核受体配体结合区蛋白融合表达在噬菌体表面的方法

摘要

本发明公开了一种噬菌体，由衣壳和位于衣壳内的噬菌体核酸构成，所述噬菌体的衣壳表面融合有外源的核受体或核受体的配体结合区。本发明的噬菌体能够用于筛选与核受体或核受体的配体结合区结合的物质，具有筛选灵敏度高和筛选效率高的特点，只需很低的蛋白表达量即可进行筛选。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种衣壳表面融合有外源的核受体或核受体LBD蛋白的噬菌体以及将所述核受体或核受体LBD蛋白融合表达在噬菌体表面的方法。

背景技术

噬菌体表面展示技术自从其建立以后，被广泛用于蛋白质结构和功能研究。外源蛋白、随机肽段、cDNA或基因组片断通过与噬菌体外壳基因融合表达而展示在噬菌体表面，组成蛋白库或多肽库。理论上，通过生物“淘洗”(biopanning)过程可以用来筛选与目标蛋白、受体、细胞表面受体及化学小分子(药物)有相互作用的蛋白或多肽。该技术主要应用于以下各方面：1.筛选特异结合的抗体，或者通过结合筛选技术改造抗体，提高抗体的亲和力和结合的特异性；2.研究蛋白-蛋白的相互作用，用来确定受体或配体的结合蛋白或多肽；3.确定功能决定簇或抗体决定簇；4.酶或蛋白的定向进化等。但以往的噬菌体展示表达的蛋白质都属于可溶性类的蛋白质，尚未涉及难于可溶性表达的外源蛋白。目前为止，尚无难溶性蛋白展示表达在噬菌体衣壳表面的相关报导。

核受体(nuclear receptor)是一类转录因子超家族，通过对已经发现的家族成员cDNA和所编码的氨基酸的序列比较发现，它们之间结构相似，在进化上相当保守，核受体与配体结合后被激活，作用于其目标基因的特定应答元件HRE(hormone respond sequence)上，从而介导特定的基因转录。

核受体在结构上有着共同的特征，一般包括A～F 6个功能区：A/B区含有一个配体非依赖的转录活化区称为AF-1(Activation Function-1)，通过和辅活化因子、辅阻遏因子等其他转录因子的相互作用而调控目的基因；C区是最保守的DNA结合区(DNA binding domain，DBD)，各种核受体DBD之间的同源性达到90％以上，由两个锌指结构构成，介导受体与靶基因结合；D区是铰链区，连接DNA结合区和配体结合区；E区为配体结合区(Ligand Binding Domain，LBD)，是由约250个氨基酸构成的长疏水区，含有一个核定位区和一个受体依赖的转录活化区(AF-2)，相对较大。不同的核受体LBD之间的同源性约为15％，虽然同源性小于DNA结合区，但根据已解析的LBD空间结构数据，所有核受体LBD的三维结构大体相同，都由12个α螺旋组成，且都具有结合配体、受体二聚体化和结合辅助因子的功能。此外F区位于核受体的羧基端。过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome Proliferators-Activated Receptors，PPARs)属于核受体家族成员，在细胞的能量代谢、细胞增殖与分化、炎症反应中起重要作用。PPARs在哺乳动物中有三种亚型：α、β、γ。与其他核受体超家族成员一样，PPAR也同样由六个结构区(A-F)构成。PPAR与其配基结合后，与另一个激活的核受体维甲酸受体(retinoid X receptor，RXR)形成异二聚体，结合于靶基因上特异性的PPAR反应元件PPRE(Peroxisome Proliferator Response Elements)，从而启动靶基因的转录。

曲格列酮(troglitazone)通过激活核受体家族中PPARγ受体，抑制TNF-a信号转导作用，能有效地增强胰岛素敏感性，是第一个作为II型糖尿病治疗药被FDA批准的噻唑烷二酮类化合物，但该药因肝脏毒性等不良反应而撤出市场。吡格列酮(pioglitazone)和罗格列酮(rosiglitazone)是目前已批准上市的用于治疗II型糖尿病的该类药物，它们也可有效地降低胰岛素拮抗，但是，此类药物同样也存在严重的不良反应，如导致体重增加，可能加重心力衰竭患者的病情等。

因此，研究和筛选核受体配体对于开发更好的治疗糖尿病、肥胖等代谢性疾病的药物具有十分重要的意义。传统的基于受体与配基亲和分析而建立的小分子化合物体外筛选分子模型的技术和方法，都需要获得足够量的可溶的纯化蛋白，并且需要分离鉴定结合的配基或蛋白。但是，对于如核受体或核受体配体结合区(LBD)这种可溶性差的蛋白质，这两个问题成为发展药物筛选分子模型的巨大障碍。

