含CpG单链脱氧寡核苷酸和利巴韦林联合应用产生的抗病毒作用

摘要

本发明提供了含CpG二核苷酸的单链脱氧寡核苷酸，它们由含一个或多个CpG二核苷酸的脱氧寡核苷酸分子所组成。本发明所提供的含CpG二核苷酸的单链脱氧寡核苷酸和利巴韦林联合应用时表现明显的抗病毒作用，尤其是抗RNA病毒的作用。本发明所提供的含CpG二核苷酸的单链脱氧寡核苷酸和利巴韦林联合应用时可用于治疗和预防病毒感染及病毒感染引起的相关疾病。

说明书

发明领域

本发明涉及一种含CpG二核苷酸的单链脱氧核苷酸和利巴韦林，特别是涉及含CpG二核苷酸的单链脱氧核苷酸和利巴韦林联合应用，本发明所涉及的含CpG二核苷酸的单链脱氧核苷酸和利巴韦林联合应用时可用于病毒感染疾病及病毒感染相关疾病的治疗和预防。本发明所指的病毒包括但不限于流感病毒、口蹄疫病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷性病毒和乳头瘤病毒。本发明还提供了含CpG二核苷酸的单链脱氧核苷酸的序列。

发明背景

CpG ODN是人工合成的含一个或多个CpG二核苷酸的脱氧寡核苷酸单链DNA，其中的CpG是由胞嘧啶和鸟嘌呤通过磷酸连接成的二核苷酸，C代表胞嘧啶，G代表鸟嘌呤，p代表磷酸，胞嘧啶位于5’端。由于序列尤其是CpG两侧的序列的不同，CpG ODN可有多种多样的形式。有些CpG ODN具有明确的免疫调节作用，表现出较好的临床应用价值(Weiner GJ.The immunobiology and clinical potential of immunostimulatory CpGoligodeoxynucleotides.J Leukoc Biol 2000 Oct；68(4)：455-63)。有些CpG ODN的作用具有种属特异性，即对一种动物表现生物学作用的CpG ODN，在另一种动物则未必表现出同样性质或强度的生物学活性(Gunther Hartmann，et al.Delineation of a CpGPhosphorothioate Oligodeoxynucleotide for Activating Primate Immune ResponsesIn Vitro and In Vivol The Journal of Immunology，2000，164：1617-1624)。

根据功能的特点，CpG ODN被分为三种类型：A型CpG ODN(CpG-A ODN)、B型CpG ODN(CpG-B ODN)和C型CpG ODN(CpG-C ODN)。主要表现为激活树突状细胞、天然杀伤细胞、刺激树突状细胞分泌干扰素活性的CpG ODN被归类为A型CpG ODN。A型CpG ODN被期望用于肿瘤、病毒感染性疾病和其它用干扰素治疗的疾病的治疗。主要表现为激活B淋巴细胞，增强体液免疫应答活性的CpG ODN被归类为B型CpG ODN。B型CpG ODN是一类分子佐剂，可增强疫苗的免疫效果。兼备A型CpG ODN和B型CpG ODN主要活性的CpGODN被归类为C型CpG ODN。

实验表明，CpG ODN具有抗病毒的生物学活性。经阴道应用CpG ODN可使小鼠或豚鼠提高抵抗II型单纯疱疹病毒(HSV-2)的能力(Richard B.Pyles et al.Use ofImmunostimulatory sequence-Containing Oligonucleotides as Topical Therapy forGenital Herpes Simplex Virus Type 2 Infection.Journal of Virology，November 2002，Vol.76，No.22 p.11387-11396)。给小鼠应用CpG ODN可减少其呼吸道合胞病毒(RSV)的荷量(Cho JY，et al.Immunostimulatory DNA sequences inhibit respiratorysyncytiai viral load，airway inflammation，and mucus secretion.J Allergy ClinImmunol 2001 Nov；108(5)：697-702)。注射CpG ODN的小鼠在经致死量的HSV-2攻击后，阴道分泌物中病毒滴度明显降低(Harandi AM，Eriksson K，Holmgren J.A protectiverole of locally administered immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotide in amouse model of genital herpes infection.J Virol 2003 Jan；77(2)：953-62)。

利巴韦林(1-β-D-ribofuranosyl-1，2，4-triazole-3-carboxamide，Ribavirin)，也称Virazole，是一种核苷类似物，具有广谱的抗病毒活性(Gilbert，B Eand Knight V.Biochemistry and clinical applications of ribavirin.Antimicrob.Agents Chemother.1986，30(2)：201-205)(Streeter DG，Witkowski JT，Khare GP，Sidwell RW，Bauer RJ，Robins RK，Simon LN.Mechanism of action of 1--D-ribofuranosyl-1，2，4-triazole-3-carboxamide(Virazole)，a newbroad-spectrum antiviral agent.Proc Natl Acad Sci U S A.1973 Apr；70(4)：1174-8.)，被用于多种病毒感染性疾病的治疗(Gilbert，B E and Knight V.Biochemistry andclinical applications of ribavirin.Antimicrob.Agents Chemother.1986，30(2)：201-205)。利巴韦林和α干扰素联合应用是治疗由丙型肝炎病毒感染引起的慢性的丙型肝炎的有效方法(Davis GL，Esteban-Mur R，Rustgi V，Hoefs J，Gordon SC，TrepoC，Shiffman ML，Zeuzem S，Craxi A，Ling MH，Albrecht J。Interferon alfa-2b aloneor in combination with ribavirin for the treatment of relapse of chronic hepatitisC.International Hepatitis Interventional Therapy Group N Engl J Med.1998 Nov19；339(21)：1493-9.)。利巴韦林和长效α干扰素(pegylated interferon，peginterferon)联合应用对治疗丙型肝炎有明显的疗效(Torriani FJ，Rodriguez-Torres M，RockstrohJK，Lissen E，Gonzalez-Garcia J，Lazzarin A，Carosi G，Sasadeusz J，Katlama C，Montaner J，Sette H Jr，Passe S，De Pamphilis J，Duff F，Schrenk UM，DieterichDT；APRICOT Study Group.Peginterferon Alfa-2a plus ribavirin for chronichepatitis C virus infection in HIV-infected patients.N Engl J Med.2004 Jul 29；351(5)：438-50)。

流感病毒是引起人流感的病原体。在1918-1919年，全世界有两千万人死于流感病毒的流行(Patterson，K.D.& Pyle，G.F.(1991)Bull.Hist.Med.65，4-213)。接种疫苗和应用抗病毒药物是防治流感病毒的两类主要方法(Bridges，C.B.，Fukuda，K.，Cox，N.J.& Singleton，J.A.(2001)Morbid.Mortal.Wkly.Rep.50，1-44)，但事实证明，这两类方法均不能有效地控制流感的流行(Webby，R.J.& Webster，R.G.(2001)Philos.Trans.R.Soc.London 356，1817-1828)。在易感人群，接种疫苗的短期(半年)保护率约为39％(Fukuda，K.，N.J.(1999)Morbid.Mortal.Wkly.Rep.48，1-28，Castle，S.C.Clinical relevance of age-related immune dysfunction.ClinInfect Dis.2000 Aug；31(2)：578-85.Epub 2000 Sep 14.Review)。由于流感病毒抗原[血细胞凝集素(HA)和神经酰胺酶(NA)]性的不断变化，现行的疫苗几乎每年都要重新改建结构。由于副作用较大和新的抗药流感病毒株不断出现，一些获得批准的抗流感病毒药物的效果也不理想(Luscher-Mattli，M.Influenza chemotherapy：a review of thepresent state of art and of new drugs in development.Arch Virol.2000；145(11)：2233-48.Review.)。

丙型肝炎病毒(HCV)是引起丙型肝炎的病原体，在全世界感染了大约1亿七千多万人。肝癌和肝硬化是HCV感染引起的两个严重的并发症。在世界范围内，采用α-干扰素和利巴韦林联合应用是治疗丙型肝炎病毒感染的方法，其有效率约为40％[Jon Cohen.Science，1999，285：26-30]。丙型肝炎病毒是一种有包膜的单股正链RNA病毒，属黄病毒科病毒。黄病毒科的另外两种病毒，登革热病毒(Wang WK，Lin SR，Lee CM，King CC，Chang SC.Dengue type 3 virus in plasma is a population of closely related genomes：quasispecies.J Virol.2002 May；76(9)：4662-5.)和日本脑炎病毒(Yun SI，Kim SY，Rice CM，Lee YM.Development and application of a reverse genetics system forJapanese encephalitis virus.J Virol.2003 Jun；77(11)：6450-65.)。登革热病毒、日本脑炎病毒也是单股正链的RNA病毒。由于尚无研究丙型肝炎病毒的细胞和动物模型，采用登革热病毒、日本脑炎病毒做实验获得的结果可在相当的程度上代表用丙型肝炎病毒做细胞实验获得的结果。

