人食管癌细胞ezrin基因上游转录调控元件

摘要

本发明涉及基因表达调控，公开了一种人食管癌细胞ezrin基因的上游转录调控区。本发明首次将ezrin基因上游序列插入含报告基因的载体构建了一系列真核表达质粒，转染哺乳动物细胞瞬时表达，确定了人ezrin基因上游序列在食管癌细胞中的重要转录调控元件，包括负调控元件和增强子序列。本发明对研究Ezrin在肿瘤细胞中的表达调控机制以及以Ezrin为靶点的临床治疗具有重要意义。将有助于从分子水平上探索食管癌的发病机制，为食管癌的防治提供新的理论依据。

说明书

技术领域

本发明涉及基因表达调控，具体地说，涉及人食管癌细胞ezrin基因上游的转录调控元件。

背景技术

食管癌是我国常见恶性肿瘤，其发病机制尚不明确。我们最近的研究结果显示，ezrin基因是食管癌侵袭转移相关基因之一。eznn基因又称VIL2，定位于染色体6q25.2～q26，人类ezrin基因DNA长度约为24kb，含13个外显子，cDNA长度为1761bp，其表达产物Ezrin蛋白是ERM(ezrin-radixin-moesin)家族成员之一，主要参与细胞中细胞骨架与胞膜之间的连接，具有维持细胞形态和运动、连接黏附分子及调节信号转导等功能。越来越多的证据表明Ezrin调控肿瘤发展。转移与非转移肿瘤细胞系及组织样品中基因表达的对比结果显示，来自啮齿动物乳腺、人胰腺和结肠的癌转移细胞中Ezrin的表达显著提高；同时，Ezrin在多种人类肿瘤中强烈表达，这些肿瘤包括骨肉瘤、黑色素瘤、星细胞瘤、胰腺癌、肺癌、子宫内膜癌等；进一步的研究显示抑制Ezrin蛋白能消除鼠科动物横纹肌肉瘤和骨肉瘤细胞，Ezrin很可能是恶性肿瘤的关键调节分子。目前的研究主要集中在Ezrin蛋白的功能、细胞中与Ezrin蛋白相互作用的分子及其作用机制，而关于ezrin基因的上游转录表达调控机制的研究，尚未见报道。

在真核生物中，一个典型的基因，其上游是一段核心启动子的DNA序列，包括距转录起始位点约-40到+50范围内的DNA序列，核心启动子结合RNA聚合酶II(Pol II)及其辅助因子(基本转录机构)，定位转录起始位点并控制转录方向，对细胞内相邻近的或远距离的激活因子和抑制因子作出应答。多数情况下，核心启动子并不直接调节转录。紧靠核心启动子的上游是一段调控性启动子，它是位于核心启动子周围、转录起始位点几百个碱基对以内的DNA区域。位于基因上游或下游或位于内含子中、距离转录起始位点较远的一段调控区域是增强子序列或负调控元件。序列特异性DNA结合蛋白与调控性启动子、增强子和负调控元件的结合控制着转录机制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人食管癌细胞ezrin基因上游转录调控区，确定人ezrin基因的增强子和负调控元件。

本发明的另一个目的在于提供含有上述基因转录调控元件的载体。

本发明的进一步目的在于提供含有上述载体的宿主细胞。

为了实现上述目的，本发明利用分子生物学软件对人食管癌细胞ezrin基因翻译起始位点(翻译起始位点ATG位于+135～+137)前的上游序列(-1759～+134)进行了分析，发现这一区域的平均GC含量为70.15％，存在CpG岛和20多个潜在的转录调控元件，提示在人食管癌中ezrin基因表达调控存在多种因素，从中找出关键的转录调控区域或调控元件，对阐明人食管癌细胞中ezrin基因的表达调控机制有重要意义。

本发明中，含有人食管癌细胞ezrin基因上游的序列命名为EZ1.759，其长度为1893bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，保留了ezrin基因上游-1759～+134之间的片段，为翻译起始位点前的一段序列，在SEQ ID NO：1中，+1为转录起始位点。

本发明提供的人食管癌细胞ezrin基因上游负调控元件之一，其长度为212bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，保留了ezrin基因上游-1102～-891之间的片段。

本发明提供的人食管癌细胞ezrin基因另一负调控元件，其长度为329bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，保留了ezrin基因上游-1102～-774之间的片段。