尽管目前人们试图采用各种方法来筛选核受体的小分子配体，但是由于核受体的配体结合区(LBD)是一种难溶性的蛋白质且很难获得足够量的可溶的纯化蛋白，仍然难于建立一个非常有效的筛选分子模型。因此，现有技术中迫切需要开发一种方法，获得能用于筛选核受体或其配体的重组蛋白，以满足配体筛选对蛋白质纯度和溶解性的要求，以便早日找到更好的治疗糖尿病、肥胖等代谢性疾病的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种衣壳表面融合有外源的核受体或核受体配体结合区的噬菌体。

本发明的目的还在于提供所述衣壳表面融合有外源的核受体或核受体配体结合区的噬菌体的用途。

本发明的目的还在于提供利用所述表面融合有外源的核受体或核受体配体结合区的噬菌体进行核受体配体筛选的方法。

在本发明的第一方面，提供一种噬菌体，由衣壳和位于衣壳内的噬菌体核酸构成，所述噬菌体的衣壳表面融合有外源的核受体或核受体的配体结合区。

在本发明的一个优选例中，所述的噬菌体的衣壳蛋白pD上融合有外源的核受体或核受体的配体结合区。

在另一优选例中，所述的核受体或核受体配体结合区是一类分布于胞浆或核内的配体依赖性的转录因子，通过结合于靶基因的反应元件而影响基因转录；所述的核受体或核受体配体结合区通常由N端的配体非依赖的转录活化区、保守的锌指结构构成的DNA结合区、绞链区、相对保守的含有核定位区和配体依赖转录活化区的配体结合区构成；N端的转录活化区和DNA结合区与C端的配体结合区在空间结构上相对独立。

在本发明的一个优选例中，所述的核受体选自下组：①类固醇激素受体；②甲状腺素受体；③孤儿核受体。

在另一优选例中，固醇激素受体家族的核受体包括但不限于：糖皮质激素(GR)、盐皮质激素(MR)、雄激素受体(AR)、雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)。

在另一优选例中，甲状腺素受体家族的核受体包括但不限于：甲状腺素受体(TR)、维甲酸受体(RAR)和维生素D受体(VDR)。

在另一优选例中，所述的孤儿核受体是指未发现其相应生理配体的核受体，包括但不限于：RXRs、LXRs、FXRs、PPARs、COUP-TFs、ERRs、HNFs等亚家族。

在另一优选例中，所述的PPARs包括但不限于：PPARα、PPARβ、PPARγ，更优选的，所述的PPARs为PPARγ。

在另一优选例中，所述的噬菌体衣壳由头部和尾部构成，所述的核受体或核受体的配体结合区位于衣壳头部。

在另一优选例中，所述的核受体结合区是PPARγ的配体结合区(LBD)。

在本发明的一个优选例中，所述的噬菌体选自下组：λ噬菌体，T7噬菌体，T4噬菌体，丝状噬菌体M13、fd和f1。

在另一优选例中，所述的噬菌体是烈性噬菌体，如λ，T7，T4噬菌体。

在另一优选例中，所述噬菌体为λ噬菌体，更优选的，所述的噬菌体为含有衣壳蛋白pD的λ噬菌体。

在本发明的一个优选例中，所述的噬菌体核酸编码噬菌体衣壳蛋白以及外源的核受体或核受体的配体结合区。

在本发明的第二方面，提供所述的噬菌体的用途，用于筛选与核受体或核受体的配体结合区结合的物质。

在另一优选例中，所述的与核受体或核受体的配体结合区结合的物质选自下组：配体、抗体、多肽或小分子化合物。

在本发明的第三方面，提供一种筛选与核受体或核受体的配体结合区结合的物质的方法，包括步骤：

(a)将候选物质分别与第一噬菌体和第二噬菌体接触，其中所述的第一噬菌体是前面所述的衣壳上融合有核受体或核受体的配体结合区的噬菌体，所述的第二噬菌体是在衣壳表面上不存在融合的外源核受体或核受体的配体结合区的与所述的噬菌体同一种类的噬菌体；

(b)观察候选物质与第一噬菌体和第二噬菌体的结合情况，

其中，结合于第一噬菌体但不结合于第二噬菌体的候选物质就是与核受体或核受体的配体结合区结合的物质。

在本发明的一个优选例中，所述的与核受体或核受体的配体结合区结合的物质选自配体、抗体、多肽或小分子化合物。

在另一优选例中，步骤(b)中通过以下方法观察候选物质与第一噬菌体和第二噬菌体的结合：噬菌体和候选物质结合后，通过竞争洗脱回收噬菌体或通过直接侵染宿主菌测定结合的噬菌体滴度。

在本发明的第四方面，提供一种核酸分子，它含有以下元件：启动子、操纵子、复制位点、筛选标记位点、噬菌体外壳蛋白编码区、噬菌体外源蛋白编码区；并且，所述的噬菌体外源蛋白编码区编码外源的核受体或核受体的配体结合区。

