包括北枳椇提取物,三丫乌药提取物,或其本草混合物提取物的组合物

摘要

本发明涉及一种组合物，其包括北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物作为有效成分。本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物对于改善肝功能高度有效，因为它能够降低作为主要的肝功能指标的GOT，GPT，ALP，BUN和总胆红素的水平。ALP和BUN还被用作肾功能指标，所以本发明的提取物导致的ALP和BUN水平的降低说明本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物还能够改善肾功能。本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物还能够降低肝中羟基脯氨酸的量但提高肾中羟基脯氨酸的量，提示上述提取物具有极佳的抗纤维变性和肾保护作用。此外，本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物能够降低肝和肾组织中脂质过氧化作用的指标丙二醛的水平，提示所述提取物具有极佳的抗氧化作用。本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物促进肝和肾细胞系中的细胞生存力，说明所述提取物具有极佳的肝和肾细胞保护作用。因此，本发明的组合物不仅能够有效地用于抗氧化和抗纤维变性，还能够用于保护和改善肝和肾功能。

说明书

【技术领域】

本发明涉及包括北枳椇(Hovenia dulcis Thunb)提取物，三丫乌药(Lindera obtusiloba)提取物或其本草混合物提取物作为有效成分的组合物。

【背景领域】

作为代表性的成人疾病之一，肝病由压力导致的慢性疲劳和大多数外源物质所导致的肝损伤造成。与外国相比，在韩国肝病的发展率非常高，并且特别地，肝癌的死亡率是世界上最高的，慢性肝病的死亡率居于第三。按照韩国国家统计局(National Statistical Office)最近的报道，肝病是导致韩国40岁年龄段的成年人死亡的主要原因。在韩国，许多肝病中最致命的疾病是病毒性肝炎。同时，在西方国家，由肝硬化导致的死亡5～10倍高于由病毒性肝炎导致的死亡。

肝是在许多人器官中显示最活跃代谢的器官。由多种原因诸如脂肪性饮食，重度酗酒，病毒感染，包括化学品的毒素，营养不足等导致的急性或慢性肝损伤可以形成严重的疾病如脂肪肝、肝炎、黄疸、肝硬化和肝癌。特别地，脂肪性饮食和重度酗酒导致脂肪肝，即脂肪积累在肝组织中。此时，血清中GOT(谷氨酸-草酰乙酸转氨酶)，GPT(谷氨酸-丙酮酸转氨酶)和γ-GTP(γ-谷氨酰转肽酶)增加。由于肝具有巨大的缓冲能力，肝病在早期几乎不显示症状，并且仅当其变得严重时，才显示症状。

肝具有血液的维持和循环、血流的调节和脱毒的功能，并且还已知涉及精神活动。由于工业化，人体暴露于污染和许多毒素，因此肝必须过度工作从而中和毒素。由精神压力导致的肝损伤更加糟糕。如果人的精神得到放松，损伤的肝细胞得以恢复。对于现代居民而言，情况是没有多余的时间用来休息。因此，过度的精神压力，酗烟和酗酒使肝损伤恶化，导致脱毒的功能失常，即免疫系统的功能失常，这可能是另一种疾病的原因。

肝硬化由肝组织的纤维变性所导致的，这是在结缔组织的产生和退化之间失去平衡的疾病。即，结缔组织在肝组织中过度积累，伴随坏死或炎症。肝组织的纤维变性是由结缔组织的过度产生所推进的，这是由于肝星状细胞(HSCs)的生长和转移所导致，所述肝星状细胞以肌成纤维细胞的形式转化而来(Gressner et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.151～222，1988)。肝硬化是每种慢性肝病的最终阶段，通过它肝迅速损失其一般功能，显示为肝血流的减少，肝中血流的减少，代谢酶的功能失常，血液蛋白质的定性和定量的变化，胆汁流出的变化等。

肝脏毒性诱导物例示为四氯化碳(CCl₄)，D-半乳糖胺，脂多糖(LPS)和溴苯，并且特别地，已知四氯化碳通过诱导肝细胞的脂质过氧化作用来诱导肝脏毒性(Recknagel et al.，Pharmacol.Rev.19：145-208，1967；Alpers et al.，Mol.Pharmacol.4：566-573，1968；Slater T.F.，Biochem.J.222：1～15，1994)。四氯化碳是肝脏毒性诱导物，其已经用于研究抗肝脏毒性活性中。更准确地说，已经将其施用于小鼠或大鼠，培养的肝细胞和培养的肝组织以人工诱导肝脏毒性。通过代谢酶如细胞色素P450在内质网中将四氯化碳转化为自由基CCl₃·的高活性分子结构，通过其，它需要非常强的肝脏毒性效应。自由基CCl₃·通过醇氧化在肝中积累的甘油三酯和在膜磷脂上的脂肪酸，导致了脂质的酸化和氧化，随后进行脂质过氧化作用。结果，产生了有机过氧化物。通过这样的脂质过氧化作用，脂肪在肝中积累，蛋白质合成减少，糖原分解，并且血管中的细胞质酶被破坏，导致了肝组织的坏死(Chang I.M.，et al.，Drug and chemicaltoxicology 6，443-453，1983)。自由基还损伤了高尔基体，从而使释放出细胞的蛋白质受到影响，提示不仅肝，肾也有可能受到损伤。

