微流孔芯片电泳分离检测小而密低密度脂蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种微流孔芯片电泳分离检测小而密低密度脂蛋白的方法，包括标本预处理微流孔芯片、电泳装置进行电泳，在高脂蛋白血症患者的样本中分离出小而密低密度脂蛋白。本发明能简便、易行、快速、准确的分离检测小而密低密度脂蛋白，从样本预染到结果分析只需6分钟，芯片的使用可达数千次，而且操作简单。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种小而密低密度脂蛋白的检测方法。

背景技术：

脂蛋白是纳米大小的球形颗粒，胆固醇酯和甘油三酯组成疏水性的内壳，载脂蛋白、磷脂及游离胆固醇组成亲水性的外壳。超速离心法将血浆脂蛋白分为乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。低高密度脂蛋白胆固醇血症和高低密度脂蛋白胆固醇血症作为冠心病传统的危险因素，已得到人们的公认。近年来研究发现，低密度脂蛋白具有明显的异质性，小颗粒致密LDL(small dense low density lipoprotein，sLDL)与大而轻LDL(large buoyant low density lipoprotein，LDL1)相比具有强烈的致动脉粥样硬化的作用，sLDL更易遭受氧化或修饰，是冠心病重要的危险因素，已成为倍受关注的新研究热点。超速离心法是目前分离sLDL的参考方法，但由于需昂贵的设备、操作复杂、费时且技术要求高，不易在普通实验室开展。至今没有一种简便、易行、快速、准确的分离sLDL的方法。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种能简便、易行、快速、准确的分离检测小而密低密度脂蛋白的微流孔芯片电泳分离检测小而密低密度脂蛋白的方法。

本发明的技术解决方案是：

一种微流孔芯片电泳分离检测小而密低密度脂蛋白的方法，其特征是：包括下列步骤：

(1)标本预处理：将5μl血清样本溶于15μl去离子水中，然后用0.5mg/ml的NBD C6-ceramide 10μl预染1分钟后加入pH9.8样本Tricine缓冲液，样本Tricine缓冲液由40mol/l的Tricme、40mol/l的泛影葡胺、0.2mmol/l的SDS组成，得待测样本；

(2)采用十字交叉形通道的微流孔芯片；将微流孔芯片的试样池、试样废液池、缓冲液池、缓冲液废液池及通道用1mol/lNaOH浸洗1分钟，然后用去离子水清洗1分钟，在试样废液池、缓冲液池、缓冲液废液池中分别加入8μl pH9.8分离缓冲液，分离缓冲液由40mmol/l的Tricine、40mmol/l的泛影葡胺、0.02mmol/l的SDS组成，在试样池中加入6μl待测样本；然后用微流孔芯片电泳装置进行电泳，电泳时采用夹流进样方式，在进样阶段，试样废液池接地，试样池+750v，缓冲液池+300v，缓冲液废液池+450v，在分离阶段，缓冲液废液池0v，缓冲液池+3000v，试样池和试样废液池均施加+300v.在高脂蛋白血症患者的样本中分离出小而密低密度脂蛋白。

本发明能有效分离HDL、LDL₁、sLDL，能简便、易行、快速、准确的分离检测小而密低密度脂蛋白，从样本预染到结果分析只需6分钟，芯片的使用可达数千次，而且操作简单。

附图说明：

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是本发明微流孔芯片的结构示图。

图2是图1中十字交叉口的扫描电镜图。

图3是健康体检者脂蛋白分离图谱。

图4是II型高脂蛋白血症患者的血清脂蛋白电泳图谱。

图中Relative fluorescence为相对荧光强度，Time(min)为时间(分)，detection point为检测点。

具体实施方式：

一种微流孔芯片电泳分离检测小而密低密度脂蛋白的方法，包括下列步骤：

(1)标本预处理：将5μl血清样本溶于15μl去离子水中，然后用0.5mg/ml的NBD C6-ceramide 10μl预染1分钟后加入pH9.8样本Tricine缓冲液，样本Tricine缓冲液由40mol/l的Tricine、40mol/l的泛影葡胺、0.2mmol/l的SDS组成，得待测样本；

(2)采用十字交叉形微流孔芯片；芯片采用石英玻璃为制作材料，经光刻、湿法腐蚀、低温键合而成，整个芯片大小为63.5mm×31.75mm，芯片微管道宽100μm，深约30μm，芯片进样池到十字交叉点长28mm，有效分离长度为45mm，储液池的直径为2mm。将微流孔芯片的试样池1、试样废液池2、缓冲液池3、缓冲液废液池4及通道用1mol/lNaOH浸洗1分钟，然后用去离子水清洗1分钟，在试样废液池、缓冲液池、缓冲液废液池中分别加入8μl pH 9.8分离缓冲液，分离缓冲液由40mmol/l的Tricine、40mmol/l的泛影葡胺、0.02mmol/l的SDS组成，在试样池中加入6μl待测样本；然后用微流孔芯片电泳装置进行电泳，电泳时采用夹流进样方式，在进样阶段，试样废液池接地，试样池+750v，缓冲液池+300v，缓冲液废液池+450v，在分离阶段，缓冲液废液池0v，缓冲液池+3000v，试样池和试样废液池均施加+300v。在高脂蛋白血症患者的样本中分离出小而密低密度脂蛋白。

微流控芯片毛细管电泳仪器激光诱导荧光检测系统(Laser InducedFluorescence Detector，LIF)，367型氩离子激光器(南京电子管厂)发出波长为488nm的激光束，经半反半透镜(Omega Optical公司)反射至物镜(Rolyn Otics公司)，将光束对准芯片检测窗口；当泳道内带有荧光基团的脂蛋白分离组分经过检测窗口时，激发出的荧光由物镜收集，通过半反半透镜(520nm)，经光电倍增管(Photo Multiplier Tube，PMT)后转换为模拟信号，经过低通滤波和放大后，经模数(Analog toDigital，A/D)转换为数字信号，由计算机对信号进行采集和处理。实验所得数据用Microsoft excel和Origin 6.0进行处理，转换为荧光强度与迁移时间的关系。