在另一优选例中，在噬菌体外源蛋白编码区和噬菌体外壳蛋白编码区上游存在启动子(tac promoter)、操纵子(lac operator)，以及质粒扩增所需的复制位点和抗生素筛选标记(Ampicillin)等。

在另一优选例中，所述的噬菌体外壳蛋白编码区编码噬菌体的衣壳蛋白。

在另一优选例中，所述的噬菌体外源蛋白编码区与pD蛋白的编码区相连。

在本发明的一个优选例中，还提供了一种融合蛋白，包括第一部分和第二部分，其中第一部分为噬菌体的衣壳蛋白pD；第二部分为所述的核受体或核受体的配体结合区。

在另一优选例中，所述的核受体或核受体的配体结合区为PPARγ或PPARγ的配体结合区(PPARγ LBD)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了pCGMT-LBD、p171-LBD、pET-hPPGLBD质粒构建模式图。

图2显示了克隆在p171Bio3上的PPARγLBD片断的PCR扩增产物电泳图谱，其中，control表示空白对照。

图3显示了质粒p171Bio3和新构建的质粒p171-LBD的EcoRI酶切图谱。

图4显示了IPTG诱导PPARγLBD在宿主菌BL21(DE3)中的蛋白电泳图谱。S表示裂解液上清，P表示裂解液离心沉淀。蛋白主要以包涵体形式存在，且占菌体超声破碎后沉淀物90％以上。

图5显示了融合蛋白LBD-gp3和pD-LBD表达的Western blot分析。

图6显示了Western blot显示部分pD-LBD融合蛋白以可溶形式表达宿主菌细胞质中。

图7A显示了抗PPAR LBD抗体分析显示PPAR LBD组装进入λ噬菌体中；图7B显示了抗pD抗体分析显示PPAR LBD组装进入λ噬菌体中。

图8显示了λp171-LBD噬菌体能结合于抗PPARγLBD抗体包被的酶标板孔，说明PPARγLBD展示表达在λ噬菌体表面。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究和试验，发现可将难溶性的核受体或其配体结合区展示在噬菌体的衣壳表面，从而率先获得了衣壳上融合有核受体配体结合区的噬菌体。所述的噬菌体可用于筛选与核受体或其配体结合区相结合的物质。

本发明人在研究之初，面临着核受体蛋白难于可溶表达、噬菌体展示表达难溶蛋白尚无任何现有技术报道以资借鉴和噬菌体展示对外源蛋白组装大小有所限制的困难，经过长期的研究和反复的试验，解决了展示表达的部位确定、外源蛋白局部表达组装和溶解性增强等问题。在试验过程中，本发明人选择核受体配体结合区作为优先展示表达，并优选适合大分子蛋白展示表达的丝状噬菌体外壳蛋白gp3和λ噬菌体外壳蛋白pD作为载体蛋白，通过比较表达的外源重组蛋白的溶解性，发现λ等裂解性噬菌体更加适合难溶性核受体的展示表达，从而将难溶性的核受体或其配体结合区展示在噬菌体的衣壳表面，获得了融合表达在噬菌体外壳的核受体或核受体配体结合区重组蛋白。所述融合表达在噬菌体表面的重组蛋白可用于筛选与核受体或其配体结合区相结合的物质。

如本发明所用，所述的“核受体”蛋白是指一类具有共同的结构特点的、同源性较高的调控因子蛋白。所述核受体蛋白与糖尿病、肥胖等代谢性疾病的致病机制密切相关，因此是一种有用的药物靶点。

如本发明所用，所述的“核受体的配体结合区”是指存在于核受体的一个结构区域，具有结合核受体的配体的能力。所有核受体LBD的三维结构大体相同，都由12个α螺旋组成，且都具有结合配体、受体二聚体化和结合辅助因子的功能。在本发明的优选例中，选择了属于核受体家族的(特别是PPARγ的配体结合区)作为示范例，由于结构上的相似性，其它核受体家族的成员(或是它们的配体结合区)也能够被展示表达在所述的噬菌体的表面。

如本发明所用，所述的“与核受体或核受体的配体结合区结合的物质”包括任何与核受体或核受体的配体结合区结合的物质，包括但不限于：配体、抗体、多肽或小分子化合物等。

应理解，在实施例或实验材料和方法中所显示的成分用量、反应条件等数字或是本申请说明书内容所使用的数字均为大约数值。因此，除非文中特别注明，本说明书的上述数字参数均为近似值，其可根据欲求得的本发明结果而加以变化。并且，这些参数并非用来限定与本发明申请专利范围均等的原理，而是应用正常操作技术下所得到的较佳数据。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅做示范之用。