抗氧化不仅抑制或预防了脂质过氧化作用，还具有肝保护和抗炎效果。因此，已经将抗氧化化合物用于针对反应性氧中间体的攻击来保护肝和肝细胞。

已经报道了从天然来源中分离的抗氧化剂诸如黄酮类化合物，栎精，水飞蓟素或维生素E具有对于脂质过氧化作用和肝纤维变性的积极效果。并且，已经证实N-乙酰基半胱氨酸(NAC)通过其抗氧化活性减少了肝纤维变性的早期阶段的氧化压力和肝纤维变性。Picrorhiza Kurroa(胡黄连苷)是另一种天然抗氧化化合物，其通过减少由脂质过氧化作用和自由基导致的损伤具有肝保护和抗纤维变性作用。

到目前为止，将用于肝病的治疗方法主要分成两种方式；一种方式是饮食治疗，另一种方式是药物治疗。在大多数情况中，将两种方法在一起使用。对于药物治疗，根据肝病的起因和类型，使用具有不同功能的各种药物。例如，使用肝细胞复制刺激物和/或肝功能保护诸如熊去氧胆酸，水飞蓟素(Biotech.Therapeutics，4，263-270，1993)，DDB(二苯基二甲基二羧酸盐(酯)；Biochem.Biophy.Res.Comm.，103，1131-1137，1981)，谷胱甘肽，甘草皂苷等，抗病毒药剂诸如阿昔洛韦，和免疫抑制药物诸如皮质类固醇，6-巯基嘌呤(6-MP)，硫唑嘌呤等。然而，肝病不是仅由一个原因而是由许多因素的共同作用所发展的。因此，具有一定功能的一种药物不足以治疗各种肝病。治疗肝病的常规药物通过长期或大量施用具有无法预期的反应和其它副作用的问题。

同时，肾具有调节离子和体液的浓度，在消除毒素后从系统中排出废物(尿，尿酸，肌酐等)和去除毒性物质，药物和代谢物的功能。已知来自组织中脂质过氧化作用的产物，丙二醛(Malonedialdehyde)(MDA)和4-hydroxynonenal(HNE)是细胞损伤的指标。并且已知催化脂质过氧化作用的超氧化物歧化酶涉及从细胞损伤中的恢复(Slater TF.Biochem.J.，222，1-15，1994；Esterbauer H，Schauer RJ，Zollner H.，1994；Free RadicalBiology&Medicine 11，81-128，1992)。此外，还将碱性磷酸酶(ALP)和血尿氮(BUN)用作肾功能的诊断指标。特别地，BUN的增加指示通过氮血肾小球过滤率(GFR)的减少。肾前氮血意味着肾的功能异常，而无肾损伤，这是由于充血性心脏衰竭、休克、低血糖症和出血引起的血流灌注不足所造成的。另一方面，肾后氮血是当尿流在肾的下部被阻断时引起的。在肾后氮血的情形中，预期通过消除起因来达到完全的康复。当氮血伴随各种临床症状和生化疾病时，将其称为尿毒症。因此，尿毒症不仅是单一的生化疾病，还是除了消除疾病(elimination disorders)之外携有代谢疾病、内分泌疾病、胃肠道疾病、神经肌肉疾病和心血管疾病的综合症。由肾的功能异常所导致的疾病例示为急性肾盂肾炎，慢性肾盂肾炎，肾结核，UTI，尿结石，肾细胞癌症等。

北枳椇是一种属于鼠李科的落叶阔叶高大树木，其在中国药物中也被称为‘Jigumok’。在Bon-cho-kang-mok中有关于北枳椇的解释，其味甜并纯净，无毒，使五脏(心、肝、脾、肺和肾)工作稳定和平缓，消除胸腔中的发热，抑制口渴，中和酒精中毒，减缓呕吐，解昆虫毒并可治疗五种类型的痔疮。还已知其具有肝保护效果。准确地说，其具有消除口臭，改善酒精性肝炎、脂肪肝和肝硬化，抗癌，调节血压，降低血糖，肝解毒，和缓解便秘的优良活性。

三丫乌药是一种属于樟科的落叶阔叶高大树木，其广泛分布在韩国、日本、中国和满洲。三丫乌药的花、叶和茎散发出独特的芳香。由于它们的抗菌作用，已经将其茎用于药物目的。将其新鲜的芽用作茶。

在长期研究了具有各种作用机制并且低毒的天然药物化合物后，本发明人通过证实北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物除了保护和改善肾功能的活性，还具有抗氧化、抗纤维变性和改善肝功能的活性而完成了本发明。

【发明内容】

【技术方案】

本发明的一个目标是提供包括北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物作为有效成分的组合物。

【最佳方式】

本发明提供包括北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物作为有效成分的化合物。

本发明的组合物包括抗氧化组合物，抗纤维变性组合物，肝功能改善组合物和肾功能改善组合物。

在下文，将详细描述本发明。

本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物的提取方法如下。

用水洗涤北枳椇或三丫乌药，接着将其在阴暗处干燥。将干燥的北枳椇或三丫乌药置于反射提取器中，向其中加入纯化的水并在100℃加热90分钟，得到了热水提取物。当其仍旧是热的时候，在减压下将热水提取物用滤纸进行过滤。通过使用真空蒸发器来浓缩滤出物。对于长期贮存，通过使用冻干机来干燥溶液。在本发明中，北枳椇或三丫乌药的茎、花、叶和种子都是可用的。