口蹄疫(foot-and-mouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒引起的烈性传染病。猪、牛、羊都可感染口蹄疫病毒而发生口蹄疫，轻者在口、舌、唇、蹄、乳房等部位出现水泡、破溃及烂斑等病变，重者发生死亡。口蹄疫的发生和流行会造成巨大的直接和间接的经济损失[江鹏斐，赵启祖，谢庆阁，口蹄疫研究进展中国农业科学1999，32(6)：93～100]。国际兽疫局(OIE)将口蹄疫列为A类家畜传染病。世界各国对预防和控制口蹄疫都十分重视。除屠杀感染口蹄疫的家畜外，接种疫苗是预防和控制口蹄疫的主要措施[M.Woolhouse，2001]。传统的口蹄疫疫苗由灭活的初步纯化的口蹄疫病毒加油佐剂乳化制成的灭活苗，对易感家畜有相当的保护作用，但存在灭活不充分而引发口蹄疫的可能。此外，在生产这种疫苗过程中动用的有活力的口蹄疫病毒是一种不可忽视的潜在传染源。

二十世纪80年代初以来，许多国家投入了大量人力、物力和财力研制新型口蹄疫疫苗，如重组蛋白疫苗，合成肽疫苗，活载体疫苗和D N A疫苗等[Broekhuigsen M P，1987；Morgan D O，1990；Ward，G.，Rieder，E.& Mason，P.W.Plasmid DNA encodingreplicating foot-and-mouth disease virus genomes induces antiviral immuneresponses in swine.Journal of Virology 1997，71，7442-7447.；Berinstein A，TamiC，Taboga O，Smitsaart E，Carrillo E.Protective immunity against foot-and-mouthdisease virus induced by a recombinant vaccinia virus.Vaccine.2000 Apr28；18(21)：2231-8.]。一些疫苗显示了较好的效果，但大部分仍在实验室的探索之中。

口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)是口蹄疫的病原体，是小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的成员，现已发现了7个血清型，即O、A、C型(称欧洲型)，SAT1、SAT2、SAT3型(南非1、2、3型，也称非洲型)和AsiaI型(亚洲I型，称亚洲型)。O型口蹄疫病毒是近年来世界范围内流行较广的血清型。研究表明，针对的体液免疫在肌体抗口蹄疫病毒感染中起主要作用。在家畜体内，口蹄疫病毒中和抗体的水平与其抵抗口蹄疫病毒攻击的能力呈明显的正相关关系[Pay TW，Hingley PJ.Correlation of 140S antigen dose with the serum neutralizing antibody responseand the level of protection induced in cattle by foot-and-mouth diseasevaccines.Vaccine.1987 Mar；5(1)：60-4.]。基于这种观察，许多实验室做了大量实验，在口蹄疫病毒上寻找能刺激机体产生病毒中和抗体的靶点，发现在口蹄疫病毒的外壳蛋白(VP)存在五个侯选的结构[Crowther JR，Farias S，Carpenter WC，Samuel AR.Identification of a fifth neutralizable site on type O foot-and-mouth disease virusfollowing characterization of single and quintuple monoclonal antibody escapemutants.J Gen Virol.1993 Aug；74(Pt 8)：1547-53.；Kitson JD，McCahon D，BelshamGJ.Sequence analysis of monoclonal antibody resistant mutants of type O foot andmouth disease virus：evidence for the involvement of the three surface exposedcapsid proteins in four antigenic sites.Virology.1990 Nov；179(1)：26-34.]，其中的三个位于外壳蛋白1(Vp1)中。实验证明，从口蹄疫病毒中分离出的Vp1蛋白具有良好的免疫原性[Bachrach HL，Moore DM，McKercher PD，Polatnick J.Immune andantibody responses to an isolated capsid protein of foot-and-mouth disease virus.JImmunol.1975 Dec；115(6)：1636-41.；Kleid DG，Yansura D，Small B，Dowbenko D，MooreDM，Grubman MJ，McKercher PD，Morgan DO，Robertson BH，Bachrach HL.Cloned viralprotein vaccine for foot-and-mouth disease：responses in cattle and swine.Science.1981 Dec 4；214(4525)：1125-9.；Strohmaier K，1982；Rodriguez A，Saiz JC，NovellaIS，Andreu D，Sobrino F.Antigenic specificity of porcine T cell response againstfoot-and-mouth disease virus structural proteins：identification of T helperepitopes in VP1.Virology.1994Nov 15；205(1)：24-33.]。用Vp1蛋白的肽段(141-160和200-213)免疫豚鼠和牛产生的中和性抗体能保护动物免于感染口蹄疫病毒[Bittle JL，Houghten RA，Alexander H，Shinnick TM，Sutcliffe JG，Lerner RA，Rowlands DJ，BrownF.Protection against foot-and-mouth disease by immunization with a chemicallysynthesized peptide predicted from the viral nucleotide sequence.Nature.1982 Jul1；298(5869)：30-3.；Pfaff E，Mussgay M，Bohm HO，Schulz GE，Schaller H.Antibodiesagainst a preselected peptide recognize and neutralize foot and mouth diseasevirus.EMBO J.1982；1(7)：869-74.；DiMarchi R，Brooke G，Gale C，Cracknell V，DoelT，Mowat N.Protection of cattle against foot-and-mouth disease by a syntheticpeptide.Science.1986 May 2；232(4750)：639-41.]。VP1 140-160氨基酸构成的“环”状结构暴露在病毒表面，其中的R-G-D序列在口蹄疫病毒高度保守，是口蹄疫病毒结合细胞表面受体的关键结构，可能介导口蹄疫病毒进入被感染的细胞[Jackson T，2002；Almeida MR，1998]。依据VP1环状结构合成的肽段能诱导产生高水平的中和抗体。也有研究表明，用从口蹄疫病毒分离出来的或基因工程方法得到的Vp1蛋白免疫动物，可以产生部分保护作用。通过基因工程手段把Vp1蛋白与某些来源于其他微生物的蛋白融合在一起可以提高Vp1蛋白的免疫原性[Clarke BE，Newton SE，Carroll AR，Francis MJ，Appleyard G，Syred AD，Highfield PE，Rowlands DJ，Brown F.Improved immunogenicityof a peptide epitope after fusion to hepatitis B core protein.Nature.1987 Nov26-Dec 2；330(6146)：381-4.；Corchero JL，Villaverde A.Antigenicity of a viralpeptide displayed on beta-galactosidase fusion proteins is influenced by thepresence of the homologous partner protein.FEMS Microbiol Lett.1996 Nov15；145(1)：77-82.]。

日本脑炎是由黄病毒属的日本脑炎病毒引起的。大多数人感染日本脑炎病毒后都不会发病。多数发病者临床症状较轻，常见发烧、头痛、恶心、倦怠、腹痛或出现意识障碍及精神症状。重症病例多以突发高烧、头痛、呕吐开始，接着出现脑脊膜刺激现象，3-5日出现痉挛、异常行为、肌强直，意识明显变化甚至昏迷、死亡。

日本脑炎在亚洲许多国家，仍然是严重威胁健康的流行病。由于预防注射的实施，日本、南韩及台湾的病例已减少很多，但其邻近的许多国家，包括中国大陆、菲律宾、印尼、马来西亚、印度、尼泊尔等国仍有许多日本脑炎患者，偶有该病的流行。

乙型肝炎病毒是一种DNA病毒。完整的乙型肝炎病毒颗粒直径为42nm，可分为包膜与核心两部分。包膜上的蛋白质称为乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，它在肝细胞内合成，然后释出入血液循环中，本身并无传染性。核心部分含有环状双股的DNA、DNA聚合酶、核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)，是病毒复制的主体，并有传染性。

