狂犬病暴露后紧急处理和发病早期紧急治疗的药物及制备方法

摘要

本发明提供了一种狂犬病暴露后紧急预防和发病早期紧急治疗的药物及制备方法，以表达质粒、合成的双链小干扰RNA(siRNA)或携带siRNA表达元件的重组载体病毒为制剂，通过阻断狂犬病病毒结构蛋白mRNA合成的RNA干扰效应进行狂犬病的暴露后紧急治疗，以替代目前使用的抗狂犬病血清或免疫球蛋白，从而杜绝异源血清蛋白导致的过敏等不良反应。同时，本发明的制剂，尚可用于狂犬病发病早期的治疗，通过静脉或脑脊液内注射给药，阻断中枢神经系统中狂犬病病毒的增殖，达到治疗目的。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种狂犬病治疗药物，尤其是提供了一种狂犬病暴露后紧急预防和发病早期紧急治疗的药物，同时还提供了相应的制备方法，属于生物制药技术领域。

背景技术：

狂犬病是病死率几乎100％的人兽共患传染病。我国是狂犬病的高发地区，人狂犬病主要因被携带狂犬病病毒的犬或猫咬伤或抓伤(暴露)导致。目前的暴露后预防措施主要包括三个方面，即伤口的清洗、抗狂犬病血清或免疫球蛋白的应用及疫苗接种。其中，抗狂犬病血清或免疫球蛋白一般是来源于马的高免血清或其精制品，含有大量的外源蛋白，应用于人体后，部分患者会出现不同程度的过敏反应，严重的可导致过敏性休克。

发明内容：

本发明提供一种狂犬病暴露后紧急处理和发病早期紧急治疗的药物，避免了传统药物(血清)含有大量的外源蛋白，导致患者出现过敏反应的现象。

本发明药物基于RNA干扰技术，通过阻断狂犬病病毒结构蛋白mRNA合成实现其预防和治疗目的。

本发明利用RNA干扰技术设计合成RNA干扰分子后，这些RNA干扰分子能阻断狂犬病病毒在感染局部和中枢神经系统内的复制，制成狂犬病暴露后紧急处理和发病早期紧急治疗的药物：

本发明以提供siRNA分子的质粒载体、重组病毒载体或人工合成的siRNA分子作为制剂，代替目前广泛使用的马抗狂犬病血清制品，为狂犬病的暴露后预防提供了效果可靠、安全性好、无副作用的制剂，同时也为狂犬病发病早期的病毒阻断性治疗提供了新的途径。

具体制备方法如下：

1.狂犬病病毒mRNA候选靶序列的确定和在敏感细胞上进行的靶序列的筛选

根据GenBank中多数狂犬病病毒株共有的糖蛋白、核蛋白、基质蛋白、磷酸蛋白和大转录酶蛋白等结构基因的保守序列，选择以AA起始、GC含量介于40％～50％之间、碱基分布随机程度高、无4个以上重复碱基、分子内不形成稳定的发夹结构、分子间不形成稳定二聚体的mRNA序列为RNA干扰的候选靶序列，同时，同一mRNA分子上各靶序列应分散分布。按上述原则，设计了针对狂犬病病毒5种结构蛋白的25个候选序列，同时设计了一个不相关的对照序列CTL，在细胞水平进行有效靶序列的筛选。

人工合成针对上述候选靶序列的双链siRNA分子，并经PAGE纯化。二链退火后即成为用于RNA干扰试验的双链小RNA(siRNA)；以QIAGEN公司的RNAiFect转染试剂介导转染，在24孔细胞培养板内的BHK-21细胞上筛选可高效阻断狂犬病病毒复制的靶序列，结果显示，狂犬病病毒在转染CTL序列后的BHK细胞上感染后，经荧光抗体染色形成的荧光细胞数目为每视野平均2060个，约为视野总细胞数的75％。各转染细胞株每视野荧光细胞数为对照转染细胞的1％到90％不等，其中狂犬病病毒增殖阻断90％以上的靶序列有5个，5个高效靶序列及其对狂犬病病毒复制的阻断的具体比例见表1。

表1 5个高效siRNA靶序列及其转染细胞后对狂犬病病毒复制的阻断比例(％)

 siRNA      靶序列(5’-3’) 在相应基因编码区的 起始位置 阻断比 例％  N10    AAAGCCCUGUAUAACCCUAGG      111    99  M23    AACCUUUAUCUUCCAGUGGGC      354    93  G69    AAUCCCAGAGAUGCAAUCAUC      1173    95  G82    AACACAAUCUCAGAGGGACAG      1469    96  L339    AAGAGUGAGAUGCAGAGAGCU      5571    92

