法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-04-10
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12Q1/68 授权公告日:20080227 终止日期:20120220 申请日:20060220
专利权的终止
2008-02-27
授权
授权
2006-12-20
实质审查的生效
实质审查的生效
2006-10-18
公开
公开
(一)技术领域
本发明涉及基因分析检测产品,具体地说是基因检测芯片,更具体的说是适用于检测血小板糖蛋白HPA-1和HPA-2基因型的基因检测芯片。本发明还涉及检测血小板糖蛋白HPA-1和HPA-2基因型的方法。
(二)背景技术
血小板为无核的血细胞。血小板的功能主要是促进止血和加速凝血,同时血小板还有维护毛细血管壁完整性的功能。血小板在止血和凝血过程中,具有形成血栓,堵塞创口,释放与凝血有关的各种因子等功能。在血液快速流动的动脉和小动脉系统形成血栓的过程中,血小板起着核心作用。
血小板膜含有多种蛋白质,这些蛋白质往往连接有大量的碳水化合物支链而成为糖蛋白。血小板糖蛋白不但对维持血小板形态及完整性至关重要,并且构成了血小板的各种受体,使血小板发挥止血及有关的功能。血小板糖蛋白基因发生变异时,可改变血小板糖蛋白结构和表达水平,进而影响血小板的黏附、聚集和血栓形成。
随着分子生物学和单克隆抗体技术的进展,许多血小板糖蛋白的基因序列已得到证实,并使得对血小板糖蛋白多态性的深入研究成为可能。此后,在关于血小板糖蛋白的生物化学本质、功能及其分子生物学研究方面取得巨大进步。血小板糖蛋白基因上存在人类血小板同种异型抗原系统(human platelet alloantigen,HPA),每个抗原系统是由共显性双等位基因控制。对血小板糖蛋白IIIa和糖蛋白Ib的基因序列研究发现,在血小板糖蛋白IIIa基因的第2号外显子上存在HPA-1 1a/1b等位基因,血小板糖蛋白Ib基因的受体结合区存在HPA-2 2a/2b等位基因。
血小板输注在临床中有着重要的作用。然而,由于血小板上存在特异性血小板抗原,临床使用时往往因抗原不合而发生血小板输注无效、输血后紫癜等。更为严重的是,许多患者由于血小板减少,且输注无效,影响了临床治疗的开展和进行,甚至发生出血、死亡。因此,在输注血小板以前检测受体和供体的特异性血小板抗原,有助于避免因抗原不合而造成的不良后果。另外,近年来有文献报道血小板糖蛋白HPA-1、HPA-2多态性和心肌梗塞以及缺血性脑血管病相关,HPA-1、HPA-2基因变异是心肌梗塞和缺血性脑血管病的危险因素。因而,快速而准确地检测HPA-1、HPA-2基因变异对临床个体化治疗、医学研究和新型抗血栓药物-血小板糖蛋白抑制剂的开发、评价等具有重要意义。
近年来,检测HPA-1、HPA-2基因型方法的研究备受关注。但目前的检测方法主要采用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)、手工或自动测序、序列特异性引物PCR等方法,不仅操作繁琐,检测周期长,而且影响检测结果的因素多,不易控制,难以满足实际应用的要求,使药物研究单位和临床至今还无法广泛开展有关HPA-1和HPA-2基因型的检测。
基因芯片是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一。它是将能反映样本中大量基因信息的基因探针(寡核苷酸探针、cDNA克隆、PCR产物等),有序固定在固相支持物(如醛基、氨基、巯基、羧基等活性基团修饰的载玻片或硅片、尼龙膜、硝酸纤维素膜)上形成阵列,通过与实际样本(或扩增产物)进行杂交反应,只需一次实验,就可高通量获得所有待检基因的信息。这种平行检测、高信息通量的特点使其在基因表达、基因多态性检测等方面的应用受到广泛重视。用基因芯片检测HPA-1和HPA-2基因型,发挥基因芯片检测操作简单、结果准确的特点,对于药物研究单位和临床的相关应用具有重要的现实意义。
(三)发明内容
本发明针对现有技术的不足,提供一种用于检测血小板糖蛋白HPA-1、HPA-2基因型的基因检测芯片。
本发明还提供一种用基因检测芯片检测血小板糖蛋白HPA-1、HPA-2基因型的检测方法。
本发明提供的基因芯片,包括固相支持物和有序固定在所述固相支持物上的寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探针在5′端包含一段氨基修饰的16聚的聚脱氧胸苷酸(聚dT),各探针序列是:
HPA1-1a allele:NH2-5’-tttttttttttttttt-ggtgagcccGgaggcagggcct-3’
(SEQ ID NO:1)
HPA1-1b allele:NH2-5’-tttttttttttttttt-ggtgagcccAgaggcagggcct-3’