艾滋病是由于感染了人类免疫缺陷病毒(简称HIV)后引起的一种致死性传染病。HIV主要破坏人体的免疫系统，使机体逐渐丧失防卫能力而不能抵抗外界的各种病原体，因此极易感染一般健康人所不易患的感染性疾病和肿瘤，最终导致死亡。2000年我国艾滋病疫情呈平稳上升趋势，与上一年相比，报告HIV感染者人数增加11.2％，艾滋病病例增加1.3％。截止2000年底，全国31个省、自治区、直辖市(不包括台湾省、香港和澳门特别行政区)累积报告HIV感染者22517例，其中艾滋病病例880例。报告死亡病例496例(AIDS死亡466例)。2000年报告艾滋病死亡病例110例，HIV感染者死亡17例。

艾滋病病毒(HIV)是带有包膜的RNA逆转录病毒，分类上属于逆转录病毒科。HIV呈球形或卵形，直径100-130nm，由包膜和核心两个部分组成。包膜蛋白包括外膜糖蛋白(gp120)和跨膜糖蛋白(gp41)。核心部分由核壳蛋白、两个相同拷贝的核酸基因组RNA和酶类组成。

目前世界已研制了一些能够有效抑制艾滋病病毒的药物，这些药物已能在某种程度上缓解艾滋病病人的症状，延长患者的生命和提高其生活质量。但是，这些药物十分昂贵，且有很大的副作用，而且有些药物长时间使用后对艾滋病病毒就没有效果了。目前，我们国家还没有正式进口或生产这些药物。至今为止，世界上还没有研制出能彻底治愈艾滋病的药物和有效预防艾滋病病毒的疫苗。

乳头瘤病毒属于乳多空病毒科(Papovaviridae)的乳头瘤病毒属，它包括多种动物的乳头瘤病毒和人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)。HPV是一种小的DNA病毒，直径45～55nm，衣壳呈二十面体立体对称，含72个壳微粒，没有囊膜。HPV基因组是一闭环双股DNA，分子量5×106道尔顿。按功能可分为早期区(E区)、晚期区(L区)和非编码区(NCR)三个区域。E区分为E1～E7开放阅读框架，主要编码与病毒复制、转录、调控和细胞转化有关的蛋白。L区分L1和L2，分别编码主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白。NCR是E区与L区间-6.4～1.0bp的DNA片段，可负责转录和复制的调控。

据流行病学调查资料显示：全球乳头瘤病毒的感染率在9-13％左右，即每年大约有6亿3千万人感染乳头瘤病毒。乳头瘤病毒与很多的皮肤粘膜疾病密切相关。乳头瘤病毒的感染可导致皮肤的扁平疣，生殖器的尖锐湿疣，更为严重的是乳头瘤病毒的感染与宫颈癌、阴茎癌和肛门的癌症密切相关。美国每年有大约1％的性生活活跃的成年人患尖锐湿疣，另外还有至少15％的亚临床感染者。(L Koutsky.Epidemiology of genital human papillomavirus infection.Am JMed，May 5，1997；102(5A)：3-8)。据世界卫生组织(WHO)报道，全世界每年新发生的宫颈癌患者4.5万人，其80％的病人位于发展中国家，宫颈癌是仅次于乳腺癌的女性第二杀手。其中，我国每年新发病例13.5万，约占世界的三分之一。近年来由于人乳头状瘤病毒(HPV)感染增多，使宫颈癌发病率明显上升且趋于年轻化。(博生肿瘤咨询)全球每年死于宫颈癌的患者有232000人，其中发展中国家192000人

另有研究证实，单纯疱疹II型病毒和人乳头瘤病毒，是导致宫颈癌的重要生物因子，是生殖系统感染最为常见的病原体。被宫颈单纯疮疹II型病毒感染的妇女宫颈癌的发病率高于健康妇女8倍。人乳头瘤病毒导致宫颈癌的危险比单纯疱疹II型病毒更大。

目前鉴定出的人乳头瘤病毒(HPV)已超过100个型别，根据各型病毒与其致病危害性的不同，将HPV分为低危型、高危型。低危型，主要引起尖锐湿疣等良性病变，其中HPV 6型感染占70％以上、其次是HPV11型(BrownDR.Schroeder JM，Fife KH，etal.Detection of multiplehuman papillomavirus types in condylomata acuminata lesions from otherwise healthy andimmunosuppressed patients.J Clin Microhiol，1999，37(10)：3316-3322)；高危型，主要与宫颈癌、外阴癌、阴茎癌等恶性肿瘤的发生有关，以HPV16型为主。(人乳头瘤病毒分子生物学研究进展 邓燕飞2000年4月国外医学·生理、病理科学与临床分册，第20卷，第2期。)

采取有效的疫苗，预防和治疗乳头瘤病毒感染是预防和治疗宫颈癌和性病并发症的理想途径。科学家一直在进行不懈的探索，试图寻找到一种行之有效的疫苗，如DNA疫苗、病毒载体疫苗和合成肽疫苗等。迄今为止，在世界上尚未研制出有效的乳头瘤病毒疫苗。

发明内容

本发明的目的之一是提供人工合成的含CpG单链脱氧核苷酸(CpG ODN)，它们由含一个或多个CpG的寡核苷酸单链DNA分子构成。CpG ODN的磷酸二酯键可以是非硫化的，部分硫化的，也可以是完全硫化的。人工合成的含CpG单链脱氧核苷酸可以是经化学修饰的。

本发明的目的之二是提供CpG ODN的抗病毒的作用以及CpG ODN和利巴韦林联合应用产生的抗病毒的作用。

本发明的目的之三是提供用CpG ODN和利巴韦林联合应用治疗和预防病毒感染及病毒感引起的相关疾病的方法和设想。

本发明的目的之四是提供用CpG ODN和利巴韦林联合应用治疗和预防包括但不限于由流感病毒、口蹄疫病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷性病毒和乳头瘤病毒感染引起的疾病的方法。

另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其它具有实质性特点的方面和创造性的有益效果对本领域的普通技术人员来说是可以直接推知的。

具体实施方式

在本发明的上下文中，所使用的术语除非另外说明，一般具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。特别地，下列术语具有如下的含义：

优选地，本发明的CpG ODN具有如下所示的序列：

CpG ODN 1：5’-ggggacgatatcgatgggggg-3’

CpG ODN 2：5’-ggggtcgttcgtcgttgggggg-3’

CpG ODN 3：5’-ggggtgcaacgttcagggggg-3’

CpG ODN 4：5’-tcgtgcgacgatcgtcgcagggggg-3’

CpG ODN 5：5’-tcgagcgatcgctcgagggggg-3’

CpG ODN 6：5’-ggggtgctggccgtcgttgggggg-3’

CpG ODN 7：5’-tcgaaacgtttcgggggg-3’

CpG ODN 8：5’-tcgtcgggtgcgacgtcgcagggggg-3’

CpG ODN 9：5’-tcggacgatcgtcgggggg-3’

CpG ODN 10：5’-tcgtcgggtgcgatcgcagggggg-3’

CpG ODN 11：5’-tcgtgcgacgtcgcagatgat-3’

CpG ODN 12：5’-tcgtatgcatcgatgcatagggagg-3’

CpG ODN 13：5’-tcgtcgtttcgtcgttgggg-3’

CpG ODN 14：5′-tcgtcgggtgcatcgatgcagggggg-3′

CpG ODN 15：5’-tcgtcgcagaacgttctgggggg-3’

CpG ODN 16：5’-tcgtcgggtgcgacgtcgca-3’

CpG ODN 17：5’-gtcgttttcgtcgacgaattgggggggg-3’

CpG ODN 18：5’-tcgtcgtcgactcgtggtcggggg-3’

CpG ODN 19：5′-tcggggacgatcgtcgggggg-3′

CpG ODN 20：5’-gggggcgtcgttttcgtcgacgaatt-3’

其中的磷酸二酯键可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。

本发明的CpG ODN可通过已知的方法生产，例如采用固相亚磷酰胺三酯法进行生产。以下的实施例详细地例举了一种生产本发明的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的方法。

在预防和治疗病毒感染和病毒感染引发的疾病时，这些CpG ODN的一次用药剂量为1-5000微克。利巴韦林的用量为300-1000毫克。

CpG ODN的应用方式包括粘膜表面(包括呼吸道、消化道和泌尿生殖道黏膜)应用，皮下、肌肉注射应用，胃肠应用，腹腔应用，静脉注射等方式应用。

利巴韦林的应用方式包括粘膜表面(包括呼吸道、消化道和泌尿生殖道黏膜)应用，皮下、肌肉注射应用，胃肠应用，腹腔应用，静脉注射等方式应用。

下面结合具体的制备实施例和生物学效果实施例，并参照附图进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例

