一种甲基对硫磷降解菌及其在降解甲基对硫磷中的应用

摘要

本发明提供一种甲基对硫磷降解菌DM－1，该甲基对硫磷降解菌已于2006年2月17日在保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1620，其分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis.。本发明提供的甲基对硫磷降解菌，是从长期受农药污染的土壤中分离和筛选的。使用本发明的甲基对硫磷降解菌对甲基对硫磷进行降解时，使用含有5g/l葡萄糖pH值为7的无机盐培养液按10％接种量接种本发明的甲基对硫磷降解菌，在30℃对50～500ppm的甲基对硫磷有良好的降解效果。

说明书

技术领域

本发明属于微生物降解领域，具体地说是涉及一种甲基对硫磷降解菌，及其在降解甲基对硫磷中的应用。

背景技术

甲基对硫磷(Methyl Parathion，简称MP)是一种高毒的有机磷杀虫剂，其化学分子式为C₈H₁₀NO₅PS，化学名称为O，O-二甲基O-(对-硝基苯基)硫逐磷酸酯。由于这种杀虫剂具有高效、经济等特点，其被广泛应用于农业生产与害虫防治中。但是同时，由于其残毒将造成环境与食品的严重污染，并产生大量的杀虫剂废物，严重影响了人们的身体健康及出口农产品的质量，带来了一系列负面效应。如何有效地处理残留的甲基对硫磷，避免对环境及人类的损害，成为人们亟待解决的问题。

使用传统的物理化学方法处理残留的甲基对硫磷，难度大、成本较高，处理效率低，而且容易造成二次污染。所以目前一般选用比较环保的微生物降解技术，通过微生物对农药矿化、水解和共代谢等代谢方式，来处理残留的甲基对硫磷。如在文献1：甲基对硫磷降解菌DLL-1的分离、鉴定及降解性研究，应用与环境生物学报[J]，1999，5(增刊)：147-150中所公开的，将农药作为其唯一碳源或氮、磷源，使用甲基对硫磷降解菌DLL-1将其水解或矿化。这种方法在对甲基对硫磷的降解时，产生的中间产物是对硝基苯酚，而对硝基苯酚是一具有中等毒性的物质，会给人类的健康带来潜在的威胁。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从长期受农药污染土壤中筛选分离出的、具有广谱性降解有机磷类化合物、可以以共代谢的方式高效转化甲基对硫磷的甲基对硫磷降解菌，及其在降解甲基对硫磷中的应用。

本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：

本发明提供一种甲基对硫磷降解菌DM-1，该甲基对硫磷降解菌已于2006年2月17日在保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》(北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所)，其保藏号为CGMCC No.1620，其分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis.。

本发明提供的甲基对硫磷降解菌，是从长期受农药污染的土壤中分离和筛选的，具体步骤如下：将采集的农药污染土样用无机盐培养液配制成20wt％的悬浮液，然后以5wt％的接种量接到含50mg/L甲基对硫磷的无机盐培养液中，振荡培养；传代培养6代，逐渐提高无机盐培养液中甲基对硫磷的浓度至600ppm；从最后的培养液取出1mL菌液，稀释后，涂布于含有500ppm甲基对硫磷的无机盐固体培养基上，30℃恒温箱培养；选取生长快(平板上有透明圈)，菌落规则，传代稳定的菌落，纯化2～3次后得到纯菌株；将分离出的5株菌作为复筛菌株在LB培养基中扩大培养至相同OD值1.0，以10％的接种量接入含100ppm甲基对硫磷的无机盐培养基中，于30℃，180rpm摇床培养48h，用气相色谱测定降解率，最终筛选到降解率最高的一株菌，转入牛肉膏蛋白胨斜面保存。

所述的无机盐培养液是按下述比例配制的：在1000ml水中，0.5g NaCl，0.2gMgSO₄，0.5g(NH₄)₂SO₄，1.5g K₂HPO₄，0.5g KH₂PO₄，0.05g CaCl₂，0.02g FeSO₄，0.002g酵母粉，pH值7.0，121℃高压灭菌20min；

所述的无机盐固体培养基是将上述无机盐培养液加入占无机盐培养液总重量的1.5～2％(w/v)的琼脂。

所述的LB培养基和牛肉膏蛋白胨与文献2：微生物学实验[M]，北京：高等教育出版社，1988，75-78中相同。

所用的气相色谱的检测条件为：HP5890II型气相色谱仪，电子捕获检测器；色谱柱：弱极性毛细管柱HP-1[100％聚二甲基硅氧烷，Polydimethylsiloxane 25m×0.32mm(I.D.)×0.25μm]；操作温度：检测器温度300℃，进样口温度300℃，柱温210℃；柱压6.9psi；柱流量0.748ml/min；最小检出量：0.05μg/ml；标样浓度0.5ppm；甲基对硫磷出峰时间约7.0min。

根据样品峰面积、标样峰面积及进样量计算出培养液中甲基对硫磷的含量。计算公式为： $>>X>=>{{{{}_{}}_{}}_{}}_{}$>