本发明的主要优点在于：

(1)将核受体或其配体结合区展示表达在噬菌体的衣壳表面，从而构建了衣壳上融合有核受体或其配体结合区的噬菌体。

(2)核受体或其配体结合区可被展示表达在噬菌体表面，可直接利用噬菌体的侵染宿主菌能力作为筛选核受体与其它物质结合情况的检测指标。并且，采用本发明的噬菌体进行与核受体或其配体结合区相结合的物质筛选，具有筛选灵敏度高和筛选效率高的特点，只需很低的蛋白表达量即可进行筛选。

(3)将核受体或其配体结合区与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，能够增进表达的融合蛋白的可溶性，克服了由于核受体或其配体结合区因属于难溶性蛋白而很难用于筛选其结合物质的问题。

I.材料和实验方法

本发明具体实施方式中使用到以下的材料和方法，以下所提供的材料和方法并非用于对本发明的限制。

菌株和质粒

大肠杆菌DH5α、BB4来源于Stratagene公司，BL21(DE3)来源于Navogen公司。

DH5α：F^-，φ80d lacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rK^-mK⁺)，phoA，supE44，λ^-，thi-1，gyrA96，relA1

BB4：supF58，supE44，hsdR514，galK2，galT22，trpR55，metB1，tonA，ΔlacU169/F’[proAB+，lacI^q，lacZΔM15Tn10(tet^r)]

BL21(DE3)：F-，ompT，hsdSB(rB- mB-)，gal(λcI857，ind1，Sam7，nin5，lacUV5-T7genel)，dcm(DE3)

人PPARγ2基因克隆自肝cDNA文库(Gnebank号：NM_015869)；pGEX-2T为Amersham Pharmacia公司产品；质粒pET-21a(+)来源于Navogen公司；质粒p171Bio3构建参见文献(Santi E，Capone S，Mennuni C，Lahm A，Tramontano A，Luzzago A，Nicosia A：Bacteriophage lambda display of complex cDNA libraries：a newapproach to functional genomics.J.Mol.Biol.2000，296：497-508.)；pCGMT噬菌粒构建参见文献(Gao C，Lin CH，Lo CH，Mao S，Wirsching P，Lerner RA，Janda KD：Making chemistry selectable by linking it to infectivity.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1997，94：11777-11782)；溶源性噬菌体λD1180(λDam15 b538 cIts857 nin5 Sam100)制备参照文献(Eguchi A，Akuta T，Okuyama H，Senda T，Yokoi H，Inokuchi H，Fujita S，Hayakawa T，Takeda K，Hasegawa M，Nakanishi M：Protein transduction domain ofHIV-1 Tat protein promotes efficient delivery of DNA into mammalian cells.J.Biol.Chem.2001，276：26204-26210)。

酶和化学试剂

实验过程中所需化学试剂和生化试剂均购自上海华舜生物工程有限公司，为Amresco产品。动物免疫所需佐剂为Sigma产品；Western blot的PVDF膜(Immobilon-P)为Millipore公司产品；HRP-羊抗鼠IgG为Calbiochem公司产品。

各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA分子量标准购自TaKaRa生物工程有限公司；用于PCR的dNTP、pfu DNA聚合酶购自上海申能博彩生物技术公司，PCR引物合成和序列测定由上海申能博彩生物技术公司完成。

主要仪器设备

PTC-150 PCR仪(美国MJ公司)；低温高速离心机TL-100(美国Beckman公司)；振荡培养摇床(上海琪特分析仪器有限公司)；电热恒温培养箱(上海上海精律实验设备有限公司)；JY-882超声波细胞粉碎机(上海新芝生物技术研究所)；DY-A电泳仪(上海西巴斯生物技术开发有限公司)；DY-24D小型电泳槽；DY-1转移电泳槽(江苏省兴化市分析仪器厂)。

培养基和缓冲溶液

细菌培养和噬菌体滴度测定所需培养基配置参照分子克隆实验指南(SambrookJ.，Russell DW：分子克隆：实验室指南，Cold Spring Harbor，NY.：Cold Spring HarborLaboratory Press；2001.)；实验过程中所需TE、PBS缓冲溶液，SDS-PAGE电泳相关溶液，Western blot检测相关溶液，以及其他所需溶液的配置参照分子克隆实验指南。

主要实验方法

常规的PCR、酶切、连接，感受态细胞的制备、质粒转化和提取等操作参照分子克隆实验指南(Sambrook J.，Russell DW：分子克隆：实验室指南，Cold SpringHarbor，NY.：Cold Spring Harbor Laboratory Press；2001.)。

