含有葡萄糖－6－磷酸脱氢酶(G6PDH)的临床诊断试剂、G6PDH的稳定化方法及G6PDH稳定剂的应用

摘要

本发明提供一种含有葡萄糖－6－磷酸脱氢酶(G6PDH)的试剂，其含有G6PDH和通式(I)表示的稳定剂。式(I)中，R1表示氢、卤素、羟基、取代或非取代低级烷基、环烷基、低级烷氧基、低级烯基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代杂环基、低级烷酰基、取代或非取代芳酰基、吡啶基羰基、低级烷氧羰基、取代或非取代氨基中的任意一种。

说明书

技术领域

本发明涉及含有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的临床诊断试剂，G6PDH的稳定化方法及G6PDH稳定剂的应用。

背景技术

G6PDH是在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADP)等的辅酶存在下，催化氧化葡萄糖-6-磷酸(以下称为G6P)而生成6-磷酸葡糖酸-δ-内酯和还原型NAD(NADH)或还原型NADP(NADPH)的反应或其逆反应的酶。利用这种催化作用，G6PDH可广泛用于各种临床诊断试剂。但由于试剂中的G6PDH不稳定，试剂中必须含有G6PDH稳定剂。

作为含有G6PDH和上述稳定剂的试剂，已知有例如USP5424204中所述的肌酸激酶(以下称为CK)活性测定用试剂。该试剂中，作为用于稳定化G6PDH的稳定剂，可含有羟胺类或醛捕捉剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种含有稳定剂的试剂，该稳定剂与以往已知的G6PDH稳定剂相比，更能改善G6PDH的保存稳定性；并提供使用该稳定剂稳定化G6PDH的G6PDH稳定化方法。

本发明能够提供含有使G6PDH稳定化的稳定剂的、保存稳定性优良的临床诊断试剂。并且能够提供稳定溶液中的G6PDH的方法。

本发明一实施方式的试剂为含有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)和通式(I)表示的稳定剂。

(式中，R1表示氢、卤素、羟基、取代或非取代低级烷基、环烷基、低级烷氧基、低级烯基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代杂环基、低级烷酰基、取代或非取代芳酰基、吡啶基羰基、低级烷氧羰基、取代或非取代氨基中的任一种)。

“稳定剂”是指在通过在试剂中与G6PDH共存而能够抑制G6PDH失活、提高保存稳定性的物质。此外，本说明书中的“稳定剂”也包括稳定剂的盐或衍生物。

通式(I)所示稳定剂的R1中，作为卤素，可举出氟、氯、溴、碘、砹等。

作为低级烷基、低级烷氧基和低级烷氧羰基的烷基部分，可举出直链或支链状的碳原子数1～6的、例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基等。

作为环烷基，可举出碳原子数3～8的、例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。

作为低级烯基、可举出直链或支链状的碳原子数2～6的、例如乙烯基、烯丙基、异丙烯基、4-戊烯基、5-己烯基等。

作为芳烷基，可举出碳原子数7～15的、苄基、苯乙基、二苯甲基、苯丙基等。

作为芳基和芳酰基的芳基部分，可举出苯基、甲苯基、萘基等。

作为杂环基，呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡喃基、噻喃基、吡啶基、噻唑基、咪唑啉基、嘧啶基、三嗪基、吲哚基、喹啉基、嘌呤基、苯并噻唑基等。

作为低级烷酰基，可举出直链或支链状的碳原子数1～6的、例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、新戊酰基、戊酰基等。

作为低级烷基的取代基，可举出相同或不同的、取代数1～3的、例如羟基、低级烷氧基、羧基、低级烷氧羰基、低级烷硫基、卤代基、氨基、单或二烷基取代氨基、邻苯二甲酰亚胺基和吡咯烷基、吡唑基、吲哚基等含氮杂环基等。