2、用于狂犬病病毒感染体内阻断试验的siRNA制剂的制备

2.1 siRNA表达质粒的构建及大量制备

委托宝生物(大连)公司合成针对上述N10、M23、G69、G82及L339靶序列的DNA插入序列(见表2)，每个DNA插入序列由两条DNA链退火后形成，退火后双链两端分别为BamHI和HindIII位点。以Ambion公司的pSilencer2.0-U6或pSilencer3.0-H1为载体，将退火后的上述各双链克隆入载体的BamHI和HindIII位点之间。经序列测定为正确插入，命名为质粒N10、质粒M23、质粒G69、质粒G82及质粒L339，然后大量制备该重组质粒。

质粒的大量制备，采用常规的碱裂解法，可参照《分子克隆》等工具书中的方法进行，并采用其中的聚乙二醇(PEG-8000)法进行质粒的纯化。要求用于体内注射的纯化质粒，外观澄清透明，无肉眼可见的杂质或沉淀，以紫外分光光度计检测，其纯度不低于95％，浓度不低于1mg/ml。

表2针对高效靶序列合成的DNA插入序列

 靶序 列                                   插  入  序  列  N10  N10T：5’-GATCCAGCCCTGTATAACCCTAGGTTCAAGAGACCTAGGGTTATACAGGGCTTTTTTTGGAAA  N10B：5’-AGCTTTTCCAAAAAAAGCCCTGTATAACCTAGGTCTCTTGAACCTAGGGTTATACAGGGCTG  M23  M23T：5’-GATCCGCCTTTATCTTCCAGTGGGCTTCAAGAGAGCCCACTGGAAGATAAAGGTTTTTTGGAAA  M23B：5’-AGCTTTTCCAAAAAACCTTTATCTTCCAGTGGGCTCTCTTGAA GCCCACTGGAAGATAAAGGCG  G69  G69T：5’-GATCCGTCCCAGAGATGCAATCATCTTCAAGAGAGATGATTGCATCTCTGGGATTTTTTGGAAA  G69B：5’-AGCTTTTCCAAAAAATCCCAGAGATGCAATCATCTCTCTTGAAGATGATTGCATCTCTGGGACG  G82  G82T：5’-GATCCGCACAATCTCAGAGGGACAGTTCAAGAGACTGTCCCTCTGAGATTGTGTTTTTTGGAAA  G82B：5’-AGCTTTTCCAAAAAACACAATCTCAGAGGGACAGTCTCTTGAACTGTCCCTCTGAGATTGTGCG  L339  L339T：5’-GATCCGAGTGAGATGCAGAGAGCTTTCAAGAGAAGCTCTCTGCATCTCACTCTTTTTTGGAAA  L339B：5’-AGCTTTTCCAAAAAAGAGTGAGATGCAGAGAGCTTCTCTTGAAAGCTCTCTGCATCTCACTCG

2.2 siRNA分子的人工合成

根据上述筛选得到的靶序列，委托宝生物(大连)公司进行双链siRNA的合成，要求采用PAGE法对合成的样品进行纯化，siRNA分子的纯度不应低于99％，每个序列的合成量为5OD，相当于100-200ug，命名为分子N10、分子M23、分子G69、分子G82和分子L339。合成后的制剂，经PBS溶解后，要求外观澄清透明，无肉眼可见的杂质或沉淀，浓度不低于500ug/ml。

2.3表达siRNA的重组腺病毒的构建及大量制备

按人5型腺病毒重组病毒构建的常规策略进行，具体步骤可以参考相关分子生物学工具书或重组病毒系统供应商的操作说明。首先以限制性内切酶酶切2.1中构建的质粒N10、质粒M23、质粒G69、质粒G82及质粒L339，DNA回收试剂盒回收其中EcoRI和HindIII位点间的siRNA表达盒，克隆入中间载体pAdTrack-CMV质粒中外源表达盒位置，可以不保留原质粒中的CMV启动子等调控元件，重组中间载体分别命名为pAdTrack-N10、pAdTrack-M23、pAdTrack-G69、pAdTrack-G82、pAdTrack-L339。上述各质粒再分别与pAdEasy-1在宿主菌BJ5183内进行同源重组，获得包含siRNA表达盒的重组腺病毒基因组。该基因组以磷酸钙共沉淀法介导转染293细胞，获得重组病毒，命名为病毒N10、病毒M23、病毒G69、病毒G82、病毒L339，并分别大量制备，要求用于体内试验的重组病毒溶液，外观澄清透明，呈现细胞培养基特有的淡粉色，无肉眼可见的杂质或沉淀，病毒滴度不低于10⁹pfu/ml，总量不少于500ml，按规定浓缩后，呈水样液，重组病毒滴度不低于10¹²pfu/ml。