一.重组质粒构建与验证

1.PPARγLBD片断的PCR扩增

以PPARγLBD的cDNA(GenBank登录号NM_015869)为模板，利用PPLBD_Fwd1和PPLBD_Rev1两个引物进行PCR扩增，扩增PPARγLBD片断，与质粒pET-21a(+)连接，所得重组质粒命名为pET-hPPGLBD。利用PPLBD_Fwd2和PPLBD_Rev2为引物进行PCR扩增，所得PPARγLBD的PCR片断与质粒p171Bio3连接，所得重组质粒命名为p171-LBD。

其中，引物PPLBD_Fwd1：5’-AGGGATCCGTGGGGATGTCTCATAATGC-3’(BamHI)；引物PPLBD_Rev1：5’-ACGCGTCGACGTACAAGTCC TTGTAGAT-3’(SalI)；引物PPLBD_Fwd2：5’-AGACTAGTGTGGGGATGTCTCATAATGC-3’(SpeI)；引物PPLBD_Rev2：5’-TGTTGCGGCCGCTACAAGTCCTTGTAGATC-3’(NotI)。并且，上述引物序列中下划线所指为括号中所示酶切位点。

2.PCR扩增片断与噬菌体载体的连接、转化与验证

通过PCR引物在PCR片断的两端引入了不同的酶切位点，PCR产物双酶切后与同样双酶切的载体质粒连接，转化宿主菌感受态细胞，具体方法参照分子克隆实验指南。挑选平皿上长出的克隆，接种于3ml LB培养基中，37℃培养过夜后，用试剂盒提取质粒，酶切验证。经酶切验证连接正确的重组子于-70℃保存。

二.外源蛋白质在大肠杆菌中的表达与分析

转化含外源蛋白质粒的宿主菌，于50ml LB(氨苄青霉素60μg/ml，0.1％葡萄糖)，37℃振荡至OD₆₀₀约为0.4～0.5，加入IPTG至终浓度为1mM诱导外源蛋白表达，30℃振荡培养8小时。

8000rpm离心10分钟收集IPTG诱导后的菌体，悬浮于超声缓冲溶液中(50mMTris pH8.0，150mM NaCl，1mM EDTA)，冰浴下超声破碎细胞，4℃10000rpm离心15分钟，分离超声波破碎物中的可溶部分和沉淀物。

离心后的各组分经过10％SDS-PAGE变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。溴酚蓝电泳至分离较底部时，电泳完成后取出凝胶，冷却条件下500mA恒流转移2小时，将蛋白转移到PVDF印迹膜上。

电泳转移完成后，取出PVDF膜，封闭液(2％BSA，TBS)封闭过夜，TBST缓冲液(TBS，0.05％Tween 20)室温下漂洗3次，每次10分钟；用抗-LBD(制备方法见下)或抗-pD血清(制备方法见下)(封闭液1∶1000稀释)作为一抗，37℃轻摇温浴1小时；重复漂洗三次，每次10分钟；加入HRP-羊抗鼠IgG二抗(封闭液1∶5000稀释)，37℃轻摇温浴1小时；重复漂洗步骤后，加入HRP底物反应液室温下显色，待显色适度时大量水冲洗终止显色，ddH₂O水漂洗后阴干保存，贮藏于4℃。

三.多克隆抗体抗-LBD和抗-pD的制备

转化有质粒pET-hPPGLBD的大肠杆菌BL21(DE3)利用IPTG诱导PPARγLBD表达，超声波裂解，PPARγLBD蛋白主要以不溶的包涵体存在，可通过离心分离出PPARγLBD蛋白。转化质粒p171Bio3的大肠杆菌BB4用IPTG诱导pD蛋白表达，菌体超声波裂解物利用SDS-PAGE胶分离，电泳完成后切割pD蛋白条带所在凝胶，于-70℃室温反复冻融分离出pD蛋白。

利用纯化的PPARγLBD蛋白和pD蛋白分别免疫小鼠。总共免疫五次，从小鼠眼角取血，收集血清。测定效价后，分装后于-70℃保存。抗体免疫方法和效价测定参照分子克隆实验指南。

四.外源蛋白在噬菌体表面的展示表达与分析

在本发明的优选例中，将核受体或其配体结合区融合于λ噬菌体的衣壳上，具体的展示表达与分析步骤如下：

1.溶源菌BB4(λD1180)的制备

原噬菌体λD1180(λDam15 b538 cIts857 nin5 Sam100)构建和制备前述的参考文献(Eguchi A，Akuta T，Okuyama H，Senda T，Yokoi H，Inokuchi H，Fujita S，Hayakawa T，Takeda K，Hasegawa M，Nakanishi M：Protein transduction domain ofHIV-1 Tat protein promotes efficient delivery of DNA into mammalian cells.J.Biol.Chem.2001，276：26204-26210)。获得的λD1180噬菌体稀释10⁴倍，取1μl与200μl新鲜的对数期大肠杆菌BB4混合，30℃静置30分钟后，用接种针取少量菌液在平板上划线，32℃培养。次日用牙签挑取单克隆，分别接种于两个平板上，并一一对应。一个平板置于32℃，另一个平板置于42℃培养12小时，挑选32℃生长42℃不生长的菌落，即为整合有原噬菌体λD1180的BB4溶源菌，称为BB4(λD1180)。

