用血管内皮生长因子受体拮抗剂抑制肿瘤生长的联合疗法

摘要

本发明提供一种减轻或抑制哺乳动物中肿瘤生长的方法，包括用治疗有效量的VEGF受体拮抗剂与放疗，化疗，和/或其它受体拮抗剂联合治疗哺乳动物。

说明书

本申请是尚未批准的，2001年3月2日提交的申请号09/798,689的部分继续申请，申请号09/798,689是尚未批准的，1999年9月22日提交的申请号09/401,163的部分继续申请，申请号09/401,163是尚未批准的，1997年11月10日提交的申请号08/967,113的部分继续申请，申请号08/967,113是1996年9月3日提交的专利号5,861,499的部分继续申请，专利号5,861,499是已经放弃的，1995年6月7日提交的申请号08/476,533的部分继续申请，申请号08/476,533是1994年10月20日提交的专利号5,840,301的部分继续申请，专利号5,840,301是已经放弃的，1994年2月10日提交的申请号08/196,041的部分继续申请。前面提到的在先申请的全部内容都引入此处作为参考。

                        发明领域

本发明涉及利用血管内皮生长因子(VEGF)受体拮抗剂与化疗剂，放疗，和/或其它生长因子受体拮抗剂联合治疗肿瘤的方法。

                        发明背景

血管发生是指毛细血管从预先存在于胚胎和成体生物中的血管形成，已知血管发生是肿瘤生长，存活和转移的重要因素。生长因子及其受体，包括表皮生长因子(EGF)，转化生长因子-α(TGF-α)，转化生长因子-β(TGF-β)，酸性和碱性成纤维细胞生长因子(aFGF和bFGF)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，和血管内皮生长因子(VEGF)在肿瘤的血管发生中发挥作用。见Klagsbrun & D’Amore，Annual Rev.Physiol.，53：217-239(1991)。这些生长因子与其细胞表面受体的结合可诱导受体活化，引发并修饰信号转导途径，导致细胞增殖和分化。VEGF，一种内皮细胞-特异性促有丝分裂剂，则与这些因子不同，这是因为它是通过特异性促进内皮细胞增殖而作为血管发生诱导剂起作用的。

VEGF是一种由两个23kD的亚单位组成的同种型二聚糖蛋白，而且它是一种较强的血管渗透性诱导剂，内皮细胞迁移和增殖的刺激剂，对于新形成的血管而言是重要的存活因素。VEGF有4种不同的单体同种型，它们是从mRNA的可变剪接产生的。它们包括两种膜结合形式(VEGF₂₀₆和VEGF₁₈₉)和两种可溶形式(VEGF₁₆₅和VEGF₁₂₁)。在除胎盘外的所有人类组织中，VEGF₁₆₅同种型的含量最高。

VEGF是血管发生的重要调节剂，血管发生是指新血管由于内皮前体的原位分化(成血管细胞)而从头发育，VEGF在胚胎组织(Breier等，Development(Camb.)，114：521(1992))，巨噬细胞，以及伤口愈合过程中的增殖表皮角质形成细胞(Brown等，J.Exp.Med.，176：1375(1992))中表达，而且涉及与炎症有关的组织水肿(Ferrara等，Endocr.Rev.，13：18(1992))。原位杂交研究已经证实，VEGF在很多人肿瘤系中高水平表达，包括多形性成胶质细胞瘤，成血管细胞瘤，中枢神经系统瘤和AIDS-相关性卡波济氏肉瘤(Plate等，(1992)Nature 359：845-848；Plate等(1993)CancerRes.53：5822-5827；Berkman等(1993)J.Clin.Invest.91：153-159；Nakamura等(1992)AIDS Weekly，13(1))。高水平的VEGF也可在低氧诱导的血管发生中观察到(Shweiki等，(1992)Nature359：843-845)。

VEGF的生物反应是通过其高亲和性受体介导的，它们在胚胎发生(Millauer，Cell，72：835-846(1993))和肿瘤形成过程中的内皮细胞上选择性表达。VEGF受体(VEGFRs)通常是III类受体型酪氨酸激酶，其特征在于它们氨基末端的胞外受体配体结合域中有若干，通常是5或7个免疫球蛋白样的环(Kaipainen等，J.Exp.Med.，178：2077-2088(1993))。另外两个区包括一个跨膜区和一个羧基末端胞内催化域，其可被不同长度的亲水性内激酶(interkinase)序列的插入，也称作激酶插入域断开(Terman等，Oncogene，6：1677-1683(1991))。VEGFRs包括由Shibuya等，Oncogene，5：519-524(1990)测序的fins样酪氨酸激酶受体(flt-1)，或VEGFR-1，在1992年2月20日提交的WO92/14248，和Terman等，Oncogene，6：1677-1683(1991)中描述，并由Matthews等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：9026-9030(1991)测序的，含有激酶插入域的受体/胎儿肝激酶(KDR/flk-1)，或VEGFR-2，当然其它受体，如neuropilin-1和-2也能结合VEGF。其它酪氨酸激酶受体，VEGFR-3(flt-4)，可结合VEGF的同源物VEGF-C和VEGF-D，而且在淋巴管的发育中更为重要。

高水平的Flk-1是由漫润神经胶质瘤的内皮细胞表达的(Plate等，(1992)Nature 359：845-848)。Flk-1的水平可被人成胶质细胞瘤产生的VEGF特异性上调(Plate等，(1993)CancerRes.53：5822-5827)。Flk-1在与内皮细胞(GAEC)有关的成胶质细胞瘤中的高水平表达表明，受体活性很可能是在肿瘤形成过程中被诱导的，这是因为在正常的脑内皮细胞中几乎检测不到Flk-1转录物。这种上调被限定在与肿瘤很近的血管内皮细胞。用中和抗-VEGF单克隆抗体(mAbs)阻断VEGF活性可抑制人肿瘤的异种移植物在裸鼠中生长(Kim等，(1993)Nature 362：841-844)，从而表明VEGF在与肿瘤有关的血管发生中的直接作用。

虽然VEGF配体在肿瘤细胞中是上调的，而且其受体在浸润肿瘤的血管内皮细胞中也是上调的，但VEGF配体及其受体在与血管发生无关的正常细胞中的表达水平较低。因此，这种正常细胞不会由于阻断VEGF及其受体间的相互作用而受到影响，从而抑制血管发生及肿瘤生长。

本发明的目的是提供VEGF受体的拮抗剂。本发明另一个目的是提供使用这种VEGF受体拮抗剂，特别是使用这种VEGF受体拮抗剂与放疗，化疗或其它受体拮抗剂联合抑制血管发生，由此抑制或减轻哺乳动物肿瘤生长的方法。

                        发明简述

本发明提供通过给予治疗有效量的VEGF受体拮抗剂和其它受体拮抗剂的联合而减轻或抑制哺乳动物肿瘤生长的方法。本发明还提供通过给予治疗有效量的VEGF受体拮抗剂和放疗的联合而减轻或抑制哺乳动物肿瘤生长的方法。此外，本发明提供通过给予治疗有效量的VEGF受体拮抗剂和化疗剂的联合而减轻或抑制哺乳动物肿瘤生长的方法。

                        附图简述

图1：用单克隆抗体DC-101使flk-1(VEGFR-2)/SEAPS免疫沉淀的蛋白质印迹证实DC-101可使鼠flk-1：SEAPS免疫沉淀，但不能使单独的SEAPS免疫沉淀。

图2a和2b：图2a：竞争性抑制测定法，表示抗-flk-1(VEGFR-2)单克隆抗体DC-101对VEGF₁₆₅诱导的转染3T3细胞中flk-1(VEGFR-2)/fms受体磷酸化的作用。图2b：VEGF诱导的flk-1(VEGFR-2)/fms受体磷酸化对单克隆抗体DC-101所致抑制的敏感性。C441细胞是在最大刺激浓度的VEGF₁₆₅(40ng/ml)及不同水平抗体的条件下测定的。

图3a和3b：图3a：在有mAb DC-101存在时，VEGF-诱导的flk-1(VEGFR-2)/fms受体磷酸化的滴定。C441细胞是在有(1-4道)或没有(5-8道)5μg/ml mAb DC-101存在时，用指定浓度的VEGF刺激的。在有抗体(9道)存在时测定的未受刺激的细胞用作对照。图3b：是相对于各VEGF浓度绘制的，图3a各道中磷酸化受体水平的光密度测定扫描图，该图显示过量配体浓度对mAb的抑制程度。用于检测的细胞溶解产物是按照下面实施例所述，通过抗-磷酸酪氨酸制备的。

图4：通过预结合的mAb DC-101抑制VEGF-flk-1(VEGFR-2)/fms的活化。C441细胞是在没有(3道和4道)和有(5道和6道)DC-101时，用指定浓度的VEGF刺激的。未受刺激的细胞(1道和2道)用作对照。MAb是在两组条件下测定的。对于P而言，细胞与mAb预结合，接着室温用VEGF刺激15分钟。对于C而言，同时加入mAb和配体，并按照上面所述进行测定。

图5：用不同浓度的单克隆抗体DC-101和成胶质细胞瘤细胞的条件培养基(GB CM)处理VEGF-诱导的flk-1(VEGFR-2)/fms受体磷酸化。

图6：对抗-flk-1(VEGFR-2)mAb与flk-1(VEGFR-2)/fms转染的3T3细胞(C441)的结合进行FACS分析。把转染的flk-1(VEGFR-2)/fms3T3细胞与10μg/ml的抗-flk-1(VEGFR-2)mAb DC-101或同种型匹配的无关抗-flk-1mAb 23H7一起放在冰上温育60分钟。洗涤细胞，用5μg与FITC偶联的山羊抗-小鼠IgG再温育，洗涤，并通过流式细胞术进行分析，确定抗体结合。数据表示与使用无关mAb 23H7检测到的相比，DC-101对C441细胞的荧光水平。

图7：mAb DC-101与flk-1(VEGFR-2)/fms受体在转染的3T3细胞系C441上的饱和结合。4℃时，使汇合的C441细胞与浓度逐渐增加的mAb DC-101(50ng/ml-2μg/ml)在24孔平板中温育2小时。洗涤细胞，用5μg抗-大鼠IgG-生物素偶联物温育。为了检测结合，洗涤细胞，用1∶1000稀释的链霉抗生物素-HRP温育，洗涤，并在比色检测系统(TMB)中温育。数据代表mAb DC-101的浓度逐渐增加时，540nm处的吸光度。除去每次测定中第二抗体与单独细胞的结合是为了对非-特异性结合进行调整。数据代表三次独立实验的平均值。

图8：磷酸化flk-1(VEGFR-2)/fms从VEGF刺激的flk-1(VEGFR-2)/fms转染的3T3细胞中的免疫沉淀。细胞是按照实验过程所述用VEGF刺激的，溶解产物是用下列无关或相关抗体免疫沉淀的：1.大鼠抗-FLK2 IgG2a(mAb 2A13)；2.大鼠抗-flk-1(VEGFR-2)IgG1(mAb DC-101)；3.大鼠抗-PLK2 IgG1(mAb 23H7)；4.兔抗-fms多克隆抗体。免疫沉淀蛋白经过SDS PAGE，接着经过蛋白质印迹分析。VEGF活化受体的免疫沉淀是通过用抗-磷酸酪氨酸抗体探测印迹而检测的。

图9：VEGF-诱导的flk-1(VEGFR-2)/fms受体磷酸化对mAb DC-101抑制的敏感性。预结合及竞争性测定法是在指定抗体浓度下，用40ng/ml VEGF进行的。用于受体检测的细胞溶解产物是按照下面实施例所述用抗磷酸酪氨酸制备的。

图10：mAb DC-101对CSF-1诱导的fms受体磷酸化的作用。在(B)中，fms/FLK-2转染的3T 3细胞系，10A2，是在没有(3道和4道)和有(5道和6道)5μg/ml的mAb DC-101时，用最优刺激水平的CSF-1刺激的。在没有(1道)或有(2道)抗体时测定的未受刺激的细胞用作对照。用于检测的细胞溶解产物是按照下面实施例所述通过抗磷酸酪氨酸制备的。

图11：活化flk-1(VEGFR-2)/fms受体的mAb DC-101中和的特异性。C441细胞是在有DC-101(IgG1)或无关抗-FLK-2大鼠单克隆抗体2A13(IgG2a)或23H7(IgG1)存在时，用20或40ng/ml VEGF刺激的。测定法是在竞争性(4-8道)或预结合(9-11道)条件下，在没有VEGF(1-3道)和有VEGF存在时，用各个抗体进行的。用于检测的细胞溶解产物是按照下面实施例所述，通过抗磷酸酪氨酸制备的。分离印迹，并使用fms受体C-末端区的兔多克隆抗体对印迹进行再次探测，从而检测flk-1(VEGFR-2)/fms受体。

图12：磷酸化受体带从VEGF刺激的HUVEC细胞中的免疫沉淀。HUVEC细胞在内皮生长培养基(EGM)中生长3天，期间不更换培养基，直到细胞亚汇合。受体形式是利用mAb DC-101从未受刺激的细胞(1道)，VEGF刺激的细胞(2道)，以及在有1μg/ml肝素(3道)存在时，用VEGF刺激的细胞的溶解产物中免疫沉淀出来的。磷酸化受体形式的磷酸化测定法，免疫沉淀法，和检测是按照实验过程所述进行的。

图13：mAb DC-101对反应于VEGF的HUVEC细胞增殖的作用。细胞按照图6的说明生长48小时。然后细胞经过下列测定条件：不向培养基中加入任何物质(未处理过的)；更换新鲜的内皮生长培养基(完全培养基)；在没有或有1μg/ml肝素存在时，加入10ng/ml VEGF；在有1μg/ml DC-101存在时测定VEGF和VEGF-肝素处理过的细胞。用于进行增殖测定的细胞是使用细胞增殖测定试剂盒(Promega)，通过在550nm处进行比色检测而测定的。

图14a和14b：图14a：用DC-101(大鼠抗-flk-1单克隆抗体)减轻个体动物的肿瘤生长。图14b：用对照的2A13组(大鼠抗-flk-2单克隆抗体)减轻个体动物的肿瘤生长。

图15：用人成胶质细胞瘤的细胞系GBM-18给无胸腺裸鼠皮下注射，并把它们分成三组：PBS对照组，无关大鼠IgG1对照23H7组，和DC-101。治疗是用肿瘤异种移植物皮下给予的，并持续4周。

图16：表示不同的scFv抗体(p1C11，p1F12，p2A6和p2A7)与固定化KDR(VEGFR-2)直接结合的曲线图。

图17：表示通过不同的scFv抗体(p1C11，p1F12，p2A6和p2A7)抑制KDR(VEGFR-2)与固定化VEGF₁₆₅结合的曲线图。

图18：表示通过scFv抗体(p2A6和p1C11)抑制VEGF-诱导的HUVEC增殖的曲线图。

图19：c-p1C11的V_H和V_L链的核苷酸及推断的氨基酸序列。

图20：表示抗体(c-p1C11，p1C11，p2A6)与固定化KDR(VEGFR-2)直接结合的曲线图。

图21：表示c-p1C11与表达HUVEC的KDR-(VEGFR-2)结合的FACS分析曲线图。

图22：表示通过不同的scFv抗体(c-p1C11，p1C11，和p2A6)抑制KDR(VEGFR-2)受体与固定化VEGF₁₆₅结合的曲线图。

图23：表示通过c-p1C11和冷VEGF₁₆₅抑制放射性标记的VEGF₁₆₅与固定化KDR(VEGFR-2)受体结合的曲线图。

图24：表示通过抗-KDR(VEGFR-2)抗体(c-p1C11，p1C11)抑制VEGF-诱导的HUVEC增殖的曲线图。

                        发明详述

本发明提供用放疗，化疗，和/或其它受体拮抗剂与VEGF受体拮抗剂联合减轻或抑制哺乳动物肿瘤生长的方法。

在优选实施方案中，当用VEGF受体拮抗剂与化疗剂，放疗，或其它受体拮抗剂或其组合联合治疗肿瘤，包括人的肿瘤时，可产生协同效果。换句话说，当VEGF受体拮抗剂与化疗剂，放疗，或其它受体拮抗剂或其组合联合抑制肿瘤生长时，可产生比所预期的还要好的治疗效果。当使用联合疗法抑制肿瘤生长所产生的效果比使用VEGF受体拮抗剂和化疗剂，放疗，或其它受体拮抗剂所产生的效果之和还要大时，表现出协同效果。优选，协同效果是通过癌症的缓解加以证实的，其中这种缓解是使用VEGF受体拮抗剂和化疗剂，放疗，或其它受体拮抗剂进行联合治疗时所没有预见到的。(见实施例VIII.)

VEGF受体拮抗剂是在开始化疗或放疗之前，之中，或之后，及其任意组合，即，在开始化疗和/或放疗之前和之中，之前和之后，之中和之后，或之前，之中，和之后给予的。例如，当VEGF受体拮抗剂是抗体时，抗体通常在开始放疗和/或化疗之前的1-30天之间，优选3-20天之间，更优选5-12天给药。

放疗

与VEGF受体拮抗剂联合使用的放射源对于所治疗的患者而言可以是外在的或内在的。当放射源对患者是外在的时，该疗法被称为外在射线放疗(EBRT)。当放射源对于患者是内在的时，该疗法被称为近程放射治疗(BT)。

放疗是按照熟知的标准技术，使用为此目的制造的标准设备，如AECL Theratron和Varian Clinac给予的。放疗的剂量取决于多种因素，这是本领域熟知的。这种因素包括所要治疗的器官，放疗途径中的健康器官，因为这些健康器官可能会无意中受到不良影响，患者对放疗的耐受性，和需要进行治疗的机体面积。所述剂量通常为1-100Gy，更优选2-80Gy。已经报道过的某些剂量包括脊髓35Gy，肾15Gy，肝20Gy，前列腺65-80Gy。然而应当强调的是，本发明不限制于任何特定的剂量。剂量可由主治医生根据已知情况中的特定因素，包括上述因素确定。

外在放射源与进入患者内的点之间的距离可以是任意距离，它代表在杀死靶细胞和使副作用达到最小之间的可接受的平衡。通常，外在放射源距离进入患者内的点70-100cm。

通常，近程放射治疗是通过把放射源放在患者中进行的。通常，放射源被放置在距离所要治疗的组织大约0-3cm处。已知的技术包括间质，腔内，和表面近程放射治疗。放射源可永久或暂时植入。永久植入物中使用的某些典型的放射性原子包括碘-125和氡。临时植入物中使用的某些典型的放射性原子包括镭，铯-137，和铱-192。已经用于近程放射治疗的某些其它放射性原子包括镅-241和金-198。

近程放射治疗的放疗剂量可与上述外在射线放疗相同。除了上面提到的，用于确定外在射线放疗剂量的因素之外，在确定近程放射治疗的剂量时，还要考虑到所用放射性原子的性质。

化疗

化疗剂包括可有效抑制肿瘤生长的所有化合物。

化疗剂的给药可以各种方式进行，包括通过肠胃外和肠内途径全身给药。在其中一个实施方案中，VEGF受体拮抗剂和化疗剂可作为独立的分子分开给药。在另一实施方案中，VEGF受体拮抗剂通过与化疗剂偶联而连接。

化疗剂的例子包括烷基化剂，例如，氮芥类，乙烯亚胺化合物和烷基磺酸盐；抗代谢物，例如，叶酸，嘌呤或嘧啶拮抗剂；有丝分裂分裂抑制剂，如，长春碱和鬼臼毒素衍生物；细胞毒性的抗生素；损害或干扰DNA表达的化合物。

此外，化疗剂包括此处所述的抗体，生物分子和小分子。

化疗剂的具体例子包括顺铂，达卡巴嗪(DTIC)，更生霉素，双氯乙基甲胺(氮芥)，链脲霉素，环磷酰胺，卡莫司汀(BCNU)，罗氮芥(CCNU)，阿霉素(亚德里亚霉素)，柔红霉素，丙卡巴肼，丝裂霉素，阿糖孢苷，依托泊苷，甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶，长春花碱，长春新碱，博莱霉素，紫杉醇(紫杉酚)，多西他赛(脱乙酰基紫杉醇)，阿地流津，天门冬酰胺酶，白消安，卡铂，克拉屈滨，达卡巴嗪，氟尿苷，氟达拉滨，羟基脲，异环磷酰胺，干扰素α，利普安，甲地孕酮，美法仑，巯基嘌呤，普卡霉素，米托坦，培加帕酶，喷司他丁，哌泊溴烷，光辉霉素，链脲霉素，他莫昔芬，替尼泊苷，睾内酯，硫鸟嘌呤，噻替派，尿嘧啶氮芥，维诺利宾，苯丁酸氮芥，紫杉酚及其组合。

生长因子受体拮抗剂

本发明所用的生长因子受体拮抗剂(除了VEGF受体拮抗剂)包括可抑制生长因子受体的配体对生长因子受体刺激的所有物质。这种刺激的抑制可抑制表达生长因子受体的细胞生长。

涉及肿瘤发生的生长因子受体的某些例子是表皮生长因子(EGFR)，血小板衍生的生长因子(PDGFR)，胰岛素样生长因子(IGFR)，神经生长因子(NGFR)，和成纤维细胞生长因子(FGF)的受体。

优选，本发明所用的生长因子受体拮抗剂是EGFR拮抗剂。本发明的EGFR拮抗剂是生物分子，小分子，或任何其它物质，它们可抑制EGFR活化，由此抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，并防止受体自磷酸化，以及涉及各种EGFR信号途径的其它蛋白磷酸化。EGFR活化的抑制是指EGFR活化的任意降低，它无需完全阻止或终止EGFR的活化。

此外，本发明定义的EGFR活化的抑制是指由于EGFR拮抗剂与受体相互作用产生的EGFR抑制。相互作用是指EGFR拮抗剂与受体之间充分的物理或化学相互作用，如此才能抑制酪氨酸激酶的活性。本领域的技术人员应当了解这种化学相互作用的例子，它包括在EGFR拮抗剂和受体之间，本领域已知的缔合或键合，还包括共价键合，离子键合，氢键键合等。与EGF拮抗剂形成对比，它与配体相互作用，由此抑制活化。

根据其它生长因子的具体情况，EGFR活化的增加可能是由于配体水平升高，EGFR基因扩增，受体转录增加或引起上调受体信号的突变增加而引起的。编码EGFR基因的扩增导致与EGFR结合的配体数增加，从而进一步刺激细胞增殖。EGFR还可在没有基因扩增的情况下过量表达，据推测是通过可增加EGFR转录，mRNA翻译，或蛋白稳定性的突变完成的。EGFR突变体已在神经胶质瘤，非小细胞肺癌，卵巢癌和前列腺癌中鉴定，它们具有组成型活性的酪氨酸激酶，表明高水平EGFR活性的作用，而不是EGFR在这些癌中过量表达的作用。见，例如，Pedersen等，Ann.Oncol.，12(6)：745-60(2001)。(III型EGFR突变-各式命名的EGFRvIII，de2-7EGFR或AEGFR-缺少由外显子2-7编码的胞外配体结合域的一部分)；见Wikstrand等，Cancer Res.，55：3140-3148(1995)。

在本发明其中一个实施方案中，EGFR拮抗剂抑制EGFR与其配体结合。配体与EGFR外部的胞外域的结合可刺激受体二聚化，EGFR自磷酸化，受体的内部胞质酪氨酸激酶结构域的活化，和涉及DNA合成及细胞分裂调节的多个信号转导途径的引发。EGFR的配体包括，例如，EGF，TGF-α，双调蛋白，肝素-结合EGF(HB-EGF)和betarecullulin。EGF和TGF-α是可导致EGFR-介导的刺激的主要内源性配体，尽管TGF-α在促进血管发生方面更有效。

在本发明另一实施方案中，EGFR拮抗剂结合EGFR。应当了解EGFR拮抗剂可与EGFR的胞外部分外部结合，抑制或不抑制配体的结合，或与酪氨酸激酶结构域内部结合。结合EGFR的EGFR拮抗剂的例子包括，但不限制于，生物分子，如对EGFR特异的抗体(及其功能等同物)，直接作用于EGFR胞质域的合成激酶抑制剂，如小分子。