3用法用量

3.1用于狂犬病暴露后紧急预防时，以本制剂进行伤口及其周围的浸润性注射。

3.2用于狂犬病发病早期的紧急治疗时，以本制剂进行静脉注射给药或脑脊液内注射给药。

以下试验例证明本发明的医疗效果：

试验例1 siRNA表达质粒对模拟狂犬病暴露后犬的紧急预防

1质粒纯化的质粒N10、质粒M23、质粒G69、质粒G82、质粒L339及对照质粒CTL，纯度95％以上，浓度皆调整为1mg/ml。

2动物3月龄以上无狂犬病免疫史的健康家犬60条，随机均分为6组，单只隔离笼养。

3病毒狂犬病标准攻击用强毒CVS-11株的鼠脑培养物，病毒量为10⁷LD₅₀/ml。

4试验过程取CVS-11病毒，以含10％牛血清的PBS稀释成终浓度200000LD₅₀/ml，取200ul(40000 LD₅₀)，肌肉注射入受试犬后肢；6小时后，各组受试犬分别注射相应的siRNA表达质粒，质粒总量为每犬500ug，以PBS稀释至总体积5ml后使用，质粒注射部位为攻毒注射部件的周围，呈立体包围状注射，类同抗狂犬病血清的浸润注射方式。注射后各组继续饲养并观察至注射后30天。详细记录各组犬的发病及死亡情况。对死亡犬，按狂犬病检测规程，进行其脑组织的直接免疫荧光检测，以确认系因狂犬病导致的死亡。

5试验结果至注射后30天，各组犬存活数量见表3。

表3 siRNA表达质粒注射后狂犬病暴露犬的存活情况

  表达质粒 受试动物数量 注射后30天仍存活动物数 存活比例％    质粒N10    10    9    90    质粒M23    10    9    90    质粒G69    10    10    100    质粒G82    10    7    70    质粒L339    10    7    70    质粒CTL    10    0    0

6结论以siRNA表达质粒进行犬的暴露后紧急预防，可保护70-100％的受试动物不发生狂犬病致死；同时，对照质粒对暴露犬无保护效果。

试验例2人工合成的siRNA分子对模拟狂犬病暴露后犬的紧急预防

1siRNA分子委托宝生物(大连)公司进行双链siRNA的合成分子N10、分子M23、分子G69、分子G82、分子L339和分子CTL，并用PAGE法对合成的样品进行纯化，siRNA分子的纯度不应低于99％，每个序列的合成量为10OD，相当于400-500ug。

2动物3月龄以上无狂犬病免疫史的健康家犬60条，随机均分为6组，单只隔离笼养。

3病毒狂犬病标准攻击用强毒CVS-11株的鼠脑培养物，病毒量为10⁷LD₅₀/ml。

4试验过程取CVS-11病毒，以含10％牛血清的PBS稀释成终浓度200000LD₅₀/ml，取200ul(40000 LD₅₀)，肌肉注射入受试犬后肢；6小时后，各组受试犬分别注射相应的siRNA分子，总量为每犬300ug，以PBS稀释至总体积5ml后使用，注射部位为攻毒注射部件的周围，呈立体包围状注射，类同抗狂犬病血清的浸润注射方式。注射后各组继续饲养并观察至注射后30天。详细记录各组犬的发病及死亡情况。对死亡犬，按狂犬病检测规程，进行其脑组织的直接免疫荧光检测，以确认系因狂犬病导致的死亡。

5试验结果至注射后30天，各组犬存活数量见表4。

表4 siRNA分子注射后狂犬病暴露犬的存活情况

    siRNA分子  受试动物数量  注射后30天仍存活动物数 存活比例％    分子N10    10    10    90    分子M23    10    9    90    分子G69    10    10    100    分子G82    10    8    80    分子L339    10    7    70    分子CTL    10    0    0

