一种治疗和预防心脑血管疾病的药物刺五加叶提取物及制备方法

摘要

本发明涉及一种治疗和预防心脑血管疾病的药物刺五加叶提取物及制备方法，属于中药领域。该刺五加叶提取物由槲皮素、槲皮苷、芦丁、金丝桃苷、绿原酸、二咖啡酰奎宁酸组成。本发明对刺五加叶中的有效成分进行分离提取，使得发明所得到产品有效成分明确，以金丝桃苷计，该提取物中酚性成分含量不低于50％。经过药理试验证实：刺五加叶酚性成分提取物能明显延长小鼠凝血时间，降低脑血管通透性，脑梗死面积，以及血小板黏附率。在预防或治疗心脑血管方面有着明确的疗效和作用，毒副作用小，使用安全等特点。

说明书

技术领域

本发明属于中药领域，涉及一种治疗和预防心脑血管疾病的药物刺五加叶提取物及制备方法。

技术背景

心脑血管类疾病是危害人类健康的三大疑难疾病之一，其发病率及死亡率在某些国家已上升到第1位。因此研制心血管类药物是广大医药工作者面临的重大课题之一。目前开发成功的很多心血管类药物，虽然治疗效果较好，但是由于药物本身的毒副作用太强，导致临床应用受到限制。因此，目前心血管类药物的研究重点，是寻找毒副作用小的预防和治疗药物。

刺五加是五加属五加科植物，为长白山地区特产中药材之一，长期以全草及茎为原料。由于刺五加的生长周期较长，必将导致药用资源的匮乏。近年来的研究表明，刺五加叶中含有丰富的具有广泛药理活性的黄酮、有机酸(统称为酚性成分)和皂甙类化合物，可以进一步开发利用。并且将叶子作为药材，具有保护药用资源，环境友好的特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种治疗和预防心脑血管疾病的药物刺五加叶提取物及制备方法。

一种治疗和预防心脑血管疾病的药物刺五加叶提取物，它由槲皮素、槲皮苷、芦丁、金丝桃苷、绿原酸、二咖啡酰奎宁酸组成，其成分结构式如下：

式中，R为OH是槲皮素(MW＝302)，

R为是槲皮苷(MW＝448)，

R为是金丝桃苷(MW＝464)，

R为是芦丁(MW＝610)：

绿原酸(MW＝354)的结构式为：

二咖啡酰奎宁酸(MW＝516)的结构式为：

一种治疗和预防心脑血管疾病的药物刺五加叶提取物的制备方法，其步骤和条件为：

将刺五加叶经除杂，碎断，置提取罐中，加40％-95％乙醇(v/v)回流提取三次，每次1-3小时，每次加乙醇的体积量L∶五加叶重量kg为6-12∶1，滤过，合并滤液，浓缩，取上清液过滤，上已处理好的聚酰胺柱上，以水洗脱至流出液近无色，再以10％-30％乙醇(v/v)洗脱至流出液淡黄色，弃去上述洗脱液，再以40％-70％乙醇(v/v)洗脱，收集洗脱液至流出液淡黄色，回收乙醇并浓缩，喷雾干燥，即得本发明的一种治疗和预防心脑血管疾病的药物刺五加叶提取物。

取50mg刺五加叶提取物，精确称取，置于50ml容量瓶中，加乙醇定容后即为酚性成分含量测定用样品，取金丝桃苷标准品溶液(0.2mg/ml)0μl-50μl及25μl样品溶液分别置于25ml容量瓶中，分别加入5％亚硝酸钠1.0ml，摇匀，静止5min，加入10％硝酸铝溶液1ml，，摇匀，放置5min，再加入4％氢氧化钠溶液5ml，加70％乙醇至刻度，放置15min，在490-510nm波长下首先测定标准溶液的吸收，作标准工作曲线，然后根据标准曲线测得样品中酚性成分的含量。

本发明的制备方法得到的刺五加叶提取物，利用分光光度法测定，以金丝桃苷计，酚性成分含量不低于50％。利用负离子电喷雾质谱分析，在质荷比(m/z)50-800的范围内，存在m/z515(二咖啡酰基奎宁酸及其异构体，分子量为516)，m/z463(金丝桃苷及其异构体、分子量为464)，m/z447(槲皮苷，分子量为448)，m/z609(芦丁，分子量为610)、m/z353(绿原酸，分子量为354)，m/z301(槲皮素，分子量为302)及等主要离子峰(见图1)。