本发明提供的人食管癌细胞ezrin基因上游增强子之一，其长度为117bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，保留了ezrin基因上游-890～-774之间的片段。

本发明提供的人食管癌细胞ezrin基因另一增强子，其长度为77bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，保留了ezrin基因上游-773～-697之间的片段。

为了鉴别ezrin基因的转录调控元件，需要对人ezrin基因上游区域进行缺失分析。在一项缺失分析中，利用嵌套缺失技术，控制外切核酸酶III(ExoIII)的消化时间，使ezrin基因上游从5’端-1759处开始逐渐截短，得到一系列以ezrin基因上游不同长度片段为启动子的真核细胞表达质粒，利用萤火虫荧光素酶报告基因，检测这些质粒在人食管癌细胞EC109中的转录活性。为减少细胞培养微环境所造成的误差，以表达海肾荧光素酶的质粒pRL-TK作为内参照，与上述嵌套缺失质粒同时转染EC109细胞，测定萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的酶活性，用二者的比值，即相对荧光素酶活性表示目的序列的转录活性。结果显示：ezrin基因上游-1324～-696之间的区域是一个重要的转录活性调控区，-146～-32之间的区域是另一个重要的转录活性调控区。

为了进一步鉴别ezrin基因上游-1324～-696区域的转录调控作用，在以ezrin基因上游-1324～+134序列为启动子的真核细胞表达质粒上对-1102～-774之间329bp片段进行删除，结果质粒的相对荧光素酶活性提高，显示-1102～-774片段有抑制转录活性作用，存在转录负调控元件。另外，对-1102～-697区域进行分段PCR扩增，连接至含SV40启动子的质粒上，相对荧光素酶活性检测结果显示，ezrin基因上游-1102～-891和-1102～-774片段有转录抑制作用，-890～-774和-773～-697片段有转录增强作用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明首次鉴定了人食管癌细胞ezrin基因启动子，构建了一系列用于检测ezrin基因上游序列转录调控元件的真核表达质粒，转染哺乳动物细胞瞬时表达，确定了ezrin基因上游序列在人食管癌细胞中的重要转录调控元件。本发明对研究Ezrin在肿瘤细胞中的表达调控机制以及以Ezrin为靶点的临床治疗具有重要意义。将有助于从分子水平上探索食管癌的发病机制，为食管癌的防治提供新的理论依据。

附图说明

图1为以ezrin基因上游序列为启动子的重组质粒构建流程图；

图2为ezrin基因上游序列5’端嵌套缺失质粒的构建流程图；

图3为ezrin基因上游序列5’端嵌套缺失质粒的PCR鉴定结果；

图4为以ezrin基因上游序列为增强子或负调控元件的重组质粒构建流程图；

图5为以ezrin基因上游序列为增强子的重组质粒双酶切鉴定结果；

图6为ezrin基因上游5’端嵌套缺失质粒在EC109细胞中的相对荧光素酶活性分析；

图7为ezrin基因上游删除部分片段的重组质粒在EC109细胞中的相对荧光素酶活性分析；

图8为以ezrin基因上游序列为增强子或负调控元件的重组质粒在EC109细胞中的相对荧光素酶活性分析；

其中，图3中，M1为DNA Marker DL2000；M2为DNA Marker100bp ladder；1～12为嵌套缺失质粒；13为对照质粒pGL3-Basic。

图5中，M1为DNA Marker DL2000；M2为DNA Marker 100bpladder；1为pGL3-Promoter；2为pGLP/-1102～-891；3为pGLP/-890～-774；4为pGLP/-773～-697；5为pGLP/-1102～-774。

图6中，(a)为ezrin基因上游序列(-1759～-32)系列缺失重组质粒(在pGL3-Basic载体上)的模式图；(b)为对应缺失子的相对荧光素酶活性。实验被重复3次，在此显示来自3次实验中有代表性的数据，误差线代表标准差。

图7中，(a)为删除ezrin基因上游部分序列的重组质粒(在pGL3-Basic载体上)的模式图；(b)为对应质粒的相对荧光素酶活性。实验被重复3次，在此显示来自3次实验中有代表性的数据，误差线代表标准差。

图8中，ezrin基因上游序列分段扩增片段构建在载体pGL3-Promoter上，质粒的相对荧光素酶活性测定实验被重复3次，在此显示来自3次实验中有代表性的数据，误差线代表标准差。