低级烷氧基、低级烷氧羰基、低级烷基硫基、烷基取代氨基的烷基部分与上述低级烷基的定义相同。

作为芳烷基、芳基、芳酰基和杂环基的取代基，可举出相同或不同的、1～5个的、例如低级烷基、羟基、低级烷氧基、卤素、硝基、氨基等，低级烷基、低级烷氧基的烷基部分与上述低级烷基的定义相同。

作为取代氨基的取代基，可举出相同或不同的、1～2个的、例如与上述定义相同的低级烷基、芳烷基、取代或非取代芳基、低级烷酰基、取代或非取代芳酰基和亚烷基(烷叉基)等，亚烷基表示直链或支链状的碳原子数1～6的、例如亚甲基(甲叉基)、亚乙基(乙叉基)、亚丙基(丙叉基)、异亚丙基(异丙叉基)、亚丁基(丁叉基)、异亚丁基(异丁叉基)、仲亚丁基(仲丁叉基)、叔亚丁基(叔丁叉基)、亚戊基(戊叉基)、新亚戊基(新戊叉基)、亚己基(己叉基)等。

作为稳定剂的盐，可举出例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐等无机酸盐或草酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、重碳酸盐等有机酸盐或钠盐、钾盐等碱加成盐。

本实施方式中，作为稳定剂，优选使用通式(I)中R1为氢原子的化合物(氨基胍)、氨基胍盐或氨基胍衍生物。

作为试剂中稳定剂的浓度，只要是能稳定化G6PDH的浓度就没有特殊限定。另外，试剂中G6PDH的浓度虽然没有特殊限定，但优选10～10000U/L，更优选100～10000U/L。

G6PDH既可以是来自微生物(例如肠系膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophiolus)、棕色固氮杆菌(Azotobacter vinelandii)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)等)、酵母、动植物等，也可以采用基因重组技术生成。

作为试剂的溶液状态下的pH，只要不是使G6PDH不稳定的pH，就没有特殊限定，优选5.0～9.0。为维持该pH，优选使试剂中含有缓冲液。缓冲液可使用例如Tris-HCl缓冲液、咪唑-乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、苹果酸缓冲液、草酸缓冲液、邻苯二甲酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、乙酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸缓冲液、Good’s缓冲液等。

试剂可以是使各成分冻干的状态，但优选使各成分在溶剂中溶解的溶液状态。

此外，试剂优选为含有第一试剂和第二试剂的两种试剂的试剂盒。此时，第一试剂和/或第二试剂可以处于冻干状态，但优选两者试剂均处于溶液状态。G6PDH和上述稳定剂既可以含在第一试剂和第二试剂的任何一种中，也可以同时含在这两种试剂中。

该试剂可广泛用于临床诊断。通过使样品中混合本实施方式的试剂，监测吸光度变化等，能够测定样品中特定物质的含量或活性等。作为样品，可举出例如血清、血浆、血液、髓液、尿、精液等，但优选使用血浆或血清。

作为使用本实施方式的试剂能够定量或测定活性的物质，只要是使用反应系中作为G6PDH的底物的葡萄糖-6-磷酸(以下称G6P)，就没有特殊限定。作为可定量的物质，可举出例如中性脂肪、无机磷酸、乳糖、麦芽糖、糖原、淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、肌酸磷酸、G6P、果糖-6-磷酸、麦芽糖-6-磷酸、果糖-2-磷酸、L-山梨糖-6-磷酸、葡萄糖-1-磷酸、NAD、NADP、尿苷三磷酸、腺苷三磷酸(ATP)、尿苷二磷酸葡萄糖等。此外，作为可测定活性的物质、可举出例如CK、CKMB、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、淀粉葡糖苷酶、转化酶、醛糖转移酶、半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶、磷酸葡糖异构酶、果糖二磷酸酶等。