基于每种本草的干重来确定本发明的组合物的本草的组合比率。准确地说，将北枳椇和三丫乌药以3∶2～1∶1的比率混合，更优选地以2∶1～1∶1的比率混合。在考虑每种本草的有效剂量及其副作用下来确定这样的比率，当比率不在上述范围内时，药物效果迅速下降或副作用可能成为问题。

在施用了北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物的组中，都作为肝功能指标的GOT，GPT，ALP，BUN和总胆红素都下降了，说明本发明的提取物具有极佳的肝功能改善作用。同时，不仅将ALP和BUN用作肝功能指标，还将其用作肾功能指标。因此，ALP和BUN的降低的水平说明本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物还具有极佳的肾功能改善效果。

本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物减少了肝组织的羟基脯氨酸的量，但是增加了肾组织中的羟基脯氨酸的量，说明本发明的提取物具有极佳的抗纤维变性和肾保护作用。特别地，提取自北枳椇和三丫乌药的混合物的本草提取物显示比每种单独的提取物更高的效果，即，与每种单独的提取物相比，混合物提取物在肝组织中更多地减少羟基脯氨酸，但是在肾组织中更多地增加羟基脯氨酸。

本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物可以减少作为肝和肾组织中脂质过氧化作用指标的丙二醛的水平，说明本发明的提取物具有极佳的抗氧化作用。

用本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物处理的肝细胞系和肾细胞系显示高细胞生存力，说明本发明的提取物具有极佳的肝细胞和肾细胞保护作用。

因此，本发明的组合物可以有效地用于改善和保护肝和肾功能并且还用于抗氧化和抗纤维变性。

除了北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物之外，本发明的组合物可以另外包括，与本发明的提取物具有相同或相似功能的一种或多种有效成分。

本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物可以口服或肠胃外施用并且可以以药物制剂的一般形式使用。本发明的本草混合物提取物可以通过混合以常用的填充剂、补充剂、粘合剂、湿润剂，崩解剂，稀释剂诸如表面活性剂，或赋形剂来进行制备用于口服或肠胃外施用。用于口服施用的固体制剂是片剂、丸剂、扑粉、颗粒剂和胶囊。通过混合一种或多种适合的赋形剂诸如淀粉，碳酸钙，蔗糖，乳糖，明胶等来制备这些固体制剂。除了简单的赋形剂之外，可以使用润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石、等。用于口服施用的液体制剂是混悬液、溶液、乳剂和糖浆并且上述提及的制剂可以包含各种赋形剂诸如湿润剂，甜味剂，芳香剂和防腐剂，以及常用的简单稀释剂诸如水和液体石蜡。用于肠胃外施用的制剂是无菌水溶液、不可溶于水的赋形剂，混悬液，乳剂，冻干剂和栓剂。不可溶于水的赋形剂和混悬液除了活性的一种化合物或多种化合物之外，可以包含丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，可注射的酯如油酸乙酯等。除了活性的一种或多种化合物之外，栓剂可以包含witepsol，聚乙二醇，吐温61，可可脂，月桂精脂，甘油，明胶等。

剂量单位可以包含例如，1，2，3或4次单独剂量或1/2，1/3或1/4单独的剂量。单独的剂量优选地包含在一次施用中给药的活性化合物的量并且其通常相应于完整的，1/2，1/3或1/4的每日剂量。本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物的有效剂量分别是200～600mg/kg，更优选地300～400mg/kg，并且施用次数是每日1～6次。

本发明的组合物可以单独或组合以外科手术、放疗、激素治疗、化疗和生物反应调节剂组合施用从而改善肝和肾功能并获得抗氧化和抗纤维变性作用。

本发明的组合物可以添加在健康食品中从而改善肝和肾功能并获得抗氧化和抗纤维变性作用。此时，可以按照常规方法将本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物原样加入或混合以其它食品或成分后加入。根据使用的目的(预防、健康或治疗性处理)来确定有效成分的混合比率。在生产包含本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物的食品或饮料的情形中，优选地将所述提取物以原材料的15重量％下，更优选地10重量％下加入。然而，当其长期施用以改善健康状况时，提取物的含量可低于上述，但是有效剂量可以包含超过上述的量，因为本发明的提取物的非常安全的。

在可应用的食物中不存在限制，其例示为肉、香肠、面包、巧克力、糖果、小吃、饼干、比萨饼、ramyun、面条、口香糖、奶制品包括冰激凌、汤、饮料、茶、酒、酒精性饮料和维生素复合物等并且事实上将一般生产的每种健康食品都包括在内。

包括本发明的组合物的健康饮料如其它的饮料，可以另外包括各种食品香料或天然的糖等。上述的天然的糖可以是单糖诸如葡萄糖和果糖，二糖诸如麦芽糖和蔗糖，多糖诸如糊精和环糊精，和糖醇诸如xilytole、山梨糖醇和赤藓糖醇其中之一。作为甜味剂，可以使用天然甜味剂诸如竹芋蛋白和stevia提取物或人工甜味剂诸如糖精和天冬甜精。天然糖与本发明的组合物的比率优选地是0.01～0.04g对100ml，更优选地是0.02～0.03g对100ml。