(SEQ ID NO:2)
HPA2-2a allele:NH2-5’-tttttttttttttttt-gggctcctgaTgcccacacccaa-3’
(SEQ ID NO:3)
HPA2-2b allele:NH2-5’-tttttttttttttttt-gggctcctgaCgcccacacccaa-3’
(SEQ ID NO:4)
为了增强检测信号的强度,提高检测结果的准确率,所述HPA-1和HPA-2突变位点序列中大写字母表示的碱基最好位于所述探针的中部。
本发明的寡核苷酸探针序列是根据以下序列或其互补序列中的包括HPA-1和HPA-2多态位点在内的连续核苷酸序列而设计获得的:
HPA1-1a allele:ctccttcaggtcacagcgaggtgagcccGgaggcagggcctgtaagacagga
(SEQ ID NO:5)
HPA1-1b allele:ctccttcaggtcacagcgaggtgagcccAgaggcagggcetgtaagacagga
(SEQ ID NO:6)
HPA2-2a allele:gaagaccctgcccccagggctcctgaTgcccacacccaagctggagaagctc
(SEQ ID NO:7)
HPA2-2b allele:gaagaccctgcccccagggctcctgaCgcccacacccaagctggagaagctc
(SEQ ID NO:8)
所述固相支持物可采用各种基因芯片领域的常用材料,如但不限于尼龙膜,经活性基团修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
上述修饰的玻片或硅片的活性基团如但不限于醛基、氨基、异硫氰酸基等,优选醛基修饰的玻片或硅片。
本发明基因芯片的制备可按照生物芯片的常规制造方法进行。例如,如果固相支持物采用的是修饰玻片或硅片,探针的5′端含有氨基修饰的聚dT串,可将寡核苷酸探针配制成溶液,然后用点样仪将其点在修饰玻片或硅片,排列成预定的序列或阵列,然后通过放置过夜来固定,就可得到本发明的基因芯片。如果寡核苷酸探针不含氨基修饰,则其制备方法也可参照:王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》和马立人,蒋中华主编.生物芯片.北京:化学工业出版社,2000,1-130。
本发明还提供了一种非以诊断为目的检测HPA-1和HPA-2基因型的方法,包括以下步骤:
(1)制备染色体DNA;
(2)用聚合酶链反应(PCR)方法扩增血小板糖蛋白IIIa和糖蛋白Ib基因中包含HPA-1和HPA-2多态位点的基因片段,包括引物设计;
(3)标记上述扩增产物;
(4)将上述标记的扩增产物与上述的基因芯片杂交;
(5)检测基因芯片的杂交信号。
制备用于PCR扩增的染色体DNA的方法有很多,可以从全血中制备、也可以从发根中制备,还可以从口腔粘膜的脱落物中制备。具体方法可参阅丁振诺,苏明权主编.《临床PCR基因诊断技术》,世界图书出版公司.1998年第一版。
用PCR方法扩增染色体基因特定片段的方法已经是本领域公知技术。其中的关键在于引物设计,有关引物设计的方法、软件均可以从商业途径获得。本发明涉及的HPA-1和HPA-2基因多态性的扩增引物和体系可根据以上方法及有关文献方法由使用者独立完成。如KB穆里斯,F.费里,R.吉布斯等主编《PCR聚合酶链式反应》,科学出版社。
对扩增产物进行标记可以通过采用5′端带标记基团的引物进行扩增的方法,也可通过在扩增过程中掺入带标记基团的单核苷酸的方法加以实现,所述标记基团包括但不限于:地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生物分子(FITC等)、其他荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法以及各标记物的检测方法都已是本领域众所周知的常规技术,也可以参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》;J.萨姆布鲁克,E.F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯主编,《分子克隆实验指南》,科学出版社,1995年;马立人,蒋中华主编,《生物芯片》,北京:化学工业出版社,2000,1-130。
扩增产物的变性可采用常规变性方法,本发明优选加热至94~98℃,并保温2~10min,然后迅速置冰上。
取适量变性的扩增产物加入杂交缓冲液中与基因芯片杂交。与基因芯片杂交时,可以先将基因芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。