6结论以人工合成的siRNA分子进行犬的暴露后紧急预防，可保护70-100％的受试动物不发生狂犬病致死；同时，对照siRNA分子对暴露犬无保护效果。

试验例3表达siRNA的重组腺病毒对模拟狂犬病暴露后犬的紧急预防

1重组病毒纯化并浓缩的表达siRNA的重组病毒病毒N10、病毒M23、病毒G69、病毒G82、病毒L339和病毒CTL，滴度为10¹²pfu/ml，各重组病毒总量不少于5ml。

2动物3月龄以上无狂犬病免疫史的健康家犬60条，随机均分为6组，单只隔离笼养。

3病毒狂犬病标准攻击用强毒CVS-11株的鼠脑培养物，病毒量为10⁷LD₅₀/ml。

4试验过程取CVS-11病毒，以含10％牛血清的PBS稀释成终浓度200000LD₅₀/ml，取200ul(40000 LD₅₀)，肌肉注射入受试犬后肢；6小时后，各组受试犬分别注射相应的浓缩重组腺病毒，总量为每犬5ml后，注射部位为攻毒注射部件的周围，呈立体包围状注射，类同抗狂犬病血清的浸润注射方式。注射后各组继续饲养并观察至注射后30天。详细记录各组犬的发病及死亡情况。对死亡犬，按狂犬病检测规程，进行其脑组织的直接免疫荧光检测，以确认系因狂犬病导致的死亡。

5试验结果至注射后30天，各组犬存活数量见表5。

表5表达siRNA的重组腺病毒注射后狂犬病暴露犬的存活情况

  重组腺病毒  受试动物数量  注射后30天仍存活动物数 存活比例％    病毒N10    10    10    100    病毒M23    10    8    80    病毒G69    10    10    100    病毒G82    10    8    80    病毒L339    10    9    90    病毒CTL    10    0    0

结论以表达siRNA分子的重组腺病毒进行犬的暴露后紧急预防，可保护80-100％的受试动物不发生狂犬病致死；同时，对照重组腺病毒对暴露犬无保护效果。

试验例4表达siRNA的重组腺病毒对狂犬病犬发病早期的治疗

1重组病毒纯化并浓缩的表达siRNA的重组病毒病毒N10、病毒M23、病毒G69、病毒G82、病毒L339和病毒CTL，滴度为10¹²pfu/ml，各重组病毒总量不少于100ml。

2动物3月龄以上无狂犬病免疫史的健康家犬60条，随机均分为6组，单只隔离笼养。

3病毒狂犬病标准攻击用强毒CVS-11株的鼠脑培养物，病毒量为10⁷LD₅₀/ml。

4试验过程取CVS-11病毒，以含10％牛血清的PBS稀释成终浓度200000LD₅₀/ml，取500ul(10⁵LD₅₀)，肌肉注射入受试犬前肢；注射后继续饲养并观察，至受试犬出现精神萎靡、进食严重减少等狂犬病前期症状时，良好保定后，静脉注射重组病毒5ml，每日两次，直至死亡或康复。详细记录各组犬的发病病程天数及死亡情况。对死亡犬，按狂犬病检测规程，进行其脑组织的直接免疫荧光检测，以确认系因狂犬病导致的死亡。

5试验结果各组受试犬的发病潜伏期为12-22天，平均为16天；试验开始后45天时，各组犬死亡及病程情况见表6。

表6表达siRNA的重组腺病毒对狂犬病犬发病早期的治疗效果

  重组  腺病毒 受试动物 数量  攻毒45天后  仍存活动物数   存活比例   ％  狂犬病发病平均病程  (发病至死亡的天数)病毒N10    10    3    30    11.3±4.6病毒M23    10    3    30    10.2±6.6病毒G69    10    5    40    13.8±5.2病毒G82    10    2    20    13.0±2.8病毒L339    10    4    40    11.6±4.0病毒CTL    10    0    0    6.8±2.6

结论以表达siRNA分子的重组腺病毒通过静脉注射给药进行狂犬病犬发病早期的治疗，可挽救20-50％的受试动物免于病死，而对照重组腺病毒对狂犬病无治疗效果；同时，表达siRNA的重组腺病毒应用后，可以明显延长狂犬病病程，能够为其它有效治疗的开展争取宝贵时间。