2.溶源菌BB4(λD1180)感受态的制备与转化

BB4(λD1180)感受态的制备与其它菌株相似，但菌体生长、培养温度为32℃。质粒p171Bio3、重组质粒p171-LBD转化BB4(λD1180)感受态，转化过程与其它细菌转化过程类似，但冰浴后不用42℃热激，直接加入LB液体培养基于32℃复苏。涂板后于32℃培养。

3.λ噬菌体扩增和滴度测定

λ噬菌体的培养、扩增和滴度(噬菌斑形成单位pfu，plaque forming unit)测定参考分子克隆实验指南。

4.λ噬菌体结合分析

鼠抗PPARγLBD多抗(抗-LBD血清，制备方法见上)用包被液稀释100倍后包被酶标板孔，每孔100μl，共6孔。同时无免疫的小鼠血清也同样用包被液稀释100倍作为对照，加入3个酶标板孔中，4℃包被过夜。次日每孔加入200μl封闭液PBST(2％BSA，0.05％Tween-20)37℃封闭2小时。然后在抗-LBD包被的三个孔中加入1×10⁸λp171Bio3噬菌体，而另外三个孔中加入同样数量的λpD-LBD噬菌体(pD蛋白上融合有LBD的λ噬菌体)，同时在无抗体小鼠血清包被的孔中也加入1×10⁸λpD-LBD噬菌体，37℃温浴1小时。去除噬菌体溶液，酶标板每孔用200μl清洗液(PBS，0.05％Tween-20，10mM MgSO₄)清洗三次，最后用PBS溶液清洗一次(10mM MgSO₄)。然后加入对数期细菌BB4，37℃温浴30分钟。利用上述λ噬菌体滴度测定方法确定结合在酶标板孔中的噬菌体数目。所得结果进行统计学分析，利用t检验(student’s paired t test)确定两组数据之间有无显著的差异性，当p＜0.05时认为两者之间存在统计学上的显著差异性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

II.具体实施例

实施例1

外源蛋白PPARγLBD表达质粒的构建

质粒构建的示意图见图1。质粒p171Bio3包含有编码λ噬菌体头部衣壳蛋白pD的基因，PPARγLBD的PCR扩增片断连接在pD蛋白基因的3’端。利用引物PPLBD_Fwd2和PPLBD_Rev2，扩增出PPARγLBD片断，基因片断约为900bp。琼脂糖电泳显示PCR产物片段的大小与预期相吻合(图2)，构建的质粒为p171-LBD。p171-LBD质粒用EcoRI酶切验证，酶切片断和大小与预期相吻合(图3)，说明外源蛋白PPARγLBD基因片断连接进入了质粒p171Bio3中

利用引物PPLBD_Fwd1和PPLBD_Rev1扩增的PPARγLBD，通过BamHI和SalI酶切位点与质粒pET-21a(+)连接，构建的质粒为pET-hPPGLBD。同样扩增的PCR片断与pCGMT连接，构建的质粒为pCGMT-LBD。

实施例2

PPARγLBD在大肠杆菌中的表达及抗-LBD和抗pD多克隆抗体的制备

pET-hPPGLBD质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后，IPTG诱导PPARγLBD表达，超声破碎处理后的菌液上清(S)和沉淀(P)进行SDS-PAGE分析，结果如图4中所示，菌体裂解液沉淀中在分子量约31kDa处有显著的蛋白条带(第4道)，而在上清裂解液中的相应位置可溶性的重组蛋白量比较少(第3道)，说明PPARγLBD在大肠杆菌中主要以不溶性的包涵体形式表达。PPARγLBD在整个包涵体蛋白中达到了95％以上，离心分离包涵体蛋白用于免疫小鼠。