除了上述提及的成分外，本发明的组合物可以包括多种营养成分、维生素、电解质、增香剂、着色剂、果胶酸及其盐、精氨酸(arginic acid)及其盐、有机酸、保护性胶体粘化剂(viscosifiers)、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于加入苏打的碳酸化剂(carbonators)等。本发明的组合物还可以包括天然的果汁，果实饮料和/或可加入植物饮料的果肉。所有的提及的成分可以单独或一起加入。事实上那些成分的混和比率并不重要，但是通常每种可以以0.01～0.1重量部分/本发明的组合物的100重量部分。

【发明方式】

本发明的实践和目前优选的实施方案如在下面的实施例中所显示的那样进行举例说明。

然而，将理解的是本领域那些技术人员，在考虑了本说明书后，在本发明的精神和范围内可以作出修改和改善。

<实施例1>北枳椇提取物的制备

用水洗涤北枳椇，接着将其在阴暗处干燥。将20g干燥的北枳椇置于反射提取器中，向其中加入1.5l纯化的水并在100℃加热90分钟。当热水提取物仍旧是热的时候，在减压下将其用滤纸进行过滤。通过使用真空蒸发器来浓缩滤出物。将其通过冻干机来进行干燥以用于长期贮存。

将浓缩的溶液用于动物测试(2ml/大鼠/天)。

<实施例2>三丫乌药提取物的制备

通过使用三丫乌药，三丫乌药提取物以类似于如上述在实施例1中所述的方法进行制备。将浓缩的溶液用于动物测试(2ml/大鼠/天)。

<实施例3>本草混合物提取物的制备

将20g的干燥北枳椇和10g的干燥三丫乌药茎混和并以类似于实施例1中所述的方法来制备其提取物。

将浓缩的溶液用于动物测试(2ml/大鼠/天)，并将4倍浓缩的溶液用于MTT和NR测定(50μl/孔)。

<实验实施例1>提取物在大鼠中的抗氧化、抗纤维变性、肝和肾功能改善和保护作用，所述大鼠具有由长期施用四氯化碳而诱导的肝和肾损伤

如下进行实验从而研究本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物在肝和肾损伤模型中的抗氧化和抗纤维变性作用以及肝和肾功能改善和保护作用。

1.测试动物

将称重为约180～210g的12周龄Sprague-Dawley大鼠(Damul science，Osan，Korea)用作测试动物。饲养温度是23±2℃并且相对湿度维持为60±10％。随意供给饲料(Purina饲料)和水，并且调节日-夜周期。

使动物适应测试室2周，并接着将它们分成5组，①正常组，②CCl₄处理组，③CCl₄+本草混合物提取物处理组，④CCl₄+北枳椇提取物处理组和⑤CCl₄+三丫乌药提取物处理组。每个组由10只大鼠组成。2.肝纤维变性(硬化)和肾损伤的诱导

除了正常组之外，以1ml/大鼠/日，用橄榄油和CCl₄混合物向实验组进行施用，一周3次持续4周从而诱导肝纤维变性(硬化)和肾损伤。

以2ml/大鼠/日，向CCl₄处理组口服施用蒸馏水，以2ml/大鼠/日向CCl₄+本草混合物提取物处理组口服施用在上述实施例3中制备的本草混合物提取物，以2ml/大鼠/日向CCl₄+北枳椇提取物处理组口服施用在上述实施例1中制备的北枳椇提取物并且还以2ml/大鼠/日，向CCl₄+三丫乌药提取物处理组口服施用在上述实施例2中制备的三丫乌药提取物。

将在包括正常组的每组中的大鼠进行称重，并接着将其用乙醚麻醉。通过心脏穿刺术，将血液从心脏中采出，将所述血液置于室温达超过2小时。接着，在3000rpm进行离心达10分钟以获得血清，将所述血清贮存于-20℃。检查血清以测量GOT，GPT，碱性磷酸酶，BUN和总胆红素的水平。

提取大鼠的肝和肾，将其用磷酸缓冲液(pH 7.0)洗涤，随后测量其重量，所述肝和肾已经由于人工诱导受到了损伤。将肝和肾组织的部分保存在-75℃以应用于测量羟基脯氨酸和丙二醛(MDA)。

每周测量重量变化。研究耳、尾巴和足来检测黄疸病的体征。当将大鼠处死的时候，对肝进行称重。

将结果通过平均值±SD来表示，并且通过斯氏t-检验来检查对照组和实验组之间的平均值的差异的显著性。当p＜0.005时，将其判断为具有统计学上的显著性。

将结果显示于表1

【表1】

  重量  (g)  肝组织  肾组织  肝重量  (g)  (肝重量/体   重)×     100(％)  肾重量  (g)  (肾重量/   体重)×     100(％)  正常组  200.8  ±8.6  6.3±0.3  3.2±1.3  1.23±0.09  0.64±0.03  CCl₄处理组  167.3  ±19.4  12.9±1.9  7.7±0.7  2.18±0.16  0.97±0.17  CCl₄+  本草混合物提取物  处理组  190.7  ±10.3  11.7±1.6^*  6.7±0.8^*  1.63±0.10  0.86±0.05  CCl₄+  北枳椇提取物处理  组  173.2  ±17.3  13.4±1.6  7.0±0.6  1.57±0.09  0.91±0.2^*  CCl₄+  三丫乌药提取物处  理组  181.8  ±16.1  12.5±1.2  6.9±0.5^*  1.59±0.11  0.88±0.07