具体实施方式

实施例1  含有ezrin基因上游序列的真核表达质粒的构建

1、人ezrin基因上游序列(-1759～+134)的克隆

文献发表的人ezrin基因序列翻译起始位点ATG位于+135～+137，据此设计并合成了用于扩增人ezrin基因翻译起始密码子上游1893bp片段的一对引物F1和R1，所述引物序列如下：

F1：

5’-CGGGGTACC^-1759AGTGAATGCTGTTGCTGCTCGTCTGGAAG-3’(下划线为Kpn I位点)

R1：

5’-CCCAAGC⁺¹³⁴TTTCGGTTTCTGGTGAGTATCCTCGATCCC-3’(下划线为Hind III位点)

应用此对引物，从人食管癌细胞EC109基因组DNA中经PCR扩增出与预期一致的约1.9kb的DNA片段。回收所扩增的目的片段，Kpn I/Hind III双酶切后，与经Kpn I/Hind III双酶切的载体pGL3-Basic(Promega公司)连接。pGL3-Basic为萤火虫荧光素酶报告基因前不含启动子的表达载体。测序结果证明人ezrin基因上游-1759～+134之间的序列已定向克隆至萤火虫荧光素酶基因的上游，该序列命名为EZ1.759，重组质粒命名为pEZ1.759。重组质粒的构建流程如图1所示。

人食管癌细胞ezrin基因上游序列EZ1.759的测序结果见SEQ IDNO：1。与GenBank已知序列比较，核苷酸相同性为99.79％。

2、以pEZ1.759为基础的ezrin基因上游序列5’端嵌套缺失载体的构建

StuI位于ezrin基因上游的-1447处，该内切酶可使DNA形成平滑末端，进一步被外切核酸酶ExoIII降解；Kpn I为载体pGL3-Basic上酶切位点，该内切酶可使DNA形成3’末端突出片段，不被ExoIII降解。将质粒pEZ1.759经StuI/Kpn I双酶切，再经ExoIII酶切。取不同反应时间的酶切后产物，用S1核酸酶切除单链DNA，Klenow补平末端，T4 DNA连接酶使片段自连，连接产物转化大肠杆菌JM109，进行抗性筛选及测序，得到一系列ezrin基因上游序列从5’端逐渐截短的真核表达质粒，重组质粒的构建流程参见图2。由质粒pGL3-Basic的上、下游测序引物RVprimer3和GLprimer2组成一对引物，对重组质粒进行PCR鉴定，结果见图3。所有构建的重组质粒通过测序验证。

3、用于鉴定ezrin基因增强子或负调控元件的重组质粒的构建

限制性内切酶Pst I有两个酶切位点分别位于ezrin基因上游的-1102和-773，质粒pEZ1.324经Pst I酶切，回收大片断，T4 DNA连接酶使片段自连，即得到去除eznn基因上游-1102～-773之间329bp片段的重组质粒pEZ1.324D。所删除的序列见SEQ ID NO：5。

设计引物对ezrin基因上游-1102～-697之间的序列进行分段扩增，将不同长度的扩增片段用BamH I/Sal I双酶切，再与经BamH I/SalI双酶切的载体pGL3-Promoter(Promega公司)连接，构建用于检测ezrin基因增强子或负调控元件的重组质粒(见表1)。pGL3-Promoter为萤火虫荧光素酶报告基因前含SV40启动子的真核表达载体。该重组质粒的整个构建流程如图4所示，重组质粒用BamH I/Sal I进行双酶切鉴定，结果见图5。所述引物序列如下：

F2：(下划线为BamH I位点)

5’-CGCGGATCC^-1102CTGCAGGCGCCGGGTGAGGCGTGC-3’

F3：(下划线为BamH I位点)

5’-CGCGGATCC^-890TCCCCTCAGGTCTCTCCCGAAGGAAACGCG-3’

F4：(下划线为BamH I位点)

5’-CGCGGATCC^-773CTGCAGCCGCGGGGCAACGGTTGCT-3’

R2：(下划线为Sal I位点)

5’-ACGCGTCGAC^-891CCCGGCGCCGAGGGGAAGGTCGC-3’

R3：(下划线为Sal I位点)

5’-ACGCGTCGAC^-774TCACAACCGTCAAGCCTTTGAGAAACTCTTTCAAAAACTGCAACCGC-3’

R4：(下划线为Sal I位点)