本发明的积极效果在于：通过阻断狂犬病病毒结构蛋白mRNA合成的RNA干扰效应进行狂犬病的暴露后紧急治疗，以替代目前使用的抗狂犬病血清或免疫球蛋白，从而杜绝异源血清蛋白导致的过敏等不良反应。同时，本发明的制剂，尚可用于狂犬病发病早期的治疗，通过静脉或脑脊液内注射给药，阻断中枢神经系统中狂犬病病毒的增殖，达到治疗目的。

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。

实施例1 siRNA分子N10的制备

委托宝生物(大连)公司人工合成针对狂犬病病毒核蛋白靶序列N10的双链siRNA分子，合成的RNA单链序列分别为：

5’-AGCCCUGUAUAACCCUAGGUU

5’-CCUAGGGUUAUACAGGGCUUU

要求合成量为1mg，经PAGE纯化并溶解于PBS缓冲液中，每管200ug分装。运输过程要求使用干冰，严格保持低温，防止RNA制品降解。对接收的制剂，进行质量检测。所有制剂，包装不得缺损，每个包装的标签均应标注制剂名称、制剂的含量及该包装内制剂体积。制剂解冻后为水样澄清透明液体，无肉眼可见的沉淀物。抽样，以紫外分光光度法检测制剂的核酸纯度，不低于99％，核酸浓度，应与包装标识一致，误差小于5％为合格。

实施例2 siRNA分子M23的制备

委托宝生物(大连)公司人工合成针对狂犬病病毒核蛋白靶序列M23的双链siRNA分子，合成的RNA单链序列分别为：

5’-CCUUUAUCUUCCAGUGGGCUU

5’-GCCCACUGGAAGAUAAAGGUU

要求合成量为1mg，经PAGE纯化并溶解于PBS缓冲液中，每管200ug分装。运输过程要求使用干冰，严格保持低温，防止RNA制品降解。

对接收的制剂，进行质量检测。所有制剂，包装不得缺损，每个包装的标签均应标注制剂名称、制剂的含量及该包装内制剂体积。制剂解冻后为水样澄清透明液体，无肉眼可见的沉淀物。抽样，以紫外分光光度法检测制剂的核酸纯度，不低于99％，核酸浓度，应与包装标识一致，误差小于5％为合格。

实施例3 siRNA分子G69的制备

委托宝生物(大连)公司人工合成针对狂犬病病毒核蛋白靶序列G69的双链siRNA分子，合成的RNA单链序列分别为：

5’-UCCCAGAGAUGCAAUCAUCUU

5’-GAUGAUUGCAUCUCUGGGAUU

要求合成量为1mg，经PAGE纯化并溶解于PBS缓冲液中，每管200ug分装。运输过程要求使用干冰，严格保持低温，防止RNA制品降解。

对接收的制剂，进行质量检测。所有制剂，包装不得缺损，每个包装的标签均应标注制剂名称、制剂的含量及该包装内制剂体积。制剂解冻后为水样澄清透明液体，无肉眼可见的沉淀物。抽样，以紫外分光光度法检测制剂的核酸纯度，不低于99％，核酸浓度，应与包装标识一致，误差小于5％为合格。

实施例4 siRNA分子G82的制备

委托宝生物(大连)公司人工合成针对狂犬病病毒核蛋白靶序列G82的双链siRNA分子，合成的RNA单链序列分别为：

5’-CACAAUCUCAGAGGGACAGUU

5’-CUGUCCCUCUGAGAUUGUGUU

要求合成量为1mg，经PAGE纯化并溶解于PBS缓冲液中，每管200ug分装。运输过程要求使用干冰，严格保持低温，防止RNA制品降解。

对接收的制剂，进行质量检测。所有制剂，包装不得缺损，每个包装的标签均应标注制剂名称、制剂的含量及该包装内制剂体积。制剂解冻后为水样澄清透明液体，无肉眼可见的沉淀物。抽样，以紫外分光光度法检测制剂的核酸纯度，不低于99％，核酸浓度，应与包装标识一致，误差小于5％为合格。

实施例5 siRNA分子L339的制备

委托宝生物(大连)公司人工合成针对狂犬病病毒核蛋白靶序列L339的双链siRNA分子，合成的RNA单链序列分别为：

5’-GAGUGAGAUGCAGAGAGCUUU

5’-AGCUCUCUGCAUCUCACUCUU

要求合成量为1mg，经PAGE纯化并溶解于PBS缓冲液中，每管200ug分装。运输过程要求使用干冰，严格保持低温，防止RNA制品降解。

对接收的制剂，进行质量检测。所有制剂，包装不得缺损，每个包装的标签均应标注制剂名称、制剂的含量及该包装内制剂体积。制剂解冻后为水样澄清透明液体，无肉眼可见的沉淀物。抽样，以紫外分光光度法检测制剂的核酸纯度，不低于99％，核酸浓度，应与包装标识一致，误差小于5％为合格。