^*：p＜0.005

如在表1中所显示，与对照相比，在用本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物和本草混合物提取物处理的实验组中体重与肝重的比率的变化是不显著的。同样，与对照相比，体重与肾重量的比率的变化也是不显著的。

3.血清学和生化测试

1)GOT(AST)测量(使用EMBIEL试剂盒)

将500μl的AST底物溶液置于两个falcon管中，将其在37℃加热3～5分钟。在一个管中，将底物溶液用标准溶液进行稀释，而在另一个管中，加入100μl的血清样品。于37℃，在两个管中诱导反应达60分钟。将100μl的纯化的水和500μl的着色溶液(2，3-二硝基苯基肼)加入每个管中，接着将其置于室温达20分钟。将5ml的0.4N NaOH加入每个管中，随后在室温反应10分钟。在505nm测量OD。

2)GPT(ALT)测量(使用EMBIEL试剂盒)

将150μl的ALT底物溶液置于两个falcon管中，将其在37℃加热4分钟。在一个管中，将底物溶液用标准溶液进行稀释，而在另一个管中，加入100μl的血清样品并于37℃，在两个管中诱导反应达30分钟。将100μl的纯化的水和500μl的着色溶液(2，3-二硝基苯基肼)加入每个管中，接着将其置于室温达20分钟。将1.5ml的0.4N NaOH加入每个测试管中，随后在室温反应10分钟。在505nm测量OD。

3)ALP(碱性磷酸酶)测量

将2.0ml的ALP底物缓冲液(2-苯基磷酸钠)置于三个测试管中，将其在37℃反应3～5分钟。将50μl的血清样品，50μl的纯化的水和50μl的标准溶液分别加入测试管中，随后在37℃反应15分钟。将2.0ml的着色剂加入每个测试管中，并接着将其置于室温达10分钟。在60分钟内，在570nm测量OD。

4)BUN(血液尿氮)测量

将20μl的血清样品，20μl的纯化的水和20μl的标准溶液分别置于三个测试管中。将2.0ml的酶溶液加入其中，随后在37℃反应5分钟。将2.0ml的着色剂加入每个管中，将其在37℃加热10分钟。在60分钟内，于580nm测量OD。

5)总胆红素的测量

将100μl的血清样品，100μl的纯化的水和100μl的标准溶液置于分别置于三个测试管中，以600μl/管向其中加入针对总胆红素起作用的着色剂。将600μl的重氮混合物加入每个测试管中，将其置于室温达10分钟。将600μl的ferring试剂加入每个管中以诱导反应。在2小时内，于600nm测量OD。

将结果显示于表2

【表2】

  GOT(IU)  GPT(IU)  ALP(KA)  BUN  (mg/□)  总胆红素  (mg/□)  正常组  61.78±6.0  13.2±    1.0  63.5±    11.2  13.6±    1.1  0.2±0.05  CCl₄处理组  241.8±43.1  145.3±38.1  156.9±36.1  23.4±    2.1  1.6±0.92  CCl₄+  本草混合物提取物  处理组  137.6±52.4^* *  69.6±47.0^*  137.0±26.0  1g.04±6.9  1  0.27±0.14  CCl₄+  北枳椇提取物处理  组  165.1±46.4^*  *  70.9±42.2^*  143.1±37.9  18.6±    2.1^*  0.7±0.04  CCl₄+  三丫乌药提取物处  理组  144.5±5.7^**  74.4±17.6^*  138.2±14.8  18.4±    3.6  -

^*：p＜0.05，^**：p＜0.005

如在表2中显示，与对照相比，在分别用本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物和其本草混合物提取物处理的实验组中，作为肝功能指数的GOT，GPT，ALP，BUN和总胆红素的水平，显著更低。特别地，在用本草混合物提取物处理的组中，那些指数的水平是最低的。

因此，证明本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物和其本草混合物提取物具有极佳的肝功能改善作用。

并且，ALP和BUN不仅是用于肝功能的指数，也是用于肾功能的指数，因此，本发明的提取物导致的ALP和BUN的降低的水平还意味着本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物和其本草混合物提取物也具有极佳的肾功能改善作用。

4.羟基脯氨酸(hyp)的测量

1)试剂的制备

①乙酸盐柠檬酸盐缓冲液

将50g的三水合乙酸钠，37.5g的柠檬酸三钠和5.5g的一水合柠檬酸混和在395ml的异丙醇中。而且，将混合物的总体积通过加入蒸馏水调整到1L。还将混和溶液的pH调整到6.0。将最终的溶液贮存于4℃。