在如下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，例如合成采用固相亚磷酰胺三酯法。

在如下实施例中，所用试剂的来源、商品名和/或有必要列出其组成成分者，均只标明一次。在其后所用相同试剂如无特殊说明，不在赘述上述内容。

实施例1  CpG ODN的制备

采用固相亚磷酰胺三酯法合成CpG ODN

1、试剂和材料：

三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)、可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass)、DMT(二甲氧基三苯甲基)、四氮唑活化剂、乙酸酐、N-甲基咪唑、A、T、C、G四种核苷酸单体、ABI DNA合成仪、高效液相色谱层析仪等

2、方法：

1)脱保护基

用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)脱去连结在可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass)上的核苷酸的保护基团二甲氧基三苯甲基(DMT)，获得游离的5’-羟基端，以供下一步缩合反应。

2)活化

将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3’-端已被活化，但5’-端仍受DMT保护)，此中间体将与可控多孔玻璃上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。

3)连接

亚磷酰胺四唑活性中间体遇到可控多孔玻璃上已脱保护基的核苷酸时，将与其5’-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。

4)封闭

缩合反应后为了防止连在可控多孔玻璃上的未参与反应的5’-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。

5)氧化

缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在可控多孔玻璃上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。

经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到可控多孔玻璃的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5’-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到一DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用腈乙基保护)、纯化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。

未硫化的CpG ODN在ABI 3900 DNA合成仪上合成；全硫化及部分硫化CpG单链脱氧寡核苷酸的合成采用置换法，在ABI 394 DNA合成仪上合成。

实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6中使用的CpG ODN序列均如下所示：

CpG ODN 1：5’-ggggacgatatcgatgggggg-3’

CpG ODN 2：5’-ggggtcgttcgtcgttgggggg-3’

CpG ODN 3：5’-ggggtgcaacgttcagggggg-3’

CpG ODN 4：5’-tcgtgcgacgatcgtcgcagggggg-3’

CpG ODN 5：5’-tcgagcgatcgctcgagggggg-3’

CpG ODN 6：5’-ggggtgctggccgtcgttgggggg-3’

CpG ODN 7：5’-tcgaaacgtttcgggggg-3’

CpG ODN 8：5’-tcgtcgggtgcgacgtcgcagggggg-3’

CpG ODN 9：5’-tcggacgatcgtcgggggg-3’

CpG ODN 10：5’-tcgtcgggtgcgatcgcagggggg-3’

CpG ODN 11：5’-tcgtgcgacgtcgcagatgat-3’

CpG ODN 12：5’-tcgtatgcatcgatgcatagggagg-3’

CpG ODN 13：5’-tcgtcgtttcgtcgttgggg-3’

CpG ODN 14：5′-tcgtcgggtgcatcgatgcagggggg-3′

CpG ODN 15：5’-tcgtcgcagaacgttctgggggg-3’

CpG ODN 16：5’-tcgtcgggtgcgacgtcgca-3’

CpG ODN 17：5’-gtcgttttcgtcgacgaattgggggggg-3’

CpG ODN 18：5’-tcgtcgtcgactcgtggtcggggg-3’

CpG ODN 19：5′-tcggggacgatcgtcgggggg-3′

CpG ODN 20：5’-gggggcgtcgttttcgtcgacgaatt-3’

实施例2  CpG ODN和CpG ODN与利巴韦林联合应用的抗滤泡口炎病毒作用比较

1、滤泡口炎病毒(VSV)的扩增

1)仪器设备和材料：低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管等。

2)RPMI1640培养基：含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL)10.4克，2.0克碳酸氢钠，10单位庆大霉素，加三蒸水至体积1000毫升。0.22微米的滤膜真空泵抽滤除菌、分装。

3)方法：用含10％小牛血清(Invitrogen，经56℃30分钟处理)的RPMI1640培养基培养Vero E6细胞。在100ml培养瓶中长成单层后，更换培养液。加入含滤泡口炎病毒(VSV)的培养液，其含量为10TCID50。设无病毒对照。约24-48小时后，感染VSV的Vero E6细胞全部发生病变，收集病变细胞和上清，将其置-20℃过夜。次晨，将其融解，用吸管猛烈吹打，离心收取上清。在测定TCID50后，将上清贮存于-20℃备用。

2、滤泡口炎病毒(VSV)TCID50的测定

1)仪器设备和材料：低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管等。

2)RPMI1640培养基：含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL)10.4克，2.0克碳酸氢钠，10单位庆大霉素，加三蒸水至体积1000毫升。用0.22微米的滤膜滤过除菌、分装。

3)含10％小牛血清的RPMI1640培养基：10毫升小牛血清(Invitrogen，经56℃30分钟处理)，90毫升RPMI1640培养基。

4)0.5％结晶紫染液：结晶紫0.5克，NaCl 0.85克，溶于50毫升无水乙醚。加3毫升甲醛，47毫升蒸馏水。

5)结晶紫脱色液：50毫升乙二醇单甲醚与50毫升蒸馏水混合。

6)0.25％胰蛋白酶(Trypsin)

7)方法：用0.25％胰蛋白酶消化生长良好的Vero E6细胞，3-5分钟。离心(1000rpm，5分钟)洗涤细胞。用10％小牛血清的RPMI1640培养基调细胞浓度为4×105个/毫升。加细胞悬液于96孔平底培养板(Costar)，每孔100微升，设三个复孔。37℃ CO₂孵箱培养24小时后，细胞形成单层。更换培养液，其中含倍比稀释的待滴定VSV(长春生物制品所)。设无VSV对照。24小时后，用结晶紫染色的方法判定细胞病变的程度。吸弃培养液，每孔加200μl 0.5％结晶紫染液，37℃，15分钟。流水冲掉结晶紫染液。每孔加入200μl结晶紫脱色液，振荡器振荡，使染料完全从细胞内脱出，用分光光度计在540nm波长处比色(Cytokines.A practical approach，second edition，edited by F.R.BALKWILLThe practical approach series.)。以出现50％细胞病变的病毒稀释度的倒数X10为此病毒液的TCID50/毫升数值。

3、人外周血单个核细胞的分离

1)仪器设备和器材：低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、滤菌器、滤过瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管、血球计数板、水平式离心机等。

2)试剂和材料：肝素抗凝的人全血购自长春市中心血站。聚蔗糖-泛影葡胺：比重1.077±0.001，购自北京鼎国生物技术有限公司。RPMI1640培养液：L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL)10.4克，碳酸氢钠2.0克，庆大霉素10万单位，加三蒸水至1000毫升。0.22微米的滤膜抽滤除菌、分装。

3)方法：用聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分层液分离人外周血的单个核细胞。分层液与肝素抗凝外周血的体积比约为2∶1。水平离心(1,000xg，20min)。用吸管吸取含单个核细胞的液带，置入另离心管中。加入等体积的无血清培养液。1,000g离心15min，弃上清。重复洗涤两次。弃上清，用2ml培养液重悬细胞，并进行细胞计数。

4、CpG ODN和CpG ODN和利巴韦林联合应用抗滤泡口炎病毒的作用的测定

用含10％小牛血清的RPMI1640培养基调人外周血单个核细胞的终浓度为3×10⁶个/毫升。加细胞悬液于12孔培养板，每孔2ml。加CpG ODN(1-20)至终浓度6μg/ml。37℃，5％二氧化碳孵箱培养48小时，收集上清。

设立CpG组、利巴韦林组、CpG+利巴韦林组、IMDM组。将生长状态良好的Vero E6细胞接种于96孔培养板，每孔1.3×10⁴个细胞，37°、5％CO₂培养24小时后，CpG组加入1∶100稀释的CpG ODN刺激的人PBMC培养上清，利巴韦林组加入利巴韦林(至终浓度10μmol/l)，CpG+利巴韦林组加入1∶100稀释的CpG ODN刺激的人PBMC培养上清和利巴韦林(浙江诚意药业有限公司)，IMDM组只加入IMDM。继续培养1.5小时后，加入250TCID50/ml的VSV病毒，同时设正常VERO细胞对照组，培养44小时。用结晶紫染色的方法判定细胞病变的程度。吸弃培养液。每孔加200μl 0.5％结晶紫染液，37℃，孵育15分钟。流水冲掉结晶紫染液。每孔加入200微升结晶紫脱色液，振荡器振荡，使染料完全从细胞内脱出，用分光光度计在540nm波长测定分光光度值。