实施例6表达siRNA的质粒N10的制备

委托宝生物(大连)公司合成以下两条DNA链，退火后双链两端分别为BamHI和HindIII位点：

N10T：5’-GATCCAGCCCTGTATAACCCTAGGTTCAAGAGACCTAGGGTTATACAGGGCTTTTTTTGGAAA

N10B：5’-AGCTTTTCCAAAAAAAGCCCTGTATAACCTAGGTCTCTTGAACCTAGGGTTATACAGGGCTG

以Ambion公司的pSilencer2.0-U6为载体，将退火后的双链克隆入载体的BamHI和HindIII位点之间。经序列测定为正确插入，命名为“质粒N10”，然后在LB培养基内培养含有质粒N10的宿主大肠杆菌2000ml，制备该重组质粒。质粒的大量制备，采用常规的碱裂解法，参照《分子克隆-第3版》中质粒的碱裂解制备法进行，采用聚乙二醇(PEG-8000)法进行质粒纯化。

纯化后的质粒制品溶于生理盐水内，经检测，纯化质粒外观为水样澄明液体，无肉眼可见杂质及沉淀，紫外分光光度检测，纯度为98％，浓度为1.3mg/ml，质粒总量为13.0mg。

实施例7表达siRNA的质粒M23的制备

委托宝生物(大连)公司合成以下两条DNA链，退火后双链两端分别为BamHI和HindIII位点：

M23T：5’-GATCCGCCTTTATCTTCCAGTGGGCTTCAAGAGAGCCCACTGGAAGATAAAGGTTTTTTGGAAA

M23B：5’-AGCTTTTCCAAAAAACCTTTATCTTCCAGTGGGCTCTCTTGAA GCCCACTGGAAGATAAAGGCG

以Ambion公司的pSilencer2.0-U6为载体，将退火后的双链克隆入载体的BamHI和HindIII位点之间。经序列测定为正确插入，命名为“质粒M23”，然后在LB培养基内培养含有质粒M23的宿主大肠杆菌2000ml，制备该重组质粒。质粒的大量制备，采用常规的碱裂解法，参照《分子克隆-第3版》中质粒的碱裂解制备法进行，采用聚乙二醇(PEG-8000)法进行质粒纯化。

纯化后的质粒制品溶于生理盐水内，经检测，纯化质粒外观为水样澄明液体，无肉眼可见杂质及沉淀，紫外分光光度检测，纯度为97％，浓度为1.2mg/ml，质粒总量为12.5mg。

实施例8表达siRNA的质粒G69的制备

委托宝生物(大连)公司合成以下两条DNA链，退火后双链两端分别为BamHI和HindIII位点：

G69T：5’-GATCCGTCCCAGAGATGCAATCATCTTCAAGAGAGATGATTGCATCTCTGGGATTTTTTGGAAA

G69B：5’-AGCTTTTCCAAAAAATCCCAGAGATGCAATCATCTCTCTTGAAGATGATTGCATCTCTGGGACG

以Ambion公司的pSilencer2.0-U6为载体，将退火后的双链克隆入载体的BamHI和HindIII位点之间。经序列测定为正确插入，命名为质粒G69，然后在LB培养基内培养含有质粒G69的宿主大肠杆菌2000ml，制备该重组质粒。质粒的大量制备，采用常规的碱裂解法，参照《分子克隆-第3版》中质粒的碱裂解制备法进行，采用聚乙二醇(PEG-8000)法进行质粒纯化。

纯化后的质粒制品溶于生理盐水内，经检测，纯化质粒外观为水样澄明液体，无肉眼可见杂质及沉淀，紫外分光光度检测，纯度为96％，浓度为1.2mg/ml，质粒总量为12.8mg。