②氯胺-T溶液

将84mg的氯胺-T溶解在10ml的乙酸盐柠檬酸盐缓冲液中。

③Ehrilich′s试剂

混和10g的对-二甲基氨基苯甲醛和11ml的60％的高氯酸以制备贮存溶液。将3ml的贮存溶液混合以8.0ml的异丙醇，得到Ehrilich′s试剂。在使用前立即制备所述试剂，并且将该贮存溶液在阴暗处贮存于4℃。

2)羟基脯氨酸的测量

将冷冻或冻干(-50℃，72小时)的0.2g的肝(或肾)组织分散在10ml的玻璃瓶中。将4ml的6N HCl置于该瓶中，随后用匀浆器来进行匀浆。接着，在干燥的烘箱中于110℃进行水解达10～24小时，随后用Whatmann滤纸进行过滤。同样，将以反式-羟基脯氨酸6N HCl稀释，在0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0μg/50μl的不同浓度的标准溶液也在110℃水解12～14小时。将每种样品和标准溶液每个取50μl，并在玻璃瓶中彻底干燥以去除HCl。加入1.2ml的50％异丙醇来溶解沉淀物。将200μl的氯胺-T溶液加入其中，随后在室温反应10分钟。接着，加入1.2ml的Ehrilich’s试剂。在50℃诱导着色90分钟，随后在室温冷却。通过使用分光光度计来在558nm测量OD。

通过下列公式测量肝组织(或肾组织)中羟基脯氨酸的含量。

C[0.2g肝组织(或肾组织)的羟基脯氨酸浓度]＝

[HA(样品的OD)/SA(用1.0μg/50μl反式羟基脯氨酸6N HCl稀释的标准溶液的OD)]×80

C×5＝羟基脯氨酸量/g肝组织(或肾组织)

结果显示于表3中。

【表3】

  羟基脯氨酸量(μg/g)  肝组织  肾组织  正常组  997.7±87.8  918.2±78.7  CCl₄处理组  2201.6±16.0  825.6±57.6  CCl₄+  本草混合物提取物处理组  1094.3±186.7  870.4±74.3  CCl₄+  北枳椇提取物处理组 ^*5341118.3±255.0^*  850.2±57.6  CCl₄+  三丫乌药提取物处理组  1110.1±201.0^*  860.4±69.3

^*：p＜0.005

如表3中所示，与对照相比，在各自用本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物及其本草混合物提取物处理的实验组中，肝组织中的羟基脯氨酸含量更低而在肾组织中更高。特别地，与对照相比，在用本草混合物提取物处理的组中，在肝组织中的羟基脯氨酸含量显著低(50.8％)。但是在肾中的羟基脯氨酸含量比对照高5.5％，比用北枳椇提取物处理的组高3.0％，比用三丫乌药提取物处理的组高1.2％。

因而，证实了本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物及其本草混合物提取物具有极好的抗纤维变性和肾保护作用。

5.MDA(丙二醛)的测量

将匀浆的组织样品[在1.8ml的1.15％KCl中的0.2g肝组织(或肾组织)]和200μl稀释的标准物质(0，4，8，16，32nmol/200μl四甲氧基丙烷)在falcon管中放在一起。将200μl以样品稀释的标准溶液与100μl的0.2％SDS相混合，随后于室温反应10分钟。向其中加入750μl的20％乙酸和750μl 0.8％硫代巴比妥酸盐。将溶液于95℃反应30分钟，随后在冰中冷却。在完成冷却后，加入2ml的正丁醇，随后进行离心以获得上清液。通过分光光度计在532nm上测量上清液的OD。

如下测量血清和组织中MDA的含量。

C[0.2g肝组织(或肾组织)(或200μl血清)的丙二醛浓度]＝[HA(样品的OD)/SA(标准溶液的OD(8μmol/1.15％KCl 200μl))×80

C×5＝丙二醛量(μmol/ml)

结果显示在表4中。

【表4】

  丙二醛量(μmol/ml)  肝组织  肾组织  正常组  89.6±3.7  142.3±12.7  CCl₄处理组  151.3±27.7  181.4±24.4  CCl₄+  本草混合物提取物处理组  105.9±12.9^*  161.7±13.2  CCl₄+  北枳椇提取物处理组  130.7±25.9  168.3±19.8  CCl₄+  三丫乌药提取物处理组  ^*593121.3±17.6  156.6±14.7^*

^*：p＜0.05

如表4中所示，与对照相比，在各自用本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物及其本草混合物提取物处理的实验组中，丙二醛的量，脂质过氧化作用的指标，在肝和肾组织中低。特别地，在用本草混合物提取物处理的组中，与对照相比，在肝组织中的含量显著要低(31.0％)而肾组织中的含量也非常低(13.0％)。

因此，证实了本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物及其本草混合物提取物具有极好的抗氧化性和肾保护作用。