本发明的EGFR拮抗剂优选对EGFR特异的生物分子，更优选抗体，或其功能等同物。对本发明所用抗体的描述可在名为“抗体”的部分找到。此外，在抗体结合之后，优选使EGFR-抗体复合物内化并降解，防止受体被细胞再利用。

已知的生物分子EGFR拮抗剂是ERBITUX^TM(IMC-C225)，它是对EGFR特异的嵌合(人/小鼠)单克隆抗体。见，例如，美国专利号4,943,533(Mendelsohn等)；美国专利号6,217,866(Schlessinger等)；美国申请号08/973,065(Goldstein等)和09/635,974(Teufel)；WO99/60023(Waksal等)和WO00/69459(Waksal)。单克隆抗体ERBITUX^TM特异性结合EGFR，并阻断配体，例如EGF的结合。这种阻断可抑制肿瘤生长，包括通过干扰EGFR活化作用而抑制肿瘤侵入，转移，细胞修复和血管发生。此外，或可选择性地，单克隆抗体ERBITUX^TM可促进受体-抗体复合物的内化，防止其配体或任何其它机理进一步刺激受体。

生物分子EGFR拮抗剂的其它例子是ABX-EGF，它是对EGFR特异的完全人IgG₂单克隆抗体。ABX-EGF以较高的特异性结合EGFR，阻断EGFR与其两个配体，EGF和TGF-α的结合。见，例如，Figlin等，ASCO第37期年会的摘要1102，San Francisco，CA，2001年5月12-15日。先前被称作克隆E7.6.3的ABX-EGF的序列和描述在美国专利号6,235,883(Abgenix，Inc.)第28栏第62行-第29栏第36行和图29-34中公开。见Yang等，Critical Rev.Oncol./Hematol.，38(1)：17-23，2001。

在可选择性，但也是优选的实施方案中，本发明的EGFR拮抗剂是小分子的酪氨酸激酶抑制剂。小分子的描述可在名为“小分子”的部分找到。已经描述过使用很多小分子抑制EGFR。

例如，Spada等，美国专利5,656,655，公开了可抑制EGFR的苯乙烯基取代的杂芳基化合物。所述杂芳基是具有一个或两个杂原子的单环，或具有1-约4个杂原子的双环，该化合物可被任选取代或多取代。美国专利5,656,655公开的化合物引入此处作为参考。

Spada等，美国专利5,646,153公开了可抑制EGFR的双单环和/或双环的芳基杂芳基，碳环，和杂碳环化合物。美国专利5,646,153公开的化合物引入此处作为参考。

Bridges等，美国专利5,679,683公开了可抑制EGFR的三环嘧啶化合物。所述化合物是稠合的杂环嘧啶衍生物，在第3栏第35行-第5栏第6行描述。第3栏第35行-第5栏第6行描述的这些化合物引入此处作为参考。

Barker，美国专利5,616,582公开了具有受体酪氨酸激酶抑制活性的喹唑啉衍生物。美国专利5,616,582公开的化合物引入此处作为参考。

Fry等，Science，265：1093-1095(1994)公开了具有抑制EGFR的结构的化合物。结构在图1中给出。Fry等所著文章图1中所示的化合物引入此处作为参考。

Osherov等，J.Biol.Chem.，268(15)：11，134-42(1993)公开了可抑制EGFR/HER1和HER2的酪氨酸磷酸化抑制剂。Osherov等所著文章中公开的化合物，特别是表I，II，III，和IV中的那些引入此处作为参考。

Levitzki等，美国专利5,196,446公开了可抑制EGFR的杂芳基乙烯二基或杂芳基乙烯二基芳基化合物。美国专利5,196,446第2栏第42行-第3栏第40行公开的化合物引入此处作为参考。

Panek等，J.Pharma.Exp.Thera.，283：1433-1444(1997)公开了被鉴定为PD166285的化合物，它可抑制受体的EGFR，PDGFR，和FGFR家族。PD166285被鉴定为6-(2，6-二氯苯基)-2-(4-(2-二乙氨基乙氧基)苯氨基)-8-甲基-8H-吡啶并(2，3-d)嘧啶-7-酮，它具有第1436页图1所示的结构。在Panek等所著文章第1436页图1中描述的化合物引入此处作为参考。

小分子EGFR拮抗剂的其中一个例子是IRESSA^TM(ZD1939)，它是quinozaline衍生物，可作为ATP-模拟物抑制EGFR。见，美国专利号5,616,582(Zeneca Limited)；WO 96/33980(Zeneca Limited)第4页；见，Rowinsky等，ASCO第37期年会的摘要5，San Francisco，CA，2001年5月12-15日；Anido等，ASCO第37期年会的摘要1712，San Francisco，CA，2001年5月12-15日。

TARCEVA^TM是小分子EGFR拮抗剂的另一个例子。TARCEVA^TM(OSI-774)是4-取代的苯氨基quinozaline衍生物[6，7-双(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)胺盐酸盐]EGFR抑制剂，它在WO 96/30347(Pfizer Inc.)第2页第12行-第4页第34行和第19页第14-17行描述。也见Moyer等，Cancer Res.，57：4838-48(1997)；Pollack等，J.Pharmacol.，291：739-48(1999)。TARCEVA^TM通过抑制EGFR及其下游PI3/Akt磷酸化和导致p27-介导的细胞周期停滞的MAP(促有丝分裂剂活化蛋白)激酶信号转导途径而发挥作用。见，Hidalgo等，ASCO第37期年会的摘要281，San Franscio，CA，2001年5月12-15日。

还有很多其它小分子也可抑制EGFR。小分子EGFR拮抗剂的一些例子在WO 91/116051，WO 96/30347，WO 96/33980，WO 97/27199(Zeneca Limited)，WO 97/30034(Zeneca Limited)，WO 97/42187(Zeneca Limited)，WO 97/49688(Pfizer Inc.)，WO 98/33798(Warner Lambert Company)，WO 00/18761(American CyanamidCompany)，和WO 00/31048(Warner Lambert Company)描述。小分子EGFR拮抗剂的具体例子包括C1-1033，它是酪氨酸激酶，特别是EGFR的quinozaline(N-[4-(3-氯-4-氟-苯氨基)-7-(3-吗啉-4-基-丙氧基)-喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺)抑制剂，在WO 00/31048(Warner-Lambert Company)第8页第22-6行描述；PKI166，它是EGFR的吡咯并嘧啶抑制剂，在WO 97/27199(Novartis AG)第10-12页描述；GW2016，它是EGFR和HER2的抑制剂；和EκB569。

其它EGFR拮抗剂可使用熟知的方法很容易地确定。本发明的EGFR拮抗剂可抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，其通常涉及磷酸化事件。因此，磷酸化测定法可用于确定本发明所用的拮抗剂。酪氨酸激酶活性的某些测定法在Panek等，(1997)和Batley等，Life Sci.，62：143-50(1998)中描述。此外，可使用特异性检测EGFR表达的方法。这些包括检测蛋白表达的免疫组织化学(HIC)，检测基因扩增的荧光原位杂交(FISH)，竞争性放射性配体结合测定法，固体基质印迹技术，如RNA和DNA印迹，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)和ELISA。见，例如，Grandis等，Cancer，78：1284-1292(1996)；Shimizu等，Japan J.Cancer Res.，85：567-571(1994)；Sauter等，Am.J.Path.，148：1047-1053(1996)；Collins，Glia，15：289-296(1995)；Radinsky等，Clin.Cancer.Res.，1：19-31(1995)；Petrides等，Cancer Res.，50：3934-3939(1990)；Hoffmann等，Anticancer Res.，17：4419-4426(1997)；Wikstrand等，Cancer Res.，55：3140-3148(1995)。

VEGF受体拮抗剂

在其中一个实施方案中，VEGF受体拮抗剂特异性结合VEGF受体胞外域上的抗原决定部位。VEGF受体的胞外域是配体-结合域。配体-结合域可在受体任何一个末端找到，但通常位于氨基末端。

VEGF受体的一些例子包括蛋白酪氨酸激酶受体，如文献中提到的flt-1(VEGFR-1)，KDR和flk-1(VEGFR-2)。除非另有说明或以其它方式清楚地说明，本说明书将遵循VEGF受体的常规文献命名法。KDR(VEGFR-2)被称作具有MW 180kD的VEGF受体的人类形式(Terman等，上述)。Flk-1(VEGFR-2)被称作KDR的鼠同系物(Matthews等，上述)。Flt-1(VEGFR-1)被称作VEGF受体的不同形式，但与KDR/flk-1(VEGFR-2)受体有关。见Shibuya等，上述。

其它VEGF受体包括用VEGF交联标记的那些，或与KDR(VEGFR-2)共-免疫沉淀的那些。这些VEGF受体某些已知形式的分子量大约为170KD，150KD，130-135KD，120-125KD和85KD。见，例如，Quinn等，Proc.Nat’l Acad.Sci USA，90：7533-7537(1993)；Scher等，J.Biol.Chem.，271：5761-5767(1996)。

VEGF受体通常与细胞，如内皮细胞结合。VEGF受体还可与非-内皮细胞，如肿瘤细胞结合。可选择性地，VEGF受体可游离于细胞，优选可溶性形式。

本发明的拮抗剂可中和VEGF受体。在本说明书中，中和受体是指使受体的内在激酶活性灭活，从而转导信号。VEGF受体中和的可靠测定法是抑制受体磷酸化。

本发明不受VEGF受体中和的任何特殊机理的限制。在申请这种应用时，还不了解通过抗体中和VEGF受体的机理，通过其中一种拮抗剂中和的机理无须与通过另一种拮抗剂中和的机理相同。某些可能的机理包括阻碍VEGF配体与VEGF受体的胞外结合域结合，并防止受体二聚或寡聚。然而，不能排除其它机理。

本发明的VEGF受体(或VEGFR)拮抗剂是生物分子，小分子，或抑制受体VEGFR亚家族的任何其它物质。受体VEGFR亚家族活化的抑制是指VEGFR活化的任意降低。即，阻碍活化时，无需完全终止VEGFR活化。此外，本发明所定义的VEGFR活化的抑制是指VEGFR拮抗剂与VEGFR相互作用之后，VEGFR拮抗剂的抑制。缔合是指VEGFR拮抗剂与VEGFR之间充分的物理或化学相互作用，从而抑制受体的酪氨酸激酶活性。本领域技术人员应当了解这种化学相互作用的例子，包括本领域已知的缔合或键合，包括共价键合，离子键合，氢键键合等。因此，本发明的VEGFR拮抗剂可抑制受体的酪氨酸激酶活性，阻碍受体自磷酸化和涉及VEGFR信号途径的各种其它蛋白磷酸化。这种涉及血管发生和血管形成的调节的途径包括下列任何一种：磷脂酶Cγ(PLCγ)途径或磷脂酰肌醇3’激酶(PI3-K)/Akt和促有丝分裂剂激活的蛋白激酶(MAPK)途径。见，例如，Larrivée等，Int’l J.Mol.Med.，5：447-56(2000)。

受体VEGFR亚家族的特征在于胞外域中7个免疫球蛋白样环，单一跨膜区和胞内区中断裂酪氨酸激酶结构域的存在(III类受体酪氨酸激酶)。受体VEGFR亚家族还有很多已知的成员，它的例子包括VEGFR-1，VEGFR-2，和VEGFR-3。据信KDR(VEGFR-2)是主要的VEGF信号转导物，它可导致内皮细胞的增殖，迁移，分化，管形成，血管渗透性的增加，和血管完整性的维持。VEGFR-1具有较弱的激酶活性，而且当受到VEGF刺激时，不能产生促有丝分裂反应，虽然它可以高于KDR(VEGFR-2)大约10倍的亲和性与VEGF结合。VEGFR-1还涉及VEGF和胎盘生长因子(PIGF)诱导的单核细胞和巨噬细胞迁移以及组织因子的产生。

对于上述EGFR而言，VEGFR活化的增加可能是由高水平的配体，VEGFR基因的扩增，受体转录的增加或引起上调受体信号的突变而引起的。

在本发明其中一个实施方案中，VEGFR拮抗剂抑制VEGFR与其配体结合。配体与VEGFR外部的胞外域结合可刺激受体二聚化，VEGFR自磷酸化，受体内部胞质酪氨酸激酶结构域的活化，和涉及血管形成及血管发生的调节的多个信号转导途径的引发。

VEGFR的配体包括VEGF及其同源物PlGF，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，和VEGF-E。例如，P1GF，它是只结合VEGFR-1的二聚分泌型因子，它通过绒毛细胞滋养层，合胞滋养层和绒毛外滋养层大量产生，其氨基酸序列与VEGF的同源性很高。人类有3种同种型，P1GF-1，P1GF-2，和P1GF-3。对缺乏P1GF小鼠的研究证实，这种生长因子本身与血管发生无关，但可特异性调节病理过程中的血管发生及VEGF的渗透作用。且，VEGF-D与VEGF-C紧密相关，这是因为在其它VEGF家族成员中是找不到N-和C-末端延伸的存在。在成人组织中，VEGF-D的mRNA在心脏，肺，骨胳肌，结肠，和小肠中的含量最丰富。对VEGF-D受体特异性进行的分析揭示，VEGF-D是VEGFR-2(Flk1)和VEGFR-3(Flt4)的配体，而且可激活这些受体；然而，VEGF-D不结合VEGFR-1。此外，VEGF-D是内皮细胞的促有丝分裂剂。

在本发明另一实施方案中，VEGFR拮抗剂结合VEGFR。应当认识到，VEGFR拮抗剂可与VEGFR的胞外部分外部结合，抑制或不抑制配体的结合，VEGFR拮抗剂还可与酪氨酸激酶结构域内部结合。结合VEGFR的VEGFR拮抗剂的例子包括，但不限制于，生物分子，如受体核酶及对VEGFR特异的抗体(或其功能等同物)，和直接作用于VEGFR胞质结构域的合成激酶抑制剂，如小分子。优选本发明的VEGFR拮抗剂是对VEGFR特异的生物分子，更优选抗体或其功能等同物，下面将对它们作更详细的描述。可选择性地，本发明的VEGFR拮抗剂是小分子激酶抑制剂，下面将对其作详细描述。

在其中一个优选实施方案中，VEGFR受体拮抗剂特异性结合VEGFR-1。特别优选抗原结合蛋白，它可结合VEGFR-1的胞外结构域，并通过其一个或两个配体，VEGF和P1GF阻断结合，和/或中和VEGF-诱导的或P1GF诱导的VEGFR-1活化。例如，mAb 6.12是与可溶性，细胞表面表达的VEGFR-1结合的scFv。ScFv 6.12含有小鼠单克隆抗体mAb 6.12的V_L和V_H结构域。产生mAb 6.12的杂交瘤细胞系已经保藏，ATCC号为PTA-3344。保藏是根据布达佩斯条约的规定，在用于专利程序及其条例(布达佩斯条约)的微生物保藏机构进行的。这样做可确保活培养物自保藏之日起维持30年。根据布达佩斯条约，在申请人和ATCC之间达成协议的情况下，可从ATCC获得生物体，这样可确保在相关美国专利公开之后，不受限制地使用它。按照专利法的规定，在实行该发明时，无须在任何行政机构的授权下使用保藏菌株。

其它优选抗体在实施例，特别是实施例XII，XIII，和XIV，及SEQ ID NO：1-83中描述。此外，这些优选VEGFR抗体拮抗剂的其中一部分在Lu等，Int’l J.Cancer，97：393-399(2002)中描述。

还存在各种产生VEGFR-2抗体的杂交瘤。例如，产生大鼠抗小鼠VEGFR-2单克隆抗体的杂交瘤细胞系(DC101)的保藏号为ATCC HB11534；产生小鼠抗小鼠VEGFR-2单克隆抗体mAb 25的杂交瘤细胞系(M25.18A1)的保藏号为ATCC HB 12152；产生小鼠抗小鼠VEGFR-2单克隆抗体mAb 73的杂交瘤细胞系(M73.24)的保藏号为ATCC HB12153。

此外，产生抗VEGFR-1抗体的各种杂交瘤包括，但不限制于，杂交瘤KM1730(保藏号FERM BP-5697)，KM1731(保藏号FERM BP-5718)，杂交瘤KM1732(保藏号FERM BP-5698)，KM1748(保藏号FERMBP-5699)，杂交瘤KM1750(保藏号FERM BP-5700)，它们在WO98/22616，WO 99/59636，澳大利亚申请号AU 1998 50666 B2，和加拿大申请号CA 2328893中描述。

很多其它VEGFR拮抗剂也是本领域已知的。VEGFR拮抗剂的某些例子在美国申请号07/813,593；07/906,397；07/946,507；07/977,451；08/055,269；08/252,517；08/601,891；09/021,324；09/208,786；和09/919,408(所有均属于Lemischka等)；美国专利号5,840,301(Rockwell等)；美国申请号08/706,804；08/866,969；08/967,113；09/047,807；09/401,163；和09/798,689(所有均属于Rockwell等)；美国申请号09/540,770(Witte等)；和PCT/US01/06966(Liao等)中描述。美国专利号5,861,301(Terman等)，Terman等，Oncogene 6：1677-1683(1991年9月)，WO 94/10202(Ferrara等)，和WO 95/21865(Ludwig)公开了VEGFR拮抗剂，特别是抗VEGFR-2抗体。此外，PCT/US95/01678(Kyowa Hakko)描述了抗VEGFR-2抗体。抗VEGFR抗体还在美国申请号09/976,787(Zhu等)中描述。美国专利号6,177,401(Ullrich等)，5,712,395(App等)，和5,981,569(App等)描述的VEGFR拮抗剂是有机分子。此外，双特异性抗体(BsAbs)是已知的，它是具有两种不同的抗原-结合特异性或位点的抗体，针对KDR(VEGFR-2)和VEGFR-1。见，例如，美国申请号09/865,198(Zhu)；60/301,299(Zhu)。

Hennequin等，在J.Med.Chem.42，5369-5389(1999)中公开了某些可用作VEGF受体拮抗剂的喹唑啉，喹啉和噌啉。见Annie等，Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes and HumanRetrovirology 17，A41(1998)。在Hennequin等所著的文章中公开的VEGF受体拮抗剂引入此处作为参考。

此外，App等(USPN：5,849,742)公开了可作为酪氨酸激酶抑制剂起作用的喹唑啉，quinoxiline，取代苯胺，异噁唑，丙烯腈和苯基丙烯腈化合物。Hennequin等，Annie等和App等描述的小分子也可作为本发明的VEGF受体拮抗剂。

此外，确定VEGFR拮抗剂的测定法是本领域熟知的，因此，适用于本发明的侯选拮抗剂可很容易地鉴定。本发明的VEGFR拮抗剂可抑制VEGFR的酪氨酸激酶活性，其通常涉及磷酸化事件。因此，磷酸化测定法可用于确定本发明的VEGFR拮抗剂。酪氨酸激酶活性的某些测定法在Panek等，J.Pharmacol.Exp.Thera.，283：1433-44(1997)和Batley等，Life Sci.，62：143-50(1998)中描述。此外，还可使用特异性检测VEGFR表达的方法。

抗体

本发明的抗体可通过本领域已知的方法生产。这些方法包括免疫学方法，由Kohler和Milstein，Nature，256：495-497(1975)和Campbell，单克隆抗体技术，啮齿动物和人类杂交瘤的生产和描述，Burdon等，Eds.，生物化学和分子生物学的实验室技术，13卷，Elsevier Science Publishers，Amsterdam(1985)描述；以及Huse等，Science，246，1275-1281(1989)描述的重组DNA方法。

本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体或任何其它适宜类型的抗体，如抗体的片段或衍生物，单链抗体(scFv)或抗体的合成同系物，只要抗体具有与那些完整抗体相同或相似的结合性。除非另有说明或可从上下文清楚地知道，此处所用的抗体的结构域，区和片段与本领域熟知的标准定义一致。见，例如，Abbas等，细胞和分子免疫学，W.B.Saunders Company，Philadelphia，PA(1991)。优选本发明的抗体是单克隆抗体。

抗体片段可通过裂解完整抗体，或通过表达编码该片段的DNA产生。抗体片段可通过Lamoyi等，J.Immunol.Methods，56：235-243(1983)和Parham，J.Immunol.131：2895-2902(1983)所述的方法制备。这种片段可含有一个或两个Fab片段或F(ab’)2片段。这种片段还可含有单链片段可变区抗体，即，scFv，双抗体，或其它抗体片段。生产这种功能等同物的方法在PCT申请WO93/21319，欧洲专利申请号239,400；PCT申请WO 89/09622；欧洲专利申请338,745；和欧洲专利申请EP 332,424中公开。

单链抗体(scFv)是由使用或不用互连接头连接的抗体重链可变区和轻链可变区组成的。因此，scFv含有完整的抗体结合位点。这些链可在细菌，或真核细胞中产生。单链抗体的一个例子是p1C11。(见下面的实施例IX。)p1C11可阻断VEGF-KDR(VEGF-VEGFR-2)的相互作用，抑制VEGF-刺激的受体磷酸化和HUVEC有丝分裂。这种scFv既可结合HUVEC上的可溶性KDR(VEGFR-2)，又可结合细胞表面表达的KDR(VEGFR-2)。p1C11的序列如SEQ ID No：21所示。通过本领域已知的方法可把上述单链抗体构成嵌合抗体或人源化抗体，例如，见下面的实施例IX-3。嵌合scFv的其中一个例子是嵌合p1C11，即，c-p1C11。

优选所述抗体片段含有完整抗体的全部6个互补决定区，尽管片段所含的这种区较少，如含有3个，4个或5个CDRs，但它也可以是功能性的。如果抗体太短以致不是免疫原性的，那么它可与载体分子偶联。一些适宜的载体分子包括匙孔血蓝蛋白和牛血清白蛋白。偶联可通过本领域已知的方法进行。

本发明的抗体还包括可通过直接突变，亲和力成熟，噬菌体展示，或链混排方法提高结合性的那些。通过使CDRs突变，并筛选具有所需特性的抗原结合位点，可修饰或改进亲和性和特异性(见，例如，Yang等，J.Mol.Bio.，254：392-403(1995))。CDRs是以各种方法突变的。其中一个方法是使单个残基或残基的组合随机化，这样在其它相同的抗原结合位点群中，就可在特定位置找到全部20种氨基酸。可选择性地，突变可通过易错PCR方法，在多种CDR残基上诱导(见，例如，Hawkins等，J.Mol.Bio.，226：889-896(1992))。含有重链和轻链可变区基因的噬菌体展示载体在大肠杆菌的增变菌株中繁殖(见，例如，Low等，J.Mol.Bio.，250：359-368(1996))。这些诱变的方法只是本领域技术人员已知的多种方法的举例说明。

本发明的抗体还可以是具有一类物种，例如小鼠的抗体可变区，和不同物种，例如人的抗体恒定区的嵌合抗体。可选择性地，本发明的抗体可以是人源化抗体，它具有来源于其中一类物种，例如小鼠的抗体的高变或互补决定区(CDRs)，和人类抗体的构架可变区及恒定区。可选择性地，本发明抗体可以是具有人类抗体恒定区和可变区的人类抗体。

抗体，特别是单克隆抗体，可通过本领域已知的方法生产。生产抗体的实例包括，但不限制于，在杂交瘤细胞中生产并用编码受体拮抗剂的DNA转化哺乳动物细胞。这些方法在各种出版物中公开，包括免疫学方法，由Kohler和Milstein，Nature，256：495-497(1975)和Campbell，“单克隆抗体技术，啮齿动物和人类杂交瘤的生产和描述”，Burdon等，Eds.，生物化学和分子生物学的实验室技术，13卷，Elsevier Science Publishers，Amsterdam(1985)；和Huse等在Science，246：1275-1281(1989)中描述的重组DNA方法。