5’-ACGCGTCGAC^-697GCTGCCAGGAAGCCCGTGAGAAGCCGAG-3’

表1  以ezrin基因上游序列为增强子或负调控元件的重组质粒的构建

  质粒名称  引物  扩增片段长度  (bp)  片段位置  pGLP/-1102～-891  pGLP/-890～-774  pGLP/-773～-697  pGLP/-1102～-774  F2/R2  F3/R3  F4/R4  F2/R3  212  117  77  329  -1102～-891  -890～-774  -773～-697  -1102～-774

实施例2  细胞培养、DNA转染和人食管癌细胞ezrin基因上游序列活性分析

用QIAprep Spin Miniprep Kit提取需转染的实验质粒、对照质粒pGL3-Basic和内参照质粒pRL-TK，测定其含量和纯度。取上述表达萤火虫荧光素酶的实验质粒和对照质粒用Buffer EB(10mmol/LTris·Cl，pH 8.5)稀释至100ng/μl，表达海肾荧光素酶的内参照质粒pRL-TK用Buffer EB稀释至20ng/μl。将实验质粒与内参照质粒按50∶1混合，即1μg∶20ng(10μl∶1μl)。

人食管癌细胞EC109进行常规传代培养，接种于24孔培养板中，每孔0.5ml。24h后细胞满度达50％～60％时即可用于转染。

转染方法如下：在超净工作台中，取7ml玻璃离心管若干支，做好标记，加入70.5μl含12.5mmol/L HEPES的199基础培养液和4.5μl Fugene6转染试剂(Roche公司)，涡旋1sec，室温下放置5min。再加入相应的质粒混合液16.5μl，空白管中加入16.5μl Buffer EB，涡旋1sec，室温下放置15min。将24孔板做好标记，每个样品设3个平行孔，每孔加入28μl转染液，轻轻摇匀，于37℃ 5％ CO₂培养箱中继续培养48h，收获细胞，进行双荧光素酶报告基因的检测。实验被重复3次。

双荧光素酶报告基因的检测采用Promega公司的Dual-LuciferaseReporter Assay System进行分析。将转染有目的DNA的贴壁细胞用1×PBS洗涤一次，去尽残液，加入100μl新鲜配制的1×PLB，室温下，摇床上剧烈振荡15min以裂解细胞。取20μl上述细胞裂解液加入含100μl LARII溶液的1.5ml离心管中，测定荧火虫荧光素酶活性，再向同一离心管中加入100μl新鲜配制的1×STOP液，测定海肾荧光素酶(内参照)活性，根据TD20/20型照度计配制的软件计算出各组相对荧光强度(萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶)，以此代表相对荧光素酶活性。各组实验数据均计算平均值及标准差，用x±s。应用SPSS14.0统计软件对各组实验数据之间是否有显著性差异进行t检验。

1、ezrin基因上游序列转录调控区的鉴定

ezrin基因上游序列(-1759～-32)从5’端嵌套缺失质粒(在pGL3-Basic载体上)的模式图及对应缺失子的相对荧光素酶活性见图6，组间差异显著性分析见表2。

表2  ezrin基因上游序列5’端嵌套缺失质粒的相对荧光素酶活性

  编号  质粒  相对荧光素酶活性  P值  1  2  3  4  5  6   7  pEZ1.759  pEZ1.324  pEZ0.696  pEZ0.213  pEZ0.146  pEZ0.032   pGL3-Basic  130.8±13.56  152.3±17.97  92.73±12.23  89.54±12.43  82.09±8.411  4.916±1.504   0.254±0.018  0.174(1vs2)  0.009(2vs3)  0.768(3vs4)  0.439(4vs5)  0.282(3vs5)  0.003(5vs6)  

在人食管癌细胞中，ezrin基因翻译起始密码子上游的1893bp序列具有明显的转录活性。质粒pEZ1.759和pEZ1.324组间相对荧光素酶活性差异没有显著性(P＞0.05)，pEZ1.324和pEZ0.696组间相对荧光素酶活性差异有高度显著性(P＜0.01)，pEZ0.696和pEZ0.213组间、pEZ0.696和pEZ0.146组间以及pEZ0.213和pEZ0.146组间相对荧光素酶活性差异均无显著性(P＞0.05)，pEZ0.146和pEZ0.032组间相对荧光素酶活性差异有高度显著性(P＜0.01)。当ezrin基因上游序列从-1759截短至-1324以及从-696截短至-146时，转录活性无明显变化，说明ezrin基因上游在-1759～-1324之间和-696～-146之间的DNA序列对转录活性无明显影响，为非转录活性调控区。当ezrin基因上游序列从-1324截短至-696时，转录活性下降39.1％，但与对照质粒pGL3-Basic相比较转录活性仍然很高，显示在这一区域有影响转录活性的重要转录调控元件，很可能存在ezrin基因增强子序列。当ezrin基因上游序列从-146截短至-32时，转录活性下降94.0％，接近对照质粒pGL3-Basic，说明在这一区域有显著影响转录活性的关键转录调控元件，为ezrin基因调控性启动子区。