本发明的制备方法得到的刺五加叶提取物，可以用现有的中药制备技术和工艺方法制成包括胶囊剂、片剂、散剂、注射剂或丸剂等多种剂型的药物。

用本发明的制备方法得到的刺五加叶提取物制成的药物，可以以口服或注射途径给药。注射给药可以为静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射；口服制剂可以为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、滴丸、软胶囊、悬浮液、溶液、糖浆；注射用制剂可以为冻干粉针、注射用静脉乳剂、注射液、输液。口服制剂优选为软胶囊、滴丸、片剂、胶囊剂、颗粒剂；注射用制剂优选冻干粉针、注射液、输液。

本发明经过中试实践，并制定了质量标准和生产工艺，取得了满意的效果。

本发明对刺五加叶中的有效分进行分离提取，使得发明所得到产品有效成分明确，以金丝桃苷计，该提取物中酚性成分含量不低于50％。经过药理试验证实：刺五加叶酚性成分提取物能明显延长小鼠凝血时间，降低脑血管通透性，脑梗死面积，以及血小板黏附率。在预防或治疗心脑血管方面有着明确的疗效和作用，毒副作用小，使用安全等特点。

附图说明

图1是刺五加叶提取物的负离子电喷雾质谱图。图中，仪器条件：喷雾电压4.5kV，金属毛细管温度200℃。

具体实施方式

实施例1：

将刺五加叶经除杂，碎断，置提取罐中，加40％乙醇回流提取三次，每次3小时，每次每次加乙醇的体积量L∶刺五加叶重量kg为6∶1，滤过，合并滤液，浓缩，取上清液通过板框过滤机滤过，上已处理好的聚酰胺柱上，以水洗脱至流出液近无色，再以10％乙醇(v/v)洗脱至流出液淡黄色，弃去上述洗脱液，再以50％乙醇(v/v)洗脱，收集洗脱液至流出液淡黄色，回收乙醇并浓缩，喷雾干燥，即得本发明的一种治疗和预防心脑血管疾病的药物刺五加叶提取物。以金丝桃苷计，酚性成分含量为58.6％。

实施例2：

将刺五加叶经除杂，予碎断，置提取罐中，加50％乙醇(v/v)回流提取三次，每次2小时，每次加乙醇的体积量L∶刺五加叶重量kg为11∶1，滤过，合并滤液，浓缩，取上清液通过板框过滤机滤过，上已处理好的聚酰胺柱上，以水洗脱至流出液近无色，再以20％乙醇(v/v)洗脱至流出液淡黄色，弃去上述洗脱液，再以60％乙醇(v/v)洗脱，收集洗脱液至流出液淡黄色，回收乙醇并浓缩，喷雾干燥，即得本发明的一种治疗和预防心脑血管疾病的药物刺五加叶提取物。以金丝桃苷计，酚性成分含量为61.3％。

实施例3：

将刺五加叶经除杂，碎断，置提取罐中，加80％乙醇(v/v)回流提取三次，每次1小时，每次加乙醇的体积量L∶刺五加叶重量kg为12∶1，滤过，合并滤液，浓缩，取上清液通过板框过滤机滤过，上已处理好的聚酰胺柱上，以水洗脱至流出液近无色，再以30％乙醇(v/v)洗脱至流出液淡黄色，弃去上述洗脱液，再以70％乙醇(v/v)洗脱，收集洗脱液至流出液淡黄色，回收乙醇并浓缩，喷雾干燥，即得本发明的一种治疗和预防心脑血管疾病的药物刺五加叶提取物物。以金丝桃苷计，酚性成分含量为65.1％。

实施例4：

将刺五加叶经除杂，碎断，置提取罐中，加60％乙醇(v/v)回流提取三次，每次1.5小时，每次加乙醇的体积量L∶刺五加叶重量kg为9∶1，滤过，合并滤液，浓缩，取上清液通过板框过滤机滤过，上已处理好的大孔树脂DM130柱上，以水洗脱至流出液近无色，弃去上述洗脱液，再以50％乙醇(v/v)洗脱，收集洗脱液至流出液淡黄色，回收乙醇并浓缩，喷雾干燥，即得本发明的一种治疗和预防心脑血管疾病的药物刺五加叶提取物。以金丝桃苷计，酚性成分含量为58.1％。

实施例5：

将刺五加叶经除杂，碎断，置提取罐中，加70％乙醇(v/v)回流提取三次，每次2.5小时，每次加乙醇的体积量L∶刺五加叶重量kg为10∶1，滤过，合并滤液，浓缩，取上清液通过板框过滤机滤过，上已处理好的聚酰胺柱上，以水洗脱至流出液近无色，再以10％，30％乙醇(v/v)洗脱至流出液淡黄色，弃去上述洗脱液，再以55％乙醇(v/v)洗脱，收集洗脱液至流出液淡黄色，回收乙醇并浓缩，喷雾干燥，即得本发明的一种治疗和预防心脑血管疾病的药物刺五加叶提取物。以金丝桃苷计，酚性成分含量为82.1％。