具体实施方式

以下说明采用本实施方式的试剂测定CK的活性的情况。

CK是指由两个亚基组成的二聚体磷酸酶。CK的亚基中存在B型(脑型)和M型(肌型)两种。CK中，通过组合两种亚基存在三种同功酶(CK-MM，CK-MB和CK-BB)。CK-MM大多含在骨骼肌中，CK-MB大多含在心肌中，CK-BB大多含在脑中。由于因心肌梗塞或肌肉萎缩等疾病存在于疾病病因部位的CK同功酶释放到血液中，因此在临床检查中，血清等样品中含有的CK同功酶的活性值成为诊断上述疾病的重要指标。

以下通过本发明一实施方式说明作为试剂的CK活性测定用试剂。

用于CK活性测定的试剂中优选含有缓冲液、含有SH基的化合物(以下称SH化合物)、NAD或NADP、己糖激酶(HK)或葡糖激酶(GK)、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)、镁离子和肌酸磷酸。另外，此时作为供测定用的样品，可使用血清或血浆等。

混合样品和试剂时，样品中含有的CK被SH化合物活化。由于CK释放到血液中后被迅速灭活，为测定CK的活性必须通过SH化合物使CK活化。作为SH化合物，只要能活化CK就没有特殊限定，可使用例如N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)、半胱胺、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、谷胱甘肽和硫代甘油等。这些SH化合物可两种以上组合使用，但优选单独使用。SH化合物在试剂中的浓度为5～250mM，优选5～70mM，更优选10～25mM。

通过向含有CK的样品中添加含有上述成分的试剂，可构筑如图1所示的反应系统。图1中，被SH化合物活化的CK催化由肌酸磷酸(CP)和ADP生成肌酸和ATP的反应(反应1)。试剂中含有的HK或GK使由试剂中含有的葡萄糖(G1c)和反应1中产生的ATP生成G6P和ADP(反应2)。然后，试剂中含有的G6PDH使由反应2产生的G6P和NAD或NADP生成6-磷酸葡糖酸-δ-内酯和NADH或NADPH(反应3)。生成NADH或NADPH后，样品和试剂的混合液在波长340nm附近的吸光度上升。通过监测该吸光度的上升，能够测定样品中CK的活性。

试剂优选含有第一试剂和第二试剂的试剂盒。第一试剂优选含有缓冲液、G6PDH、稳定剂、NAD或NADP、己糖激酶(HK)或葡糖激酶(GK)、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)、镁离子和SH化合物，第二试剂优选含有肌酸磷酸。

如上所述，由于G6PDH不稳定，可以使试剂中含有G6PDH的稳定剂。但是，作为以往的稳定剂已知的化合物，由于使SH化合物劣化，因此无法添加能使G6PDH的保存稳定性提高的足够量的稳定剂，从而不能使G6PDH充分稳定化。本实施方式的试剂中含有的稳定剂，通过与G6PDH共存，不使SH化合物劣化，而能充分提高G6PDH的保存稳定性。

除上述成分以外，也可以向试剂中适当添加防腐剂、螯合剂等。防腐剂可使用例如叠氮化钠等。螯合剂由于通过抑制样品中的金属离子对CK活性的妨碍而被使用，具体可使用EDTA，EDDA及它们的盐等。

此外，可以向试剂中添加具有表面活性作用的化合物。例如可使用非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、具有表面活性作用的蛋白质等，具体可使用Triton、Emulgen类、BSA等。

样品中有时可含有腺苷酸激酶。腺苷酸激酶特别是在溶血样品中所含较多，给测定CK活性带来不良影响。为避免这种不良影响，优选向试剂中添加抑制腺苷酸激酶作用的抑制剂。抑制剂的种类只要是具有抑制腺苷酸激酶的作用就没有特殊限定，例如可使用腺苷单磷酸(AMP)或P1P5二腺苷-5’-五磷酸(AP5A)等。

进一步地，也可以通过双动力(Double Kinetic)法测定活性以避免腺苷酸激酶的不良影响。通过双动力法首先测定腺苷酸激酶的活性，其后添加肌酸磷酸，利用CK使酶反应开始，测定样品中含有的激酶的活性(CK活性和腺苷酸激酶活性的和)。以上述测定结果的差作为CK的活性值。