2、ezrin基因上游增强子或负调控元件的鉴定

删除ezrin基因上游部分序列的重组质粒(在pGL3-Basic载体上)的模式图及对应的相对荧光素酶活性见图7，组间差异显著性分析见表3。

表3.删除ezrin基因上游部分序列的重组质粒的相对荧光素酶活性

  编号  质粒  相对荧光素酶活性  P值  1  2  3  4  pEZ1.324  pEZ1.324D  pEZ0.890  pEZ0.696  77.13±6.835  93.35±2.519  69.56±6.135  44.43±4.419  0.224(1vs3)  0.018(1vs2)  0.005(3vs4)  0.002(1vs4)

质粒pEZ1.324和pEZ0.890组间相对荧光素酶活性差异没有显著性(P＞0.05)。pEZ1.324和pEZ1.324D组间的相对荧光素酶活性差异有显著性(P＜0.05)，在pEZ1.324基础上删除-1102～-774之间的序列反而使转录活性提高，提示在-1102～-774之间序列可能对转录有负调控作用。pEZ0.890和pEZ0.696组间的相对荧光素酶活性差异有高度显著性(P＜0.01)，删除-890～-697之间序列的使转录活性下降，提示-890～-697之间序列对转录活性有增强作用。

为了进一步分析ezrin基因上游片段-1102～-891、-890～-774、-773～-697和-1102～-774对转录活性的影响，利用PCR方法克隆上述片段，将目的片段连接至质粒pGL3-Promoter上构建重组质粒。重组质粒pGLP/-1102～-891为在质粒pGL3-Promoter上连接有ezrin基因上游片段-1102～-891，其它质粒命名与此类似。利用相对荧光素酶活性来分析这些DNA片段对转录活性的抑制或增强作用。实验结果见图8和表4。

表4  ezrin基因上游序列对转录活性的调控作用

  编号  质粒  相对荧光素酶活性  P值  1  2  3  4  5  pGL3-Promoter  pGLP/-1102～-891  pGLP/-890～-774  pGLP/-773～-697  pGLP/-1102～-774  22.07±0.822  14.68±1.562  24.96±0.820  36.18±1.056  18.84±1.129  0.002(1vs2)  0.013(1vs3)  0.000(1vs4)  0.016(1vs5)

连接有ezrin基因上游片段的质粒(pGLP/-1102～-891，pGLP/-890～-774，pGLP/-773～-697，pGLP/-1102～-774)与对照质粒pGL3-Promoter相比较，组间的相对荧光素酶活性差异有显著性或高度显著性(P＜0.05或P＜0.01)。可以看出，将-1102～-697之间的DNA序列分为3个区段，-1102～-891之间的片段使相对荧光素酶活性降低33.5％，对转录活性有抑制作用；-890～-774之间的片段使相对荧光素酶活性升高13.1％，对转录活性有弱的增强作用；-773～-697之间的片段使相对荧光素酶活性升高63.9％，对转录活性有增强作用。而-1102～-774片段使相对荧光素酶活性降低14.6％，表现出对转录活性的抑制作用，这与前面的实验结果相一致，即质粒pEZ1.324在删除-1102～-774之间的序列时相对荧光素酶活性升高。

综上，可以确定ezrin基因上游-1102～-697之间长406bp的DNA序列为重要的转录活性调控区。-1102～-891之间212bp片段为ezrin基因负调控元件；-890～-774之间117bp片段为ezrin基因弱增强子序列；-773～-697之间77bp片段为ezrin基因增强子序列。

                人食管癌细胞ezrin基因上游转录调控元件序列表

           SEQUENCE LISTING

<110>汕头大学医学院

<120>人食管癌细胞ezrin基因上游转录调控元件

<130>

<160>1

<170>Patent In version 3.2

<210>1

<211>1893

<212>DNA

<213>人食管癌细胞(HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELLS)