实施例6：

刺五加叶经除杂，碎断，置提取罐中，加95％乙醇(v/v)回流提取2次，每次3小时，每次加乙醇的体积量L∶刺五加叶重量kg为6∶1，滤过，合并滤液，浓缩，取上清液通过板框过滤机滤过，上已处理好的聚酰胺柱上，以水洗脱至流出液近无色，再以25％乙醇(v/v)洗脱至流出液淡黄色，弃去上述洗脱液，再以70％乙醇(v/v)洗脱，收集洗脱液至流出液淡黄色，回收乙醇并浓缩，喷雾干燥，即得本发明的一种治疗和预防心脑血管疾病的药物刺五加叶提取物。以金丝桃苷计，酚性成分含量为75.2％。

药效实例

药效试验例1：刺五加叶提取物对大鼠不完全性脑缺血的影响

方法：将70只大鼠随机分为正常对照组、脑缺血模型组及刺五加叶提取物小、中、大剂量组，正常对照组每组10只，其余每组12只。刺五加叶提取物小、中、大剂量组，分别舌下静脉注射刺五加叶提取物7、14、28mg/kg，阳性对照组舌下注射刺五加注射液90mg/kg(相当于临床日用药500mg/70kg的2倍)，正常对照组及脑缺血模型组注射同体积的生理盐水，连续给药3天，于第3天制作不完全性脑缺血模型：水合氯醛0.4g/kg腹腔注射麻醉大鼠，分离双侧颈总动脉，在结扎颈总动脉前10min给药，在结扎颈总动脉前5分钟舌下注射伊文思兰50mg/kg，正常对照组不结扎。颈总动脉结扎3小时后，断头取脑、称重，将脑浸泡于甲酰胺溶液中，在45℃恒温箱中温育72小时，取浸泡液用722-2型分光光度计进行比色，根据标准曲线算出脑内伊文思兰含量，以微克/克脑湿重表示。

结果：与正常对照组比较，脑缺血模型组脑组织伊文思兰渗出量显著升高(p＜0.01＝；与脑缺血模型组比较，刺五加叶叶提取物7、14、28mg/kg组脑组织伊文思兰渗出量显著降低(p＜0.05或p＜0.01＝，提示刺五加叶叶提取物可明显降低脑血管通透性，阳性对照组脑组织伊文思兰渗出量显著降低(p＜0.05)，结果见表1。

表1.刺五加叶提取物对不完全性脑缺血大鼠脑血管通透性的影响(x±s)

  组别  剂量(mg/kg)  动物数伊文思兰含量(μg/g)  正常对照组  脑缺血模型组  刺五加注射液组  刺五加叶提取物  刺五加叶提取物  刺五加叶提取物    —    —    90    7    14    28    10    10    10    10    10    10    4.71±0.69^**    5.97±0.61    5.44±0.52^*    5.21±0.65^*    5.04±0.85^*    5.01±0.59^**

与脑缺血模型组比较^*p＜0.05，^**p＜0.01

药效试验例2：刺五加叶提取物对小鼠断头完全性脑缺血的影响

试验方法  将60只小鼠随机分为正常对照组、阳性对照组及刺五加叶提取物小、中及大剂量组，每组12只。阳性对照组给注射用刺五加注射液130mg/kg(相当于临床日用药500mg/70kg的2倍)，刺五加叶总黄酮小、中及大剂量组给刺五加叶提取物10、20、40mg/kg，正常对照组给同体积的生理盐水，尾静脉给药，连续给药3天，于第3天药后10min，利用快速断头方法制作完全性脑缺血模型。记录小鼠从断头至喘息停止的时间及喘息次数。断头同时用毛细血管法及玻片法测定凝血时间。

试验结果  与正常对照组比较，刺五加叶提取物10、20、40mg/kg小鼠断头后的喘息时间明显增加(p＜0.05或p＜0.01)，小鼠断头后的喘息次数明显增加(p＜0.05或p＜0.01)；刺五加叶提取物20、40mg/kg组小鼠凝血时间明显延长(玻片法与毛细血管法)(p＜0.05或p＜0.01)阳性对照组小鼠断头后喘息时间明显延长(p＜0.05)，喘息次数显著增加(p＜0.01)，小鼠凝血时间(玻片法与毛细血管法)明显延长(p＜0.05)，见表2、3。

表2.刺五加叶提取物对小鼠断头完全性脑缺血的影响(n＝12，x±s)