5、结果：CpG ODN组和CpG ODN与利巴韦林联合应用组相比较，CpG ODN与利巴韦林联合应用组的OD值显著地高于CpG ODN组，这一结果说明，CpG ODN具有明显的抗病毒作用，CpG ODN和利巴韦林联合应用具有更显著的抗病毒作用。两组间的OD值比较见表1。

表1  CpG ODN和CpG ODN与利巴韦林联合应用的抗滤泡口炎病毒作用比较

实施例3  CpG ODN和CpG ODNN与利巴韦林联合应用的抗流感病毒作用比较

1、人外周血单个核细胞的分离

1)仪器设备和器材：低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、滤菌器、滤过瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管、血球计数板、水平式离心机等。

2)试剂和材料：肝素抗凝的人全血购自长春市中心血站。聚蔗糖-泛影葡胺：比重1.077±0.001，购自北京鼎国生物技术有限公司。DMEM培养液：1000ml含庆大霉素10万单位。0.22微米的滤膜抽滤除菌、分装。

3)方法：用聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分层液分离人外周血的单个核细胞。分层液与肝素抗凝外周血的体积比约为2∶1。水平离心(1,000xg，20min)。用吸管吸取含单个核细胞的液带，置入另离心管中。加入等体积的无血清培养液。1,000g离心15min，弃上清。重复洗涤两次。弃上清，用2ml培养液重悬细胞，并进行细胞计数。

2、CpG ODN和CpG ODN与利巴韦林联合应用的抗流感病毒作用测定

用DMEM培养液调人外周血单个核细胞的终浓度为3×10⁶个/毫升。加此细胞悬液于12孔培养板，每孔2ml。加CpG ODN至终浓度6μg/ml。37℃，5％二氧化碳孵箱培养48小时，收集上清，检测其抗流感病毒的活性。

设立CpG组、利巴韦林组、CpG+利巴韦林组、DMEM组。用0.3％BSA DMEM调节生长状态良好的Vero E6细胞浓度至3×10⁵个/ml。将细胞接种于96孔平底培养板，每孔1.3×10⁴个细胞，37°and 5％CO₂培养24小时后，CpG组加入1∶100稀释的CpG ODN刺激的人PBMC培养上清，利巴韦林组加入利巴韦林(至终浓度10μmol/l)，CpG+利巴韦林组加入1∶100稀释的CpG ODN刺激的人PBMC培养上清和利巴韦林(浙江诚意药业有限公司)，DMEM组只加入DMEM。继续培养1.5小时后，每孔加入0.3％BSA DMEM(4μg/ml胰酶)稀释的流感病毒液(长春生物制品研究所)200μl，同时设正常VERO细胞对照。37℃、5％CO2孵箱培养44小时，用结晶紫染色的方法判定细胞病变的程度。吸弃培养液。每孔加200μl 0.5％结晶紫染液，37℃，15分钟。流水冲掉结晶紫染液。每孔加入200微升结晶紫脱色液，振荡器振荡，使染料完全从细胞内脱出，用分光光度计在540nM波长测定分光光度值。

3结果：CpG ODN组和CpG ODN与利巴韦林联合应用组相比较，CpG ODN与利巴韦林联合应用组的OD值显著地高于CpG ODN组，这一结果说明，CpG ODN具有明显的抗流感病毒作用，CpG ODN和利巴韦林联合应用具有更显著的抗流感病毒作用。两组间的OD值比较见表2。

表2  CpG ODN和CpG ODNN与利巴韦林联合应用的抗流感病毒作用比较

实施例4  CpG和利巴韦林抗流感病毒的小鼠体内实验

1材料：雌性昆明鼠，14-16克，流感病毒H1N1型肺适应株(FM1)购自长春生物制品所。

2方法：设立正常小鼠对照、模型对照组(阴性对照组)、利巴韦林组、CpG组、利巴韦林加CpG组。CpG组小鼠皮下注射CpG ODN 80μg(CpG ODN 1-20)，48小时后，将流感病毒用0.3％BSA DMEM稀释至10LD₅₀，除正常小鼠对照组外，其它各组小鼠经乙醚麻醉后，鼻腔给予20μl的10LD₅₀的流感病毒。2小时后，采用灌胃的方法给予利巴韦林组小鼠，50mg利巴韦林/kg体重，每只小鼠0.2-0.4ml，每日3次。采用皮下注射的方式给予CpG组小鼠80μgCpG ODN，每两天注射一次。利巴韦林加CpG组，给予利巴韦林和CpG，给药剂量和给药方式同利巴韦林组和CpG组。4天后，解剖小鼠，取肺，称重，判定肺部病变指数。肺部病变指数(Biochemical and Biophysical Research Communications 279，158-161(2000).Inhibitory Effects of an Antisense Oligonucleotide in an Experimentally InfectedMouse Model of Influenza A Virus.)判定指标：

            -未有明显病变

            +25％肺组织发生病变

            ++25-50％肺组织发生病变

            +++50-75％肺组织发生病变

            ++++＞75％肺组织发生病变

3结果：CpG+利巴韦林组小鼠的肺部病变指数显著低于CpG组和利巴韦林组。说明CpG和利巴韦林联合应用具有比CpG和利巴韦林单独应用时更好的效果。各组间肺病变指数的比较见表3。

4结论：CpG ODN具有明显的抗流感病毒作用，CpG ODN和利巴韦林联合应用具有更显著的抗流感病毒作用。

实施例5  CpGODN和CpGODNN与利巴韦林联合应用的抗口蹄疫病毒作用比较

1、人外周血单个核细胞的分离

1)仪器设备和器材：

低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、滤菌器、滤过瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管、血球计数板、水平式离心机等。

2)试剂和材料：O型口蹄疫病毒由内蒙古生物制药厂提供，抗病毒实验在内蒙古生物制药厂进行。肝素抗凝的人全血购自长春市中心血站。聚蔗糖-泛影葡胺：比重1.077±0.001，购自北京鼎国生物技术有限公司。IMDM培养液：1000ml含庆大霉素10万单位。0.22微米的滤膜抽滤除菌、分装。

3)方法：用聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分层液分离人外周血的单个核细胞。分层液与肝素抗凝外周血的体积比约为2∶1。水平离心(1,000xg，20min)。用吸管吸取含单个核细胞的液带，置入另离心管中。加入等体积的无血清培养基。1,000g离心15min，弃上清。重复洗涤两次。弃上清，用2ml培养基重悬细胞并进行细胞计数。

2、CpG ODN和CpG ODN与利巴韦林联合应用的抗口蹄疫病毒作用测定

用含10％胎牛血清的IMDM培养液调人外周血单个核细胞的终浓度为3×10⁶个/毫升。加此细胞悬液于12孔培养板，每孔2ml。加CpG ODN至终浓度6μg/ml。37℃，5％二氧化碳孵箱培养48小时，收集上清，检测其抗口蹄疫病毒的活性。

设立CpG组、利巴韦林组、CpG+利巴韦林组、IMDM组。用5％胎牛血清IMDM调节生长状态良好的BHK细胞浓度至3×10⁵个/ml。将细胞接种于96孔平底培养板，每孔1.3×10⁴个细胞，37°、5％CO₂培养24小时后，CpG组加入1∶100稀释的CpG ODN刺激的人PBMC培养上清，利巴韦林组加入利巴韦林(至终浓度10μmol/l)，CpG+利巴韦林组加入1∶100稀释的CpG ODN刺激的人PBMC培养上清和利巴韦林(浙江诚意药业有限公司)，IMDM组只加入IMDM。继续培养1.5小时后，每孔加入2％FBS IMDM稀释的口蹄疫病毒液(内蒙生物制药厂)200μl，设正常Vero细胞对照。37℃、5％CO2孵箱培养44小时，用结晶紫染色的方法判定细胞病变的程度。吸弃培养液。每孔加200μl 0.5％结晶紫染液，37℃，15分钟。流水冲掉结晶紫染液。每孔加入200微升结晶紫脱色液，振荡器振荡，使染料完全从细胞内脱出，用分光光度计在540nm波长测定分光光度值。