<实验实施例2>细胞毒性测试

本发明中所用的细胞系是NCTC克隆1469(肝细胞系)和vero(肾细胞系)，其购自韩国细胞系库(Korea Cell Line Bank)(KCLB)。

将5mg MTT粉溶于1ml磷酸盐缓冲液中，将其充分搅拌并且随后通过0.4μm滤器进行过滤，得到MTT贮存溶液。

将4mg NR粉溶于1ml的三重蒸馏水中，接着将其充分搅拌并且通过0.4μm滤器进行过滤，得到NR贮存溶液。

购买含有0.5％胰蛋白酶和5.3mM EDTA的胰蛋白酶-EDTA并在使用前用PBS进行10倍稀释。

1)MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-溴化二苯基四唑盐]测定

除去培养基后，加入1ml胰蛋白酶-EDTA溶液，将其放置10～20分钟。从容器中分离细胞并且随后转移到15ml的falcon管中。将1ml培养基加入到培养瓶中并摇动以分离所有剩余的细胞，将其也置于falcon管中。将10μl的细胞混悬液置于血细胞计数器中并且随后对细胞进行计数(2.5×10⁴细胞/ml)。以50μl(1～2×10⁵细胞)/孔将细胞接种到96孔板上，向其加入150μl的培养基(DMEM+10％FBS+抗生素)。将细胞培养于37℃，5％CO₂温箱中24小时，导致细胞附着。

24小时后，将培养基小心地从附着到96孔板上的细胞中去除(需要仔细注意使培养基不被细胞沾染和污染)。将150μl的培养基添加以50μl的实施例1中制备的北枳椇提取物，50μl的实施例2中制备的三丫乌药提取物和50μl的实施例3中制备的本草混合物提取物，使总体积为200μl。将溶液培养于37℃，5％CO₂温箱中达24小时。此时，提取物应当在后来加入，否则细胞会受到损害。所以，应当首先加入培养基并且随后将提取物放于其中。在培养后，取96孔板除去培养基。加入50μl/ml的MTT染料(50μl的贮存液+950μl的培养基)以稀释溶液，其在每孔中分配50μl，随后在CO₂温箱中进一步培养4小时。除去上清液后，加入100μl的DMSO，随后搅拌10分钟。用ELISA读取器于540nm上测量OD。

向对照中只加入培养基，并研究生存力。

2)NR(中性红：3-氨基-7-二甲基氨基-2-甲基吩嗪)测定

除去培养基后，加入1ml的胰蛋白酶-EDTA溶液，将其放置10～20分钟。从容器中分离细胞并且随后转移到15ml的falcon管中。将1ml的培养基加入到培养瓶中并摇动以分离所有剩余的细胞，将其也置于falcon管中。将10μl的细胞混悬液置于血细胞计数器中并且随后对细胞进行计数(2.5×10⁴细胞/ml)。以50μl(1～2×10⁵细胞)/孔将细胞接种到96孔板上，向其加入150μl培养基(DMEM+10％FBS+抗生素)。将细胞培养于37℃，5％CO₂温箱中24小时，得到细胞附着。

24小时后，将培养基小心地从附着到96孔板上的细胞中去除(需要仔细注意使培养基不被细胞沾染和污染)。将150μl的培养基添加以50μl的实施例1中制备的北枳椇提取物，50μl的实施例2中制备的三丫乌药提取物和50μl的实施例3中制备的本草混合物提取物，使总体积为200μl。将溶液培养于37℃，5％CO₂温箱中24小时。此时，提取物应当在后来加入否则细胞会受到损害。所以，应当首先加入培养基并且随后将提取物置于其中。

在培养后，取96孔培养板除去培养基。加入10μl/ml的NR染料(10μl的贮存液+990μl的培养基)以稀释溶液，其在每孔中分配200μl，随后在37℃，5％CO₂温箱中进一步培养3小时。除去培养基后，用100μl的1％CaCl₂和0.5％甲醛洗涤板。除去上清液。随后，加入200μl的1％乙酸和50％乙醇，随后搅拌10分钟。用ELISA读取器于540nm上测量OD。

向对照中只加入培养基，并研究生存力。

结果显示于表5中。

【表5】

  肝细胞系(NCTC)  肾细胞系(Vero)  MTT(％)  NR(％)  MTT(％)  NR(％)  本草混合物提取物  105.70±12.9  109.00±5.3  96.20±4  106.90±7.4 (北枳椇+三丫乌药) 北枳椇提取物  44.60±6.6  42.30±4.1  98.40±4.1  99.00±12 三丫乌药提取物  95.7±10.9  96.7±5.7  98.7±3.8  97.3±3.5

如表5中所示，本发明的三丫乌药提取物和本草混合物提取物在肝细胞系中显示高细胞生存力。特别地，本草混合物提取物比北枳椇提取物对于在肝细胞系中提高细胞生存力更加有效。同时，本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物及其本草混合物提取物并不损害肾细胞系中的细胞生存力。

因此，确证了本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物及其本草混合物提取物具有极好的肝和肾保护作用。