实施例9表达siRNA的质粒G82的制备

委托宝生物(大连)公司合成以下两条DNA链，退火后双链两端分别为BamHI和HindIII位点：

G82T：5’-GATCCGCACAATCTCAGAGGGACAGTTCAAGAGACTGTCCCTCTGAGATTGTGTTTTTTGGAAA

G82B：5’-AGCTTTTCCAAAAAACACAATCTCAGAGGGACAGTCTCTTGAACTGTCCCTCTGAGATTGTGCG

以Ambion公司的pSilencer2.0-U6为载体，将退火后的双链克隆入载体的BamHI和HindIII位点之间。经序列测定为正确插入，命名为“质粒G82”，然后在LB培养基内培养含有质粒G82的宿主大肠杆菌2000ml，制备该重组质粒。质粒的大量制备，采用常规的碱裂解法，参照《分子克隆-第3版》中质粒的碱裂解制备法进行，采用聚乙二醇(PEG-8000)法进行质粒纯化。

纯化后的质粒制品溶于生理盐水内，经检测，纯化质粒外观为水样澄明液体，无肉眼可见杂质及沉淀，紫外分光光度检测，纯度为97％，浓度为1.25mg/ml，质粒总量为14.0mg。

实施例10表达siRNA的质粒L339的制备

委托宝生物(大连)公司合成以下两条DNA链，退火后双链两端分别为BamHI和HindIII位点：

L339T：5’-GATCCGAGTGAGATGCAGAGAGCTTTCAAGAGAAGCTCTCTGCATCTCACTCTTTTTTGGAAA

L339B：5’-AGCTTTTCCAAAAAAGAGTGAGATGCAGAGAGCTTCTCTTGAAAGCTCTCTGCATCTCACTCG

以Ambion公司的pSilencer2.0-U6为载体，将退火后的双链克隆入载体的BamHI和HindIII位点之间。经序列测定为正确插入，命名为“质粒L339”，然后在LB培养基内培养含有质粒L339的宿主大肠杆菌2000ml，制备该重组质粒。质粒的大量制备，采用常规的碱裂解法，参照《分子克隆-第3版》中质粒的碱裂解制备法进行，采用聚乙二醇(PEG-8000)法进行质粒纯化。

纯化后的质粒制品溶于生理盐水内，经检测，纯化质粒外观为水样澄明液体，无肉眼可见杂质及沉淀，紫外分光光度检测，纯度为98％，浓度为1.5mg/ml，质粒总量为14.3mg。

实施例11表达siRNA的重组腺病毒N10的制备

按人5型腺病毒重组病毒构建的常规策略进行，具体步骤参考Invitrogen公司重组病毒系统的操作说明。首先以限制性内切酶酶切质粒N10，以DNA回收试剂盒回收其中EcoRI和HindIII位点间的siRNA表达盒，克隆入中间载体pAdTrack-CMV质粒中外源表达盒位置，不保留原质粒中的CMV启动子等调控元件，重组中间载体分别命名为pAdTrack-N10。pAdTrack-N10再与腺病毒全基因组质粒pAdEasy-1在宿主菌BJ5183内进行同源重组，获得包含siRNA表达盒的重组腺病毒基因组。该基因组以磷酸钙共沉淀法介导转染293细胞，获得重组病毒，命名为“病毒N10”，并在293细胞系上大量制备。病毒液外观澄清透明，呈现细胞培养基特有的淡粉色，无肉眼可见的杂质或沉淀，经检测，病毒滴度为10^9.5pfu/ml，总量2000ml，超速离心进行重组腺病毒的浓缩，浓缩后病毒重悬于PBS内，即为注射应用制剂。该制剂不水样液，外观澄清透明，无肉眼可见的沉淀，经检测，重组病毒滴度为10^12.8pfu/ml，病毒液总量为700ml。

实施例12表达siRNA的重组腺病毒M23的制备

按人5型腺病毒重组病毒构建的常规策略进行，具体步骤参考Invitrogen公司重组病毒系统的操作说明。首先以限制性内切酶酶切质粒M23，以DNA回收试剂盒回收其中EcoRI和HindIII位点间的siRNA表达盒，克隆入中间载体pAdTrack-CMV质粒中外源表达盒位置，不保留原质粒中的CMV启动子等调控元件，重组中间载体分别命名为pAdTrack-M23。pAdTrack-M23再与腺病毒全基因组质粒pAdEasy-1在宿主菌BJ5183内进行同源重组，获得包含siRNA表达盒的重组腺病毒基因组。该基因组以磷酸钙共沉淀法介导转染293细胞，获得重组病毒，命名为“病毒M23”，并在293细胞系上大量制备。病毒液外观澄清透明，呈现细胞培养基特有的淡粉色，无肉眼可见的杂质或沉淀，经检测，病毒滴度为10^9.5pfu/ml，总量2000ml，超速离心进行重组腺病毒的浓缩，浓缩后病毒重悬于PBS内，即为注射应用制剂。该制剂不水样液，外观澄清透明，无肉眼可见的沉淀，经检测，重组病毒滴度为10^12.8pfu/ml，病毒液总量为700ml。