抗体等同物也可通过本领域已知的方法制备。例如，抗体片段可从完整抗体酶促制备。优选，抗体等同物是从编码这种等同物的DNA制备的。编码抗体片段的DNA是通过使除编码全长抗体的DNA所需部分之外的部分缺失而制备的。编码嵌合抗体的DNA可通过使编码人恒定区的DNA重组而制备，它们基本上或仅仅来源于相应的人抗体区，还可通过使编码可变区的DNA重组而制备，它们基本上或仅仅来源于除人之外的哺乳动物可变区序列。编码人源化抗体的DNA可通过使编码除互补决定区(CDRs)之外的恒定区和可变区的DNA重组而制备，它们基本上或仅仅来源于相应的人抗体区，还可通过使编码CDRs的DNA重组而制备，它们基本上或仅仅来源于除人之外的哺乳动物。

编码抗体片段的DNA分子的适宜来源包括细胞，如杂交瘤，它可表达全长抗体。该片段自身可被用作抗体等同物，或按照上面所述被重组成等同物。这部分描述的DNA缺失和重组可通过已知方法进行，如在名为“抗体的功能等同物”部分所列的专利申请中公开的那些，和/或其它标准重组DNA技术，如下面描述的那些。

用于进行载体转化和本发明受体拮抗剂表达的优选宿主细胞是哺乳动物细胞，例如，COS-7细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，和淋巴来源的细胞系，如淋巴瘤，骨髓瘤，或杂交瘤细胞。也可选择性使用其它真核宿主，如酵母。例如，小鼠胎儿肝基质细胞系2018可结合AP标记-flk1和Ap标记-flk-2融合蛋白，即，含有VEGFR-2和flk-2(ATCC，Manassas，VA，CRL 10907)的配体，人胎儿脾细胞系Fsp 62891含有flk-2配体(ATCC CRL 10935)，和人基质胎儿胸腺细胞系，F.thy62891含有VEGFR-2配体(ATCC CRL 10936)。

转化的宿主细胞是利用本领域已知的方法在液体培养基中培养的，所述液体培养基含有可同化的碳源(碳水化合物，如葡萄糖或乳糖)，氮源(氨基酸，肽，蛋白或它们的降解产物，如胨，铵盐等)，和无机盐(钠，钾，镁和钙的硫酸盐，磷酸盐和/或碳酸盐)。此外，培养基还含有，例如，促进生长的物质，如微量元素，例如，铁，锌，锰等。

当需要在酵母中表达基因构建体时，用于酵母中的适宜选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因。Stinchcomb等，Nature，282：39(1979)；Kingsman等，Gene，7：141(1979)。trp1基因可为酵母突变株提供选择标记，所述酵母缺乏在色氨酸中生长的能力，例如，ATCC No.44076或PEP4-1。Jones，Genetics，85：12(1977)。酵母宿主细胞基因组中trp1的损害可为通过在色氨酸缺乏情况下的生长而检测转化提供有效的环境。同样，Leu2-缺陷酵母株(ATCC 20，622或38，626)是由含有Leu2基因的已知质粒补充的。

可选择性地，编码受体拮抗剂的DNA可被克隆到来源于病毒，如腺病毒腺伴随病毒，疱疹病毒，逆转录病毒或慢病毒的载体中。基因表达可由诱导型或非诱导型调节序列控制。

简单地说，选择含有表达所需DNA，如抗体，抗体等同物或VEGF受体的核酸分子的适宜细胞来源。总RNA是通过标准过程从适宜来源制备的。总RNA用于指导cDNA合成。分离RNA及合成cDNA的标准方法在分子生物学的标准手册中提供，例如，上述那些。

cDNA可通过已知方法扩增。例如，cDNA可被用作通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增的模板；见Saiki等，Science，239，487(1988)或Mullis等，美国专利4,683,195。进行PCR扩增的寡核苷酸引物序列来源于被扩增的已知序列。寡核苷酸是通过本领域已知的方法合成的。适宜的方法包括由Caruthers在Science 230，281-285(1985)描述的那些。

PCR扩增使用上游和下游寡核苷酸的混合物。按照标准过程，根据每个特定的引物对优化条件。利用电泳分析PCR产物的cDNA，所述cDNA具有与引物间序列相对应的适宜大小。可选择性地，编码区可在两个或多个重叠片段中扩增。重叠片段被设计成包括一个限制性位点，从而使片段的完整cDNA组装。

为了分离VEGF受体完整的蛋白编码区，例如，上游的PCR寡核苷酸引物与5’端的序列互补，优选含有ATG起始密码子和起始密码子的至少5-10个上游核苷酸。下游的PCR寡核苷酸引物与所需DNA序列的3’端序列互补。所需DNA序列优选编码VEGF受体的整个胞外部分，且任选编码跨膜区的全部或一部分，和/或胞内区的全部或一部分，包括终止密码子。

扩增的DNA，如编码抗体，抗体等同物，或VEGF受体的DNA可在各种宿主细胞中的各种克隆载体中复制。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。

其中剪接DNA的载体可含有染色体，非-染色体及合成DNA序列的片段。一些适宜的原核克隆载体包括来源于大肠杆菌的质粒，如colE1，pCR1，pBR 322，pMB9，pUC，pKSM，和RP4。原核载体还包括噬菌体DNA的衍生物，如M13和其它丝状单链DNA噬菌体。用于克隆编码VEGF受体的核酸的优选载体是杆状病毒载体。

把含有所要表达的DNA的载体转染到适宜的宿主细胞中。宿主细胞在适宜的培养基中维持，并在细胞和载体复制的条件下生长。载体可从细胞回收。所要表达的DNA可从载体回收。

所要表达的DNA，如编码抗体，抗体等同物，或受体的DNA被插入到适宜的表达载体中，并在适宜的原核或真核细胞中表达。

例如，插入到宿主细胞中的DNA可编码VEGF受体的整个胞外部分，或编码VEGF受体胞外部分的可溶性片段。DNA编码的VEGF受体胞外部分任选在5’端或3’端或两个末端与附加氨基酸序列连接。附加氨基酸序列可与VEGF受体的胞外区连接，如VEGF受体的前导序列，跨膜区和/或胞内区。附加氨基酸序列也可以是不与VEGF受体连接的序列。优选，这种附加氨基酸序列可发挥特殊的作用，如提高表达水平，分泌，溶解性，或免疫原性。

用于在细菌，特别是大肠杆菌中表达蛋白的载体是已知的。这种载体包括由Dieckmann和Tzagoloff在J.Biol.Chem.260，1513-1520(1985)中描述的PATH载体。这些载体含有编码邻氨基苯甲酸盐合成酶(TrpE)的DNA序列，然后是羧基末端多接头。其它表达载体系统是以β-半乳糖苷酶(pEX)；λP_L；麦芽糖结合蛋白(pMAL)；和谷胱甘肽S-转移酶(pGST)为基础的，见Gene 67，31(1988)和PeptideResearch 3，167(1990)。

在酵母中使用的载体也是可用的。适宜的例子是2μ质粒。

用于在哺乳动物细胞中表达的适宜载体也是已知的。这种载体包括熟知的SV-40衍生物，腺病毒，逆转录病毒衍生的DNA序列和来源于功能性哺乳动物载体组合的穿梭载体，如上面描述的那些，和功能性质粒及噬菌体DNA。

其它真核表达载体是本领域已知的(例如，P.J.Southern和P.Berg，J.Mol.Appl.Genet.，1，327-341(1982)；Subramani等，Mol.Cell.Biol.，1：854-864(1981)；Kaufmann和Sharp，“用调节物二氢叶酸盐还原酶互补DNA基因共转染的序列的扩增和表达”，J.Mol.Biol.159，601-621(1982)；)Kaufmann和Sharp，Mol.Cell.Biol.159，601-664(1982)；Scahill等，“中国仓鼠卵巢细胞中人免疫干扰素DNA基因产物的表达和描述”，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 80，4654-4659(1983)；Urlaub和Chasin，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 77，4216-4220，(1980)。

本发明所用表达载体含有至少一个表达控制序列，它与所要表达的DNA序列或片段可操作性连接。把控制序列插入到载体中，从而控制并调节克隆DNA序列的表达。有效的表达控制序列的例子是lac系统，trp系统，tac系统，trc系统，噬菌体λ的主要操纵子和启动子区，fd外被蛋白的控制区，酵母的糖酵解启动子，例如，3-磷酸甘油酸激酶的启动子，酵母酸磷酸酶的启动子，例如，Pho5，酵母α-交配因子的启动子，和来源于多形瘤，腺病毒，逆转录病毒，和猿猴病毒的启动子，例如，早期和晚期启动子或SV40，和其它序列，已知它们可控制原核或真核细胞和它们的病毒或其组合的基因表达。

把含有控制信号和所要表达的DNA，如编码抗体，抗体等同物，或VEGF受体的DNA的载体插入到宿主细胞中进行表达。一些有效的表达宿主细胞包括熟知的原核及真核细胞。某些适宜的原核宿主包括，例如，大肠杆菌，如大肠杆菌SG-936，大肠杆菌HB101，大肠杆菌W3110，大肠杆菌X1776，大肠杆菌X2282，大肠杆菌DHI，和大肠杆菌MRC1，假单胞菌属，杆菌属，如枯草杆菌，和链霉菌属。适宜的真核细胞包括组织培养物中的酵母和其它真菌，昆虫，动物细胞，如COS细胞和CHO细胞，人类细胞和植物细胞。

在维持于适宜培养基中的宿主细胞中表达之后，可从培养基中分离所要表达的多肽或肽，如编码抗体，抗体等同物，或VEGF受体的多肽或肽，并利用本领域已知的方法进行纯化。如果多肽或肽没有分泌到培养基中，那么在分离和纯化之前，要先溶解宿主细胞。

此外，本发明的抗体可通过使用可溶性受体给哺乳动物免疫接种而制备。所述可溶性受体自身可被用作免疫原，或与载体蛋白或其它物体，如珠子，即，琼脂糖珠连接。在哺乳动物产生抗体之后，分离产生抗体的细胞混合物，如脾细胞。单克隆抗体可通过从混合物中分离产生抗体的各个细胞，并通过把细胞与肿瘤细胞，如骨髓瘤细胞融合使它们无限增殖而制备。所得杂交瘤保存在培养基中，并表达单克隆抗体，它们是从培养基中采集的。

抗体还可从与细胞表面结合的受体制备，所述细胞可表达目标特异性受体。与受体结合的细胞可以是天然表达受体的细胞，如用于表达VEGFR的血管内皮细胞。可选择性地，与受体结合的细胞可以是其中已经转染了编码受体的DNA的细胞，如3T3细胞，它已经用VEGFR转染。

受体可被用作免疫原，从而得到本发明的抗体。受体肽可从天然来源获得，如从表达受体的细胞获得。例如，VEGF受体肽可从血管内皮细胞获得。可选择性地，合成的受体肽可使用市售的机器制备。在这种实施方案中，flt-1(VEGFR-1)的VEGF受体氨基酸序列例如由Shibuya等在Oncogene 5，519-524(1990)中提供；KDR(VEGFR-2)的VEGF受体氨基酸序列由PCT/US92/01300和Terman等，Oncogene6：1677-1683(1991)提供；flk-1的VEGF受体氨基酸序列由Mattews等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA，88：9026-9030(1991)提供。

作为又一个选择，编码受体的DNA，如cDNA或其片段可被克隆并表达，回收所得多肽，将其用作免疫原，从而得到本发明的抗体。例如，为了制备针对抗体的VEGF受体，可使用标准重组DNA技术，如下面描述的那些，把编码本发明VEGF受体的核酸分子，或其一部分，特别是其胞外部分插入到用于在宿主细胞中表达的已知受体中。这种核酸分子的适宜来源包括表达VEGF受体的细胞，即，血管内皮细胞。

抗体可在任何哺乳动物中制备；除人之外的适宜哺乳动物包括，例如，兔，大鼠，小鼠，马，山羊，或灵长类动物。优选小鼠。抗体可以是下列其中一类免疫球蛋白的成员：IgG，IgM，IgA，IgE，及其亚类，优选IgG1抗体。本发明的抗体及其等同物可以是任何一类免疫球蛋白的成员或其组合。

非抗体VEGFR拮抗剂

除了上面讨论的抗体，或抗体的功能等同物之外，本发明所用受体拮抗剂还可以是其它生物分子和小分子，特别是与上述疗法联合。

生物分子包括所有脂类和单糖聚合物，氨基酸及分子量大于450的核苷酸。因此，生物分子包括，例如，寡糖和多糖；寡肽，多肽，肽，和蛋白；及寡核苷酸和多核苷酸。寡核苷酸和多核苷酸包括，例如，DNA和RNA。

生物分子还包括上述任何一种分子的衍生物。例如，生物分子的衍生物包括脂类和寡肽，多肽，肽及蛋白的糖基化衍生物。生物分子的衍生物还包括寡糖和多糖的脂类衍生物，例如，脂多糖类。

在本说明书中，不是生物分子的任何分子都被认为是小分子。本发明的小分子是具有碳和氢原子，及杂原子的物质，其中杂原子包括，但不限制于，氮，硫，氧和磷。小分子中的原子经由共价键和离子键连接；前者通常用于小的有机化合物，例如，小分子酪氨酸激酶抑制剂，如Iressa^TM和Tarceva^TM，后者通常用于小的无机化合物。小的有机分子中的原子排列可以是一个链，例如，碳-碳链或碳-杂原子链，或含有碳原子的环，例如，苯，或碳与杂原子的组合，即，杂环，例如，嘧啶或喹唑啉。与环系统连接的小的有机分子中一个或多个链的结合构成取代的环系统，两个环的稠合构成稠合的多环系统，它们可被简单称作多环系统，其中一个例子是Iressa^TM的母体构架。小分子包括天然存在的化合物，如激素，神经递质，核苷酸，氨基酸，糖，脂类，及其衍生物，和通过常规的有机合成，生物合成，或其组合合成的那些化合物。见，例如，Ganesan，Drug Discov.Today，7(1)：47-55(2002年1月)；Lou，Drug Discov.Today，6(24)：1288-1294(2001年12月)。

小分子的某些例子包括有机化合物，有机金属化合物，有机化合物和有机金属化合物的盐，糖，氨基酸，核苷及核苷酸。应当强调的是，小分子可具有任何分子量。它们被称作小分子仅仅是因为它们的分子量通常小于450。小分子包括天然存在的化合物及合成的化合物。

小分子和生物药对人类患者的给药是通过本领域已知的方法进行的。对于小分子而言，这种方法的例子在Spada，美国专利5,646,153第57栏第47行-第59栏第67行描述。给予小分子的描述引入此处作为参考。

中和VEGF受体的VEGF活化

内皮或非内皮细胞，如肿瘤细胞样品中VEGF受体活化的中和可在体外或体内进行。中和VEGF-受体表达细胞样品中VEGF受体的VEGF活化包括使细胞与本发明的拮抗剂，例如抗体接触。细胞是在把VEGF加入到细胞样品中之前，同时，或之后，在体外与拮抗剂，例如抗体接触的。

本发明的拮抗剂，例如抗体与VEGF受体的体内接触是通过把它给予哺乳动物而实现的。给予哺乳动物的方法包括，例如，口服，静脉内，腹膜内，皮下，或肌内给药。

这种体内中和法可用于抑制哺乳动物血管发生。血管发生的抑制是一种有效的治疗方法，如用于预防或抑制与病理状况，如肿瘤生长有关的血管发生。因此，本发明的拮抗剂，例如抗体是抗-血管发生并抗肿瘤的免疫治疗剂。

术语哺乳动物是指任何哺乳动物。哺乳动物的一些例子包括宠物，如狗和猫；饲养动物，如猪，牛，绵羊和山羊；实验室动物，如小鼠和大鼠；灵长类动物，如猴，无尾猿，黑猩猩；及人类。

VEGF受体可在某非-内皮细胞，如肿瘤细胞上找到，表明自分泌和/或旁分泌环在这些细胞中的意外存在。本发明的拮抗剂，例如，抗体可中和这种细胞上VEGF受体的活性，由此阻断自分泌和/或旁分泌环，并抑制肿瘤生长。

抑制哺乳动物血管发生及病理状况，如肿瘤生长的方法包括全身给予哺乳动物，或直接给予哺乳动物内的肿瘤有效量的本发明任何一种拮抗剂，例如抗体，包括其任何一种功能等同物。哺乳动物优选人。该方法可有效治疗患有实体瘤，优选血管瘤，和非实体瘤的患者。

肿瘤生长的抑制或减轻包括阻止或抑制肿瘤，如癌性肿瘤或非癌性肿瘤的进展。肿瘤的进展包括侵入，转移，复发和肿瘤大小的增加。肿瘤生长的抑制或减轻还包括破坏肿瘤。

所有类型的肿瘤都可通过本发明的方法进行治疗。肿瘤可以是实体瘤或非实体瘤。

可用本发明拮抗剂治疗的实体瘤的一些例子包括癌，肉瘤，胚细胞瘤或神经胶质瘤。这种肿瘤的一些例子包括表皮样肿瘤，鳞状细胞肿瘤，如头和颈部肿瘤，结肠直肠肿瘤，前列腺肿瘤，乳腺肿瘤，肺肿瘤，包括小细胞和非-小细胞肺肿瘤，胰腺肿瘤，甲状腺肿瘤，卵巢肿瘤，和肝肿瘤。其它例子包括卡波济氏肉瘤，CNS肿瘤，成神经细胞瘤，毛细血管成血管细胞瘤，脑膜瘤和脑转移瘤，黑素瘤，胃肠癌和肾癌，及肉瘤，横纹肌肉瘤，成胶质细胞瘤，优选多形性成胶质细胞瘤，和平滑肌肉瘤。可使用本发明拮抗剂有效治疗的血管化皮肤癌的例子包括鳞状上皮细胞癌，基底细胞癌，和皮肤癌，它们通过抑制恶性角质形成细胞，如人恶性角质形成细胞治疗。

非实体瘤的一些例子包括白血病，多发性骨髓瘤和淋巴瘤。白血病的一些例子包括急性髓细胞性白血病(AML)，慢性髓细胞性白血病(CML)，急性淋巴细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，红细胞性白血病或单核细胞性白血病。淋巴瘤的一些例子包括与何杰金氏病和非何杰金氏病有关的淋巴瘤。

随后描述的实验结果证实，本发明的抗体可特异性阻断VEGF诱导的，在转染的3T3细胞中表达的，小鼠胞外flk-1(VEGFR-2)(VEGFR-2)/胞内fms嵌合受体的磷酸化。所述抗体对CSF-1完全刺激的嵌合胞外fms/胞内FLK-2受体没有作用。下面所述的体内研究表明，所述抗体可显著抑制裸鼠的肿瘤生长。

VEGF受体拮抗剂，例如，单克隆抗体的混合物可为抑制肿瘤细胞生长提供一种特别有效的方法。该混合物可含有少至2，3或4种抗体，多至6，8或10种抗体。

预防或抑制血管发生还可用于治疗特征在于过量血管发生的非瘤性病理疾病，如新血管性青光眼，增生性视网膜病，包括增生性糖尿病性视网膜病，关节炎，黄斑变性，血管瘤，血管纤维瘤，和牛皮癣。

使用本发明的拮抗剂分离并纯化VEGF受体

使用常规方法，如亲和色谱法，本发明的拮抗剂可用于分离并纯化VEGF受体(Dean等，Affinity Chromatography：A PracticalApproach，IRL Press，Arlington，VA(1985))。本领域熟知的其它方法包括使用抗体包被的磁珠的磁性分离技术，使用与固体基质连接的抗体的“淘选”技术，和流式细胞术。

VEGF受体的来源通常是血管细胞，特别是血管内皮细胞，它可表达VEGF受体。血管内皮细胞的适宜来源是血管，如脐带血细胞，特别是人脐带血管内皮细胞(HUVEC)。

VEGF受体可用作生产其它物质的起始材料，如用于制造其它单克隆和多克隆抗体的抗原，所述抗体可识别并结合VEGF受体或表达VEGF的细胞表面上的其它抗原。

使用本发明的拮抗剂分离并纯化flk-1(VEGFR-2)阳性肿瘤细胞

使用常规方法，如亲和色谱法，本发明的拮抗剂可用于分离并纯化flk-1(VEGFR-2)(VEGFR-2)阳性肿瘤细胞，即，表达flk-1(VEGFR-2)受体的肿瘤细胞(Dean等，Affinity Chromatography：APractical Approach，IRL Press，Arlington，VA(1985))。本领域熟知的其它方法包括使用抗体包被的磁珠的磁性分离技术，细胞毒性剂，如与抗体偶联的补体，使用与固体基质连接的抗体的“淘选”技术，和流式细胞术。

体外或体内监测VEGF和VEGF受体的水平

使用标准测定法和本领域已知的方法，本发明的拮抗剂，例如抗体可用于在体外或体内监测生物样品中VEGF或VEGF受体的水平。生物样品的一些例子包括体液，如血液。标准测定法包括，例如，标记抗体并进行标准免疫测定法，如本领域熟知的放射性免疫测定法。

用于进行本发明的标准重组DNA技术由Sambrook等，在“分子克隆”，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1987)中和Ausubel等(Eds.)在“分子生物学的当前方案”，Green PublishingAssociates/Wiley-Interscience，New York(1990)中描述。

给药

为进行治疗，可把本发明的受体拮抗剂给予肿瘤患者，给药量足以预防，抑制，或减轻肿瘤的进展，例如，肿瘤的生长，侵入，转移和/或复发。足以达到这一目的的量被定义为治疗有效量。用于这种用途的有效量取决于疾病的严重程度和患者自身免疫系统的一般状况。给药方案还可根据疾病状况和患者的状态而改变，通常每天给药一次或连续输注多次给药(例如，每隔4-6小时)，或由主治医生根据患者的情况决定。然而，应当注意，本发明不限于任何特定的剂量。

本发明可用于治疗任何适宜的肿瘤，包括，例如，乳腺，心脏，肺，小肠，结肠，脾，肾，膀胱，头和颈，卵巢，前列腺，脑，胰腺，皮肤，骨，骨髓，血液，胸腺，子宫，睾丸，子宫颈或肝的肿瘤。优选，当肿瘤是结肠肿瘤或非小细胞肺癌(NSCLC)时，使用本发明的方法。

此外，本发明的肿瘤优选过量表达EGFR。在很多人类肿瘤中，都能检测到升高的EGFR表达；例如，头和颈(80-100％)，结直肠(25-77％)，胰腺(30-50％)，肺(40-80％)，食管(43-89％)，肾细胞(50-90％)，前列腺(65％)，膀胱(31-48％)，子宫颈/子宫(90％)，卵巢(35-70％)和乳腺(14-91％)。EGFR的表达已被证实是预后不良，存活率降低，和某些肿瘤类型转移增加的指标。

此外，本发明的肿瘤优选具有VEGFR的异常表达或信号传递。VEGFR信号传递的提高可在多种不同的人类癌症中观察到。高水平VEGFR-2是由浸润神经胶质瘤的内皮细胞表达的(Plate等，(1992)Nature 359：845-848)。VEGFR-2的水平可由人成胶质细胞瘤产生的VEGF特异性上调(Plate等，(1993)Cancer Res.53：5822-5827)。VEGFR-2在成胶质细胞瘤相关性内皮细胞(GAEC)中的高水平表达表明，受体活性很可能是在肿瘤形成过程中被诱导的，这是因为在正常的脑内皮细胞中，几乎检测不到VEGFR-2的转录物。这种上调被限定在与肿瘤邻近的血管内皮细胞。

本发明可用于抑制或减轻肿瘤生长。肿瘤生长的抑制或减轻是指预防，抑制，或减轻肿瘤的发展，例如肿瘤的生长，侵入，转移和/或复发。此外，本发明还可用于治疗血管发生状况，如动脉粥样硬化，关节炎，黄斑变性和牛皮癣。对于所患状况可用本发明进行治疗的那些患者的鉴定是本领域技术人员能力和知识范围之内的事情。

在本发明中，任何适宜的方法或途径都可用于给予EGFR拮抗剂和/或VEGFR拮抗剂，例如，口服，静脉内，腹膜内，皮下，或肌内给药。拮抗剂的给药剂量取决于多种因素，包括，例如，拮抗剂的类型，所治疗肿瘤的类型和严重程度，以及拮抗剂的给药途径。然而，应当强调的是，本发明不限于任何一种特定的给药方法或途径。