下文介绍本发明的组合物的制备实施例。

如下制备包含本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物的药物组合物。

<制备实施例1>药物组合物的制备

1.粉末的制备

北枳椇提取物(或三丫乌药提取物或其本草混合物提取物)2g

乳糖                                             1g

将上述成分混合在一起，并将气密袋填充以所述混合物以制备粉末。

2.片剂的制备

北枳椇提取物(或三丫乌药提取物或其本草混合物提取物)100mg

玉米淀粉                                         100mg

乳糖                                             100mg

硬脂酸镁                                         2mg

将上述成分混合在一起，按照常规片剂生产方法通过压片来制备片剂。

3.胶囊的制备

北枳椇提取物(或三丫乌药提取物或其本草混合物提取物)100mg

玉米淀粉                                           100mg

乳糖                                               100mg

硬脂酸镁                                           2mg

将上述成分混合在一起，按照常规胶囊生产方法将胶囊填充以所述混合物以制备胶囊。

<制备实施例2>食品的制备

如下制备包含本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物的食品。

1.香料和调味品的制备

制备含有20～95重量％的本发明的北枳椇提取物(或三丫乌药提取物或其本草混合物提取物)的香料和调味品用于改善健康。

2.番茄酱和原料(source)的制备

通过以0.2～1.0重量％将本发明的北枳椇提取物(或三丫乌药提取物或其本草混合物提取物)加入到番茄酱和原料中来制备番茄酱和原料用于改善健康。

3.面食的制备

以0.5～5.0重量％将本发明的北枳椇提取物(或三丫乌药提取物或其本草混合物提取物)加入到面粉中，并将所述混合物用于制备面包，蛋糕，饼干，薄脆饼干和面条以生产改善健康的食品。

4.汤和肉汁的制备

通过以0.1～5.0重量％将本发明的北枳椇提取物(或三丫乌药提取物或其本草混合物提取物)加入汤和肉汁中来制备改善健康的加工过的肉，面条汤和肉汁。

5.研磨牛肉的制备

通过以10重量％将本发明的北枳椇提取物(或三丫乌药提取物或其本草混合物提取物)加入到研磨牛肉中来制备改善健康的研磨牛肉。

6.乳制品的制备

以5～10重量％将本发明的北枳椇提取物(或三丫乌药提取物或其本草混合物提取物)加入乳中，随后使用它来生产改善健康的乳制品，包括黄油和冰淇淋。

7.cerial的制备

通过常规方法将糙米，大麦，糯米和薏苡(Job’s-tears)成胶状，干燥和烘烤，随后用粉碎机进行粉碎，得到60-网眼的颗粒。

通过常规方法蒸黑豆，黑芝麻，Perilla japonica，干燥和烘烤，随后用粉碎机进行粉碎，致成60-网眼的颗粒。

将本发明的北枳椇提取物(或三丫乌药提取物或其本草混合物提取物)在真空浓缩仪中于减压下进行浓缩，随后通过喷雾干燥器进行干燥。将干燥的产品粉碎成60-网眼的颗粒。

通过下列比率混合作物，种子和北枳椇提取物(或三丫乌药提取物或其本草混合物提取物)的干粉。

作物(糙米30重量％，薏苡15重量％，大麦20重量％)，

种子(Perilla japonica 7重量％，黑豆8重量％，黑芝麻7重量％)，

北枳椇提取物(或三丫乌药提取物或其本草混合物提取物)的干粉(3重量％)，

灵芝(Ganoderma lucidum)(0.5重量％)，

地黄(Rehmannia glutinosa)(0.5重量％)

<制备实施例3>饮料的制备

1.碳酸饮料的制备

将糖(5～10％)，柠檬酸(0.05～0.3％)，焦糖(0.005～0.02％)和维生素C(0.1～1％)混合在一起，向其加入纯化的水(79～94％)，得到糖浆。将所述糖浆于85～98℃灭菌20～180秒，随后以1∶4的比例与冷水混合。以0.5～0.82％向其中注入二氧化碳，导致包含本发明的北枳椇提取物(或三丫乌药提取物或其本草混合物提取物)的碳酸饮料的制备。

2.健康饮料的制备

将任选的组分如液体果糖(0.5％)，寡糖(2％)，糖(2％)，盐(0.5％)，水(75％)和北枳椇提取物(或三丫乌药提取物或其本草混合物提取物)均匀混合。粉碎后，将混合物置于小容器诸如pet或玻璃瓶中，得到健康饮料的制备。

3.植物汁的制备

将5g本发明的北枳椇提取物(或三丫乌药提取物或其本草混合物提取物)加到1,000ml蕃茄或胡萝卜汁中以制备改善健康的植物汁。

4.果汁的制备

将1g本发明的北枳椇提取物(或三丫乌药提取物或其本草混合物提取物)加到1,000ml的苹果或葡萄汁中以制备改善健康的果汁。

【工业应用性】

本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物对于改善肝功能高度有效，因为它能够降低作为主要的肝功能指标的GOT，GPRT，ALP，BUN和总胆红素的水平。ALP和BUN还被用作肾功能指标，所以本发明的提取物导致的ALP和BUN水平的降低说明本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物还能够改善肾功能。

本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物还能够降低肝中羟基脯氨酸的量但提高肾中羟基脯氨酸的量，提示上述提取物具有极佳的抗纤维变性和肾保护作用。

此外，本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物能够降低肝和肾组织中脂质过氧化作用的指标丙二醛的水平，提示所述提取物具有极佳的抗氧化作用。

本发明的北枳椇提取物，三丫乌药提取物或其本草混合物提取物促进肝和肾细胞系中的细胞生存力，说明所述提取物具有极佳的肝和肾细胞保护作用。

因此，本发明的组合物不仅能够有效地用于抗氧化和抗纤维变性，还能够用于保护和改善肝和肾功能。