p171Bio3载体质粒转化BB4后，IPTG诱导质粒上的pD蛋白基因表达，SDS-PAGE电泳分离后，割胶后反复冻融回收pD蛋白，抽提到的蛋白用于免疫小鼠。

利用纯化获得的PPARγLBD和pD蛋白多次免疫小鼠后，分别获得的抗-LBD和抗pD多克隆抗体血清利用间接ELISA法测定效价后，备用。

实施例3

λ噬菌体展示系统比丝状噬菌体gp3系统更适合于PPARγLBD蛋白的展示表达

PPARγLBD分别融合表达在噬菌粒pCGMT编码的的gp3蛋白N末端和质粒p171Bio3编码的pD蛋白C末端，IPTG诱导后分别表达融合蛋白LBD-gp3(55kDa)和pD-LBD(46kDa)。菌体经IPTG诱导蛋白表达后利用超声波破碎。超声波裂解物进行SDS-PAGE电泳，利用抗LBD多克隆抗体进行Western blot检测(图5)。图中T、S、P分别代表融合蛋白菌体总蛋白、菌体裂解液上清和菌体裂解液沉淀中的蛋白。可见可溶性的gp3-LBD融合蛋白主要分布在沉淀中，以不溶的包涵体的形式存在。而相同条件下诱导的pD-LBD融合蛋白同时存在于超声波裂解物的上清和沉淀中，有一部分的pD-LBD蛋白以可溶的形式存在。因为可溶性的外源蛋白有利于其组装展示到噬菌体颗粒中。

因此从此可以看出，λ噬菌体展示系统比丝状噬菌体gp3系统更适合于PPARγLBD蛋白的展示表达。

实施例4

部分与pD蛋白融合的PPARγLBD以可溶形式表达在宿主菌细胞质中

进一步地对pD-LBD融合蛋白在宿主菌中诱导和非诱导条件下的表达情况进行Western blot分析。

结果见图6，显示作为空白对照的载体p171Bio3转化菌在诱导和非诱导条件下都无pD-LBD蛋白的表达。而转化重组质粒p171-LBD的细菌克隆在非诱导条件下，在46kDa处有新生蛋白pD-LBD可溶性表达(第6道)，而在裂解沉淀中相应位置无条带出现(第7道)。IPTG诱导后，pD-LBD融合蛋白的表达量在裂解液上清中显著增加(第8道)，同时由于pD蛋白提高外源蛋白的溶解性是有限的，随着IPTG诱导后大量pD-LBD融合蛋白的表达，融合蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在于宿主菌细胞质中(第9道)。其中可溶性的pD-LBD约占其总表达量的30％。这结果进一步说明了pD蛋白可以在一定程度上促进与其融合的蛋白保持溶解状态，虽然大部分表达的融合蛋白是仍以包涵体形式存在(第9道)，但这小部分保持溶解状态的融合蛋白足够用于噬菌体的展示。图中S、P分别代表菌体裂解液上清和菌体裂解液沉淀中的蛋白。

实施例5

PPARγ能组装进入λ噬菌体衣壳蛋白中

载体p171Bio3和p171-LBD分别转化溶源菌BB4(λD1180)，热诱导λ噬菌体裂解组装和释放，PEG沉淀所得的λp171Bio3和λp171-LBD SDS-PAGE电泳后转移到PVDF膜上，利用抗LBD多克隆抗体(图7A)和抗pD多克隆抗体(图7B)检测。图7A中，λp171-LBD在46kDa处出现一条明显条带，而在作为对照的λp171Bio3处无对应条带，这条带的蛋白应该是组装到λ噬菌体中的pD-LBD。进一步用抗λ噬菌体外壳蛋白pD的抗体检测，λp171-LBD除在46kDa处的pD-LBD蛋白条带外，另外在11kDa处还出现一条pD蛋白(图7B)，其来源于溶源在宿主菌BB4中的原噬菌体λD1180基因组中的gpD基因编码的pD蛋白。

pD蛋白和pD-LBD融合蛋白两者的比值反应了外源蛋白PPARγLBD组装进入λ噬菌体的能力。通常每个野生型λ噬菌体含有405个拷贝的pD蛋白，通过对图7B中两条带的扫描定量分析，可以得出pD-LBD与pD的比值约为0.4，因此融合有外源蛋白的pD的数量占总共pD数量的28％，从而可以计算出大概每个λ噬菌体组装有115个PPARγLBD分子。

实施例6

融合表达在λp171-LBD噬菌体上PPARγLBD的能被抗LBD抗体识别并捕获

通过组装有PPARγLBD的噬菌体与其抗体之间的相互作用，确定外源蛋白组装到λ噬菌体中的位置。利用抗PPARγLBD包被酶标板孔，分别与λp171Bio3和λp171-LBD噬菌体结合，并同时以无抗体的小鼠血清包被的酶标板孔作为对照(图8)。在抗LBD包被的酶标板孔中捕获的λp171-LBD数量是捕获的λp171Bio3数量的四倍，统计学分析说明两者之间具有显著差异(P＜0.01)。两者的差异来源于λp171-LBD中组装了PPARγLBD蛋白，说明抗LBD血清与PPARγLBD蛋白存在强烈的结合。同时无抗体小鼠血清包被的酶标板孔捕获λp171-LBD的量显著下降(P＜0.01)，说明抗LBD血清与PPARγLBD蛋白存在的强烈结合主要来自抗体血清中的抗LBD抗体与PPARγLBD融合蛋白之间。