<400>1

-1759 AGTGAATGCT GTTGCTGCTC GTCTGGAAGC CAGACGTTGA GAACCCCTTC

-1709 TAGAGTGAGC TCTCCCGCAG CAAATTCTAC TGGCCCCCAA AGTATGTGTT

-1659 TTGTGTGTCT TAAAAATTTG TTGAGAACCA TTAGCAAAAA AACAAACAAA

-1609 AAAACTTAAT TCCTAGAATT CCAGAGAAAT CCCATGGAGC TTTTTGCCAG

-1559 TCACGTCAAG AGAGGCCACA AACGTGCCAC TTAACCAGAG CTTCGGAAAG

-1509 GCGGCGGCTG GGCCGGCCAC GTGCACCGAG ACTCGGGGCC AGGTGCAGCC

-1459 GCCCCAGGGC CGAGGCCTCG GAACTGGCCC CCGGTCCCGG CCCCAAGCGG

-1409 TCCAGCGATT CCCCCAAGCC GTCCGCCCCT CCAGATTTAT TTACGTTTTC

-1359 CTGACTTCCC CCTGCCCGCT GTGGGACAAA CAGCCTCCCC ACTTGCATCT

-1309 GCGAGGGGAG TAGCGCGCAC TTCCGCCAAG TTCCGCCCCC ACCCAGCCCG

-1259 AGGCCCGGCT GCCGCCATCT TGCGGGGGGC GCACCTCACA GGTCGGGAGC

-1209 TGGGCGGGAA GGGGCGTGGT CCCGGGACCC GCCCCGCCGG GGCTTTTGGG

-1159 AGCGCGGGCA GCGAGCGCAC TCGGCGGACG CAAGGGCGGC GGGGAGCACA

-1109 CGGAGCACTG CAGGCGCCGG GTGAGGCGTG CGGCGGCCGG GGTCGGGACG

-1059 GGGGTTCTGG GCGGGGGGTT CCTGGTGGAG GGCCCGGGCG GGCGGCGGGG

-1009 TTCGGCGGCA GGTGCGGCGG GCAGCCTAGG GGGCGCGGCG CGGGGTTCTC

-959  GCCCGGCACC CCCGGGGCAG GTGGAGCTGA GCCGGCCCGC GGCCCCGCGA

-909  CCTTCCCCTC GGCGCCGGGT CCCCTCAGGT CTCTCCCGAA GGAAACGCGG

-859  AGCCTGGGTG CCTGGGCGCC GTCCCTCGGC GGCTCCCGAG CGGTTGCAGT

-809  TTTTGAAAGA GTTTCTCAAA GGCTTGACGG TTGTGACTGC AGCCGCGGGG

-759  CAACGGTTGC TACACAAAGT GAAACTTGCC GAGTGCTCGG CTTCTCACGG

-709  GCTTCCTGGC AGCCCCGGGA AGTTCCTCGG CGGACCCCGA GCCCGCGCCC

-659  CCTCTCCACG GATCCCTCCC CAGCGAGTGC CCCCCCGCCC GCCCTGTGCC

-609  CCCTCTCCCC TGACCCCTCC CTGTCGGGTG CCCCGCGGGC TCGCGCTGGC

-559  TGTCCTGGGA CTCCTTCCTC CTAGGTGTTC CTCCTGCCCC TCGCCCTCTC

-509  TCTCCCAGGC GCGCGCTCCC TCTCCCCGGG CCTTTCCCCG CCGGGTATCC

-459  CTGGGCCCGC GCCCCGTCTT CTCCGCCTCT CTCCGCTGGG TGCACCTCGA

-409  GTGTCCCCCA GACCCCTCCC CGCCCGGCCG GCGCTCTCTC CCCTGACCCT

-359  CCTGGCCGAG TGTTCCCCGG GGCCCGCGCC CCCTCCCCCC GATCCTCCCC

-309  ACTGAGTGTT CCCCCTGCCC TCTCTCTCCC GGGCCTGCGC CCCCCACCAG

-259  CCCCTTCATG CTGGGGGTCC CCTGGGTGCG CACCCCCTCT CCTCGGACCC

-209  ACCCCCAACT GGGGGGCACC TCCAGTGCCC GCCGGCTGCC CCTTGGGCGC

-159  GCGCCCCCGC TCTCGGGCGC CTCCTCGCCG GGGGCCCGGC CCGGCCCCGC

-109  CCCGCCCGTG CCCCCTCCCC ATGCCCGCAG TGCTGGGCGG GGCGCTGACT