3结果：CpG ODN组和CpG ODN与利巴韦林联合应用组相比较，CpG ODN与利巴韦林联合应用组的OD值显著地高于CpG ODN组，这一结果说明，CpG ODN具有明显的抗口蹄疫病毒作用，CpG ODN和利巴韦林联合应用具有更显著的抗口蹄疫病毒作用。两组间的OD值比较见表4。

表4  CpGODN和CpGODNN与利巴韦林联合应用的抗口蹄疫病毒作用比较

实施例6  CpG ODN和CpG ODNN与利巴韦林联合应用抗单股正链RNA日本脑炎病毒作用比较

1、人外周血单个核细胞的分离同实施例2。

2、获取CpG ODN(6μg/ml)刺激人外周血PBMC培养上清同实施例2。

3、CpG ODN和CpG ODN与利巴韦林联合应用的抗单股正链RNA日本脑炎病毒作用测定

1)材料：日本脑炎病毒购自长春生物制品所。10％FCSRPMI1640完全培养液：同实施例2。

2)方法：

用含10％小牛血清的RPMI1640培养基调人外周血单个核细胞的终浓度为3×10⁶个/毫升。加细胞悬液于12孔培养板，每孔2ml。加CpG ODN至终浓度6μg/ml。37℃，5％二氧化碳孵箱培养48小时，收集上清。

设立CpG组、利巴韦林组、CpG+利巴韦林组、IMDM组。将生长状态良好的BHK细胞接种于96孔培养板，每孔1.3×10⁴个细胞，37°、5％CO₂培养24小时后，CpG组加入1∶100稀释的CpG ODN刺激的人PBMC培养上清，利巴韦林组加入利巴韦林(至终浓度10μmol/l)，CpG+利巴韦林组加入1∶100稀释的CpG ODN刺激的人PBMC培养上清和利巴韦林(浙江诚意药业有限公司)，IMDM组只加入IMDM。继续培养1.5小时后，加入100TCID50/ml的日本脑炎病毒，同时设正常BHK细胞对照，培养44小时。在显微镜下观察细胞病变(CPE)，出现25％的细胞病变记“+”，出现26-50％的细胞病变记“++”，出现51-75％的细胞病变记“+++”，出现76-100％的细胞病变记“++++”。

3)结果(CPE法)：CpG ODN组和CpG ODN与利巴韦林联合应用组相比较，CpG ODN与利巴韦林联合应用组的细胞病变显著地低于CpG ODN组，这一结果说明，CpG ODN具有明显的抗日本脑炎病毒作用，CpG ODN和利巴韦林联合应用具有更显著的抗日本脑炎病毒作用。两组间的细胞病变的比较见表5。

表5  CpG ODN和CpG ODNN与利巴韦林联合应用抗单股正链RNA日本脑炎病毒作用比较

上述的实验结果表明，本发明的CpG ODN具有明显的抗日本脑炎病毒的作用，CpG ODN和利巴韦林联合应用有更显著的抗日本脑炎病毒的作用。丙型肝炎病毒和登革热病毒、日本脑炎病毒一样同是单股正链的RNA病毒，因此，CpG ODN和利巴韦林联合应用同样可以具有抗丙型肝炎病毒的作用。

附表部分

表1  CpG ODN和CpG ODN与利巴韦林联合应用的抗滤泡口炎病毒作用比较

  CpG  ODN  OD值  CpG ODN诱导上清 CpGODN诱导上清+Ribavirin  1  0.512±0.03 0.908±0.05  2  0.498±0.04 1.120±0.13  3  0.625±0.09 1.340±0.08  4  0.523±0.07 1.180±0.10  5  0.465±0.09 0.988±0.03  6  0.533±0.01 0.877±0.11  7  0.476±0.06 1.005±0.12  8  0.516±0.07 0.998±0.08  9  0.487±0.10 1.560±0.14  10  0.678±0.11 1.345±0.09  11  0.576±0.07 1.123±0.13  12  0.765±0.14 1.407±0.09  13  0.816±0.12 1.654±0.14  14  0.569±0.09 1.213±0.11  15  0.659±0.17 1.457±0.19  16  0.789±0.13 1.345±0.08  17  0.499±0.05 1.180±0.15  18  0.522±0.07 1.398±0.11  19  0.609±0.14 1.478±0.18  20  0.712±0.18 1.589±0.16

IMDM组 0.213±0.07

利巴韦林组0.398±0.09

正常VERO细胞：1.625±0.11

表2  CpG ODN和CpG ODNN与利巴韦林联合应用的抗流感病毒作用比较

  CpG  ODN  OD值  CpGODN诱导上清 CpGODN诱导上清+Ribavirin  1  0.678±0.12 1.412±0.16  2  0.569±0.09 1.345±0.11  3  0.729±0.07 1.456±0.19  4  0.801±0.06 1.678±0.18  5  0.599±0.04 1.342±0.09  6  0.499±0.06 1.234±0.06  7  0.612±0.04 1.367±0.06  8  0.579±0.05 1.258±0.03  9  0.578±0.03 1.298±0.06  10  0.621±0.06 1.312±0.07  11  0.587±0.02 1.199±0.05  12  0.703±0.05 1.389±0.08  13  0.698±0.06 1.378±0.07  14  0.709±0.08 1.409±0.09  15  0.567±0.06 1.298±0.08  16  0.721±0.09 1.476±0.09  17  0.691±0.05 1.309±0.07  18  0.580±0.04 1.199±0.05  19  0.615±0.07 1.099±0.08  20  0.745±0.08 1.305±0.07

DMEM组0.245±0.08

利巴韦林组0.423±0.09

正常VERO细胞对照1.328±0.13

表3  CpG ODN和CpG ODN与利巴韦林联合应用抗流感病毒的小鼠体内实验

  CpG  ODN  细胞病变 CpG ODN组 CpG ODN+Ribavirin组  1 ++ +  2 ++ -  3 ++ -  4 +++ +  5 ++ -  6 ++ -  7 ++ -  8 ++ -  9 ++ -  10 ++ +  11 ++ -  12 ++ -  13 ++ -  14 +++ -  15 ++ +  16 ++ -  17 ++ -  18 +++ +  19 ++ -  20 ++ -

模型组(阴性对照)++++

正常细胞组-

利巴韦林组+++

表4  CpGODN和CpGODNN与利巴韦林联合应用的抗口蹄疫病毒作用比较

  CpG  ODN  0D值  CpGODN诱导上清  CpGODN诱导上清+Ribavirin  1  0.678±0.08  1.325±0.07  2  0.895±0.09  1.654±0.12  3  0.567±0.05  1.189±0.10  4  0.901±0.10  1.679±0.11  5  0.697±0.09  1.345±0.09  6  0.713±0.06  1.513±0.10  7  0.890±0.09  1.690±0.11  8  0.541±0.06  1.167±0.10  9  0.900±0.14  1.791±0.18  10  0.734±0.06  1.398±0.09  11  0.499±0.04  1.011±0.02  12  0.590±0.05  0.999±0.01  13  0.609±0.08  1.187±0.06  14  0.714±0.06  1.310±0.08  15  0.824±0.12  1.456±0.19  16  0.766±0.11  1.388±0.16  17  0.578±0.09  1.213±0.12  18  0.643±0.07  1.312±0.09  19  0.719±0.06  1.398±0.09  20  0.890±0.09  1.432±0.12

IMDM组0.267±0.05

利巴韦林组0.561±0.09

正常BHK细胞1.782±0.14

表5  CpG ODN和CpG ODNN与利巴韦林联合应用抗单股正链RNA日本脑炎病毒作用比较

  CpG  ODN  细胞病变 CpGODN诱导上清 CpGODN诱导上清+Ribavirin  1 + -  2 + -  3 + -  4 + -  5 + -  6 + -  7 + -  8 + -  9 + -  10 + -  11 + -  12 + -  13 + -  14 + -  15 + -  16 + -  17 + -  18 + -  19 + -  20 + -

IMDM组++++

利巴韦林组++

正常BHK细胞-

CpG序列

设计序列如下：

(G)n(L)nX1X2CGY1Y2(M)n(G)n

X1＝A，T，G；X2＝A，T；Y1＝A，T；Y2＝A，T，C；L，M＝A，T，C，G；n为0-6

5’-ggggTCgTTCgTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO：1)[121]

5’-ggggATAACgTTgCgggggg-3’(SEQ ID NO：2)[143]

5’-ggggTgCAACgTTCAgggggg-3’(SEQ ID NO：3)[402]

5’-ggggTCCTACgTAggAgggggg-3’(SEQ ID NO：4)[123]