组别剂量(mg/kg)    喘息时间    喘息次数正常对照组刺五加注射液组刺五加叶提取物刺五加叶提取物刺五加叶提取物    —    130    10    20    40  18.41±1.65  20.79±2.11^*  20.46±2.05^*  20.77±1.69^**  20.84±1.64^**    12.77±1.12    14.89±1.98^**    14.67±2.50^*    14.84±2.38^*    15.26±1.81^**

与正常对照组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01

表3.刺五加叶提取物对小鼠断头完全性脑缺血凝血时间影响(n＝12，x±s)

  组别  剂量(mg/kg)    毛细血管法(秒)    玻片法(秒)  正常对照组  刺五加注射液组  刺五加叶提取物  刺五加叶提取物  刺五加叶提取物    —    130    10    20    40    264.80±42.93    300.30±21.44^*    273.00±37.56    304.70±32.58^*    308.50±36.51^*    243.10±39.38    284.00±39.08^*    261.30±41.03    290.60±47.18^*    299.80±39.74^**

与正常对照组比较，^*p＜0.05，^*p＜0.01

药效试验例3：刺五加叶提取物对大鼠局部性脑缺血的影响

试验方法水合氯醛0.4g/kg腹腔注射麻醉大鼠，按文献方法制作局部性脑缺血模型[4、5]：将大鼠仰位固定，沿颈中作约2cm长皮肤切口，分离出右侧颈总动脉后，分离、结扎颈外动脉，在已分离的颈总动脉近心端用动脉夹阻断血流，将一端加热成圆珠状(直径0.3～0.35mm)尼龙线棒插入颈总动脉，经颈内动脉推入至前脑动脉(自颈内、外动脉分叉处算起20mm)，再往回拉约2mm，使尼龙线棒的圆球塞在大脑中动脉口，取下动脉夹，缝合肌肉与皮肤。将72大鼠随机分为正常对照组、脑缺血模型组、阳性对照组及刺五加叶提取物小、中及大剂量组，正常对照组每组10只，其余每组12只。术后立即给药，连续给药4天。刺五加叶提取物小、中及大剂量组分别舌下静脉注射刺五加叶提取物7、14、28mg/kg，阳性对照组注射刺五加注射液90mg/kg(相当于临床日用药500mg/70kg的2倍)，正常对照组及模型组注射同体积的生理盐水。手术96小时后断头，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，冠状切4刀，共5片，用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色，采用图象分析系统测定脑梗死面积占切片总面积的百分比，然后将脑片于福尔马林中固定7天后做病理。在取脑前，腹主动脉取血测定血小板黏附率。按文献方法测定血小板黏附率[2]，取血2.7ml置于含有3.13％枸橼酸钠溶液0.3ml的硅化试管中，轻轻混匀，随后取1.5ml抗凝血加入容量为12ml的球形玻璃瓶中，将球形瓶固定在血小板黏附仪的转动装置上，以3转/min的速度转15min，使血液与瓶壁充分接触，旋转后从球形瓶(黏附后)中及试管(黏附前)中各取1ml血液分别加入到盛有3.13％枸橼酸钠溶液19ml的大试管中，反复倾倒3次，使其均匀，在室温下静止2h，取试管上清液体进行血小板计数，计算血小板黏附率。血小板黏附率＝[(黏附前血小板数-黏附后血小板数)/黏附前血小板数]×100％。

试验结果  与正常对照组比较，脑缺血模型组脑梗死面积明显增大(p＜0.01)，血小板黏附率明显增高(p＜0.05)；与脑缺血模型组比较，刺五加叶提取物7、14、28mg/kg组脑梗死面积明显降低(p＜0.05或p＜0.01)，血小板黏附率明显降低(p＜0.05或p＜0.01)，作用呈剂量相关性；阳性对照组脑梗死面积明显缩小(p＜0.01)，血小板黏附率明显降低(p＜0.05)。

表4.刺五加叶提取物对局限性脑缺血大鼠脑梗死面积及血小板黏附率的影响(x±s)

组别剂量(mg/kg)    n    梗死面积百分比  血小板黏附率正常对照组脑缺血模型刺五加注射液刺五加叶提取物刺五加叶提取物刺五加叶提取物    —    —    90    7    14    28    10    11    11    12    11    11    0.0005±0.0003^**    0.0725±0.0204    0.0414±0.0258^**    0.0473±0.0188^*    0.0353±0.0179^**    0.0299±0.0187^**  45.20±10.93^*  59.05±4.64  50.63±10.06^*  51.03±7.84^*  48.38±6.43^**  48.72±7.48^**

与脑缺血模型组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01