-59   CACCCGGGCC CGGGCTGGCC GGTTCTTAAG CGGCAGCGCG CTGCGGGCGC

-9    CGAGTGTCGG GCGCGGCAGG AGGACGAGGC AGGGCGGGCG GGCGCTCTAA

+42   GGGTTCTGCT CTGACTCCAG GTTGGGACAG CGTCTTCGCT GCTGCTGGAT

+92   AGTCGTGTTT TCGGGGATCG AGGATACTCA CCAGAAACCG AAA

<210>2

<211>212

<212>DNA

<213>人食管癌细胞(HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELLS)

<400>2

-1102 CTGCAGGCGC CGGGTGAGGC GTGCGGCGGC CGGGGTCGGG ACGGGGGTTC

-1052 TGGGCGGGGG GTTCCTGGTG GAGGGCCCGG GCGGGCGGCG GGGTTCGGCG

-1002 GCAGGTGCGG CGGGCAGCCT AGGGGGCGCG GCGCGGGGTT CTCGCCCGGC

-952  ACCCCCGGGG CAGGTGGAGC TGAGCCGGCC CGCGGCCCCG CGACCTTCCC

-902  CTCGGCGCCG GG

<210>3

<211>117

<212>DNA

<213>人食管癌细胞(HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELLS)

                人食管癌细胞ezrin基因上游转录调控元件序列表

<400>3

-890 TCCCCTCAGG TCTCTCCCGA AGGAAACGCG GAGCCTGGGT GCCTGGGCGC

-840 CGTCCCTCGG CGGCTCCCGA GCGGTTGCAG TTTTTGAAAG AGTTTCTCAA

-790 AGGCTTGACG GTTGTGA

<210>4

<211>77

<212>DNA

<213>人食管癌细胞(HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELLS)

<400>4

-773 CTGCAGCCGC GGGGCAACGG TTGCTACACA AAGTGAAACT TGCCGAGTGC

-723 TCGGCTTCTC ACGGGCTTCC TGGCAGC

<210>5

<211>329

<212>DNA

<213>人食管癌细胞(HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELLS)

<400>5

-1102 CTGCAGGCGC CGGGTGAGGC GTGCGGCGGC CGGGGTCGGG ACGGGGGTTC

-1052 TGGGCGGGGG GTTCCTGGTG GAGGGCCCGG GCGGGCGGCG GGGTTCGGCG

-1002 GCAGGTGCGG CGGGCAGCCT AGGGGGCGCG GCGCGGGGTT CTCGCCCGGC

-952  ACCCCCGGGG CAGGTGGAGC TGAGCCGGCC CGCGGCCCCG CGACCTTCCC

-902  CTCGGCGCCG GGTCCCCTCA GGTCTCTCCC GAAGGAAACG CGGAGCCTGG

-852  GTGCCTGGGC GCCGTCCCTC GGCGGCTCCC GAGCGGTTGC AGTTTTTGAA

-802  AGAGTTTCTC AAAGGCTTGA CGGTTGTGA

<210>6

<211>

<212>DNA

<213>引物

<400>6

F1：5’-CGGGGTACCAGTGAATGCTGTTGCTGCTCGTCTGGAAG-3’

R1：5’-CCCAAGCTTTCGGTTTCTGGTGAGTATCCTCGATCCC-3’

<210>7

<211>

<212>DNA

<213>引物

<400>7

F2：5’-CGCGGATCCCTGCAGGCGCCGGGTGAGGCGTGC-3’

F3：5’-CGCGGATCCTCCCCTCAGGTCTCTCCCGAAGGAAACGCG-3’

F4：5’-CGCGGATCCCTGCAGCCGCGGGGCAACGGTTGCT-3’

R2：5’-ACGCGTCGACCCCGGCGCCGAGGGGAAGGTCGC-3’

R3：5’-ACGCGTCGACTCACAACCGTCAAGCCTTTGAGAAACTCTTTCAAAAACTGCAACCGC-3’

R4：5’-ACGCGTCGACGCTGCCAGGAAGCCCGTGAGAAGCCGAG-3’