5’-ggggTCCATgACgTTCCTgAAgggggg-3’(SEQ ID NO：5)[603]

5’-gggggACgTCgCCggggggg-3’(SEQ ID NO：6)[118]

5’-ggATCCgTACgCATgggggg-3’(SEQ ID NO：7)[320]

5′-gggggAATCgATTCgggggg-3′(SEQ ID NO：8)[154]

5′-gggATgCATCgATgCATCgggggg-3′(SEQ ID NO：9)[464]

5′-ggTgCgACgTCgCAgggggg-3′(SEQ ID NO：10)[471]

5′-gggACgTACgTCgggggg-3′(SEQ ID NO：11)[390]

5′-gggggATCgACgTCgATCgggggg-3’(SEQ ID NO：12)[322]

5′-ggCgATCgATCgATCggggggg-3′(SEQ ID NO：13)[333]

5’-ggggTCgATCgATCgAgggggg-3′(SEQ ID NO：14)[113]

5’-ggTCgCgATCgCgAgggggg-3’(SEQ ID NO：15)[307]

5’-ggGGTCAACGTTGAgggggG-3’(SEQ ID NO：16)[156]

5’-gTCgTTTTCgTCgACgAATTgggggggg-3’(SEQ ID NO：17)[222]

5’-gTCgTTATCgTTTTTTCgTAgggggg-3’(SEQ ID NO：18)[151]

5’-ggCgTTAACgACgggggg-3’(SEQ ID NO：19)[288]

5’-gTCggCACgCgACgggggg-3’(SEQ ID NO：20)[157]

5’-ggTgCgACgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO：21)[312]

5’-gTCTATTTTgTACgTACgTgggg-3’(SEQ ID NO：22)[360]

5’-gACgTCgACgTCgACgTCAggggg-3’(SEQ ID NO：23)[209]

5’-ggggTCgATCgTTgCTAgCgggggg-3’(SEQ ID NO：24)[399]

5’-gggggACgTTATCgTATTggggggg-3’(SEQ ID NO：25)[600]

5’-ggggTCgTCgTTTgTCgTgTgTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO：26)[408]

5’-ACgATCgATCgATCgggggg-3’(SEQ ID NO：27)[304]

5’-AgACgTCTAACgTCggggg-3’(SEQ ID NO：28)[301]

5’-ggggTgCTggCCgTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO：29)[266]

5’-ggggTCgTTgCCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO：30)[248]

5’-ACCggTATCgATgCCggTgggggg-3’(SEQ ID NO：31)[389]

5’-TTCgTTgCATCgATgCATCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO：32)[287]

(G)n(L)nCG(XY)nCG(M)n(G)n

X＝A，T；Y＝A，T；L，M＝A，T，C，G；n为0-6

5’-ggggACgATACgTCggggggg-3’(SEQ ID NO：33)[546]

5’-ggggACgATATCgATgggggg-3’(SEQ ID NO：34)[1007]

5′-ggACgATCgATCgTgggggg-3′(SEQ ID NO：35)[521]

5′-TCggggACgATCgTCgggggg-3′(SEQ ID NO：36)[677]

5′-gggggATCgATATCgATCgggggg-3′(SEQ ID NO：37)[576]

5′-ggATCgATCgATCgATgggggg-3′(SEQ ID NO：38)[268]

5′-ggTgCATCgATCgATgCAgggggg-3′(SEQ ID NO：39)[101]

5′-ggTgCATCgTACgATgCAgggggg-3′(SEQ ID NO：40)[100]

5’-ggTgCgATCgATCgCAgggggg-3′(SEQ ID NO：41)[134]

5’-gggggggTCgATCgATgggggg-3’(SEQ ID NO：42)[519]

5’-ggggTCgTCgAACgTTgggggg-3’(SEQ ID NO：43)[350]

5’-TgTCgTTCCTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO：44)[387]

5’-TTCgCTTCgCTTTTCgCTTCgCTT-3’-3’(SEQ ID NO：45)[212]

5’-ACCgCCAAggAgAAgCCgCAggAggg-3’(SEQ ID NO：46)[166]

5’-TACAACggCgAggAATACC-3’(SEQ ID NO：47)[176]

5’-gTACAACggCgAggAATACCT-3’(SEQ ID NO：48)[523]

5’-ACCgTCgTTgCCgTCggCCC-3’(SEQ ID NO：49)[230]

5’-TgCTggCCgTCgTT-3’(SEQ ID NO：50)[435]

5’-gTCggCACgCgACg-3’(SEQ ID NO：51)[325]

5’-gTCggCACgCgACgCCCCCC-3’(SEQ ID NO：52)[523]

5’-TCCCgCTggACgTT-3’(SEQ ID NO：53)[188]

5’-TTACCggTTAACgTTggCCggCC-3’(SEQ ID NO：54)[403]

5’-ACCggTTAACgTTgTCCCCgggg-3’(SEQ ID NO：55)[420]

5’-CgTTgACgATCgTCCCATggCggg-3’(SEQ ID NO：56)[104]

5’-TCTgCggCCTTCgTCg-3’(SEQ ID NO：57)[257]

5’-TAgTAACCggTCCggCgCCCCC-3’(SEQ ID NO：58)[221]

5’-TTgCAgCgCTgCCggTggg-3’(SEQ ID NO：59)[611]

5’-CggCCCATCgAgggCgACggC-3’(SEQ ID NO：60)[378]

5’-TCATCgACTCTCgAgCgTTC-3’(SEQ ID NO：61)[599]

5’-ATCgTCgACTCTCgTgTTCTC-3’(SEQ ID NO：62)[201]

5’-TgCAgCTTgCTgCTTgCTgCTTC-3’(SEQ ID NO：63)[153]

5’-ggTgCgACgTCgCAgATgAT-3’(SEQ ID NO：64)[116]

5’-ggTCgAACgTTCgAgATgAT-3’(SEQ ID NO：65)[133]

5’-gggggCgTCgTTTTCgTCgACgAATT-3’(SEQ ID NO：66)[278]

5’-actcgagacgcccgttgatagctt-3’(SEQ ID NO：67)355[244]

5’-AACgTTggCgTCgACgTCAgCgCC-3’(SEQ ID NO：68)[623]

5’-gACgTCgACgTTgACgCT-3’(SEQ ID NO：69)[485]

5’-ggCgTTAACgTTAgCgCT-3’(SEQ ID NO：70)[579]

5’-AgCgCTAgCgCTgACgTT-3’(SEQ ID NO：71)[232]

5’-CTAgACgTTCAAgCgTT-3’(SEQ ID NO：72)[233]

5’-gACgATCgTCgACgATCgTC-3’(SEQ ID NO：73)[344]

5’-gTCgTTCgTAgTCgACTACgAgTT-3’(SEQ ID NO：74)[379]

5’-AAAAgACgTCgACgTCgACgTCTTTT-3’(SEQ ID NO：75)[489]

5’-TgCgACgATCgTCgCACgATCggAT-3’(SEQ ID NO：76)[479]

5’-TgCgACgTCgCACAgCgT-3’(SEQ ID NO：77)[492]

(TCG)n(L)nCG(M)n(G)n

L，M＝A，T，C，G；n为0-6

5’-TCgTTgCCgTCgg-3’(SEQ ID NO：78)[619]

5’-TCgTTgCCgTCggg-3’(SEQ ID NO：79)[577]

5’-TCgTTgCCgTCgggg-3’(SEQ ID NO：80)[533]

5’-TCgTTgCCgTCggggg-3’(SEQ ID NO：81)[537]

5’-TCgTTgCCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO：82)[481]

5’-TCgTTgCCgTCggggggg-3’(SEQ ID NO：83)[177]

5’-TCgTTgCCgTCgggggggg-3’(SEQ ID NO：84)[111]

5’-TCgTTgCCgTCggggggggg-3’(SEQ ID NO：85)[105]

5′-TCgTCgggTgCATCgATgCAgggggg-3′(SEQ ID NO：86)[664]

5’-TCgTCgggTgCAACgTTgCAgggggg-3’(SEQ ID NO：87)[564]

5’-TCgTCgggTgCgTCgACgCAgggggg-3’(SEQ ID NO：88)[542]

5’-TCgTCgggTgCgATCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO：89)[450]

5’-TCgTCgggTgCgACgATCgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO：90)[465]

5’-TCgTCgTgCgACgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO：91)[498]

