土壤和淡水线虫以及植物线虫的插管检测方法

摘要

土壤和淡水线虫以及植物线虫的插管检测方法，涉及一种生物类群的检测方法，提供一种微生物，为酵母菌Yr0503，菌株分类命名为酵母菌，保藏编号CGMCC No.1336。利用微生物将土壤和淡水线虫及植物线虫诱入检测管鉴定的检测方法的步骤为取检测管，装载玻片，加纤维素，高压灭菌冷却后取出；配培养基，分装，高压灭菌冷却后接种微生物；培养基装入检测管；在土壤中设孔，在孔内注灭菌水，检测管插入土壤孔内留置，拔出检查。方便检验人员操作，使植株免于掘土切根之患，达到保护植物的目的，检测灵敏度高。用于土壤线虫的普查和某些植物线虫病害的调查，也可以检测土壤的线虫为指标进行环境评价。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物类群的检测方法，尤其是涉及一种存在于土壤、淡水和植物中的线虫的插管检测方法。

背景技术

线虫是自然界中广泛分布的一大生物类群，有的寄生于动物、植物体内，有的存在于土壤和水体中。前者引起病害，导致经济损失；后者构成人类食物链的一环，也是土壤和水体自净功能的一个组成部分，同时还是自然界能量循环的一个环节。寄生于农作物的线虫需要检测以获得病原进行准确诊断；对于土壤和水体中的线虫也可以进行检测以评价环境的质量。

现有检测植物线虫都是沿用贝尔曼漏斗法。其基本装置为一合适直径的漏斗，漏斗管端接一段橡皮管，以弹簧止水夹控制管的开闭。漏斗放在铁架的圆环上，其内盛满清水。掘开植株旁边的土壤，切下一部分根系，洗净后剪成1～2cm的小段，包在一块方形的薄纱布内，浸在水内。线虫从根组织中游出，经纱布而沉落在漏斗管底。经一昼夜后，打开弹簧夹，流出少量水，收集在玻璃皿内，水内含有线虫。再用显微镜鉴定水内含有的线虫以属于什么种类。(毕志树，李进，植物线虫学，农业出版社，211-212)。这种方法虽然能够分离出线虫，但是具有明显的缺点：1)取样时伤及植株根系，农民有时难以接受，特别是接近收获的季节；2)费工费时；3)需要用很多漏斗，且占用很多实验室空间。

检测土壤线虫一般选用以下两种方法：

土壤悬浮液倾注法：

在水桶中放3-4L水，然后加入大约500cm³的土壤并用力搅拌以打散土块，于是线虫游离出来。大约静置1min后，土粒沉到底部，线虫就留在悬浮液中。倾注悬浮液，通过各具850、250和45μm筛孔(相当于20、250和325目/平方英寸)的一套筛到第二个桶里，再将液体倒回第一个桶，重复这整个过程，象前面一样搅拌，让土壤沉下，倾注过筛。最后第二桶的水再一次过筛，然后从筛里收集线虫，即用细的水流从筛的背后将它们冲到烧杯内。如果土壤有很多有机物质，那么可通过一个装置让线虫游离出来，即用一块清洁的布扣紧烧杯口，然后将烧杯倒放在一个有水的漏斗中。

高比重溶液差别离心分离法：

首先从土壤中分离悬浮的有机物质，而土壤保留线虫，然后再用高比重溶液分离线虫。把100cm³土壤悬浮在600mL水中并很好地搅拌，通过粗筛注入一个容器中以除去石头、小须根等。将土壤悬浮液分装到各离心管离心5min。土壤通常含很多粘土，离心时土面上会粘着线虫。如果土壤没有粘土，需在离心前加入少量高岭土(Kaolin)。倒掉上清液，擦干离心管上部以除去杂物。加糖溶液到管中(490克蔗糖溶于1000mL水中)。使土壤在管中再悬浮并同上离心，将上清液倒入最细的筛并用自来水收集线虫，让它们在水中利用重力或再次离心而下沉。高比重溶液也可以用其他物质如糖蜜来配制。(①和②引自〔美〕V.H.Dropkin著，潘沧桑·林竞译，植物线虫学导论，厦门：厦门大学出版社，45-47)。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种微生物。