在其中一个选择性实施方案中，EGFR拮抗剂和VEGFR拮抗剂可与一种或多种抗肿瘤剂联合给药。见，例如，美国专利号6,217,866(Schlessinger等)(抗EGFR抗体与抗肿瘤剂联合给药)；美国申请号09/312,286(Waksal等)(抗EGFR抗体与放疗联合治疗)。任何适宜的抗肿瘤剂都可使用，如化疗剂或放疗。化疗剂的例子包括，但不限制于，顺铂，阿霉素，紫杉醇，伊立替康(CPT-11)，拓扑替康或其组合。当抗肿瘤剂是指进行放疗时，放射源对于所治疗的患者而言，可以是外在的(外在光束放疗-EBRT)或内在的(近程放射治疗-BT)。抗肿瘤剂的给药剂量取决于多种因素，包括，例如，药剂的类型，所治疗肿瘤的类型和严重程度，及药剂的给药途径。然而，应当强调的是，本发明不限制于任何特定的剂量。

在其它选择性实施方案中，EGFR拮抗剂和VEGFR拮抗剂可与一种或多种适宜的佐剂，例如，细胞因子(例如，IL-10和IL-13)或其它免疫刺激剂联合给药。见，例如，Larrivée等，supra。然而，应当理解，仅给予EGFR拮抗剂和VEGFR拮抗剂的治疗有效方式就足以预防，抑制，或减轻肿瘤的进展。

此外，EGFR拮抗剂和/或VEGFR拮抗剂可作为配体偶联物给药，它特异性结合受体，并在配体-毒素内化后，传递中毒性致死负荷量。毒素和受体间的偶联物是为了研究对EGFR-或VEGFR-过量表达的肿瘤细胞特异的毒剂，同时使非特异性毒性达到最小而设计的。例如，由EGF和假单胞菌内毒素(PE)组成的偶联物在体外对表达EGFR的HeLa细胞是毒性的。各种药剂，包括硫利达嗪和腺病毒，都可提高细胞对偶联物的摄取，并增加偶联物的细胞毒性。

应当理解，为预防或治疗目的而用于哺乳动物中的本发明的EGFR和/或VEGFR拮抗剂可以组合物的形式给药，所述组合物还含有药学上可接受的载体。适宜的药学上可接受的载体包括，例如，水，生理盐水，磷酸盐缓冲的盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等的一种或多种，及其组合。药学上可接受的载体还可包括微量的辅助物质，如湿润剂或乳化剂，防腐剂或缓冲剂，它们可提高结合蛋白的保存期或有效性。正如本领域熟知的，可把组合物配制成注射液，从而在给予哺乳动物后，快速，持续或延迟释放活性成分。

本发明的EGFR拮抗剂和/或VEGFR拮抗剂可以是各种形式。这些形式包括，例如，固体，半-固体和液体剂型，如片剂，丸剂，粉剂，液体溶液，分散液或混悬液，脂质体，栓剂，可注射和可输注的溶液。优选形式取决于目标给药模式和治疗应用。

这种拮抗剂可按照制药领域熟知的方法制备。在制造组合物时，活性成分通常与载体混合，或用载体稀释，和/或封在载体内，例如，封入胶囊，药袋，纸或其它容器中。当载体作为稀释剂使用时，它可以是固体，半-固体，或液体材料，它还可作为活性成分的载体，赋形剂或介质。因此，组合物可以是片剂，锭剂，药袋，扁囊剂，酏剂，混悬液，气溶胶(固体或液体基质)，含有10重量％活性化合物的软膏剂，软明胶胶囊和硬明胶胶囊，栓剂，注射液，悬浮液，无菌包装的粉剂和局部用药膏。

抑制肿瘤生长的试剂盒

本发明还包括抑制肿瘤生长的试剂盒，试剂盒中含有治疗有效量的EGFR拮抗剂和治疗有效量的VEGFR拮抗剂。本发明试剂盒的EGFR或VEGFR拮抗剂可以是任何适宜的拮抗剂，它们的例子已经在上面描述。优选，试剂盒的EGFR拮抗剂包含对EGFR特异的抗体，或其功能等同物。可选择性地，还优选试剂盒的EGFR拮抗剂包含对EGFR特异的小分子。试剂盒的VEGFR拮抗剂优选包含对VEGFR特异的抗体，或其功能等同物。可选择性地，试剂盒的VEGFR拮抗剂优选包含对VEGFR特异的小分子。此外，本发明的试剂盒还可含有抗肿瘤剂。本发明适宜的抗肿瘤剂的例子已经在这里描述。本发明的试剂盒还可含有佐剂，它们的例子也已经在上面描述。

因此，本发明的受体拮抗剂可用于体内体外的研究，诊断，预防或治疗方法，它们是本领域熟知的。当然，应当了解并预期本领域的技术人员可根据这里公开的本发明原理进行改变，这种改变也落在本发明的范围之内。

这里提到的所有参考文献全部引入此处作为参考。

                       实施例

提出下列实施例的目的是为了帮助理解本发明，而不是，也不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。实施例中不包括常规方法的详细描述，例如在构建载体和质粒，把编码多肽的基因插入到这种载体和质粒中，或把质粒引入到宿主细胞中时所用的那些方法。这种方法是本领域那些普通技术人员熟知的，而且已经在很多公开出版物中描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)分子克隆：实验室指南，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress。

实施例1.细胞系和培养基

NIH 3T3细胞是从美国典型培养物保藏中心(Rockville MD)获得的。C441细胞系是用嵌合受体小鼠flk-1(VEGFR-2)/人fms转染3T3细胞构建的。10A2是含有嵌合受体人fms/小鼠FLK-2的3T3转染子，它的分离和特性已经描述过(Dosil等，Mol.Cell.Biol.13：6572-6585(1993))。细胞通常维持在Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(DME)中，其中补充了10％小牛血清(CS)，1mML-谷氨酰胺，抗生素，和600μg/ml G418(Geneticin；Sigma，St LouisMO)。

成胶质细胞瘤细胞系，GBM-18维持在补充了5％小牛血清，1mM L-谷氨酰胺，和抗生素的DME中。

生产分泌可溶性嵌合蛋白，小鼠flk-1(VEGFR-2)：SEAPs(分泌型碱性磷酸酶)的稳定3T3系，并把它维持在DMEM和10％小牛血清中。收集条件培养基。从条件培养基中分离出可溶性flk-1(VEGFR-2)：SEAP。

实施例II.单克隆抗体的分离

实施例II-1.大鼠抗小鼠flk-1(VEGFR-2)单克隆抗体DC-101(IgG1)

用免疫复合物使Lewis大鼠(Charles River Labs)超免疫，所述免疫复合物含有小鼠flk-1：SEAPs可溶性受体，兔抗-碱性磷酸酶多克隆抗体和G蛋白琼脂糖珠。动物在3个月内，腹膜内注射7次这种复合物(第0，14，21，28，49，63，77天)。在不同的时间，从动物尾静脉采集血液，并通过ELISA筛选与mflk-1(VEGFR-2)：SEAPs高滴定度结合的免疫血清。最后一次注射5天后，杀死大鼠，无菌除去脾脏。洗涤脾细胞，计数，并与鼠骨髓瘤细胞系NS1以2∶1的比例融合。在HAT培养基中选择杂交瘤，并通过ELISA筛选特异性结合mflk-1(VEGFR-2)：SEAPs而不结合SEAPs蛋白的集落。许多阳性杂交瘤进一步扩增并通过限制稀释而被克隆三次。下面研究其中一个被称为DC-101的亚克隆。

实施例II-2小鼠抗小鼠flk-1(VEGFR-2)单克隆抗体Mab25和Mab73

鼠抗flk-1(VEGFR-2)单克隆抗体(Mabs)是按照与DC-101所用类似的方法生产的。简单地说，使用结合抗SEAP-蛋白/A琼脂糖复合物或来源于转染NIH 3T3细胞条件培养基的小麦胚凝集素琼脂糖的flk-1(VEGFR-2)/SEAP可溶性受体给小鼠注射。6个月内，定期使小鼠超免疫。收集免疫脾细胞，与鼠骨髓瘤细胞系NSI融合。在HAT培养基中选择杂交瘤，温育之后，筛选产生小鼠Mab的集落。与DC-101所用的方法不同，首先筛选结合flk-1(VEGFR-2)/fms受体的阳性上清液，所述受体捕获自ELISA平板上的C441细胞溶解产物，所述ELISA平板包被有针对fms C-末端区的肽产生的多克隆抗体。然后通过ELISA测定与完整C441细胞，和纯化flk-1(VEGFR-2)/SEAP及单独的SEAP结合的活性Mabs。使结合C441，与flk-1(VEGFR-2)/SEAP反应，而不与SEAP反应的杂交瘤上清液扩增，在腹水中生长，并纯化(EZ-PREP，Pharmacia)。在C441细胞上对纯化的Mabs进行测定，通过FACS测定它们的细胞表面结合能力，并在磷酸化测定法中测定它们抑制VEGF诱导的flk-1(VEGFR-2)/fms活化的能力。这些研究的结果得到了Mabs 25和73的克隆(同种型IgG1)，用于根据它们特异性结合flk-1(VEGFR-2)，以及以与DC-101相似的水平阻断受体活化的能力而进一步进行表征。

实施例III测定法

实施例III-1.ELISA方法

抗体是通过固态ELISA筛选的，其中比较了各种mAbs与flk-1(VEGFR-2)：SEAP和SEAP蛋白的结合特征。以50-100ng/孔，用pH9.6碳酸盐缓冲液中的flk-1：SEAP或AP包被微量滴定板，4℃过夜。37℃时，用补充有10％新生小牛血清(NB10)的磷酸盐缓冲盐水封闭平板1小时。37℃时，把杂交瘤上清液或纯化抗体加入到平板中温育2小时，然后加入与辣根过氧化物酶(Tago)偶联的山羊抗-大鼠IgG温育1小时。充分洗涤后，加入TMB(Kirkegaard和Perry，GaithersburgMD)和过氧化氢作为色原，在ELISA阅读器的450nm处对平板读数。

实施例III-2同种型分析

各单克隆抗体的同种型分析是按照先前所述(Songsakphisarn，R.和Goldstein，N.I.，Hybridoma 12：343-348，1993)使用大鼠同种型特异性试剂(Zymed Labs，South San Francisco CA)进行的。

实施例III-3磷酸化，免疫沉淀和免疫印迹测定法

对前述方法(Tessler等)进行改进后，使用C441和10A2细胞进行磷酸化测定和蛋白质印迹分析。简单地说，细胞在DME-10％CS中生长至90％汇合，然后在实验前，使血清在DME-0.5％CS中饥饿24小时。HUVEC细胞在EGM基础培养基中生长至亚汇合。对于中和测定法而言，在有和没有mAb DC-101存在时，在没有血清的条件下(DME-0.1％BSA)，用各种浓度的适宜配体室温刺激细胞15分钟。配体VEGF和CSF-1分别以10-80ng/ml和20-40ng/ml的浓度进行测定。单克隆抗体以0.5μg/ml-10μg/ml的浓度测定。为了评估mAb DC-101对VEGF诱导的flk-1(VEGFR-2)-fms受体活化的作用，同时加入抗体(竞争性抑制)或在加入配体之前，使抗体与细胞预结合15分钟。没有和有DC-101存在时，在没有血清的培养基中温育的细胞分别用作没有和有抗体存在时的受体自磷酸化的对照。使表达fms/FLK-2嵌合受体(10A2)的对照细胞系饥饿，用20和40ng/ml CSF-1刺激，在有和没有5μg/ml DC-101存在的情况下测定。

刺激后，用含有1mM原钒酸钠的冰冷PBS洗涤细胞单层。然后，把细胞溶解在溶解缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.4，1％ Triton X-100，137mM NaCl，10％甘油，10mM EDTA，2mM原钒酸钠，100mM NaF，100mM焦磷酸钠，5mM Pefabloc(Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis IN))，100μg抑肽酶和100μg/ml亮抑蛋白酶肽)中，14000xg离心10分钟。利用多克隆抗体，使蛋白从转染细胞的澄清溶解产物中免疫沉淀出来，其中所述多克隆抗体是由与人fms受体C-末端区(Tessler等，J.Biol.Chem.269，12456-12461，1994)或与A蛋白琼脂糖珠偶联的鼠FLK-2内激酶结构域(Small等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA，91，459-463，1994)相对应的肽产生的。与DC-101或无关大鼠IgG的免疫沉淀是用10μg与G蛋白珠偶联的抗体进行的。然后用0.2％ Triton X-100，10mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，2mM EDTA(缓冲液A)洗涤珠子一次，用含有500mM NaCl的缓冲液A洗涤珠子两次，用Tris-HCl，pH8.0洗涤珠子两次。把滴干的珠子与30μl 2x SDS加样缓冲液混合，并在4-12％梯度凝胶(Novex，San DiegoCA)中经过SDS PAGE。进行电泳后，把蛋白印在硝酸纤维素滤膜上进行分析。使滤膜在含有5％牛血清白蛋白和10％脱脂奶粉(Biorad，CA)的封闭缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl(TBS))中封闭过夜。为了检测磷酸化受体，用封闭缓冲液中，针对磷酸酪氨酸的单克隆抗体(UBI，Lake Placid，NY)室温探测印迹1小时。然后用含有0.1％吐温-20(TBS-T)的0.5 x TBS洗涤印迹，并用与辣根过氧化物酶(Amersham)偶联的山羊抗-小鼠Ig温育。用TBS洗涤印迹，并用化学发光试剂(ECL，Amersham)温育1分钟。与磷酸化蛋白反应的抗磷酸酪氨酸是通过曝光高效发光检测胶片(Hyperfilm-ECL，Amersham)0.5-10分钟检测的。

为了检测C441细胞中flk-1(VEGFR-2)/fms的受体水平，按照制造商(Amersham)提供的方法分离印迹，并用抗-fms兔多克隆抗体再次探测。

实施例III-4流式细胞计结合测定法

C441细胞在10cm平板中生长至近汇合。用非-酶促解离缓冲液(Sigma)把细胞移出，在没有血清的冷培养基中洗涤，并重悬浮在补充了1％BSA(HBS S-BSA)的Hanks平衡盐溶液中，浓度为每只试管1百万个细胞。在每只试管中加入10μg单克隆Ab DC-101或同种型匹配的无关抗体抗FLK-223H7，在冰上再保持60分钟。洗涤后，加入5μl与FITC(TAGO)偶联的山羊抗-小鼠IgG，在冰上保持30分钟。洗涤细胞3次，在1ml HBSS-BSA中重悬浮，并在Coulter Epics Elite细胞计数器上进行分析。荧光第二抗体的非特异性结合是根据缺少第一抗体的样品测定的。

实施例III-5完整细胞的结合测定法

使用在24孔培养皿中生长至汇合的细胞对C441细胞进行测定。HUVEC细胞在6孔培养皿中生长至汇合。用结合缓冲液(DMEM，50mMHEPES pH7.0，0.5％牛血清白蛋白)中不同量的mAb DC-101 4℃温育细胞单层2小时。然后用冷的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤细胞，用终浓度为2.5μg/ml，与生物素偶联的第二抗-大鼠IgG抗体温育。4℃温育1小时后，洗涤细胞，并用链霉抗生物素-辣根过氧化物酶复合物4℃温育30分钟。洗涤后，通过用比色检测系统(TMB，Kirkeggard和Perry)测量540nm处的吸光度而测定细胞结合抗体。单独的第二抗体的OD 540nm用作非特异性结合的对照。

实施例III-6细胞增殖测定法

促有丝分裂测定法是用Cell Titer 96非放射性细胞增殖测定试剂盒(Promega Corp.，Madison，WI)进行的。在该测定法中，根据活细胞把四唑盐还原成甲产物所获得的值比色测量增殖。简单地说，HUVEC细胞以1000个细胞/孔的密度，在EGM基础培养基中的24孔明胶包被的平板中生长。温育48小时后，向孔中加入各种成分。在有和没有1μg/ml mAb DC-101存在时，向培养基中加入10ng/ml VEGF。加入肝素(Sigma)至最终浓度为1μg/ml。然后再温育该细胞3天。为测量细胞生长，向各孔中加入20μl四唑染料的等分试样，37℃温育该细胞3小时。溶解细胞，测量甲产物的吸光度(OD570)，从而量化增殖。

实施例IV.体外活性测定法

实施例IV-1.鼠抗-flk-1(VEGFR-2)Mabs 25和73引起VEGF诱导的flk-1(VEGFR-2)/fms受体活化的特异性中和

测定法是用从等浓度flk-1(VEGFR-2)/fms转染的3T3细胞系C441中免疫沉淀出来的FLK/fms和PDGF受体进行的，而人EGFR是从肿瘤细胞系KB中免疫沉淀出来的。细胞在有和没有10μg/ml鼠抗-flk-1 Mabs 25和37存在时，用含有20ng/ml VEGF(flk-1/fms)，DMEM-10％小牛血清(PDGFR)，或10ng/ml EGF(EGFR)的RPMI-0.5％BSA刺激。刺激后，用PBS-1mM原钒酸钠洗涤细胞并溶解。Flk-1/fms和PDGFR是从溶解产物中免疫沉淀的，所述溶解产物具有分别针对c-fms(IM 133)C-末端区和PDGF(UBI)受体的肽产生的多克隆抗体。EGFR用针对人受体N-末端区温育的Mab(C225)免疫沉淀。免疫沉淀的溶解产物经过SDS聚丙稀酰胺电泳，接着进行蛋白质印迹分析。用抗-PTyr Mab(UBI)探测印迹，以检测受体活化。相对于无关Mab和未受刺激的对照组评估受刺激细胞的受体中和。

实施例IV-2使用Mab25和Mab73作为探针，通过蛋白质印迹检测flk-1(VEGFR-2)/fms受体

受体是用鼠抗-flk-1(VEGFR-2)Mabs在flk-1(VEGFR-2)/fms受体的蛋白质印迹上检测的，所述flk-1(VEGFR-2)/fms受体是由针对c-fms受体C-末端区的肽产生的多克隆抗体免疫沉淀的，而c-fms受体则来源于等浓度转染的3T3细胞系C441的溶解产物。通过SDS凝胶电泳和蛋白质印迹分析后，把印迹分成四部分，每部分都用50μg/ml的抗-flk-1(VEGFR-2)Mabs 25和73探测。然后分离印迹，并用抗-fms多克隆抗体再次探测，以证实由各Mab检测的带代表flk-1(VEGFR-2)fms受体。

实施例IV-3通过用抗-flk-1(VEGFR-2)Mabs免疫沉淀而检测来源于VEGF刺激的HUVEC和OVCAR-3细胞的活化KDR(VEGFR-2)

蛋白是用来源于新鲜分离的HUVEC溶解产物的不同抗体免疫沉淀的。在溶解前，用RPMI-0.5％BSA中的20ng/ml VEGF室温刺激细胞10分钟，并用含1mM原钒酸钠的PBS洗涤。各次免疫沉淀是用等体积溶解产物进行的，然后经过SDS聚丙烯酰胺电泳，接着进行蛋白质印迹。最初用抗-PTyr Mab(UBI)探测印迹，随后分离，并用针对flk-1/KDR(VEGFR-1/VEGFR-2，IM 142)内激酶的肽产生的多克隆抗体再次探测，接着用针对flk-1(VEGFR-2)C-末端区的多克隆抗体(Santa CruzBiotechnology，Inc.)探测。免疫沉淀是用无关大鼠Mab，23H7，无关小鼠Mab，DAB8，和抗flk-1(VEGFR-2)Mabs，DC-101，73，25，和抗flk-1/KDR(VEGFR-1/VEGFR-2)多克隆抗体，IM142进行的。在某些情况下，分离印迹，并用抗flk-1 Mabs 73和25再次探测，以检测交叉反应带。

类似方法用于检测卵巢癌细胞系OVCAR-3的KDR(VEGFR-2)受体形式。

实施例V抗体的活性

实施例V-1 ELISA和用DC-101免疫沉淀

人们发现大鼠IgG1单克隆抗体DC-101对鼠酪氨酸激酶受体flk-1(VEGFR-2)特异。ELISA数据表明，抗体与纯化的flk-1(VEGFR-2)：SEAP结合，但不与碱性磷酸酶或其它受体酪氨酸激酶如FLK-2结合。如图1所示，DC-101可使鼠flk-1(VEGFR-2)：SEAPS免疫沉淀，而不能使单独的SEAPS免疫沉淀。

实施例V-2用DC-101抑制Flk-1(VEGFR-2)受体磷酸化

进行实验以便确定DC-101是否能通过其关联配体VEGF₁₆₅中和C441细胞中flk-1(VEGFR-2)的磷酸化。在这些研究中，单克隆抗体和VEGF在室温同时加入到细胞单层中15分钟。这些条件被设计成测定抗体对受体/配体结合的竞争性作用(竞争性抑制)。图2a所示的这些测定结果表明，当在有DC-101存在的情况下测定细胞时，VEGF₁₆₅诱导的flk-1(VEGFR-2)/fms受体磷酸化显著降低。此外，这些数据表明，Mab与VEGF₁₆₅竞争阻止配体导致的受体完全活化。为了测定VEGF-flk-1(VEGFR-2)相互作用对DC-101所致抑制的敏感性，C441细胞是以最大刺激浓度的VEGF₁₆₅(40ng/ml)结合各种水平的抗体测定的。这些Mab滴定的结果在图2b中给出。当DC-101的浓度大于0.5μg/ml时，VEGF₁₆₅所致的flk-1(VEGFR-2)磷酸化显著降低。这些数据表明，相对较低浓度的抗体(＜1μg/ml)足以抑制配体所致的受体活化。在80ng/ml的配体过量存在时，5μg/ml抗体就能够中和VEGF₁₆₅对flk-1(VEGFR-2)的刺激。作为对照，使用CSF-1在完全刺激的fms/FLK-2受体(10A2细胞系)上测试DC-101的作用。在这些条件下，DC-101对受体活化没有影响。

实施例V-3利用DC-101进行抑制研究

通过研究进一步评估Mab抑制的程度和特异性，其中在加入配体之前，用细胞预温育DC-101，以便使抗体与受体充分作用。在这些实验中，用5μg/ml DC-101，通过常规方法(ImClone，NY)制备的大鼠抗-FLK-2 Mab(2A13)，和对照组大鼠IgG1(Zymed Labs)室温温育细胞单层15分钟，然后加入40ng/ml VEGF₁₆₅再温育15分钟。为了比较而进行测定，其中同时加入DC-101和VEGF₁₆₅(竞争性抑制)。这些研究的结果(图4)表明，用flk-1(VEGFR-2)/fms转染的细胞预温育的抗-flk-1(VEGFR-2)单克隆抗体可完全消除VEGF₁₆₅所致的受体活化。类似结果是用VEGF₁₂₁进行刺激观察到的。当加入无关同种型匹配的大鼠抗体不会影响VEGF所致的flk-1(VEGFR-2)磷酸化时，用抗-fms多克隆抗体探测的相同印迹的活性显示，每道受体蛋白的水平相同。这些数据表明，使用DC-101观察到的磷酸化抑制是由于受体活化的阻断，而不是试验样品中缺少受体蛋白。

实施例V-4通过FACS分析DC-101与C441细胞的结合

通过FACS分析测定mAb与flk-1(VEGFR-2)/fms受体(C441细胞)转染的3T3细胞的结合。图6所示结果证明，在C441细胞表面上表达的嵌合flk-1(VEGFR-2)/fms可被mAb DC-101特异性识别，而不能被针对相关酪氨酸激酶受体，FLK-2温育的同种型抗体识别。mAb-受体在细胞表面相互作用的效率是根据测定法确定的，其中在完整的C441细胞上测量mAb结合的不同水平。图7所示的这些结果表明，mAb以大约500ng/ml相对较显著亲和性与flk-1(VEGFR-2)/fms受体结合。这些结果表明，mAb对细胞表面表达的flk-1(vEGFR-2)具有较强的亲和性。