5’-TCgTCgCAgAACgTTCTgggggg-3’(SEQ ID NO：92)[527]

5’-TCgTgCgACgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO：93)[112]

5’-TCgTgCgACgATCgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO：94)[178]

5’-TCgTATgCATCgATgCATAgggAgg-3’(SEQ ID NO：95)[410]

5’-TCgTgCATCgATgCAgggggg-3’(SEQ ID NO：96)[444]

5’-TCgAAACgTTTCgggggg-3’(SEQ ID NO：97)[532]

5’-TCggACgATCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO：98)[598]

5’-TCgAgCgATCgCTCgAgggggg-3’(SEQ ID NO：99)[555]

5’-TCgTCgCTTTgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO：100)[418]

5’-TCgTCgTTTTgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO：101)[208]

5’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO：102)[302]

5’-TCgTCgggTgCgACgATCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO：103)[290]

5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAggggggg-3’(SEQ ID NO：104)[627]

5’-TCgTCgTTTTgACgATCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO：105)[500]

5’-TCgTTCggggTgCCg-3’(SEQ ID NO：106)[103]

5’-TCgTTCggggTACCgATgggg-3’(SEQ ID NO：107)[578]

5’-TCgTTgCgCTCCCATgCCgggggg-3’(SEQ ID NO：108)[319]

5’-TCgTCgTTTCgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO：109)[205]

5’-TCgTTgTCgTTTCgCTgCCggCggggg-3’(SEQ ID NO：110)[417]

5’-TgCTTgggTggCAgCTgCCAgggggg-3’(SEQ ID NO：111)[427]

5’-TgCTgCTTTgCTgCTTgggg-3’(SEQ ID NO：112)[421]

5’-AACgTTCgACgTCgAACggggggg-3’(SEQ ID NO：113)[453]

5’-AACgACgACgTTggggg-3’(SEQ ID NO：114)[580]

5’-tcgtcgggtgcgacgtcgca-3’(SEQ ID NO：165)[612]

(TCG)n(L)nX1X2CG(M)n

X1＝A，T，G；X2＝A，T；L，M＝A，T，C，G；n为0-6

设计序列如下：

5’-TCgTAACgTTgTTTTTAACgTT-3’(SEQ ID NO：115)[470]

5’-TCgTCgTATACgACgATCgTT-3’(SEQ ID NO：116)[502]

5’-TCgTCgTTTgCgTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO：117)[601]

5’-TCCTgTCgTTTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO：118)[625]

5’-TCgTCgTTgTCgTTCgCT-3’(SEQ ID NO：119)[430]

5’-TCgTCgTTACCgATgACgTCgCCgT-3’(SEQ ID NO：120)[480]

5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAgTCgTCgTT-3’(SEQ ID NO：121)[108]

5’-TCgCCTCgTCgCCTTCgAgC-3’g-3’(SEQ ID NO：122)[102]

5’-TCgTgTgCgTgCCgTTggg-3’T-3’(SEQ ID NO：123)[406]

5’-TCgTCgAgggCgCCggTgAC-3’-3’(SEQ ID NO：124)[560]

5’-TCgTCgCCggTgggggTgTg-3’3’(SEQ ID NO：125)[629]

5’-TCgTCgTACgCAATTgTCTT-3’3’(SEQ ID NO：126)[440]

5’-TCgCCCACCggTgggggggg-3’3’(SEQ ID NO：127)[207]

5’-TCgTCgCAgACCggTCTgggg-3’(SEQ ID NO：128)[615]

5’-TCgTCgCggCCggCgCCCCC-3’(SEQ ID NO：129)[610]

5’-TCgTCgCggCCgCgAggggg-3’(SEQ ID NO：130)[206]

5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgC-3’(SEQ ID NO：131)[119]

5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgCAggCC-3’(SEQ ID NO：132)[570]

5’-TCgTgCAggCCAACgAggCCg-3’(SEQ ID NO：133)[631]

5’-TCgTTgCCgTCggCCC-3’(SEQ ID NO：134)[115]

5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTTTCC-3’(SEQ ID NO：135)[370]

5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCCCC-3’(SEQ ID NO：136)[309]

5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCC-3’(SEQ ID NO：137)[506]

5’-TCgTTgCCgTCggCCCCC-3’(SEQ ID NO：138)[404]

5’-TCgTTgCCgTCggCCCC-3’(SEQ ID NO：139)[203]

5’-TCgTTgCCgT℃ggCCCCCCC-3’(SEQ ID NO：140)[501]

5’-TCgAggACAAgATTCTCgT-3’(SEQ ID NO：141)[305]

5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTT-3’(SEQ ID NO：142)[509]

5’-TCgTCgCgCCgTCACgggggg-3’(SEQ ID NO：143)[630]

5’-TCgTgTgCgTgCCgTTggg-3’(SEQ ID NO：144)[106]

5’-TCgTCgCCgTTgggCggg-3’(SEQ ID NO：145)[117]

5’-TCgTCgACgTCgTTgggCggg-3’(SEQ ID NO：146)[280]

5’-TCgCAgTTgTCgTAACgTTgggCggg-3’(SEQ ID NO：147)[299]

5’-TCgTCgTTggTATgTT-3’(SEQ ID NO：148)[613]

5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO：149)[306]

5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO：150)[309]

5’-TCgTTCggggTgCCg-3’(SEQ ID NO：151)[409]

5’-TCgTTCggggTAACgATT-3’(SEQ ID NO：152)[508]

5’-TCgTTCggggTAACgTT-3’(SEQ ID NO：153)[540]

5’-TCgTTCggggTACCgAT-3’(SEQ ID NO：154)[401]

5’-TCgTACggCCgCCgTACggCggg-3’(SEQ ID NO：155)[607]

5’-TCgCgTCgACTCCCCTCgAgggg-3’(SEQ ID NO：156)[380]

5’-TCgTCgTCgACTCgTggTCggggg-3’(SEQ ID NO：157)[656]

5’-TCgggCgCCCgATCgggggg-3’(SEQ ID NO：158)[310]

5’-TCgTCggTCTTTCgAAATT-3’(SEQ ID NO：159)[109]

5’-TCgTgACgTCCTCgAgTT-3’(SEQ ID NO：160)[330]

5’-TCgTCTTTCgACTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO：161)[605]

5’-TCgTCgTTTTgCgTTCTC-3’(SEQ ID NO：162)[504]

5’-TCgACTTTCgTCgTTCTgTT-3’(SEQ ID NO：163)[407]

5’-TCgTCgTTTCgTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO：164)[550]

5’-TCgTTCTCgACTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO：166)[277]

5’-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3’(SEQ ID NO：167)[667]

5’-TCgTCgACgTCgTTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO：168)[705]

5’-TCgTgCgACgTCgCAgATgAT-3’(SEQ ID NO：169)[114]

5’-TCgTCgAgCgCTCgATCggAT-3’(SEQ ID NO：170)[211]

5’-TCgTCgTTTCgTAgTCgTTgACgTCggg-3’(SEQ ID NO：171)[204]

5’-TCgTCggACgTTTTCCgACgTTCT-3’(SEQ ID NO：172)[308]

5’-TCgTCgTTTTCgTCgTTTTCgTCgTT-3’(SEQ ID NO：173)[340]

5’-TCgTCgTTTgTCgTgTgTCgTT-3；(SEQ ID NO：174)[503]

5’-TCgTCgTTggTCggggTCgTTggggTCgTT-3’(SEQ ID NO：175)[405]

5’-TCgTCgTTTCgTCTCTCgTT-3’(SEQ ID NO：176)[614]

5’-TCgTCgTTTTgCTgCgTCgTT-3’(SEQ ID NO：177)[505]

5’-TCgAgCgTTTTCgCTCgAATT-3’(SEQ ID NO：178)[530]

包含TTCGTCG的序列

5’-TTCgTCgTTTgATCgATgTTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO：179)[507]

5’-TTCgTCgTTgTgATCgATgggggg-3’-3’(SEQ ID NO：180)[210]

5’-TATCgATgTTTTTCgTCgTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO：181)[202]

5’-TCgACTTTCgTCgTTCTgTT-3’(SEQ ID NO：182)[303]

5’-TCgTCgTTTCgTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO：183)[491]

5’-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3’(SEQ ID NO：184)[590]

5’-TCgTCgTTTTCgTCgTTTTCgTCgTT-3’(SEQ ID NO：185)[633]