为避免腺苷酸激酶的不良影响，优选使用含有上述抑制剂的试剂，通过双动力法进行活性测定。

此外，通过使上述CK活性测定用试剂中含有特异性识别CK的M型亚基的抗体(以下称“抗CK-M抗体”)，能够测定样品中CK-MB的活性(Wurzburg等，1977，J.Clin.Chem.Clin.Biochem.，15：131-135)。作为抗CK-M抗体，只要是特异性识别M型亚基的抗体，既可以是多克隆抗体或单克隆抗体，也可以将它们混合使用。并且还可以使用抗体的片段及其衍生物。作为抗体的片段及其衍生物，具体可示例Fab、Fab’、F(ab)₂和sFv片段等(Blazar等，1997，J.Immunol.，159：5821-5833和Bird等，1988，Science，242：423-426)。抗体的亚型不限定于IgG，也可以是IgM等。

(实施例1)

<试剂的制备>

混合如下所示的化合物，调制CK活性测定用试剂。各成分的浓度表示试剂中的浓度。

咪唑            125mM

EDTA            2.5mM

醋酸镁          12.5mM

ADP             2.5mM

AMP             6.25mM

AP5A            12.5μM

葡萄糖          25mM

NADP            2.5mM

NAC             25mM

G6PDH           1875U/L

己糖激酶        3750U/L

此外，试剂的pH调整至6.6。

CK活性测定试剂由上述试剂(第一试剂)和含有肌酸磷酸的试剂(第二试剂)组成，由于本实施例是向上述试剂中施加温度负荷而分析G6PDH和NAC的稳定性，因此未使用第二试剂。

向上述组分中添加氨基胍，调制成氨基胍浓度不同的三种试剂。这些试剂中氨基胍浓度分别为10mM、20mM和40mM。向这些试剂施加37℃的5日温度负荷后，进行G6PDH的残存活性的测定及NAC的SH基的残存量的定量测定。

G6PDH的活性按如下所示测定。首先制备使含有0.1M甘胺酰甘氨酸的溶液(pH8.5)中溶解有20mM的氯化镁、0.6mM的NADP和0.5mM的G6P的溶液。混合该溶液300μl和第一试剂1μl，通过G6PDH的活性生成NADPH。由于生成NADPH时，在波长340nm处吸光度上升，因此可以通过测定该吸光度算出G6PDH的活性。

SH基的定量采用DTNB[5，5’-二硫-双(2-硝基苯甲酸)]进行。向试剂中添加DTNB时，NAC存在下切断了与NAC的SH基的量相当的量的二硫键而生成5-巯基-2-硝基苯甲酸。由于生成5-巯基-2-硝基苯甲酸时，在波长412nm处吸光度上升，因此通过测定该吸光度来定量试剂中的SH基。

(比较例1～3)

作为比较例1，向上述组分中不添加氨基胍，而添加作为G6PDH稳定剂已知的乙酰肼，除了制备乙酰肼浓度不同的两种试剂以外，其余与实施例1同样地，进行G6PDH的残存活性的测定及NAC的SH基的残存量的定量。试剂中乙酰肼的浓度分别是20mM和40mM。

另外，作为比较例2，不添加氨基胍，而添加作为G6PDH稳定剂已知的肼，除了制备肼浓度不同的两种试剂以外，其余与实施例1同样地，进行G6PDH的残存活性的测定及NAC的SH基的残存量的定量。试剂中肼的浓度分别是20mM和40mM。

另外，作为比较例3，在不添加稳定剂下进行G6PDH的残存活性的测定及NAC的SH基的残存量的定量。

实施例1和比较例1～3的测定结果如下表1所示。此外，表1中G6PDH的残存活性和NAC的残存量以百分率表示。这些值是相对于不施加温度负荷而采用实施例1所述方法测定的G6PDH的活性值和NAC的SH基的量的值。

[表1]