实施例V-5通过免疫沉淀测定DC-101的反应性

DC-101与flk-1(VEGFR-2)/fms受体的反应程度是在被VEGF活化后，测定抗体使受体免疫沉淀的能力而进一步评估的。图8表示VEGF刺激的C441细胞磷酸化flk-1(VEGFR-2)/fms受体的mAb DC-101所致的免疫沉淀。结果表明DC-101单克隆抗体和抗fms多克隆抗体具有相似的受体作用水平，而大鼠抗FLK-2抗体2H37(IgG1)和2A13(IgG2a)则没有反应性。然后进行实验，确定mAb DC-101是否能够在配体的最大刺激浓度(40ng/ml)中和VEGF诱导的flk-1(VEGFR-2)/fms磷酸化。在这些研究中，把单克隆抗体与配体同时加入到细胞单层中，或在配体刺激之前加入，室温测定15分钟。对这些条件进行研究，以确定抗体对受体/配体结合的竞争性作用(竞争性抑制)和预结合抗体阻止受体活化效果。图4所示的这些测定结果表明，flk-1(VEGFR-2)/fms的磷酸化是通过同时加入mAb和VEGF降低的，并可被与受体预结合的抗体明显抑制。这些数据的光密度扫描揭示，mAbDC-101与flk-1(VEGFR-2)/fms相互作用，抑制磷酸化至完全刺激的受体对照组(4道)的6％(5道，P)和40％(6道，C)。根据这些数据我们可推断mAb DC-101与配体-受体相互作用激烈竞争，中和flk-1受体的活化。为了确定VEGF-flk-1(VEGFR-2)相互作用对mAb DC-101所致抑制的敏感性，在抗体浓度逐渐增加时，用最大的VEGF水平测定C441细胞。测定是在竞争和预结合条件下，用mAb进行的。这些mAb滴定的结果在图9中给出。当mAb DC-101与浓度大于0.5μg/ml的VEGF抗体竞争时，可观察到flk-1(VEGFR-2)磷酸化的显著降低。这些数据还表明，相对较低浓度的预结合抗体(＜1μg/ml)足以完全抑制配体所致的受体活化。

实施例V-6通过磷酸化测定法测定DC-101的活性

为进一步评估mAb DC-101对受体活化的拮抗作用，进行磷酸化测定，其中把固定量的抗体(5μg/ml)加入到用量逐渐增加的配体所刺激的C441细胞中(图3a)。通过光密度测定法的读数量化有和没有mAb DC-101时各配体浓度诱导的磷酸化水平。图3b给出的这些数据的图表明，即使有过量VEGF存在，抗体也能部分中和受体磷酸化。为了评估mAb DC-101对受体活化的特异性，测试了抗体竞争性抑制3T3转染细胞系10A2中，CSF-1诱导的fms/FLK-2受体活化的能力。在这些实验中，测试了5μg/ml的mAb DC-101和已知导致受体完全活化的CSF-1浓度(20-40ng/ml)。图10所示的这些结果表明，mAb DC-101对CSF-1介导的fms/FLK-2受体磷酸化没有作用。

实施例V-7通过预温育研究DC-101的抑制作用

通过研究进一步评估抗体抑制的程度和特异性，其中DC-101或无关抗体是在加入配体前用细胞预温育的，以确保抗体与受体充分作用。在这些实验中，细胞单层是在加入40ng/ml VEGF前，用5μg/mlDC-101，大鼠抗FLK-2mAb(2A13)或对照大鼠IgG1(Zymed Labs)预温育的。为了进行对比，还进行了竞争性测定，其中同时加入抗体和VEGF。这些研究的结果表明，只有把抗flk-1(VEGFR-2)单克隆抗体与flk-1(VEGFR-2)/fms转染的细胞预温育才能够完全消除VEGF所致的受体活化，而加入无关同种型匹配的大鼠抗体则不能影响VEGF所致的flk-1(VEGFR-2)磷酸化。用抗-fms多克隆探测同一印迹的活性(图11)显示，每道的受体蛋白水平相等。这些数据表明，用mAb DC-101处理过的细胞观察到的磷酸化不足是由于阻断了VEGF-诱导的等量表达受体的磷酸化。

        实施例V-8抗体与同源受体形式的相互作用

然后进行实验，确定抗flk-1(VEGFR-2)单克隆抗体是否与人内皮细胞上的同源受体形式相互作用。在克隆的HUVEC细胞(ATCC)上，对浓度逐渐增加的DC-101进行的滴定表明，抗体具有复杂的结合行为。数据表示不同抗体与存在于内皮细胞上的VEGF受体的相互作用(Vaisman等，J.Biol.Chem.265，19461-19466，1990)。然后在与图8报道的那些相似的条件下，利用磷酸化测定法描述DC-101与VEGF刺激的HUVEC细胞相互作用的特异性。在这些研究中，当扣除配体成分时，DC-101可使HUVEC细胞的蛋白带免疫沉淀，所述蛋白带分子量与交联VEGF-受体带的那些相似(图12)。当VEGF刺激细胞时(比较图12中的1道和2道)，这些带显示磷酸化的增加。此外，VEGF诱导的受体带磷酸化是通过在测定时加入1μg/ml肝素而加强(图12中的3道)。这些发现与先前报道过的，存在低浓度肝素时，VEGF与内皮细胞结合的增加相一致(Gitay-Goren等，J.Biol.Chem.267，6093-6098.1992)。

很难确定免疫沉淀蛋白与DC-101相互作用可产生图12观察到的复杂的磷酸化带，图12给出了各种受体形式与HUVEC上VEGF的结合，及刺激后它们缔合的可能性。据报道，分子量约为180(KDR(VEGFR-2))，155，130-135，120-125和85的细胞表面表达的受体形式可结合HUVEC上的VEGF。这种发现强调了若干不同受体形式在配体刺激后异二聚的可能性，其异二聚的方式与KDR-flk-1(VEGFR-2/VEGFR-1)相似。然而，除了KDR(VEGFR-2)外，这些受体形式的准确特性和作用还不明确。所以，抗体反应性可能是因为与其中不依赖于KDR(VEGFR-2)的VEGF受体中之一相互作用而引起的。

通过FACS分析可知，DC-101既不与ELISA形式的人KDR(VEGFR-2)反应，也不与新鲜分离的HUVEC结合。这些结果表明，DC-101与人KDR(VEGFR-2)直接作用是不大可能的。

通过FACS分析可知，与DC-101不同，Mab 25和Mab 73都与ELISA形式的人KDR(VEGFR-2)反应，并结合新鲜分离的HUVEC。

实施例V-9HUVEC的促有丝分裂测定法

有和没有抗体存在时，在用VEGF刺激的HUVEC细胞(ATCC)的促有丝分裂测定法中对抗体进行试验，可观察到DC-101对内皮细胞的抑制作用。这些结果表明，VEGF所致的细胞增殖的显著增加可被DC-101大约减少35％。在这些测定法使用的生长条件下，肝素对细胞生长没有不同的作用。

因为DC-101可对VEGF诱导的增殖和HUVEC的受体磷酸化起作用，因此可以想得到这些结果是由于Mab与不定受体形式相互作用，其中不定受体形式很难接近细胞表面，但可对HUVEC生长发挥某些作用，尽管这种作用很小。且，DC-101可把分子量合适的磷酸化带从VEGF-刺激的HUVEC中免疫沉淀出来的事实表明，DC-101可与和活化受体有关的不定flk-1(VEGFR-2)样蛋白相互作用。

实施例V-10Mab 25和Mab 73与C441细胞和HUVEC的结合

通过FACS分析可知，Mabs 25和73可结合C441和HUVEC，并可在两个细胞系中内化。蛋白质印迹的结果表明，两种抗flk-1Mabs都可检测由抗fms多克隆抗体从C441细胞中免疫沉淀出来的FLK/fms受体带。(见上面实施例IV-2的方法)。这些抗体可引起VEGF诱导的flk-1(VEGFR-2)/fms受体的特异性中和，而且对PDGF所致的小鼠PDGF受体磷酸化或EGF所致的人EGF受体磷酸化没有作用。(见上述实施例IV-1的方法)。由增殖测定法可知，它们具有抑制VEGF刺激的HUVEC至50％的能力，而DC-101则影响生长至很小的程度。

实施例V-11 KDR(VEGFR-2)与Mab25和Mab73的免疫沉淀

KDR(VEGFR-2)代表一类可利用Mab 25和Mab 73从活化HUVEC中免疫沉淀出来的磷蛋白。KDR(VEGFR-2)是在蛋白质印迹中检测的，并使用抗flk-1/KDR(VEGFR-1/VEGFR-2)多克隆抗体(IM142)从VEGF-刺激的早期传代HUVEC进行免疫沉淀分析。相反，利用这些抗体从VEGF-刺激的HUVEC中免疫沉淀出来的带与IM142交叉反应，而不与抗-flt-1(抗-VEGFR-1)多克隆抗体交叉反应。以实验证据为基础，根据这些发现推断出，Mabs可影响HUVEC中KDR(VEGFR-2)的活性，并且暗示作为VEGF受体的KDR(VEGFR-2)与活化内皮细胞中的增殖反应有关。(见上面实施例IV-3的方法)

实施例VI非内皮(肿瘤)细胞上VEGF受体形式的存在

通过免疫沉淀对若干肿瘤系进行筛选，以确定它们与DC-101的蛋白反应性，并用抗磷酸酪氨酸检测。细胞系8161(黑素瘤)和A431(表皮样癌)的免疫印迹可产生分子量约为170和120kd的磷酸化带。这些结果表明，人VEGF受体形式在非内皮细胞，如肿瘤细胞中表达。

类似的实验显示，KDR(VEGFR-2)样受体在卵巢癌细胞系，OVCAR-3中表达。这些细胞似乎也分泌VEGF。磷酸化带是利用抗-KDR(VEGFR-2)多克隆抗体从VEGF-刺激的OVCAR-3细胞中免疫沉淀出来的，通过蛋白质印迹分析可知，它可与抗flk-1(VEGFR-2)Mabs反应。且，利用鼠Mabs从这些细胞中免疫沉淀出来的带可与同一多克隆抗体交叉反应。此外，由增殖测定法可知，某些鼠抗-flk-1(VEGFR-2)Mabs可引起对这些细胞的抑制作用。这些结果证实了人VEGF受体形式的非内皮表达(即，在肿瘤细胞上表达)。磷酸化和增殖测定的数据还表明，VEGF可调节肿瘤发生过程中，自分泌和旁分泌方式的受体活性。(见上述实施例IV-3的方法)

实施例VII使用DC-101进行体内研究

实施例VII-1利用DC-101体内抑制血管发生

设计进行体内研究是为了确定抗flk-1(VEGFR-2)单克隆抗体能否阻断表达VEGF的肿瘤细胞生长。在这些实验中，使用了人多形性成胶质细胞瘤细胞系，它具有高水平的VEGF信息，而且可在没有血清的培养基中处理24小时后，分泌大约5ng/ml的VEGF生长因子(图5)。

第0天，给无胸腺裸鼠(nu/nu；Charles River Labs)侧腹注射1-2百万个成胶质细胞瘤细胞。在同一天开始，给动物腹膜内注射DC-101或对照抗体(100μg/动物)。随后，在第3，5，7，10，12，14，17，19，和21天，小鼠接受抗体治疗。在第0，3，5，7，10，12，14，17，19，和21天，给动物注射100μg DC-101或鼠FLK-2(2A13)受体的对照大鼠抗体，每只动物共接种1mg。肿瘤在第5天开始出现，一直持续50天。每天用测径规测量肿瘤大小，并利用下列公式计算肿瘤体积：p/6x较大直径x(较小直径)2(Baselga J.Nat’l CancerInst.85：1327-1333)。每周至少测量3次，并按照上面所述计算肿瘤体积。DC-101组中，有一只患有肿瘤的动物在研究的早期死亡，不能用于测定两组之间的统计学显著差异。

图14a和14b表示38天后，DC-101和2A13对照组之间，各动物肿瘤生长减轻的比较。虽然在研究过程中，所有动物肿瘤的大小和数量都发生了变化，但用DC-101治疗过的小鼠在肿瘤进展过程中表现出全面的延迟。DC-101组的其中一只小鼠保持没有肿瘤一直到第49天才发现较小的生长。尽管那样，肿瘤生长还是被显著抑制。对数据进行统计学分析，以便评估两组之间肿瘤大小的差异。对数据进行协方差的标准分析，其中肿瘤大小随治疗时间而减小。结果表明，在肿瘤大小随时间而减小的方面，DC-101组与注射2A13的小鼠明显不同(p＜0.0001)。

图15表示DC-101对无胸腺裸鼠的治疗效果，所述无胸腺裸鼠中移植了分泌VEGF的人成胶质细胞瘤细胞系GBM-18。给裸鼠皮下注射GBM-18细胞，并把它们分成3个治疗组：PBS对照组，无关大鼠IgG1对照组，和DC-101。治疗与肿瘤的异种移植同时进行，并持续4周。结果表明，与对照组相比，用DC-101治疗过的裸鼠中的GBM-18肿瘤生长显著降低。该实验表明，DC-101通过阻断肿瘤相关性血管内皮细胞上flk-1(VEGFR-2)的VEGF活化而抑制肿瘤生长，且DC-101作为针对分泌VEGF的血管化肿瘤的抗-血管发生剂具有治疗价值。

flk-1(VEGFR-2)受体酪氨酸激酶的单克隆抗体可通过消除血管发生而抑制肿瘤侵入。侵入性生长和血管发生是恶性肿瘤的重要特征。两个现象都被证实适于在表面移植测定法中区分良性和恶性的角质形成细胞。把与胶原凝胶结合的细胞单层移植到裸鼠背肌上后，最初形成的所有肿瘤细胞构成鳞状上皮，但只有恶性角质形成细胞在2-3周内侵入性生长。良性及恶性细胞都可诱导血管发生。然而，恶性细胞的血管发生反应发生较早，更强，且毛细血管向着恶性上皮生长。此外，在良性肿瘤细胞的移植物中，毛细血管在2-3周后消退，而恶性角质形成细胞则维持不间断的血管发生水平。血管内皮生长因子(VEGF)及其关联配体在肿瘤血管发生中起着关键的作用。DC-101的给药可破坏不间断的血管发生，从而抑制肿瘤侵入。抗体可阻止新形成的血管网的成熟及进一步扩展，但不能显著干扰最初的血管发生诱导。这些结果证实肿瘤侵入需要在先的血管发生，VEGF受体在维持这种模型系统的血管发生中至关重要。

实施例VII-2不同浓度的DC-101对所确立的成胶质细胞瘤(gbm-18)的作用

给无胸腺小鼠(nu/nu)皮下接种GBM-18(人多形性成胶质细胞瘤)。当肿瘤的平均体积达到100-200mm³时，开始抗体治疗。治疗包括下列6次注射(每周2次，注射3周)：(i)每次注射200，400或800μg的DC-101；(ii)无关同种型匹配的大鼠IgG(每次注射400μg)；或(iii)PBS。用测径规测量肿瘤体积。与PBS和无关单克隆抗体组相比，DC-101组的肿瘤抑制比较显著(*)。

其它实验可证实大鼠抗flk-1(VEGFR-2)单克隆抗体DC-101对裸鼠GBM-18肿瘤生长的作用。第0天，给动物(nu/nu；Charles RiverLabs；10只动物/组)皮下注射GBM-18细胞(人成胶质细胞瘤[100]；1百万/只动物)。第7天开始用PBS或DC-101(每次注射200μg)治疗，每周两次，持续3周(6x)。曲线图表示各组随时间改变的平均肿瘤体积和消退数据，图中还给出了它们各自的肿瘤生长速度(斜率以λ表示；实线)和99％置信限(虚线)。用DC-101处理过的动物的曲线斜率与PBS的明显不同(p＜0.01)。值得注意的是，无关大鼠IgG1单克隆抗体(抗小鼠IgA；Pharmigen)对GBM-18异种移植物的生长没有影响，其结果与使用PBS观察到的相似(没有给出数据)。

实施例VIII抗flk-1(VEGFR-2)抗体可选择性增加放疗诱导的裸鼠中人肿瘤异种移植物的治愈率

该实施例是为了评估可阻断鼠肿瘤血管内皮细胞上的重要VEGF受体-2，flk-1(VEGFR-2)的单克隆抗体DC-101能否增加分次放疗(RT)导致的肿瘤异种移植物的治愈可能性，以及该抗体能否同时调节正常组织(小鼠皮肤)的放疗反应。

材料&方法：把人小细胞肺癌54A和多形性成胶质细胞瘤U87皮下植入到裸鼠的后腿中。当肿瘤直径达到8mm时(第0天)开始治疗。每3天腹膜内注射20或40mg/kg体重的DC-101，共注射6次。连续5天，每天给予相等的分次放疗总剂量。第0天，小鼠第一次注射抗体，或开始RT。对于联合疗法而言，DC-101给药在第0天开始，RT在第1天开始。治疗后，每周测量肿瘤大小2-3次。在任一组中观察到肿瘤复发后，跟踪有局部对照肿瘤的小鼠90天。在开始RT后的前30天内，使用记分量表评估肿瘤放疗区域的急性皮肤反应。

结果：单独使用的抗体可以剂量依赖性的方式抑制两种肿瘤的生长(但不会消退)。这种作用在54A中比在U87异种移植物中更显著。在任一模型中，与单独进行RT相比，把最低剂量(共25-30Gy)的放疗与DC-101联合可进一步延迟肿瘤的生长。抗体也是以剂量依赖性的方式增加RT的治愈效果。例如，较高剂量的DC-101可使局部控制50％肿瘤所需的放疗剂量降低：在54A异种移植物中为1.7倍(从单独进行RT时的67.6Gy降至联合疗法的39.1Gy)；在U87中为1.3倍(从97.8-74.8Gy)。还有一点特别重要，那就是DC-101的这种作用对肿瘤是选择性的。即，没有检测到抗体对皮肤放疗反应的平行改变。正如在其它实验中评估的，DC-101诱导的肿瘤放疗反应的提高与它们的辐射敏化或氧化的改变无关，而与抗体显著降低肿瘤间质液压有关。

结论：结果共同表明，针对这些生长因子分子主要受体的抗体对VEGF-信号传递途径的阻断可选择性加强分次RT的肿瘤治愈反应；并因此提供一种治疗法。

实施例IX.生产单链抗体

实施例IX-1材料

实施例IX-1(a)细胞系和蛋白

原代培养的HUVEC维持在37℃，5％CO₂的EBM-2培养基中。使用2-5代的细胞进行所有测定。VEGF₁₆₅蛋白在杆状病毒中表达并纯化。通过RT-PCR从人类胎儿肾脏的mRNA中分离编码KDR(VEGFR-2)胞外域的互补DNA，并把它亚克隆到载体AP-Tag的BglII和BspEI位点中。在该质粒中，KDR(VEGFR-2)胞外域的cDNA在读框中与人胎盘AP的cDNA融合。所述质粒与新霉素表达载体pSV-Neo一起被电穿孔到NIH3T3细胞中，并用G418选择稳定的细胞克隆。使用AP的固定化单克隆抗体，通过亲和色谱法从细胞培养物上清液中纯化出可溶性融合蛋白KDR-AP。

实施例IX-1(b)小鼠免疫法和单链抗体噬菌体展示文库的构建

给雌性BALB/C小鼠腹膜内(i.p.)注射200μl RIBI佐剂系统中的10μg KDR-AP两次，接着在2个月内，在没有RIBI佐剂系统的条件下，腹膜内注射1次。在第一次免疫接种时，给小鼠皮下(s.c.)注射200μl RIBI中的10μg KDR-AP。实行安乐死前，给小鼠腹膜内加强20μg KDR-AP三天。除去供体小鼠的脾脏，并分离细胞。提取RNA并从脾细胞的总RNA中纯化出mRNA。使用mRNA构建scFv噬菌体展示文库，它是在丝状噬菌体M13的表面展示的。

scFv在丝状噬菌体表面展示时，抗体的V_H和V_L结构域是通过15个氨基酸长的接头(GGGGS)3连接在一起的，并与噬菌体蛋白III的N-末端融合。为了进行检测和分析，把15个氨基酸长的E标记(其后面是琥珀密码子(TAG))插入到V_L的C-末端和蛋白III之间。位于E标记和蛋白III间的琥珀密码子可使该构建体在转移到抑制宿主(如TGI细胞)中时，构成表面-展示形式的scFv，并在转移到非抑制宿主(如HB2151细胞)中时，构成可溶性形式的scFv。

把组装的scFv DNA连接到pCANTAB 5E载体中。把转化的TG1细胞铺于2YTAG平板上并进行温育。把集落刮在10ml 2YT培养基中，与5ml 50％甘油混合，-70℃贮存，作为文库的原液。

实施例IX-1(c)生物淘选

文库原液生长至对数期时，把它引入到M13K07辅助噬菌体中，并于30℃时，在2YTAK培养基(2YT含有100μg/ml氨苄西林和50μg/ml卡那霉素)中过夜扩增。噬菌体制品在4％PEG/0.5M NaCl中沉淀，在3％脱脂奶/含500μg/ml AP蛋白的PBS中重悬浮，37℃温育1小时，以捕获展示抗AP scFv的噬菌体并阻断其它非特异性结合。

首先于37℃时用3％奶/PBS封闭包被有KDR-AP(10μg/ml)的Maxisorp Star试管(Nunc，Denmark)1小时，然后用噬菌体制品室温温育1小时。用PBST洗涤试管10次，然后用PBS(PBS含0.1％吐温20)洗涤10次。用1ml新鲜制备的100mM三乙胺溶液室温洗脱结合噬菌体10分钟。37℃用10ml对数中期的TG1细胞温育洗脱的噬菌体30分钟，静置30分钟，振摇。然后把感染的TG1细胞铺于2YTAG平板上，30℃过夜温育。

在第三轮淘选后筛选出来的克隆有99％(185/186)是特异性的KDR(VEGFR-2)结合剂。然而，在这些结合剂中，只有15(8％)个能阻断KDR(VEGFR-2)与固定化VEGF的结合。这15个克隆的DNA BstN I指纹表明存在2种不同的消化模式；而21个随机抽取的VEGF非阻断剂产生了4种不同的模式。第二轮淘选之后，可在已经鉴定的克隆中见到所有的消化模式。各消化模式的代表克隆是从第二轮淘选后回收的克隆中挑选的，并进行DNA测序。在15个测过序的克隆中，鉴定了2个独特的VEGF阻断剂和3个非阻断剂。其中一个scFv，p2A7既不结合KDR(VEGFR-2)，又不阻断VEGF与KDR(VEGFR-2)的结合，因此被选作所有研究的阴性对照。

实施例IX-1(d)噬菌体的ELISA

各TG1克隆37℃时在96孔平板中生长，并按照上面所述把它引入到M13K07辅助噬菌体中。用1/6体积的18％奶/PBS室温阻断扩增的噬菌体制品1小时，然后加入到包被有KDR-AP或AP(1μg/ml×100μl)的Maxi-sorp 96孔微量滴定板(Nunc)中。室温温育1小时后，用PBST洗涤该平板3次，并用兔抗M13噬菌体Ab-HRP偶联物温育。洗涤平板5次，加入TMB过氧化物酶底物，使用微量平板读数器读出450nm处的OD，鉴定并对scFv抗体测序。

实施例IX-1(e)可溶性scFv的制备

各个克隆的噬菌体用于感染非抑制大肠杆菌宿主HB2151和在2YTAG-N平板上选择的感染物。scFv在HB2151细胞中的表达是通过30℃时，在含有1mM异丙基-1-硫代-B-D-吡喃半乳糖苷的2YTA培养基中培养细胞诱导的。细胞的胞质提取物是通过把细胞沉淀重悬浮在25mM Tris(pH 7.5)中，并于4℃时，轻轻振摇温育1小时制备的，其中25mM Tris(pH 7.5)含有20％(w/v)蔗糖，200mM NaCl，1mM EDTA和0.1mM PMSF。15,000rpm离心15分钟后，使用RPAS PurificationModule(Pharmacia Biotech)通过亲和色谱法从上清液中纯化出可溶性scFv。