λp171-LBD能被抗体捕获说明PPARγLBD表达在λ噬菌体表面。同时也说明了组装在λ噬菌体中的PPARγLBD是展示表达在λ噬菌体的外表面，并且保持了能被抗体识别并结合的结构特征。

实施例7

用组装于λ噬菌体表面的PPARγLBD进行基于展示表达重组蛋白定性定量检测的应用

第一噬菌体：衣壳表面组装有PPARγLBD的λ噬菌体。

第二噬菌体：衣壳表面不组装有PPARγLBD的λ噬菌体。

将候选物质分别与上述的第一噬菌体和第二噬菌体接触，观察候选物质与第一噬菌体和第二噬菌体的结合情况。

分别分析候选物质与第一和第二噬菌体的结合结果，如果一种候选物质能够结合于第一噬菌体但不结合于第二噬菌体的，其就是与核受体或核受体的配体结合区结合的物质。

讨论

(1)可溶性差的外源蛋白与pD融合表达后蛋白的溶解度有所改善

大肠杆菌因其操作方便和易于培养等优点，使之仍然是主要的蛋白表达体系，但真核蛋白在大肠杆菌中表达时，往往形成不可溶的蛋白质包涵体，它是蛋白在表达过程中非正确折叠而形成的蛋白质中间产物。蛋白功能研究并不能直接利用包涵体来进行，通常的办法是先将分离到的包涵体蛋白进行复性，但蛋白复性并无一定的规律可循，因此蛋白复性在当前的技术条件下还有很大的困难。另外一种绕过蛋白复性问题的方法是，通过减少蛋白表达过程中包涵体产生，提高蛋白溶解度来实现的。通常的方法是通过优化蛋白表达条件或者与能提高溶解度的蛋白融合表达来提高蛋白的溶解度，如谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-Transferase，GST)、麦芽糖结合蛋白(Maltose Binding Protein，MBP)、硫氧化还原蛋白(Thioredoxin，Trx)等。

核受体以及核受体的配体结合区(如PPARγLBD)由于含有与疏水性小分子配体结合的界面，其整体的疏水性氨基酸的含量较高，因此表达过程中更易于形成包涵体，本发明人的试验结果也证实了这一点，PPARγLBD在大肠杆菌中表达时，大部分表达的蛋白都是以不溶性的形式存在于细菌中。即使是在融合GST蛋白后，PPARγLBD的溶解性并没有很大的提高。而λ噬菌体衣壳蛋白pD与PPARγLBD融合后，能显著提高后者的溶解性，说明利用pD蛋白是一种较好选择。

(2)蛋白保持溶解性是组装到噬菌体中的前提

噬菌体展示技术虽然无需蛋白的纯化，但外源蛋白在宿主菌中表达时保持一定的溶解性，这也是外源蛋白得以展示表达到噬菌体表面的前提。虽然并不需要外源蛋白全部都保持可溶状态，但是至少需要一部分能可溶性表达。已有研究表明提高外源蛋白的可溶性，包括与促溶的蛋白融合表达或者共表达蛋白伴侣分子，可以提高外源蛋白组装到噬菌体表面的效率。从这点上来看，选择pD蛋白作为载体蛋白，适合于那些容易在表达过程中形成不可溶性包涵体蛋白的展示表达。

(3)蛋白大小限制在λ噬菌体展示系统中不是主要限制因素

本发明人的结果显示较大的外源蛋白可以在噬菌体表面展示表达。其它的报道也显示，大分子量的蛋白，如β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶、蛋白毒素能高拷贝地组装到λ噬菌体中，这些结果说明λ噬菌体对于其所展示的蛋白大小限制相对比较宽。因此利用λ噬菌体展示系统是比较适合展示大分子量蛋白。

(4)λ噬菌体展示系统是多价展示系统

λ噬菌体是一个多价展示系统，比较适合于筛选亲和力较小的配基。对于高亲和力配基的筛选，可以选择广泛应用的单价的丝状噬菌体gp3系统，也可以通过调节启动子来调控融合有外源蛋白的pD蛋白的表达，通过改变野生型pD蛋白和融合的pD的分子数量的比值，从而达到调控组装到λ噬菌体中外源蛋白的价数。

(5)其它核受体或核受体配体结合区同样可以展示表达在噬菌体表面

其它核受体在结构上非常类似，配体结合区大小都在250个氨基酸左右，相差不大，并且由于都是与脂溶性的配体结合，因此具有强疏水性，在大肠杆菌中表达时都易于形成不溶性的包涵体。对于外源蛋白在噬菌体表面的展示表达，主要的限制来源于外源蛋白的溶解性限制和分子大小限制，根据本发明的实施例，PPARγLBD可以展示表达在噬菌体表面，因此可以推断，对于其它类似的核受体或核受体结合区同样也可以展示表达在噬菌体表面。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。