本发明的另一目的旨在提供一种利用微生物将土壤和淡水线虫以及植物线虫诱入检测管鉴定的检测方法。

本发明所说的微生物为酵母菌Yr 0503，酵母菌Yr 0503是从福建省厦门市东孚垃圾填埋场的渗水池的污泥中分离得到的，菌株的分类命名为酵母菌，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册的编号为CGMCC No.1336，株号：Yr 0503，保藏日期：2005年3月24日。

酵母菌Yr 0503的筛选、分离、培养方法如下：

配制玉米粉琼脂培养基(CMA)待用。从垃圾填埋场的渗水池底部挖取污泥，装入灭菌过的容器中带回实验室，在无菌室中挑取一点点污泥，移入经干热灭菌的培养皿(直径可选为9cm)中。熔化CMA培养基，待其冷至凝固前(温度可选为42～45℃)，以无菌操作倒入培养皿内，每皿约20ml，盖上皿盖，立即旋转培养皿，静置，待培养基冷却凝固后将培养皿倒放，转入25℃培养箱内培养。待琼脂平板表面长出菌落时，在解剖镜下寻找似油滴状(有光泽)的菌落，挑取其单个菌落，在CMA或PDA琼脂平板上以斜线法划线接种，使其与混杂的微生物菌种在琼脂平板表面分散开，使单个菌体能固定在一点，在生长繁殖后形成单个菌落，从而达到分离提纯的目的。如果不纯，则还需要继续进行分离纯化。纯化后在25～28℃的培养箱中培养。

本发明所说的利用微生物将土壤和淡水线虫以及植物线虫诱入检测管鉴定的检测方法，其步骤为：

步骤一：取线虫检测管，长3～15cm(优选9cm)，宽1.5～5cm(优选2.9cm)，高1～3cm(优选1.5cm)，其一端封闭，另一端开放；

步骤二：检测管装入载玻片，再往检测管里加入纤维素，管口用过滤物塞住，经高压灭菌，再冷却后取出；

步骤三：配制培养基，培养基为液体培养基或固体培养基；

步骤四：将配制好的液体培养基分装，用过滤物塞住或包住管口，经高压灭菌，冷却后接种微生物菌；

或将配制好的固体培养基分装，用锡箔纸包住管口，经高压灭菌后倾倒成平面，冷却凝固后接种微生物菌；

所说的微生物菌为酵母菌(Yr 0503)、交链孢(Alternaria spp.)、镰刀菌(Fusarium spp.)、头孢霉属未定种(Cephalosporium sp.)、盾克霉属未定种(Coniothyrium sp.)或茎点霉属的一个种(Phoma lingam)等中的一种；

步骤五：将培养好的培养基逐份装入步骤二所完成的检测管中；

步骤六：在待测的土壤或待测植株的根周土壤中设置小孔，在小孔内注入灭菌水，将检测管管口朝下，插入土壤的小孔内；

步骤七：插入土壤中的检测管在土壤中留置3～5天，然后拔出检查，若是透明的检测管，则用解剖镜对着管壁检查；

若是不透明的检测管，则在拔去塞子之后抽出管内的载玻片，在显微镜下观察。

在步骤一中，检测管容2片载玻片装入。

在步骤二中，高压灭菌的温度为121℃，时间为20min，载玻片长7.6cm，宽2.6cm。

在步骤三中，所说的培养基选自糖蜜培养基，淘米水培养基，马铃薯培养基(PDA)，麦芽汁培养基、米曲汁培养基、豆芽汁培养基、草浸汁培养斟、玉米粉培养基(CMA)和察培克培养基中的至少一种。

在步骤四中，将配制好的液体培养基分装，装量为检测管容量的1/5～1/3，温度为121℃，1Kg/cm²高压灭菌20min.，冷却后接种微生物菌，在25～28℃下振荡培养3～7天后，在5～10℃冰箱中冷藏备用。

或将配制好的固体培养基分装入试管内，装量约为管子容量的1/3～1/2，用锡箔纸封口，经高压灭菌后倾倒成平面，冷却凝固后接种微生物菌，在25～28℃下培养3～7天后，在5～10℃冰箱中冷藏备用。

在步骤五中，培养好的微生物菌培养基逐份装入步骤二所完成的检测管中，每只管装量2～5ml，以管内的纤维素吸饱为宜。

在步骤六中，在小孔内注入5～10ml灭菌水。

除了上述可以插入载玻片的管子之外，还可以利用大小不同的试管做检测管。当用试管做检测管时，虽然省却了步骤一和步骤二，但是检查、鉴定时不如上述方法方便，因为鉴定虫种必须把线虫从检测管的管壁上洗下来，再用吸管移到载玻片上进行仔细观察。

