV释放：

细胞免疫反应：HIV gag肽特异性的IFN-γ ELISPOT反应和VSV N肽特异性的IFN-γ ELISPOT反应。体液免疫反应：通过ELISA测定血清抗-HIV gag抗体效价，通过ELISA测定血清抗-VSV抗体效价，和血清抗-VSV中和抗体效价。

表10

灵长类动物免疫原性研究

  组  #动物  基础  (印地安那  血清型)  加强  (新泽西  血清型)剂量途径    1    5    TsN+L    TsN+L 1×10⁷    IM    2    5    TsN+L    TsN+L 1×10⁷    IN    3    5    N4CT9    N4CT9 1×10⁷    IM    4    5    N4CT9    N4CT9 1×10⁷    IN    5    2    Gag 5    Gag 5 1×10⁷    IM    6    2    Gag 5    Gag 5 1×10⁷    IN

途径IM是肌内的。

途径IN是鼻内的。

表11

灵长类动物免疫原性研究

  组  #动物  基础  (印地安那  血清型)  加强  (新泽西  血清型)剂量  途径    1    5    Mncp CT1    Mncp CT1  1×10⁷    IM    2    5    Mncp CT1    MncpCT1  1×10⁷    JN    3    5    G茎    G茎  1×10⁷    IM    4    5    G茎    G茎  1×10⁷    IN    5    5    N4CT1    N4CT1  1×10⁷    JM    6    5    N4CT1    N4CT1  1×10⁷    IN    7    2    Gag 5    Gag 5  1×10⁷    IM    8    2    Gag 5    Gag 5  1×10⁷    IN

途径IM是肌内的。

途径IN是鼻内的。

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