实施例13表达siRNA的重组腺病毒G69的制备

按人5型腺病毒重组病毒构建的常规策略进行，具体步骤参考Invitrogen公司重组病毒系统的操作说明。首先以限制性内切酶酶切质粒G69，以DNA回收试剂盒回收其中EcoRI和HindIII位点间的siRNA表达盒，克隆入中间载体pAdTrack-CMV质粒中外源表达盒位置，不保留原质粒中的CMV启动子等调控元件，重组中间载体分别命名为pAdTrack-G69。pAdTrack-G69再与腺病毒全基因组质粒pAdEasy-1在宿主菌BJ5183内进行同源重组，获得包含siRNA表达盒的重组腺病毒基因组。该基因组以磷酸钙共沉淀法介导转染293细胞，获得重组病毒，命名为“病毒G69”，并在293细胞系上大量制备。病毒液外观澄清透明，呈现细胞培养基特有的淡粉色，无肉眼可见的杂质或沉淀，经检测，病毒滴度为10^9.5pfu/ml，总量2000ml，超速离心进行重组腺病毒的浓缩，浓缩后病毒重悬于PBS内，即为注射应用制剂。该制剂不水样液，外观澄清透明，无肉眼可见的沉淀，经检测，重组病毒滴度为10^12.8pfu/ml，病毒液总量为700ml。

实施例14表达siRNA的重组腺病毒G82的制备

按人5型腺病毒重组病毒构建的常规策略进行，具体步骤参考Invitrogen公司重组病毒系统的操作说明。首先以限制性内切酶酶切质粒G82，以DNA回收试剂盒回收其中EcoRI和HindIII位点间的siRNA表达盒，克隆入中间载体pAdTrack-CMV质粒中外源表达盒位置，不保留原质粒中的CMV启动子等调控元件，重组中间载体分别命名为pAdTrack-G82。pAdTrack-G82再与腺病毒全基因组质粒pAdEasy-1在宿主菌BJ5183内进行同源重组，获得包含siRNA表达盒的重组腺病毒基因组。该基因组以磷酸钙共沉淀法介导转染293细胞，获得重组病毒，命名为“病毒G82”，并在293细胞系上大量制备。病毒液外观澄清透明，呈现细胞培养基特有的淡粉色，无肉眼可见的杂质或沉淀，经检测，病毒滴度为10^9.5pfu/ml，总量2000ml，超速离心进行重组腺病毒的浓缩，浓缩后病毒重悬于PBS内，即为注射应用制剂。该制剂不水样液，外观澄清透明，无肉眼可见的沉淀，经检测，重组病毒滴度为10^12.8pfu/ml，病毒液总量为700ml。

实施例15表达siRNA的重组腺病毒L339的制备

按人5型腺病毒重组病毒构建的常规策略进行，具体步骤参考Invitrogen公司重组病毒系统的操作说明。首先以限制性内切酶酶切质粒L339，以DNA回收试剂盒回收其中EcoRI和HindIII位点间的siRNA表达盒，克隆入中间载体pAdTrack-CMV质粒中外源表达盒位置，不保留原质粒中的CMV启动子等调控元件，重组中间载体分别命名为pAdTrack-L339。pAdTrack-L339再与腺病毒全基因组质粒pAdEasy-1在宿主菌BJ5183内进行同源重组，获得包含siRNA表达盒的重组腺病毒基因组。该基因组以磷酸钙共沉淀法介导转染293细胞，获得重组病毒，命名为“病毒L339”，并在293细胞系上大量制备。病毒液外观澄清透明，呈现细胞培养基特有的淡粉色，无肉眼可见的杂质或沉淀，经检测，病毒滴度为10^9.5pfu/ml，总量2000ml，超速离心进行重组腺病毒的浓缩，浓缩后病毒重悬于PBS内，即为注射应用制剂。该制剂不水样液，外观澄清透明，无肉眼可见的沉淀，经检测，重组病毒滴度为10^12.8pfu/ml，病毒液总量为700ml。