本发明扩增产物与基因芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行,本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样品浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》;J.萨姆布鲁克,E.F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯主编,《分子克隆实验指南》,科学出版社,1995年。
然后根据标记信号在基因芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。本发明所述检测基因芯片杂交信号的方法是基于与抗生物素抗体或亲合素或链亲合素或抗地高辛抗体或抗荧光素抗体复合在一起的碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶催化的四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺盐(BCIP)或四甲基联苯胺(TMB)的显色反应。具体方法可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》。若扩增产物用荧光基团标记,也可以直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等)获取待测信息。
本发明还提供一种用于检测HPA-1和HPA-2基因型的试剂盒,该试剂盒包含本发明所说的基因芯片和使用说明书,使用说明书包含非以诊断为目的检测HPA-1和HPA-2基因型的方法及上述现有技术的相关内容。
本发明提供的基因芯片及其试剂盒,可用于HPA-1和HPA-2基因型,这对于药物研究单位和临床有针对性的治疗等相关应用提供了一种简便易行的解决方案。
(四)附图说明
图1:本发明基因芯片上的一种点样列阵;
图2:用本发明基因芯片检测HPA-1和HPA-2基因型所得结果的照片。
(五)具体实施方式
以下实施例是对本发明的更详细的说明,而不是对本发明范围的限定。
实施例1:基因芯片的制备
购置醛基修饰的载玻片(产品编号:BSM03011,上海百傲科技有限公司)。人工合成(上海生工生物工程技术服务有限公司)以下探针,用水溶解成(100pmol/ul)浓度,然后用2×点样buffer(产品编号:BST02010,上海百傲科技有限公司)等比混合。接着,用Affymetrix公司的GMS417点样仪按说明书所述方法点制如图1的阵列。然后室温放置过夜。
其中各探针序列为:
HPA1-1a allele:NH2-5’-tttttttttttttttt-ggtgagcccGgaggcagggcct-3’
(SEQ ID NO:1)
HPA1-1b allele:NH2-5’-tttttttttttttttt-ggtgagcccAgaggcagggcct-3’
(SEQ ID NO:2)
HPA2-2a allele:NH2-5’-tttttttttttttttt-gggctcctgaTgcccacacccaa-3’
(SEQ ID NO:3)
HPA2-2b allele:NH2-5’-tttttttttttttttt-gggctcctgaCgcccacacccaa-3’
(SEQ ID NO:4)
实施例2:染色体DNA的制备
取待检者全血500μl,用一次性无菌注射针头抽取,收集于含50ul的2%EDTA溶液的无菌1.5ml离心管中,将管盖盖上,上下颠倒数次,使混匀。取无菌的1.5ml离心管,向其中加入混匀的待检全血100μl和纯水300μl,充分混匀,室温静置8分钟;将离心管置离心机中,6000g离心1分钟;取出离心管,倾去上清液,离心管底部可见少量白色沉淀;向离心管中加入抽提液(产品编号:BST01010,上海百傲科技有限公司)60μl,充分振荡使沉淀溶解;沸水浴中15分钟;取出离心管,置离心机中,12,000g离心15分钟。离心后上清液可直接用于PCR扩增。
实施例3:用PCR方法扩增HPA-1和HPA-2基因多态性片段
委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成以下引物:
HPA1上游引物:5’-ctgacttgagtgacctgggag-3’
(SEQ ID NO:9)
HPA1下游引物:Biotin-5’-cttagctattgggaagtggtagg-3’
(SEQ ID NO:10)
HPA2上游引物:5’-gacgtctccttcaaccggctg-3’
(SEQ ID NO:11)
HPA2下游引物:5’-Biotin-ggtattgtatacagcgagttctcttg-3’