无论哪一种检测管，都可以把它放在培养箱中25～28℃培养3～4天后再取出镜检，这样线虫得以繁殖，会大大提高检出率。

用这种方法检测土壤和淡水线虫以及植物线虫，大大方便了检疫检验人员操作，有利于大规模检测；同时使植株免于掘土切根之患，达到保护植物的目的。因为有时土壤和植物中的线虫数量很少，本发明能把线虫诱入管子内，在其培养的微生物上虫量迅速扩增，从而提高检测的灵敏度。本发明用于土壤线虫的普查和某些植物线虫病害的调查，也可以利用本方法以检测土壤的线虫为指标进行环境评价。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

取糖蜜和清水，按1∶8至1∶6的比例稀释，或糖蜜和废糖蜜按1∶20至1∶10的比例稀释，混合后将pH调至5.5至7，以6～6.5最佳。将配制好的液体培养基分装入三角烧瓶内，装量约为烧瓶容量的1/5～1/3，用棉花塞塞住或用8层纱布包住瓶口，经高压灭菌，冷却后接种酵母菌，25～28℃振荡培养3～7天后，将发酵液注入线虫检测管中，每只管装量2～5ml，然后用8层纱布包住管口，或者用灭菌棉花(或其他有孔介质)塞住管口。

在待测的土壤中挖出或钻出一个小孔，在孔内注入5～10ml灭菌水；然后将检测管倒翻过来插入土壤的小孔内。

用这种接种了酵母菌糖蜜发酵液的检测管10支插入校园内10棵榕树的根周土壤中，3天后拔出带回实验室检查，结果9支检测管中有大量自由生活线虫，自由生活线虫的阳性率为90％。

实施例2

与实施例1类似，其不同的是采用固体培养基。将配制好的糖蜜溶液分装入试管，每支试管装量为1/2，用锡铂纸扣住管口，并包住管壁上沿，经高压灭菌后倒成平面，冷却凝固后接种酵母菌，25℃培养3天后取出置于5～10℃冰箱中冷藏备用。

用这种接种了酵母菌的糖蜜琼脂培养基检测管10支插入果园内的10棵柑橘树的根周土壤中，4天后拔出带回实验室检查，结果每支检测管中都有大量线虫，其中有小杆类的线虫，也有长针线虫等能够传播病毒的线虫。线虫阳性率为100％。

实施例3

与实施例1类似，其不同的是培养基用淘米水培养基，将淘米水静置一段时间后倾去上清液，其沉淀物用比重计测定为1.4Be左右，调节pH为6.0～6.5。

用这种加入酵母菌淘米水发酵液的检测管10支插入街道中央绿化带的10株马樱丹的根周土壤中，5天后拔出带回实验室检查，结果9支检测管中有大量线虫，线虫的阳性率为90％。

实施例4

与实施例1类似，其不同的是培养基用马铃薯汁培养基：把200g马铃薯洗净去皮，切成小块或推成细丝，按1∶5的比例加1000ml水(W∶V)，煮沸30min.(注意防止烧糊，可用水浴)，用纱布过滤，滤汁添水至煮前的体积。再加20g蔗糖，调pH至6左右。

用这种加入酵母菌马铃薯汁发酵液的检测管10支插入出入境检验检疫局提供的10份进口的百合球茎的根周土壤中，3天后拔出带回实验室检查，结果每支检测管都有大量自由生活线虫，自由生活线虫的阳性率为100％。

实施例5

与实施例1类似，其不同的是培养基用麦芽汁培养基：把干麦芽粉和水按1∶4的比例混和，在58～65℃下糖化3～4h，得到糖度10°左右(巴林)的麦芽汁，煮沸后纱布过滤，调节pH至6左右。

用这种加入酵母菌麦芽汁发酵液的检测管20支插入果园内10棵香蕉树的根周土壤中，3天后拔出带回实验室检查，结果每支检测管都被有大量线虫，线虫的阳性率为100％。

实施例6

与实施例1类似，其不同的是培养基用米曲汁培养基：将曲霉接种于大米饭上，于28℃培养4天，制成大米曲，风干后称取1kg，加水3L，保温60℃数小时，至无淀粉反应时为止。煮沸，用纱布过滤，加水调至12BX。