实施例IX-2测定法

实施例IX-2(a)定量KDR(VEGFR-2)结合测定法

使用两种测定法定量检测纯化的可溶性scFv与KDR(VEGFR-2)的结合。

4个不同的克隆，包括两个VEGF阻断剂，p1C11和p1F12，一个非阻断剂，优势克隆p2A6和非结合剂p2A7是利用非抑制宿主大肠杆菌HB2151细胞在摇瓶中表达的。可溶性scFv是通过抗-E标记亲和色谱法从大肠杆菌的胞质提取物中纯化出来的。这些克隆的纯化scFv的产率为100-400μg/l培养物。

在直接结合测定法中，把不同量的可溶性scFv加入到KDR(VEGFR-2)包被的96孔Maxi-sorp微量滴定平板中，室温温育1小时，用PBST洗涤平板3次。然后用100μl小鼠抗E标记抗体室温温育该平板1小时，接着用100pl兔抗-小鼠抗体-HRP偶联物培养。在进行上述噬菌体ELISA过程后，洗涤平板并显影。

在另一测定法，即竞争性VEGF阻断测定法中，把不同量的可溶性scFv与固定量的KDR-AP(50ng)混合，室温温育1小时。然后把混合物转移到包被有VEGF₁₆₅(200ng/孔)的96孔微量滴定平板中，室温温育2小时，之后洗涤平板5次，加入AP的底物，从而量化结合的KDR-AP分子。然后计算IC₅₀，即，抑制KDR(VEGFR-2)与VEGF结合的50％所需的scFv浓度。

图16表示通过直接结合ELISA测定的，scFv与固定化KDR(VEGFR-2)的剂量依赖性结合。如图17所示，克隆p1C11和p1F12也可阻断KDR(VEGFR-2)与固定化VEGF的结合，但p2A6不能。图17所示的数据是三次测量的平均值±SD。阴性对照克隆p2A7，既不结合KDR(VEGFR-2)，也不阻断KDR(VEGFR-2)与VEGF的结合(图16和17)。克隆p1C11，即每轮淘选后的优势克隆，显示出最高的KDR(VEGFR-2)结合能力和阻断VEGF与KDR(VEGFR-2)结合的最高效力(表1)。使克隆p1C11与KDR(VEGFR-2)结合最大的50％所需的抗体浓度和抑制KDR(VEGFR-2)与VEGF结合的50％所需的浓度分别为0.3nM和3nM(图17)。FACS分析证实，p1C11，p1F12和p2A6也能结合在HUVEC细胞表面表达的受体。

实施例IX-2(b)可溶性scFv的BIAcore分析

可溶性scFv与KDR(VEGFR-2)的结合动力学是用BIAcore生物传感器(Pharmacia Biosensor)测量的。把KDR-AP融合蛋白固定在传感器芯片上，注射62.5nM-1000nM浓度的可溶性scFv。获得各浓度的传感图，并使用BIA Evaluation 2.0程序评估，以测定速率常数kon和koff。Kd是根据速率常数koff/kon的比值计算的。

表1表示BIAcore仪器上表面等离子共振的结果。阻断VEGF的scFv，p1C11和p1F12分别以2.1和5.9nM的Kd与固定化的KDR(VEGFR-2)结合。非阻断性scFv，p2A6与KDR(VEGFR-2)结合时，其亲和性比最好的结合剂p1C11弱6倍，这主要是由于其更快的解离速率。正如所预期的，p2A7不与BIAcore上的固定化KDR(VEGFR-2)结合。

实施例IX-2(c)磷酸化测定法

磷酸化测定法是按照前述方法，用早期传代HUVEC进行的。简单地说，在有或没有5μg/ml scFv抗体存在时，在补充了0.5％牛血清白蛋白，没有血清的EBM-2基础培养基中室温温育HUVEC 10分钟，接着用20ng/ml VEGF₁₆₅室温刺激15分钟。溶解细胞，使用与兔抗-KDR(抗VEGFR-2)多克隆抗体(ImClone Systems Incorporated)偶联的蛋白A琼脂糖珠把KDR(VEGFR-2)受体从细胞溶解产物中免疫沉淀出来。洗涤珠子，与SDS加样缓冲液混合，对上清液进行蛋白质印迹分析。为了检测KDR(VEGFR-2)的磷酸化，用抗-磷酸酪氨酸Mab，4G10探测印迹。对于MAP激酶活性测定法而言，用SDS-PAGE分辨细胞溶解产物，接着使用磷酸-特异性MAP激酶抗体进行蛋白质印迹分析。所有信号都是用ECL检测的。

结果表明，阻断VEGF的scFv p1C11能够抑制VEGF刺激的KDR(VEGFR-2)受体磷酸化，而非阻断性scFv p2A6则不能。此外，p1C11还可有效抑制VEGF-刺激的MAP激酶p44/p42活化。相反，p1C11和p2A6都不能抑制FGF-刺激的MAP激酶p44/p42活化。

实施例IX-2(d)抗有丝分裂测定法

把HUVEC(5×10³个细胞/孔)铺于96孔组织培养平板上的200μl没有VEGF，bFGF或EGF的EBM-2培养基中，37℃温育72小时。把不同量的抗体一式两份加到孔中，37℃预温育1小时，之后加入VEGF₁₆₅至16ng/ml的终浓度。温育18小时后，向各孔中加入0.25μCi的[³H]-TdR(Amersham)，再温育4小时。把细胞放在冰上，用含血清的培养基洗涤两次，然后用10％TCA在4℃时温育10分钟。然后用水洗涤细胞1次，并在25μl的2％SDS中溶解。加入闪烁液(150μl/孔)，在闪烁计数器(Wallach，Model 1450 Microbeta ScintillationCounter)上测定已掺入DNA的放射性。

scFv抗体阻断HUVEC上VEGF-刺激的促有丝分裂活性的能力在图18中表示。阻断VEGF的scFv p1C11可有力抑制HUVEC上VEGF诱导的DNA合成，其EC₅₀，即抑制50％ VEGF-刺激的HUVEC促有丝分裂的抗体浓度约为5nM。非阻断性scFv p2A6对VEGF所致的促有丝分裂活性没有抑制作用。p1C11和p2A6都不能抑制HUVEC中bFGF诱导的DNA合成(没有标出)。图18所示数据表示至少3次独立的实验。(！)仅有VEGF；(A)没有VEGF。

实施例IX-3从p1C11生产嵌合抗体

实施例IX-3(a)细胞系和蛋白

原代培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在37℃，5％CO₂的EBM-2培养基中维持。用2-5代的细胞进行全部测定。VEGF₁₆₅和KDR(VEGFR-2)碱性磷酸酶融合蛋白(KDR-AP)分别在杆状病毒和NIH 3T3细胞中表达，并按上述过程纯化。抗-KDR(抗-VEGFR-2)scFv p1C11和scFvp2A6，一种结合KDR(VEGFR-2)，但不阻断KDR(VEGFR-2)-VEGF相互作用的抗体，是从噬菌体展示文库中分离出来的，噬菌体展示文库是按上面所述，从使用KDR(VEGFR-2)免疫的小鼠构建的。C225是一种针对表皮生长因子(EGF)受体的嵌合IgG1抗体。见上文。

实施例IX-3(b)scFv p1C11可变结构域的克隆

p1C11的轻链(V_L)(SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：16)和重链(V_H)(SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：15)的可变结构域是分别使用引物1和2，引物3和4，通过PCR从scFv表达载体克隆的。然后分别使用引物5和2，引物5和4，通过PCR把哺乳动物细胞分泌的蛋白前导肽序列加到V_L和V_H的5’端。

引物1：5’CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA GAC ATC GAGCTC 3’[SEQ ID No：37]

引物2：5’TCG ATC TAG AAG GAT CCA CTC ACG TTT TAT TTC CAG 3’BamHI[SEQ ID No：38]

引物3：5’CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA CAG GTC AAGCTG 3’[SEQ ID No：39]

引物4：5’TCG AAG GAT CCA CTC ACC TGA GGA GAC GGT 3’BamHI[SEQ  ID  No：40]

引物5：5’GGT CAA AAG CTT ATG GGA TGG TCA TGT ATC ATC CTT TTTHind III CTA GTA GCA ACT 3’[SEQ ID No：41]

实施例IX-3(c)嵌合p1C11 IgG表达载体的构建

构建用于表达嵌合IgG轻链和重链的独立载体。克隆V_L基因是用Hind III和BamH I消化的，并连接到含人κ轻链恒定区(C_L)的载体pKN100中，从而制造嵌合p1C11轻链，c-p1C11-L的表达载体。克隆V_H基因是用Hind III和BamH I消化的，并连接到含人IgG1(γ)重链恒定区(C_H)的载体pGID105中，从而制造嵌合p1C11重链，c-p1C11-H的表达载体。两个构建都是通过限制酶消化检验的，并通过双脱氧核苷酸测序加以证实。

如图19所示，V_H和V_L结构域在它们的5’端与编码所标前导肽序列(SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24)的基因片段准确融合。V_H和V_L结构域分别经由Hind III/BamH I位点连接到表达载体pG1D105中，含有人γ1恒定区基因的cDNA形式，和表达pKN100中，含有人κ链恒定区基因的cDNA形式。在两种情况下，表达都是在HCMVi启动子的控制下进行的，并由人工终止序列终止。根据Kabat等在高变序列定义中的规定，轻链和重链互补决定区(CDR)残基是下面划线的部分，并分别标出了CDR-H1至H3，CDR-L1至L3。CDR-H1(SEQ ID NO：1和SEQID NO：9)；CDR-H2(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：10)；CDR-H3(SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：11)；CDR-L1(SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：12)；CDR-L2(SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：13)；CDR-L3(SEQ ID NO：6和SEQID NO：14)。

实施例IX-3(d)IgG的表达和纯化

COS细胞与等量c-p1C11-L和c-p1C11-H质粒共转染，进行瞬时IgG表达。把在150mm培养皿的DMEM/10％ FCS中生长的亚汇合COS细胞用20ml含40mM Tris(pH 7.4)的DMEM冲洗一次，然后用4mlDMEM/DEAE-葡聚糖/DNA混合物(DMEM含有40mM Tris，0.4mg/ml DEAE-葡聚糖(Sigma)，和20μg c-p1C11-L和c-p1C11-H质粒)37℃温育4.5小时。把细胞用4ml DMEM/含100nM氯喹(Sigma)的2％FCS在37℃时培养1小时，接着用1.5ml 20％甘油/PBS室温温育1分钟。用DMEM/5％FCS洗涤细胞两次，在20ml相同的培养基中37℃过夜温育。然后用纯DMEM洗涤细胞两次后，把细胞培养基更换成没有血清的DMEM/HEPES。在转染后的第48和120小时，收集细胞培养物的上清液。按照制造商(Pharmacia Biotech)描述的方法，使用G蛋白柱通过亲和色谱法从合并的上清液纯化嵌合IgG。收集含IgG的部分，把缓冲液更换成PBS，并用Centricon 10浓缩器(Amicon Corp.，Beverly，MA)浓缩。IgG纯度是通过SDS-PAGE分析的。纯化抗体的浓度是使用山羊抗-人y链特异性抗体作为捕获剂，使用HRP-偶联的山羊抗-人k链抗体作为检测剂，利用ELISA测定的。使用临床级抗体C225校准标准曲线。

用G蛋白进行亲和纯化后，在SDS-PAGE中见到一个约150kD的单一蛋白带。使用HRP-偶联的抗人IgG1 Fc特异性抗体进行的蛋白质印迹分析证实，纯化蛋白中存在人IgG的Fc部分(没有标出)。

ELISA的结果表明，与亲代scFv相比，c-p1C11可更有效地结合固定化的KDR(VEGFR-2)(图20)。

实施例IX-4测定和分析

实施例IX-4(a)FACS分析

早期世代的HUVEC细胞在缺失生长因子的EBM-2培养基中生长过夜，从而诱导KDR(VEGFR-2)的表达。采集细胞，并用PBS洗涤3次，用c-p1C11 IgG(5μg/ml)4℃温育1小时，接着用FITC标记的兔抗人Fc抗体(Capper，Organon Teknika Corp.，West Chester，PA)再温育60分钟。洗涤细胞，利用流式细胞计(Model EPICS，CoulterCorp.，Edison，NJ)进行分析。

图21是表示c-p1C11与表达KDR(VEGFR-2)的HUVEC结合的FACS分析曲线图。正如先前使用亲代scFv p1C11所见，c-p1C11特异性结合在早期世代的HUVEC上表达的KDR(VEGFR-2)。

实施例IX-4(b)定量的KDR(VEGFR-2)结合测定法

把不同量抗体加入到包被有KDR(VEGFR-2)的96孔Maxi-sorp微量滴定平板(Nunc.Danmark)中，室温温育1小时，然后用含0.1％吐温20的PBS洗涤平板3次。室温使该平板用100μl scFv的小鼠抗E标记抗体-HRP偶联物(Phannacia Biotech)，或嵌合IgG的兔抗人IgG Fc特异性抗体-HRP偶联物(Cappel，Organon Teknika Corp.)温育1小时。洗涤平板5次，加入TMB过氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg，MD)，利用微量平板读数器(Molecular Device，Sunnyvale，CA)读出450nm处的OD。

图20是表示抗体与固定化KDR(VEGFR-2)直接结合的曲线图。与亲代scFv相比，c-p1C11可更有效地结合固定化的KDR(VEGFR-2)受体。

实施例IX-4(c)BIAcore分析

抗体与KDR(VEGFR-2)的结合动力学是用BIAcore生物传感器(Pharmacia Biosensor)测量的。把KDR(VEGFR-2)-AP融合蛋白固定在传感器芯片上，注射25nM-200nM浓度的抗体或VEGF。获得各浓度的传感图，并用BIA Evaluation 2.0程序评估，从而测定速率常数kon和koff。Kd是用速率常数koff/kon的比值计算的。

BIAcore分析揭示，与亲代scFv相比，c-p1C11与KDR(VEGFR-2)的结合亲和性更高(表2)。c-p1C11的Kd为0.82nM，而scFv的Kd为2.1nM。c-p1C11亲和性的增加主要是由于二价嵌合IgG的解离速率(koff)较低。值得注意的是，c-p1C11与KDR(VEGFR-2)的结合亲和性与天然配体VEGF与KDR(VEGFR-2)的结合亲和性类似，在BIAcore分析中测定为0.93nM(表2)。

实施例IX-4(d)竞争性VEGF结合测定法

在第一个测定法中，把不同量抗体与固定量的KDR(VEGFR-2)-AP(50ng)混合，室温温育1小时。然后把混合物转移到包被有VEGF₁₆₅(200ng/孔)的96-孔微量滴定板中，室温温育2小时，然后洗涤平板5次，加入AP的底物(对-硝基苯基磷酸，Sigma)，从而量化结合的KDR(VEGFR-2)-AP分子。然后计算EC₅₀，即，抑制KDR(VEGFR-2)与VEGF结合的50％所需的抗体浓度。

图22表示c-p1C11可阻断KDR(VEGFR-2)受体与固定化VEGF的剂量依赖性结合。与scFv 2.0nM的IC₅₀值相比，嵌合抗体可更有效地阻断VEGF-KDR(VEGFR-2)的相互作用，其IC₅₀值(即，抑制KDR(VEGFR-2)与VEGF结合的50％所需的抗体浓度)为0.8nM。对照scFv p2A6也可结合KDR(VEGFR-2)(图20)，但不阻断VEGF-KDR(VEGFR-2)的相互作用(图22)。

在第二个测定法中，把不同量的c-p1C11抗体或冷的VEGF₁₆₅蛋白与固定量¹²⁵I标记的VEGF₁₆₅混合，加入到包被有KDR(VEGFR-2)受体的96孔微量滴定板中。室温温育该平板2小时，洗涤5次，计算结合固定化KDR(VEGFR-2)受体的放射性标记的VEGF₁₆₅量。测定阻断放射性标记的VEGF与固定化KDR(VEGFR-2)受体结合的50％所需的c-p1C11和冷VEGF₁₆₅的浓度。

放射性标记的VEGF₁₆₅的结合抑制结果在图23中表示。所示数据为三次测量的平均值。c-p1C11可以剂量依赖性方式与¹²⁵I标记的VEGF有效地竞争结合固定化KDR(VEGFR-2)受体。正如所预期的，C225，一种针对EGF受体的嵌合抗体既不结合KDR(VEGFR-2)受体，也不阻断VEGF-KDR(VEGFR-2)的相互作用(没有表示)。

实施例IX-4(e)磷酸化测定法

在进行实验前，使亚汇合的HUVEC细胞在缺失生长因子的EBM-2培养基中生长24-48小时。用50nM原钒酸钠预处理30分钟后，在有或没有抗体存在时，温育该细胞15分钟，接着用20ng/ml的VEGF₁₆₅或10ng/ml的FGF室温刺激15分钟。然后在溶解缓冲液(50nM Tris，150mM NaCl，1％NP-40，2mM EDTA，0.25％脱氧胆酸钠，1mM PMSF，1μg/ml亮抑蛋白酶肽，1μg/ml胃蛋白酶抑制剂，10μg/ml抑肽酶，pH7.5)中溶解该细胞，细胞溶解产物用于KDR(VEGFR-2)和MAP激酶磷酸化测定。KDR(VEGFR-2)受体是用与抗KDR(VEGFR-2)抗体，Mab4.13(ImClone Systems)偶联的A蛋白琼脂糖珠(Santa CruzBiotechnology，Inc.，CA)从细胞溶解产物中免疫沉淀出来的。蛋白用SDS-PAGE分辨，并经过蛋白质印迹分析。为了检测KDR(VEGFR-2)磷酸化，用抗磷酸酪氨酸Mab，PY20(ICN Biomedicals，Inc.Aurora，OH)探测印迹。对于MAP激酶活性测定而言，细胞溶解产物是用SDS-PAGE分辨的，接着使用磷酸特异性MAP激酶抗体(NewEngland BioLabs，Beverly，MA)进行蛋白质印迹分析。所有信号都是用ECL(Amersham，Arlington Heights，IL.)检测的。在两个测定法中，用多克隆抗KDR(VEGFR-2)抗体(ImClone Systems)再次探测该印迹，从而确保在SDS-PAGE凝胶各道中加样等量的蛋白。

c-p1C11可有效抑制VEGF-刺激的KDR(VEGFR-2)受体磷酸化和p44/p42MAP激酶的活化。相反，C225则对VEGF-刺激的KDR(VEGFR-2)受体活化和MAP激酶没有任何抑制作用。单独的c-p1C11和C225对KDR(VEGFR-2)受体和p44/p42 MAP激酶的活性没有任何作用。正如前面使用scFv p1C11所见到的，c-p1C11不能抑制FGF-刺激的p44/p42MAP激酶活化(没有表示)。此外，scFv p2A6和p2A6的嵌合IgG形式(c-p2A6)都不能抑制VEGF-刺激的KDR(VEGFR-2)受体和MAP激酶的活化(没有表示)。

实施例IX-4(f)抗有丝分裂测定

抗KDR(VEGFR-2)抗体对VEGF-刺激的人内皮细胞有丝分裂的作用是用HUVEC，通过[³H]-TdR DNA掺入测定法测定的。把HUVEC(5×10³个细胞/孔)铺板于96-孔组织培养平板上200μl没有VEGF，bFGF或EGF的EBM-2培养基中，37℃温育72小时。把不同量抗体一式两份加入到孔中，37℃预温育1小时，然后加入VEGF₁₆₅至16ng/ml的终浓度。温育18小时后，向各孔中加入0.25μCi的[³H]-TdR，再温育4小时。用闪烁计数器测定已掺入DNA的放射性。图24所示数据表示至少3次的独立实验。

c-p1C11和scFv p1C11可有效抑制VEGF刺激的HUVEC有丝分裂(图24)。与亲代scFv相比，c-p1C11对VEGF-诱导的HUVEC有丝分裂而言，是一种更强的抑制剂。抑制VEGF-诱导的HUVEC有丝分裂的50％所需的抗体浓度分别是：c-p1C11为0.8nM，scFV为6nM。正如所预期的，scFv p2A6对VEGF-刺激的内皮细胞增殖没有任何抑制作用。

根据上述说明以及很容易获得的参考文献和起始材料，本发明是可行的。然而，申请人已经在美国典型培养物保藏中心，12301Parklawn Drive，Rockville，Md.，20852 USA(ATCC)中，保藏了下列产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系：

1994年1月26日保藏的，产生大鼠抗小鼠flk-1(VEGFR-2)单克隆抗体的杂交瘤细胞系DC-101(ATCC保藏号HB11534)。

1996年7月19日保藏的，产生小鼠抗小鼠flk-1(VEGFR-2)单克隆抗体Mab 25的杂交瘤细胞系M25.18A1(ATCC登记号HB12152)。

1996年7月19日保藏的，产生小鼠抗小鼠flk-1(VEGFR-2)单克隆抗体Mab 73的杂交瘤细胞系M73.24(ATCC保藏号HB12153)。

保藏是根据布达佩斯条约的规定，在用于专利程序及其条例(布达佩斯条约)的国际微生物保藏机构进行的。这样做可确保活培养物自保藏之日起维持30年。根据布达佩斯条约，在申请人和ATCC之间达成协议的情况下，可从ATCC获得生物体，这样可确保在相关美国专利公开之后，不受限制地使用它。按照专利法的规定，在实行该发明时，无须在任何行政机构的授权下使用保藏菌株。

表1 抗-KDR(VEGFR-2)scFv抗体的KDR(VEGFR-2)结合分析

  ScFv克隆  KDR结合¹   (ED₅₀nM)  VEGF结合²   (IC₅₀nM)                结合动力学³  kon  (10⁵M^-1s^-1)  koff  (10^-4s^-1)  Kd  (10-9M)  P1C11  P1F12  P2A6  P2A7  是(0.3)  是(1.0)  是(5.0)  否(N/A)  是(3.0)  是(15)  否(＞300)  否(＞300)  1.1  0.24  4.1  N/A  2.3  1.4  46.1  N/A  2.1  5.9  11.2  N/A

1.通过直接结合ELISA测定，括号中的数字代表产生50％最大结合的scFv浓度；

2.通过竞争性VEGF阻断ELISA测定，括号中的数字代表抑制KDR与固定化VEGF结合的50％所需的scFv浓度；

3.通过BIAcore分析测定。N/A＝不可应用。

           表2 p1C11 scFv和c-p1C11与

          KDR(VEGFR-2)受体的结合动力学*

   抗体  kon  (10⁵M^-1s^-1)  koff  (10^-4s^-1)  Kd  (10^-9M)  p1C11 scFv  c-p1C11  VEGF  1.11  0.63  1.87  2.27  0.52  1.81  2.1  0.82  0.93

*所有比值都是使用BIAcore系统，通过表面等离子共振测定的，是至少3次独立测量的平均值

实施例X

本实施例可证实VEGFR拮抗剂，即，抗-flt-1(抗-VEGFR-1)单克隆抗体，MF-1的生产。

大鼠抗VEGFR-1单克隆抗体是通过标准杂交瘤技术研制的。给8周龄的大鼠腹膜内(i.p.)灌注与弗氏完全佐剂混合的100μg VEGFR-1Fc(恒定区)重组蛋白(R&D Systems，Minneapolis，MN)进行激发。然后，在与混合了弗氏不完全佐剂的相同蛋白融合前，给大鼠加强注射3次。

杂交瘤细胞是通过把骨髓瘤细胞P3x63Ag8.653与免疫大鼠的脾细胞和骨髓细胞融合而产生的。在基于ELISA的结合与阻断测定法中，使用VEGFR-1碱性磷酸酶(AP)重组蛋白选择抗VEGFR-1的特异性克隆。阳性克隆是通过限制稀释而亚克隆的。