  稳定剂  添加浓度(mM)  G6PDH残存活性(％)  SH基残存量(％)  氨基胍  实施例1  10  20  40  88.2  92.6  94.8  92.2  95.4  94.1  乙酰肼  比较例1  20  40  84.3  87.8  78.4  77.7  肼  比较例2  20  40  87.8  91.9  54.7  56.2  未添加  比较例3  0  63.2  95.2

由比较例1可知，通过温度负荷G6PDH的活性丧失，进一步地NAC劣化、SH基的量减少。

由比较例2可知，虽然G6PDH的活性下降受到某种程度的抑制，但由于NAC劣化而使SH基的量大大减少。

由比较例3可知，虽然NAC没有劣化、SH基的量没有减少，但由于没有添加稳定剂，导致G6PDH的活性丧失。

在实施例1中，SH基的量既没有减少，也能够保持G6PDH的活性。

由以上可判明，作为稳定剂，向试剂中添加氨基胍时，可以在不使NAC劣化的情况下提高G6PDH的保存稳定性。

(实施例2)

以20mM的浓度向实施例1的试剂中添加氨基胍，在37℃施加30日的温度负荷，进行G6PDH的活性测定及NAC的SH基的定量。以与实施例1同样的方法，在温度负荷前、温度负荷开始起7日后、温度负荷开始起14日后、温度负荷开始起20日后及温度负荷开始起30日后，进行活性测定和定量。

(比较例4)

向A公司、B公司、C公司、D公司、E公司和F公司市售的CK活性测定用试剂的第一试剂(试剂A～试剂F)分别施加37℃的温度负荷，进行G6PDH的活性测定及NAC的SH基的定量。与实施例2同样地进行活性测定和定量。

并且，作为对照向实施例1制备的试剂(对照试剂：不添加氨基胍)施加37℃的温度负荷，进行G6PDH的活性测定及NAC的SH基的定量。与实施例2同样地进行活性测定和定量。

实施例2和比较例4的G6PDH活性测定结果如表2和图2所示。图2的纵轴表示G6PDH的残存活性(％)、横轴表示温度负荷期(日)。

实施例2和比较例4的SH基的定量结果如表3和图3所示。图3的纵轴表示SH基的残存量(％)、横轴表示温度负荷期(日)。

[表2]

                                 G6PDH活性(％)

  试剂  A  试剂  B  试剂  C  试剂  D  试剂  E  试剂  F  对照  试剂  实施  例2  温度负荷前  1周后  2周后  3周后  4周后  100.0  55.0  34.1  26.0  9.6  100.0  60.9  34.7  22.2  10.3  100.0  37.0  8.7  4.3  1.7  100.0  44.8  19.3  9.4  4.6  100.0  48.5  19.3  10.5  4.2  100.0  19.5  9.1  5.7  5.4  100.0  29.9  11.0  6.2  3.1  100.0  90.5  83.9  78.9  66.9

[表3]

                                         SH基残存量(％)

  试剂  A  试剂  B  试剂  C  试剂  D  试剂  E  试剂  F  对照  试剂  实施  例2  温度负荷前  1周后  2周后  3周后  4周后  100.0  95.3  85.3  71.1  56.1  100.0  90.4  83.3  77.1  61.7  100.0  91.2  83.7  76.4  72.9  100.0  98.3  95.8  92.2  83.3  100.0  100.3  90.1  81.7  58.0  100.0  93.9  88.0  83.8  80.7  100.0  67.0  53.9  40.2  26.3  100.0  96.4  94.3  95.5  90.3

由表2和图2可知，在市售的试剂A～F和对照试剂中，向任意试剂施加温度负荷都会造成G6PDH的活性显著降低，而添加了氨基胍的实施例2试剂即使在30日的温度负荷后仍显示了66.9％的残存活性。并且，由表3和图3可知，与试剂A～F和对照试剂相比，实施例2的试剂中SH基的残存量较多。

综上可判定，作为稳定剂添加了氨基胍的试剂，与不添加氨基胍的试剂及市售的试剂相比，其G6PDH和NAC的保存稳定性较高。