用这种加入米曲汁酵母菌发酵液的检测管10支插入校园内10棵龙眼树的根周土壤中，4天后拔出带回实验室检查，结果7支检测管中都有大量线虫，线虫的阳性率为70％。

实施例7

与实施例1类似，其不同的是培养基用豆芽汁培养基：在1000ml水中加入100g黄豆芽，煮沸半小时，用纱布过滤，滤液用水补充至1000ml，加糖50g，自然pH。

用这种加入酵母菌豆芽汁发酵液的检测管10支插入菜园内10株丝瓜的根周土壤中，3天后拔出带回实验室检查，结果每支检测管都有大量线虫，线虫的阳性率为100％。

实施例8

与实施例1类似，其不同的是培养基用草浸汁培养基，其配方为：干草(粉碎)50g或鲜草200g，KH₂PO₄2g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH 5.5～7。干草(常常使用稻草)或鲜草(可用草皮修剪下来的草)在高压灭菌锅中先在120℃下煎煮30min后过滤。

用这种加入酵母菌草浸汁发酵液的检测管10支插入校园内10块草坪的土壤中，3天后拔出带回实验室检查，结果4支检测管中有自由生活线虫，自由生活线虫的阳性率为40％。

实施例9

与实施例1类似，其不同的是培养基为CMA培养基，其配方为：玉米(玉米片)20g，蔗糖20g，琼脂17g，蒸馏水1000ml。玉米片在500ml水中60℃下煮1h。用布过滤，把滤液加入溶于500ml水中的琼脂液中，再加水补足1000ml。

用这种加入酵母菌CMA发酵液的检测管10支插入花圃内10棵四季桔的根周土壤中，5天后拔出带回实验室检查，结果8支检测管中都有大量线虫，线虫的阳性率为80％。

实施例10

与实施例1类似，其不同的是培养基采用察培克(Czapek)培养基，其配方为：NaNO₃3g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，蔗糖30g，琼脂15g，蒸馏水1000ml(蔗糖要在临灭菌前放入)。

用这种加入酵母菌察培克发酵液的检测管10支插入花圃内10株菊花的根周土壤中，3天后拔出带回实验室检查，结果9支检测管中有大量线虫，线虫的阳性率为90％。

实施例11

与实施例1类似，其不同的是其所接种的微生物为交链孢(Alternaria sp.)。

把这种装接种了交链孢的马铃薯汁琼脂培养基检测管20支插入果园内10棵柑橘树的根周土壤中，3天后拔出带回实验室检查，结果16支检测管中有大量线虫，线虫的阳性率为80％。其中有燕麦真滑刃线虫(Aphelenchus avenae)、墙草滑刃线虫(Aph.parietinus)等，此外还有较多的自由生活线虫及其他线虫。

实施例12

与实施例1类似，其不同的是其所接种的微生物为镰刀菌(Fusarium sp.)。把这种装接种了镰刀菌的马铃薯汁琼脂培养基检测管20支插入果园内10棵柑橘树的根周土壤中，5天后拔出带回实验室检查，结果18检测管中有大量线虫，线虫的阳性率为90％。其中有燕麦真滑刃线虫(Aphelenchus avenae)等，此外还有较多的自由生活线虫及其他线虫。

实施例13

与实施例1类似，其不同的是其所接种的微生物为头孢霉属未定种(Cephalosporium sp.)。把这种装接种了头孢霉的马铃薯汁琼脂培养基检测管10支插入市区10棵榕树的根周土壤中，4天后拔出带回实验室检查，结果9支检测管中有大量线虫，线虫的阳性率为90％。其中有较多的自由生活线虫及其他线虫。

实施例14

与实施例1类似，其不同的是其所接种的微生物为盾克霉属未定种(Coniothyrium sp.)。把这种装接种了盾克霉的马铃薯汁琼脂培养基检测管10支插入花圃内10株红紫苏的根周土壤中，4天后拔出带回实验室检查，结果9支检测管中有大量线虫，线虫的阳性率为90％。其中有根结线虫(Meloidogyne spp.)幼虫等，此外还有较多的自由生活线虫。

实施例15

与实施例1类似，其不同的是其所接种的微生物为茎点霉属的一个种(Phoma lingam)。把这种装接种了茎点霉的马铃薯汁琼脂培养基检测管10支插入花圃内10株鸡冠花的根周土壤中，3天后拔出带回实验室检查，结果8支检测管中有大量线虫，线虫的阳性率为80％。其中有根结线虫(Meloidogyne spp.)幼虫等，此外还有较多的自由生活线虫。