来源于杂交瘤的抗-VEGFR-1单克隆抗体(mAbs)是通过在没有血清的培养基中连续饲养发酵而获得的。使用γ-结合G蛋白琼脂糖，通过亲和色谱法从没有血清的条件培养基中纯化mAbs。使用Pyrogentplus Limulus Amebocyte Lysate试剂盒(Bio Whittaker，Walkersville，MD)试验体内研究所用mAbs的内毒素。动物研究所用的所有抗体制品都含有≤1.25EU/ml的内毒素。抗-VEGFR-1多克隆抗体是从重组VEGFR-1 AP蛋白免疫接种的兔子生产的，并通过γ-结合G蛋白柱(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)纯化。

抗-VEGFR-1 mAbs的免疫化学性是在基于ELISA的结合及阻断测定法，以及亲和性的BIAcore分析中鉴定的。结合测定法是4℃时，用50ng/孔的VEGFR-1AP或VEGFR-2AP蛋白过夜包被96孔微量滴定板(Falcon Flexible plate，Becton Dickinson，Bedford，MA)进行的。加入200μl含5％牛血清，0.05％吐温20的磷酸盐缓冲盐水(封闭缓冲液)把孔封闭，室温(RT)温育2小时。洗涤该孔(5x)，室温时，用50μl在封闭缓冲液中稀释的不同浓度mAbs温育1小时。再次洗涤该孔(5x)，室温用50μl山羊抗大鼠IgG-HRP(BioSourceInternational，Camarillo，CA)温育1小时。最后洗涤该孔(5x)，室温用50μl 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物(Kirkegaard andPerry Lab Inc.，Gaithersburg，MD)温育15分钟。加入50μl 1M磷酸(H₃PO₄)终止反应，在微量滴定板读数器的450nm处对该孔读数。

对于VEGFR-1/VEGF或P1GF阻断测定而言，孔是4℃时，用100ngVEGF或P1GF(R & D Systems，Minneapolis，MN)包被过夜的。按照上面所述封闭该孔，然后用100ng VEGFR-1AP室温温育1小时，其中所述VEGFR-1 AP已经用不同浓度的mAb预温育了1个小时。洗涤该孔，并用对-硝基苯基磷酸(PNPP，Sigma，St.Louis，MO)温育。室温显色30分钟，在微量滴定板读数器的405nm处读数。

抗VEGFR-1 mAbs与VEGFR-1的结合动力学是用BIAcore生物传感器(Pharmacia Biosensor)测定的。把VEGFR-1 Fc融合蛋白固定在传感器的芯片上，注射3.125nM-50nM浓度的mAbs。获得各浓度的传感图，用BIA Evaluation 2.0程序评估，从而测定作为速率常数kon/koff之比的Kd值。

实施例XI

本实施例证实了在给予表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂，单克隆抗体ERBITUX^TM(也称为IMC-C225或C225)，和治疗有效量的血管内皮生长因子受体(VEGFR)拮抗剂，抗VEGFR-1单克隆抗体DC101后，可抑制肿瘤生长。

进行免疫组织化学分析和抗血管发生疗法的抗体如下：来源于Pharmingen(SanDiego，CA)的大鼠抗-小鼠CD31/PECAM-1抗体；来源于DAKO Corp.(Carpinteria，CA)的小鼠抗-增殖细胞核抗原(PCNA)克隆PC10 DAKO A/S；来源于Jackson Research Laboratories(WestGrove，PA)的过氧化物酶-偶联的山羊抗-大鼠免疫球蛋白(IgG)(H+L)和德克萨斯红偶联的山羊抗大鼠IgG；来源于Serotec HarlanBioproducts for Science，Inc.(Indianapolis，IN)的过氧化物酶偶联的大鼠抗小鼠IgG2a；和来源于ImClone Systems，Inc.(NewYork，NY)(Prewett等，1999；Witte等，1998)的大鼠抗小鼠VEGF受体-2单克隆抗体(Prewett等，1999；Witte等，1998)和嵌合的抗人EGF受体单克隆抗体(Goldstein等，1995)。

使用与1ml注射器连接的30号针给8周龄的雄性无胸腺裸鼠(National Cancer Institute，Animal Production Area，Frederick，MD)腹膜内注射500μl HBSS中的1.0×10⁶个KM12L4结肠癌细胞。然后把小鼠随机分为4组(每组10只小鼠)：对照组，DC101，C225，或DC101和C225。所有动物研究都是在Animal Care andUse Committee of MD Anderson Cancer Center and UKCCCR，1998的批准下进行的。

从注射肿瘤细胞后3天开始，使用与1ml注射器连接的27号针每3天给小鼠腹膜内(i.p.)注射对照赋形剂(磷酸盐缓冲的盐水[PBS])，DC101(0.8mg)，C225(1.0mg)，或DC101(0.8mg)和C225(1.0mg)(每次注射700μl的总体积)。每周给小鼠称重。当对照组濒死时(大约治疗开始后30天)杀死小鼠，进行完全的尸检，量化肿瘤负荷，采集肿瘤，按照下面所述进行分析。

对每只小鼠都要进行尸检，用测径规测量腹膜肿瘤的大小，确定肿瘤平均大小，切除有代表性的病变。由不知道治疗组分配方案的研究人员评估腹水的程度，标准如下：0级，没有腹水；1级，轻度腹水；2级，中度腹水；3级，重度腹水；4级，腹部绷紧的严重腹水(Aparicio等，1999)。把肿瘤切片包埋在OCT化合物中，-70℃冷冻，或把它固定在福尔马林中，然后包埋在石蜡中。

组织切片是通过进行标准脱蜡(对于福尔马林固定和石蜡包埋的组织而言)或把它固定在丙酮和氯仿(对于冷冻在OCT中的组织而言)中进行处理的，按照前面所述进行免疫组织化学分析(Shaheen等，1999)。简单地说，用甲醇中的3％H₂O₂封闭内源性过氧化物酶，用PBS洗涤载玻片，在蛋白封闭溶液(补充了1％正常山羊血清和5％正常马血清的PBS)中温育20分钟，与针对CD31或PCNA的第一抗体4℃温育过夜。然后，洗涤载玻片，用蛋白-封闭溶液温育，室温用过氧化物酶-偶联的第二抗体培养1小时，洗涤，用DAB温育，洗涤，用苏木精负染，洗涤，并用Universal Mount封固，在56℃的热平板上干燥。使用与德克萨斯红(红色荧光)偶联的第二抗体代替过氧化物酶-偶联的抗体温育对CD31染色的冷冻切片。第一抗体的省略可作为阴性对照。

末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)-介导的dUTP切口-末端标记(TUNEL)染色是按照制造商提供的方法进行的。简单地说，用4％没有甲醇的低聚甲醛固定切片，洗涤，用0.2％Triton X-100渗透，洗涤，用试剂盒的平衡缓冲液温育，用含有平衡缓冲液，核苷酸混合物，及TdT酶的反应混合物37℃温育1小时，用2x标准柠檬酸盐水室温温育15分钟而终止TdT反应，洗涤，用DAPI封固染色(以观察细胞核)，盖上盖玻片。

一些肿瘤血管和PCNA-阳性细胞是利用光学显微镜(以100倍的放大率，在5个随机的0.159-mm²区域中计数)评估的，并用Optimas图像分析软件(Biscan，Edmond，WA)进行数字成像并处理。编程性死亡的细胞是按照下面所述用免疫荧光观察的。用Adobe Photoshop软件(Adobe Systems，Mountain View，CA)对切片进行数字成像并处理。CD311-阳性内皮细胞(ECs)是用罗丹明滤光器，由局部红色荧光检测的。编程性细胞死亡是使用荧光滤器，由肿瘤细胞(TCs)的局部绿色荧光或Ecs带有红色的绿色荧光测定的。细胞核是用滤器由DAPI的蓝色荧光检测的。以400倍的放大率，在载玻片中5个连续的0.011-mm²非-重叠区域对细胞计数，第一个区域是在肿瘤的立刻坏死部分中随机选择的。然后计算每个区域中编程性死亡的ECs和TCs的百分比，[编程性死亡的细胞％＝(编程性死亡的细胞数/总细胞数)×100]。

治疗30天后，测量腹膜病变的直径，评估总的肿瘤负荷。与对照组相比，DC101组(小55.3％)和DC101+C225组(小66.7％)的平均腹膜肿瘤大小要小一些。虽然对照组为100％，而C225小鼠在研究结束时患有腹膜疾病，但10％的DC101小鼠和30％进行联合治疗的小鼠没患疾病。最终，与对照组小鼠相比，DC101(低66.7％)和联合治疗组(低100％)的平均腹水等级要低。此外，DC101+C225组与DC101组相比，腹水明显更少；在联合治疗组中几乎没有见到腹水。

对PCNA给肿瘤细胞染色，然后通过免疫组织化学分析评估肿瘤细胞的增殖。与对照组相比，DC101(小50.3％)组和DC101+C225组(小66.7％)的腹膜肿瘤要小。

对CD31给小鼠腹膜病变的切片染色，利用免疫荧光检测ECs数，作为编程性细胞死亡的测量值。与对照组相比，在DC101和DC101+C225组中可观察到明显更少的ECs。

在有和没有对CD31同时进行染色的情况下，在腹膜转移瘤的切片上进行免疫荧光TUNEL染色，从而量化TC和EC的编程性细胞死亡。与对照组比，可在DC101组(TCs为多14.3倍，Ecs为多226倍)和DC101+C225组(TCs为多23.6倍，Ecs为多331倍)见到更多编程性死亡的TCs和ECs，而与单独的DC101组比，DC101+C225组编程性死亡的TCs和ECs(TCs为1.7倍，ECs为1.46倍)更多。

实施例XII人Fab的生产

实施例XII(a)蛋白和细胞系

原代培养的HUVEC是从Dr.S.Rafii，Cornell Medical Center，New York获得的，并在37℃，5％CO₂的EBM-2培养基(Clonetics，Walkersville，MD)中维持。可溶性融合蛋白KDR(VEGFR-2)-AP，其缺失免疫球蛋白(Ig)结构域的变体，和Flk-1-AP是在稳定转染的NIH 3T3中表达的，并按照Lu等在J.Biol.Chem.275：14321-30(2000)中所述，使用AP的固定化单克隆抗体，通过亲和色谱法从细胞培养物上清液纯化。VEGF₁₆₅蛋白是在杆状病毒中表达的，并按照Zhu等在Cancer Res.58：3209-14(1998)中描述的过程纯化。白血病细胞系HL60和HEL都维持在含10％胎牛血清的RPMI中。

实施例XII(b)噬菌体ELISA

挑选各个TG1克隆，37℃时在96孔平板中生长，并按照上面所述把它引入到M13K07辅助噬菌体中。用1/6体积的18％奶/PBS室温封闭扩增的噬菌体制品1小时，然后加入到包被KDR(VEGFR-2)-AP或AP(1μg/ml×100μl)的Maxi-sorp 96孔微量滴定板(Nunc)中。室温温育1小时后，用PBST洗涤该平板3次，并用兔抗-M13噬菌体-HRP偶联物(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)温育。洗涤该平板5次，加入TMB过氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg，MD)，使用微量平板读数器(Molecular Devices，Sunnyvate，CA)测量450nm处的吸光度。

实施例XII(c)DNA BstN I模式的分析及核苷酸测序

每轮选择后，通过限制酶消化模式(即，DNA指纹)分析抗-KDR(VEGFR-2)Fab克隆的多样性。各克隆的Fab基因插入物是用引物PCR扩增的，所述引物为：反向PUC19，即5’AGCGGATAACAATTTC ACACAGG3’；和fdtet序列，即5’GTCGTCTTTCCAGACGTTAGT 3’。扩增产物是用常见的切割酶BstN I消化的，并在3％琼脂糖凝胶上进行分析。通过双脱氧核苷酸测序测定各消化模式代表性克隆的DNA序列。

实施例XII(d)可溶性Fab片段的表达和纯化

各克隆的质粒用于转化非抑制大肠杆菌宿主HB2151。Fab片段在HB2151中的表达是30℃时，通过在含有1mM异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG，Sigma)的2YTA培养基中培养细胞诱导的。细胞的周质提取物是通过把细胞颗粒状物重悬浮在25mM Tris(pH7.5)中，并于4℃轻轻振摇培养1小时制备的，其中25mM Tris(pH7.5)含有20％(w/v)蔗糖，200mM NaCl，1mM EDTA和0.1mM PMSF。15,000rpm离心15分钟后，按照制造商(Amersham Pharmacia Biotech)提供的方法，使用G蛋白柱，通过亲和色谱法从上清液纯化可溶性scFv蛋白。

实施例XII(e)从噬菌体展示文库选择人抗KDR(VEGFR-2)Fab

使用含有3.7×10¹⁰个克隆的人Fab噬菌体展示文库进行选择(DeHaard等，J.Biol.Chem.274：18218-30(1999))。该文库包括PCR-扩增抗体的可变轻链基因和可变重链基因，它们分别与人恒定轻链基因(κ和λ)及编码IgG1重链C_H1结构域的DNA融合。重链和轻链构建体都位于信号序列——即，轻链的pelB和重链的基因III信号序列之前。重链构建体进一步编码用于噬菌体展示的基因III蛋白的一部分，六组氨酸标记，和11个氨基酸长的c-myc标记，然后是琥珀密码子(TAG)。六组氨酸和c-myc标记可用于纯化或检测。琥珀密码子可使用抑制宿主(如TG1细胞)进行噬菌体展示或在转化到非抑制宿主(如HB2151细胞)中时，产生可溶形式的Fab片段。

文库原液生长至对数期，把它引入到M13-K07辅助噬菌体中，并于30℃时，在2YTAK培养基(2YT含有100μg/ml氨苄西林和50μg/ml卡那霉素)中扩增过夜。使噬菌体制品在4％PEG/0.5M NaCl中沉淀，在3％脱脂奶/含500μg/ml AP蛋白的PBS中重悬浮，37℃温育1小时，以捕获展示抗-AP Fab片段的噬菌体，并阻断其它非特异性结合。

首先，在37℃时，用3％奶/PBS封闭包被有KDR(VEGFR-2)-AP(在PBS中为10μg/ml)的Maxisorp Star试管(Nunc，Rosklide，Denmark)1小时，然后用噬菌体制品室温温育1小时。用PBST洗涤试管10次，然后用PBS(PBS含0.1％吐温20)洗涤10次。用1ml新鲜制备的100mM三乙胺溶液(Sigma，St.Louis，MO)室温洗脱结合的噬菌体10分钟。用10ml对数中期的TG1细胞37℃温育洗脱的噬菌体30分钟，静置，振摇30分钟。使感染的TG1细胞沉淀，把它铺于数个大的2YTAG平板上，30℃过夜温育。把在平板上生长的所有集落刮在3-5ml的2YTA培养基中，与甘油混合(10％终浓度)，等分，-70℃贮存。对于下一轮选择而言，把100μl噬菌体原液加入到25ml2YTAG培养基中，生长至对数中期。把培养物引入到M13K07辅助噬菌体中，扩增，沉淀，并按照上述过程用于选择，随着结合过程后洗涤次数的增加，固定在免疫试管上的KDR(VEGFR-2)-AP的浓度越来越小。

总共3次选择都是在固定化的KDR(VEGFR-2)上进行的，原始结合过程后蛋白浓度和洗涤次数发生改变。每轮选择后，随机挑选93个克隆，通过噬菌体ELISA测定它们与KDR(VEGFR-2)的结合。在第二次选择后，在93个克隆中挑选了70个(75％)，在第三次选择之后，超过90％的回收克隆在KDR(VEGFR-2)结合中呈阳性，表明选择过程的高效。扩增DNA片段，所述DNA片段编码在第二次选择中鉴定的全部70种结合剂的Fab，用BstN I消化，比较指纹模式。对总共42种不同模式进行观察，表明分离出来的抗-KDR(VEGFR-2)Fab的多样性很好。交叉反应性检测证实，42个抗体中的19个是特异性的FLT-1(VEGFR-1)-结合剂，而剩下的23个则可与KDR(VEGFR-2)及其鼠同源物Flk-1结合。进一步的选择是利用竞争性VEGF-结合测定法进行的，其中测定了有或没有抗-KDR(VEGFR-2)Fab片段存在时，可溶性KDR(VEGFR-2)与固定化VEGF的结合。该测定法鉴定了4个Fab克隆，它们都能阻断VEGF和KDR(VEGFR-2)间的结合。其中有3个是KDR(VEGFR-2)的特异性结合剂，有1个与Flk-1交叉反应。DNA指纹和测序分析证实，这4个具有独特DNA和氨基酸序列的KDR(VEGFR-2)/VEGF阻断抗体是不同的。

4个克隆的V_H和V_L的CDR1，CDR2，CDR3的氨基酸序列在表3中给出。

           表3-所选结合KDR(VEGFR-2)的人Fabs的CDR序列

  克隆  CDR1  CDR2  CDR3  轻链              重链            D2C6    D2H2    D1H4    D1F7     D2C6   D2H2  D1H4   D1F7    RASQSVSSYLA   (SEQ ID NO：1)  RASQGISSRLA   (SEQ ID NO：4)  AGTTTDLTYYDLVS   (SEQ ID NO：7)  SGSTSNIGTNTAN   (SEQ ID NO：10)   GFTFSSYSMN   (SEQ ID NO：13)  GFTFSSYSMN  GFTFSSYSMN  GGTFSSYAIS   (SEQ ID NO：16)   DSSNRAT   (SEQ ID NO：2)  AASSLQT   (SEQ ID NO：5)  DGNKRPS   (SEQ ID NO：8)  NNNQRPS   (SEQ ID NO：11)   SISSSSSYIYYADSVKG   (SEQ ID NO：14)  SISSSSSYIYYADSVKG  SISSSSSYIYYADSVKG  GGIIPIFGTANYAQKFQG   (SEQ ID NO：17)   LQHNTFPPT   (SEQ ID NO：3)  QQANRFPPT   (SEQ ID NO：6)  NSYVSSRFYV   (SEQ ID NO：9)  AAWDDSLNGHWV   (SEQ ID NO：12)   VTDAFDI   (SEQ ID NO：15)  VTDAFDI  VTDAFDI  GYDYYDSSGVASPFDY   (SEQ ID NO：18)

V_H和V_L链的完整序列在序列表中给出。对于D1F7而言，V_H的核苷酸和氨基酸序列分别由SEQ ID NOS：19和20表示，V_L的核苷酸和氨基酸序列分别由SEQ ID NOS：21和22表示。

对于D2C6而言，V_H的核苷酸和氨基酸序列分别由SEQ ID NOS：23和24表示，V_L的核苷酸和氨基酸序列分别由SEQ ID NOS：25和26表示。

对于D2H2而言，V_H的核苷酸和氨基酸序列分别由SEQ ID NOS：30和31表示，V_L的核苷酸和氨基酸序列分别由SEQ ID NOS：32和33表示。

对于D1H4而言，V_H的核苷酸和氨基酸序列分别由SEQ ID NOS：27和24表示，V_L的核苷酸和氨基酸序列分别由SEQ ID NOS：28和29表示。

第二个文库是把D2C6的单一重链与原始文库轻链的不同群体结合创造的。鉴定了10个附加的Fabs，命名为SA1，SA3，SB10，SB5，SC7，SD2，SF2，SF7和1121。这10个Fabs的V_L的核苷酸及氨基酸序列在下面给出。对于SA1而言，V_L的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS：34和35表示。对于SA3而言，V_L的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS：36和37表示。对于SB10而言，V_L的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS：38和39表示。对于SB5而言，V_L的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS：40和41表示。对于SC7而言，V_L的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS：42和43表示。对于SD2而言，V_L的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS：44和45表示。对于SD5而言，V_L的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS：46和47表示。对于SF2而言，V_L的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS：48和49表示。对于SF7而言，V_L的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS：50和51表示。对于1121而言，V_L的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS：52和53表示。

V_L的CDR序列在表4中给出。

          表4-结合KDR(VEGFR-2)的人Fabs的轻链CDR序列

  克隆  CDR1  CDR2  CDR3   SA1    SA3    SB10    SB5    SC7    SD2    SD5    SF2    SF7    1121   TGSHSNFGAGTDV   (SEQ ID NO：54)  RASQNINNYLN   (SEQ ID NO：57)  TGSSTDVGNYNYIS   (SEQ ID NO：60)  TGQSSNIGADYDVH   (SEQ ID NO：63)  RASQDISWLA   (SEQ ID NO：66)  RASQSIKRWLA   (SEQ ID NO：69)  SGSRSNIGAHYEVQ   (SEQ ID NO：72)  TGSSSNIGTGYDVH   (SEQ ID NO：75)  TGSHSNFGAGTDVH   (SEQ ID NO：78)  RASQGIDNWLG   (SEQ ID NO：81)  GDSNRPS   (SEQ ID NO：55)  AASTLQS   (SEQ ID NO：58)  DVTSRPS   (SEQ ID NO：61)  GHNNRPS   (SEQ ID NO：64)  AASLLQS   (SEQ ID NO：67)  AASTLQS   (SEQ ID NO：70)  GDTNRPS   (SEQ ID NO：73)  AYTNRPS   (SEQ ID NO：76)  GDTHRPS   (SEQ ID NO：79)  DASNLDT   (SEQ ID NO：82)  QSYDYGLRGWV   (SEQ ID NO：56)  QQYSRYPPT   (SEQ ID NO：59)  NSYSATDTLV   (SEQ ID NO：62)  QSYDSSLSGLV   (SEQ ID NO：65)  QQADSFPPT   (SEQ ID NO：68)  QQANSFPPT   (SEQ ID NO：71)  QSYDTSLRGPV   (SEQ ID NO：74)  QSFDDSLNGLV   (SEQ ID NO：77)  QSYDYGLRGWV   (SEQ ID NO：80)  QQAKAFPPT   (SEQ ID NO：83)

实施例XIII测定法

实施例XIII(a)定量的KDR(VEGFR-2)结合及KDR(VEGFR-2)/VEGF相互作用的阻断

在直接结合测定法中，把不同量的可溶性Fab蛋白加入到KDR(VEGFR-2)包被的96孔Maxi-sorp微量滴定平板中，室温温育1小时，然后用PBST洗涤平板3次。用100μl兔抗人Fab抗体-HRP偶联物(Jackson ImmunoResearch Laboratory Inc.，West Grove，PA)室温温育该平板1小时。洗涤平板，并按照上述噬菌体ELISA的过程显影。在竞争性KDR(VEGFR-2)/VEGF阻断测定法中，把不同量的Fab蛋白与固定量的KDR(VEGFR-2)-AP(100ng)混合，室温温育1小时。然后把混合物转移到预先包被有VEGF₁₆₅(200ng/孔)的96孔微量滴定板中，再室温温育2小时，洗涤平板5次，加入AP的底物(对-硝基苯磷酸，Sigma)。测量405nm处的吸光度，量化结合的KDR(VEGFR-2)-AP分子(8)。然后计算IC₅₀，即，抑制KDR(VEGFR-2)与VEGF结合的50％所需的Fab蛋白浓度。

4个VEGF-阻断克隆(D2C6，D2H2，D1H4，D1F7)被表达成可溶性的Fab，并通过G蛋白亲和色谱法从大肠杆菌周质提取物中纯化。这些克隆的纯化Fab蛋白的产量为60-400μg/升培养物。各纯化Fab制品的SDS-PAGE分析产生了一个具有预期分子大小的单一蛋白带。

克隆D2C6和D2H2是更有效的结合剂，然后是克隆D1H4和D1F7。所有这四个Fabs都能阻断KDR(VEGFR-2)与固定化VEGF的结合。对于克隆D2C6，D2H2和D1H4而言，抑制KDR(VEGFR-2)与VEGF结合的50％所需的抗体浓度约为2nM，对于克隆D1F7而言，约为20nM。只有D1F7可阻断VEGF与Flk-1的结合，其IC₅₀值约为15nM。

实施例XIII(b)可溶性scFv的BIAcore分析

可溶性Fab蛋白与KDR(VEGFR-2)的结合动力学是用BIAcore生物传感器(Pharmacia Biosensor)，通过表面等离子共振测量的。把KDR(VEGFR-2)-AP融合蛋白固定在传感器芯片上，注射1.5nM-100nM浓度的可溶性Fab蛋白。获得各浓度的传感图，使用BIA Evaluation2.0程序评估，从而测定速率常数kon和koff。Kd是根据速率常数koff/kon的比值计算的。