(SEQ ID NO:12)
然后用水溶解并稀释至10pmol/μl。将购置的Taq酶(产品编号:Lot,CE1101-1,TaKaRa)、10×缓冲液(产品编号:Lot,A2401-2,TaKaRa)、dNTP(产品编号:D0056,上海生工生物工程技术服务有限公司)、纯水以及实施例2获得的PCR扩增模板按以下配方配制PCR扩增体系:
用PCR扩增仪Tc-25/H(杭州大和热磁电子有限公司)按以下程序扩增:94℃,5min,然后按94℃25sec,56℃25sec,72℃25sec做40个循环,最后72℃5min。
实施例4:PCR产物与基因芯片的杂交
采用上海百傲科技有限公司的芯片杂交试剂盒与芯片显色试剂盒进行此杂交试验。所述芯片杂交试剂盒(产品编号:BST05010,上海百傲科技有限公司)包含:预杂交液,杂交缓冲液,洗液1,反应舱。所述芯片显色试剂盒(产品编号:BST06010,上海百傲科技有限公司)包含:抗体液,洗液2,洗液3,显色液。
(1)将实施例1的基因芯片用预杂交液预杂交5min,然后除去预杂交液。芯片的预杂交温度为39℃。
(2)将实施例3获得的PCR扩增产物混合后先98℃变性5min,然后取10μl加至190μl杂交缓冲液中混匀,与预杂交完毕的基因芯片进行30分钟杂交反应,杂交温度为39℃。
(3)将杂交完毕的基因芯片用已预热至杂交温度的洗液1洗两次,每次10分钟;
(4)然后用洗液2室温洗2分钟;
(5)将基因芯片与抗体液室温反应20分钟;
(6)然后将基因芯片用洗液2室温洗5分钟,再重复此步骤一次;再用洗液3室温洗2分钟。
(7)在基因芯片上加显色液200μl,39℃放置40分钟。然后用水冲洗干净,晾干。
实施例5:基因芯片杂交信号的检测
将杂交并洗涤完毕的基因芯片置于Baio BE3.0生物芯片识读仪(BSE01021,上海百傲科技有限公司)上扫描后得到如图2所示的检测结果。结果表明受检者的HPA1和HPA2基因型为:HPA1:1a/1b;HPA2:2a。检测结果经测序结果验证完全符合。
序列表
<110>张涌
<120>一种血小板糖蛋白HPA-1和HPA-2基因型检测芯片及其用途
<170>Patent In3.1
<212>PRT
<400>1-12
HPA1-1a allele:NH2-5’-tttttttttttttttt-ggtgagcccGgaggcagggcct-3’
(SEQ ID NO:1)
HPA1-1b allele:NH2-5’-tttttttttttttttt-ggtgagcccAgaggcagggcct-3’
(SEQ ID NO:2)
HPA2-2a allele:NH2-5’-tttttttttttttttt-gggctcctgaTgcccacacccaa-3’
(SEQ ID NO:3)
HPA2-2b allele:NH2-5’-tttttttttttttttt-gggctcctgaCgcccacacccaa-3’
(SEQ ID NO:4)
HPA1-1a allele:ctccttcaggtcacagcgaggtgagcccGgaggcagggcctgtaagacagga
(SEQ ID NO:5)
HPA1-1b allele:ctccttcaggtcacagcgaggtgagcccAgaggcagggcctgtaagacagga
(SEQ ID NO:6)
HPA2-2a allele:gaagaccctgcccccagggctcctgaTgcccacacccaagctggagaagctc
(SEQ ID NO:7)
HPA2-2b allele:gaagaccctgcccccagggctcctgaCgcccacacccaagctggagaagctc
(SEQ ID NO:8)
HPA1上游引物:5’-ctgacttgagtgacctgggag-3’
(SEQ ID NO:9)
HPA1下游引物:Biotin-5’-cttagctattgggaagtggtagg-3’
(SEQ ID NO:10)
HPA2上游引物:5’-gacgtctccttcaaccggctg-3’
(SEQ ID NO:11)
HPA2下游引物:5’-Biotin-ggtattgtatacagcgagttctcttg-3’
(SEQ ID NO:12)
机译: DNA探针/芯片,用于检测特征性感染症状的病原菌,基因型分析和抗生素耐受性基因型分析,试剂盒的分析方法,以及使用此{DNAchip,试剂盒或基因分型试剂盒引起性传播疾病和基因分型的方法和基因分型方法
机译: 混合培养的哺乳动物细胞粘液菌-单克隆抗体对人血小板糖蛋白IIB-IIIA的生产和单克隆抗体对人血小板糖蛋白IIB-IIIA的生产
机译: 杂交培养的哺乳动物细胞粘液菌-单克隆抗体对人血小板糖蛋白IIB-IIIA和单克隆抗体FRA MON对人血小板糖蛋白IIB-IIIA的产生