所有这3个KDR(VEGFR-2)-特异性Fab片段都以2-4nM的Kd与固定化受体结合(表5)。交叉反应克隆D1F7的Kd为45nM，大约比KDR(VEGFR-2)特异性克隆的那些弱10-15倍。值得注意的是，虽然这三个KDR(VEGFR-2)特异性Fab片段的Kd相似，但这些抗体的结合动力学，即，kon和koff大不不同，例如，D2C6具有最快的启动速度，而D1H4则具有最慢的关闭速度(表5)。

表5-四个中和人抗-KDR(VEGFR-2)Fab片段的结合动力学

 克隆  kon  (10⁴M^-1S^-1)  koff  (10^-4S^-1)  Kd  (nM) Hu-2C6 Fab Hu-2H2 Fab Hu-1H4 Fab Hu-1F7 Fab  27.3±8.6^*  12.4±2.9  5.55±0.59  4.14±1.21  5.38±0.54  4.87±0.18  1.53±0.22  18.7±2.12  1.97  3.93  2.76  45.2

所有数值都是通过BIAcore分析测定的，代表至少三次测量的平均值±SE。

实施例XIII(c)结合表位的作图

按照前面所述(Lu等，(2000))生产缺失KDR(VEGFR-2)胞外Ig-样结构域的变体。在表位作图测定法中，首先使用兔抗-AP抗体(DAKO-免疫球蛋白，Glostrup，Denmark)作为捕获试剂，把全长KDR(VEGFR-2)-AP，两个缺失KDR(VEGFR-2)Ig-结构域的变体的AP融合，和Flk-1-AP固定在96孔平板(Nunc)上。然后用各种抗-KDR(VEGFR-2)Fab蛋白室温培养该平板1小时，接着用兔抗-人Fab抗体-HRP偶联物培养。洗涤平板，按照上面所述显影。

抗-KDR(VEGFR-2)Fab片段的结合表位是用全长KDR(VEGFR-2)和两个缺失KDR(VEGFR-2)Ig结构域的变体作图的。KDR(VEGFR-2)(1-3)是含有前三个N-末端Ig结构域的KDR(VEGFR-2)变体。KDR(VEGFR-2)(3)是仅含有第三个Ig结构域的变体。克隆D2C6和D1H4同等结合KDR(VEGFR-2)，KDR(VEGFR-2)(1-3)和KDR(VEGFR-2)(3)，因此结合表位位于Ig结构域3内。克隆D2H2和D1F7更可有效地结合全长KDR(VEGFR-2)和KDR(VEGFR-2)(1-3)，表明KDR(VEGFR-2)Ig结构域1-3内的结合抗原决定部位很多。只有克隆DIF7与Flk-1交叉反应。

实施例XIII(d)抗有丝分裂测定

把HUVEC(5×10³个细胞/孔)铺于96孔组织培养平板上200μl没有VEGF，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或表皮生长因子(EGF)的EBM-2培养基中，37℃温育72小时。把不同量的Fab蛋白一式两份加入到孔中，37℃预温育1小时，然后加入VEGF₁₆₅至16ng/ml的终浓度。温育18小时后，向各孔中加入0.25μCi的[³H]TdR(Amersham)，再温育4小时。用PBS洗涤细胞一次，使其经过胰蛋白酶消化，并用细胞收集器(Harvester 96，MACH III，TOMTEC，Orange，CT)收集在玻璃滤器上。用H₂O洗涤该膜3次，风干。加入闪烁液，在闪烁计数器(Wallach，Model 1450 Microbeta Scintillation Counter)上测定已掺入DNA的放射性。

人抗-KDR(VEGFR-2)Fab具有阻断HUVEC上VEGF-刺激的有丝分裂活性的能力。所有这4个人Fab片段都可以剂量依赖性方式抑制HUVEC中VEGF诱导的DNA合成。抑制HUVEC中VEGF-刺激的[³H]-TdR掺入的50％所需的Fab浓度(EC₅₀)，对于克隆D2C6和D1H4而言约为0.5nM，对于克隆D2H2而言约为0.8nM，对于克隆D1F7而言约为15nM。对照组只含有VEGF(1500cpm)和纯培养基(60cpm)。一式两份进行测定。所示数据表示至少3次的独立实验。

实施例XIII(e)白血病迁移测定法

用没有血清的纯RPMI 1640培养基洗涤HL60和HEL细胞3次，以1×10⁶/ml悬浮在培养基中。把100μl细胞混悬液的等分试样加入到HL60细胞的3μm-孔经孔插入物，或HEL细胞的8μm-孔经孔插入物中(Costar，Corning Incorporated，Corning，NY)，37℃时与抗KDR(VEGFR-2)Fab蛋白(5μg/ml)温育30分钟。然后把插入物放在24孔平板的孔中，所述24孔平板含有0.5ml有或没有VEGF₁₆₅的，没有血清的RPMI 1640。迁移是在37℃，5％CO₂的条件下进行的，HL60细胞进行16-18小时，HEL细胞进行4小时。从区室下部采集迁移的细胞，用Coulter计数器(Model Z1，Coulter Electronics Ltd.，Luton，England)计数。

VEGF可以剂量依赖性方式诱导HL60和HEL细胞的迁移，最大刺激是在200ng/获得的。所有抗KDR(VEGFR-2)Fab片段都可显著抑制VEGF-刺激的HL60和HEL细胞迁移。在这个测定法中，作为对照，C225，一种针对EGF受体的抗体的Fab片段，没有显示出显著的抑制作用。

实施例XIV.IgG的生产

实施例XIV(a)表达IgG的载体的构建

构建表达IgG轻链和重链的独立载体。消化克隆的V_L基因，并把它连接到载体pKN100中。消化克隆的V_H基因，并把它连接到载体pGID105中，所述pGID105含有人IgG I(γ)重链恒定结构域。构建是通过限制酶消化检测的，并通过双脱氧核苷酸测序加以证实。在这两种情况中，表达都是在HCMV启动子的控制下进行的，并由人工终止序列终止。

然后把组装的重链和轻链基因克隆到Lonza GS表达载体pEE6.1和pEE12.1中。把重链和轻链载体重组为单一载体，用于CHO细胞和NSO细胞的稳定转染。在缺少谷氨酰胺的培养基中培养转染的细胞，并以高达1g/L的水平表达抗体。

                         序列表

<110>帕特里夏.罗克韦尔

     尼尔I.戈尔茨坦

<120>用血管内皮生长因子受体拮抗剂抑制肿瘤生长的联合疗法

<130>11245/46276

<140>PCT/US02/06762

<141>04-03-2002

<160>85

<170>WordPerfect 8.0 for Windows

<210>1

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>1

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

        5           10

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>2

Asp Ser Ser Asn Arg Ala Thr

        5

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>3

Leu Gln His Asn Thr Phe Pro Pro Thr

5

<210>4

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>4

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Arg Leu Ala

        5        10

<210>5

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>5

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Thr

        5

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>6

Gln Gln Ala Asn Arg Phe Pro Pro Thr

        5

<210>7

<211>14

<212>PRT

<213>人

<400>7

Ala Gly Thr Thr Thr Asp Leu Thr Tyr Tyr Asp Leu Val Ser

        5       10

<210>8

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>8

Asp Gly Asn Lys Arg Pro Ser

        5

<210>9

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>9

Asn Ser Tyr Val Ser Ser Arg Phe Tyr Val

        5       10

<210>l0

<211>13

<212>PRT

<213>人

<400>10

Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Thr Asn Thr Ala Asn

            5       10

<210>11

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>11

Asn Asn Asn Gln Arg Pro Ser

        5

<210>12

<211>12

<212>PRT

<213>人

<400>12

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly His Trp Val

        5           10

<210>13

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>13

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn

        5           10

<210>14

<211>17

<212>PRT

<213>人

<400>14

Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

        5            10      15

Gly

17

<210>15

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>15

Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile

            5

<210>16

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>16

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser

        5 1      10

<210>17

<211>18

<212>PRT

<213>人

<400>17

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

        5           10      15

Gln Gly

18

<210>18

<211>16

<212>PRT

<213>人

<400>18

Gly Tyr Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Val Ala Ser Pro Phe Asp Tyr

            5       10      15

<210>19

<211>375

<212>DNA

<213>人

<400>19

gag gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg gcc    48

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

        5           10      15

tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc agc agc tat    96

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

        20      25          30

gct atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg    144

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

        35          40      45

gga ggg atc atc cct atc ttt ggt aca gca aac tac gca cag aag ttc    192

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

        50      55          60

cag ggc aga gtc act ttt acc gcg gac aaa tcc acg agt aca gcc tat    240

Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

        65      70      75      80

atg gag ttg agg agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt    288

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

        85          90          95

gcg aga gga tac gat tac tat gat agt agt ggc gtg gct tcc ccc ttt    336

Ala Arg Gly Tyr Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Val Ala Ser Pro Phe

        100     105         110

gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tca agc         375

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115     120     125

<210>20

<211>125

<212>PRT

<213>人

<400>20

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

        5       10          15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

        20      25          30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

        35      40          45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

        50      55      60

Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

        65      70      75      80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

        85      90      95

Ala Arg Gly Tyr Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Val Ala Ser Pro Phe

        100     105     110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115     120     125

<210>21

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>21

cag tct gtg ctg act cag cca ccc tca gcg tct ggg acc ccc ggg cag    48

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

        5       10      15

agg gtc acc atc tct tgt tct gga agc acc tc cac atc ggt act aat     96

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Thr Asn

        20      25      30

act gca aac tgg ttc cag cag ctc cca gga acg gcc ccc aaa ctc ctc    144

Thr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

        35      40      45

atc cac aat aat aat cag cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc tct     192

Ile His Asn Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

        50      55      60

ggc tcc aag tct ggc acc tca gcc tcc ctg gcc atc agt ggg ctc cag     240

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

        65      70      75      80

tct gag gat gag gct gat tat tac tgt gca gca tgg gat gac agc ctg     288

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

        85      90      95

aat ggc cat tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg aac gtc ctg    333

Asn Gly His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

        100     105     110

<210>22

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>22

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

        5       10      15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Thr Asn

        20      25      30

Thr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

        35      40      45

Ile His Asn Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

        50      55      60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

        65      70      75      80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

        85      90      95

Asn Gly His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

        100     105     110

<210>23

<211>348

<212>DNA

<213>人

<400>23

gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ctg gtc aag cct ggg ggg 48

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

        5       10      15

tcc ctg aga ctc tcc tga gca gcc tct gga ttc acc ttc agt agc tat    96

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

        20      25      30

agc atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc    144

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35      40      45

tca tcc att agt agt agt agt agt tac ata tac tac gca gac tca gtg    192

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

        50      55      60

aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tca ctg tat    240

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

        65      70      75      80

ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt    288

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

        85      90      95

gcg aga gtc aca gat gct ttt gat atc tgg ggc caa ggg aca atg gtc    336

Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

        100     105     110

acc gtc tca agc                             348

Thr Val Ser Ser

    115

<210>24

<211>116

<212>PRT

<213>人

<400>24

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

        5   10      15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

        20      25      30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35      40      45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

        50      55      60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

        65      70      75      80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

        85      90      95

Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

       100      105     110

Thr Val Ser Ser

    115

<210>25

<211>321

<212>DNA

<213>人

<400>25

gaa att gtg atg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg    48

Glu IIe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

        5       10      15

gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt tcg agt gtt agc agc tac    96

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

        20      25      30

tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc    144

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

        35      40      45

tat gat tca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc aga ttc agt ggc    192

Tyr Asp Ser Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

        50      55      60

agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc cta gag cct  240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

        65      70      75      80

gaa gat ttt gca act tat tac tgt cta cag cat aac act ttt cct ccg  288

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Thr Phe Pro Pro

        85      90      95

acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa             321

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

        100     105

<210>26

<211>107

<212>PRT

<213>人

<400>26

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

        5       10      15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

        20      25      30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

        35      40      45

Tyr Asp Ser Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

        50      55      60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

        65      70      75      80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Thr Phe Pro Pro

        85      90      95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

        100     105

<210>27

<211>348

<212>DNA

<213>人

<400>27

gag gtc cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ctg gtc aag cct ggg ggg 48

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

        5       10      15

tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt agc tat 96

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

        20      25      30

agc atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35      40      45

tca tc att agt agt agt agt agt tac ata tac tac gca gac tca gtg    192

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

        50      55      60

aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tca ctg tat    240

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

        65      70      75      80

ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

        85      90      95

gcg aga gtc aca gat gct ttt gat atc tgg ggc caa ggg aca atg gtc 336

Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

        100     105     110

acc gtc tca agc                             348

Thr Val Ser Ser

    115

<210>28

<211>330

<212>DNA

<213>人

<400>28

cag tct gcc ctg act cag cct gcc tcc ctg tct ggg tct cct gga cag  48

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Gly Ser Pro Gly Gln

        5       10      15

tcg atc acc atc tcc tgc gct gga acc acc act gat ctt aca tat tat  96

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ala Gly Thr Thr Thr Asp Leu Thr Tyr Tyr

        20      25      30

gac ctt gtc tcc tgg tac caa cag cac cca ggc cca gca ccc aaa ctc    144

Asp Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu

        35      40      45

gtg att tat gac ggc aat aag cgg ccc tca gga gtt tct aat cgc ttc  192

Val Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

        50      55      60

tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcc ctg aca atc tct gga ctc  240

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

        65      70      75      80

cag gct gag gac gag gct gat tat tac tgc aac tca tat gta agc agc  288

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Val Ser Ser

        85      90      95

agg ttt tat gtc ttc gga act ggg acc aag gtc acc gtc cta          330

Arg Phe Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

        100     105     110

<210>29

<211>110

<212>PRT

<213>人

<400>29

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Gly Ser Pro Gly Gln

        5       10      15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ala Gly Thr Thr Thr Asp Leu Thr Tyr Tyr

        20      25      30

Asp Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu

        35      40      45

Val Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

        50      55      60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

        65      70      75      80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Val Ser Ser

        85      90      95

Arg Phe Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

        100     105     110

<210>30

<21l>348

<212>DNA

<213>人

<400>30

gaa gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ctg gtc aag cct ggg ggg    48

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

        5       10      15

tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt agc tat  96

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

        20      25      30

agc atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc  144

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35      40      45

tca tcc att agt agt agt agt agt tac ata tac tac gca gac tca gtg  192

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

        50      55      60

aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag gac tca ctg tat  240

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Ser Leu Tyr

        65      70      75      80

ctg caa atg aac agc ctg aga gec gag gac acg gct gtg tat tac tgt  288

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

        85      90      95

gcg aga gtc aca gat gct ttt gat atc tgg ggc caa ggg aca atg gtc  336

Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

        100     105     110

acc gtc tca agc                             348

Thr Val Ser Ser

    115

<210>31

<211>116

<212>PRT

<213>人

<400>3l

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

        5       10      15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

        20      25      30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35      40      45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

        50      55      60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Ser Leu Tyr

        65      70      75      80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

        85      90      95

Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

        100     105         110

Thr Val Ser Ser

    115

<210>32

<211>32l

<212>DNA

<213>人

<400>32

gac atc cag ttg acc cag tct cca tct tct gtg tct gca tct gta gga    48

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

        5       10      15

gac aga gtc acx atx act tgt cgg gcg agt cag ggt att agt agt cgg    96

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Arg

        20      25      30

tta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc    144

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35      40      45

tat gct gca tcc agt ttg caa act ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc    192

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

        50      55      60

agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc act atc agc agc ctg cag cct    240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

        65      70      75      80

gaa gat ttt gca act tac tat tgt caa cag gct aac agg ttc cct ccg    288

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Arg Phe Pro Pro

        85      90      95

act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat atc aaa             321

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

        100     105

<210>33

<211>107

<212s PRT

<213>人

<400>33

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

        5       10      15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Arg

        20      25      30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35      40      45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

        50      55      60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

        65      70      75      80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Arg Phe Pro Pro

        85      90      95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

        100     105

<210>34

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>34

cag tct gtc gtg acg cag ccg ccc tca gtg tct ggg gcc cca ggg cag    48

Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

        5       10      15

agg gtc acc atc tcc tgc act ggg agc cac tcc aac ttc ggg gca gga    96

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser His Ser Asn Phe Gly Ala Gly

        20      25      30

act gat gta cat tgg tac caa cac ctt cca gga aca gccc Gcc aga ctc 144

Thr Asp Val His Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Arg Leu

        35      40      45

ctc att cat gga gac agt aat cgg ccc tcc ggg gtc cct gac cga ttc    192

Leu Ile His Gly Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

        50      55      60

tct ggc tcc agg tct ggc acc tca gcc tcc ctg gcc atc act ggg ctc 240

Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

        65      70      75      80

cgg gtt gag gat gag gct gat tat tac tgt cag tcg tat gac tat ggc    288

Arg Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Tyr Gly

        85      90      95

ctg aga ggt tgg gtg ttc ggc ggc ggg acc aag ctg acc gtc ctt    333

Leu Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

        100     105     110

<210>35

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>35

Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

        5       10      15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser His Ser Asn Phe Gly Ala Gly

        20      25      30

Thr Asp Val His Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Arg Leu

        35      40      45

Leu Ile His Gly Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

        50      55      60

Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

        65      70      75      80

Arg Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Tyr Gly

        85      90      95

Leu Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

        100     105     110

<210>36

<211>321

<212>DNA

<213>人

<400>36

gta gtt gtg atg act cag tct cca tcg tcc ctg tct gca tct gta ggg    48

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

        5       10      15

gac aga gtc acc atc act tgc cgg gac agt cag aac att aac aac tat    96

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr

        20      25      30

tta aat tgg tat caa cag aaa cca gga aaa gcc cct aag ctc ctg atc    144

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35      40      45

tat gct gcc tcc act ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc    192

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

        50      55      60

agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc acc agc tca cag cct    240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro

        65      70      75      80

gaa gat tct gca act tat tac tgc caa cag tat tcc cgt tat cct ccc    288

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Pro

        85      90      95

act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aca             321

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Thr

        100     105

<210>37

<211>107

<212>PRT

<213>人

<400>37

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

        5       10      15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr

        20      25      30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35      40      45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

        50      55      60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro

        65      70      75      80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Pro

        85      90      95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Thr

        100     105

<210>38

<211>330

<212>DNA

<213>人

<400>38

cag tct gcc ctg act cag cct gcc tcc gtg tct ggg tct cgt gga cag    48

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Arg Gly Gln

        5       10      15

tcg atc acc ctc tcc tgc acc ggc tcc agc act gat gtg ggt aat tat    96

Ser Ile Thr Leu Ser Cys Thr Gly Ser Ser Thr Asp Val Gly Asn Tyr

        20      25      30

aac tat atc tcc tgg tac caa caa cac cca ggc caa gcc ccc aaa ctc    144

Asn Tyr Ile Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Gin Ala Pro Lys Leu

        35      40      45

ttg att tac gat gtc act agt cgg ccc tca ggt gtt tct gat cgc ttc    192

Leu Ile Tyr Asp Val Thr Ser Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe

        50      55      60

tct ggc tcc aag tca ggc ctc acg gcc tcc ctg acc atc tct gga ctc    240

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Leu Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

        65      70      75      80

cag cct gaa gac gag gct gac tat tac tgc aac tcc tat tct gcc acc    288

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Ser Ala Thr

        85      90      95

gac act ctt gtt ttt ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta    330

Asp Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

        100     105     110

<210>39

<211>110

<212>PRT

<213>人

<400>39

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Arg Gly Gln

        5       10      15

Ser Ile Thr Leu Ser Cys Thr Gly Ser Ser Thr Asp Val Gly Asn Tyr

        20      25      30

Asn Tyr Ile Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu

        35      40      45

Leu Ile Tyr Asp Val Thr Ser Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe

        50      55      60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Leu Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

        65      70      75      80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Ser Ala Thr

        85      90      95

Asp Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

        100     105     110

<210>40

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>40

cag gct gtg ctg act cag ccg tcc tca gtg tct ggg gcc cca gga cag    48

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

        5       10      15

agg gtc acc at tcc tgc act ggg caa agc tcc aat atc ggg gca gat     96

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gln Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asp

        20      25      30

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Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

        35      40      45

ctc atc tat ggt cac aac aat cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc    192

Leu Ile Tyr Gly His Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

        50      55      60

tct ggc tcc aag tct ggc acc tca gtc tcc ctg gtc atc agt ggg ctc    240

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Val Ser Leu Val Ile Ser Gly Leu

        65      70      75      80

cag gct gag gat gag gct gat tat tat tgc cag tcc tat gac agc agt    288

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

        85      90      95

cta agt ggt ttg gta ttc ggc gga ggg acc aag gtg acc gtc cta    333

Leu Ser Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

       100      105     110

<210>41

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>41

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

        5       10      15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gln Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asp

        20      25      30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

        35      40      45

Leu Ile Tyr Gly His Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

        50      55      60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Val Ser Leu Val Ile Ser Gly Leu

        65      70      75      80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

        85      90      95

Leu Ser Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

        100     105     110

<210>42

<211>321

<212>DNA

<213>人

<400>42

gac atc cag ttg acc cag tct cca tct tct gtg tct gca tct gtt gga    48

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

        5       10      15

gac agc gtc acc atc act tgt cgg gcg agt cag gat att agc agc tgg    96

Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp

        20      25      30

tta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg gag gcc cct aag ctc ctg atc    144

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35      40      45

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Tyr Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

        50      55      60

agt gga tct ggg aca gat ttc gct ctc act atc aac age ctg cag cct    240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro

        65      70      75      80

gaa gat ttt gca act tac ttt tgt caa cag gct gac agt ttc cct ccc    288

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Pro

        85      90      95

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

        100     105

<210>43

<211>107

<212>PRT

<213>人

<400>43

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

        5   10      15

Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp

        20  25      30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35  40      45

Tyr Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

        50  55      60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro

        65  70      75      80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Pro

        85  90      95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

        100     105

<210>44

<211>321

<212>DNA

<213>人

<400>44

gac atc gag ttg acc cag tct cca tct tcc gtg tct gca tct gtg gga    48

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

        5       10      15

gac aga gtc acc ctc act tgt cgg gcg agt cag agt att aag agg tgg    96

Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Lys Arg Trp

        20      25      30

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile

        35      40      45

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Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

        50      55      60

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Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro

        65      70      75      80

gaa gat ttt gca att tac tac tgt caa cag gct aac agt ttc cct ccc    288

Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro

        85      90      95

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Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

        100     105

<210>45

<211>107

<212>PRT

<213>人

<400>45

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

        5       10      15

Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Lys Arg Trp

        20      25      30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile

        35      40      45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

        50      55      60

Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro

        65      70      75      80

Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro

        85      90      95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

        100     105

<210>46

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>46

cag tct gtc gtg acg cag ccg ccc tca gtg tct ggg gcc cca ggg cag    48

Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

        5       10      15

agg gtc acc atc tcc tgc agt ggg agc agg tcc aac atc ggg gca cac    96

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ala His

        20      25      30

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Tyr Glu Val Gln Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu

        35      40      45

ctc atc tat ggt gac acc aat cgg ccc tca ggg gtc cct gag cga ttc    192

Leu Ile Tyr Gly Asp Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

        50      55      60

tct gcc tcc cac tct ggc acc tca gcc tcc ctt gcc atc aca ggg ctc    240

Ser Ala Ser His Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

        65      70      75      80

cag gct gag gat gag gct gat tat tac tgc cag tcg tat gac acc agt    288

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Ser

        85      90      95

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Leu Arg Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

        100     105     110

<210>47

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>47

Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

        5       10      15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ala His

        20      25      30

Tyr Glu Val Gln Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu

        35      40      45

Leu Ile Tyr Gly Asp Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

        50      55      60

Ser Ala Ser His Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

        65      70      75      80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Ser

        85      90      95

Leu Arg Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

        100     105     110

<210>48

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>48

cag tct gtc gtg acg cag ccg ccc tca gtg tct ggg gcc cca ggg cag    48

Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

        5       10      15

agg gtc acc at tcc tgc act ggg agc agc tcc aac atc ggg aca ggt     96

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Gly

        20      25      30

tat gat gta cat tgg tac cag cag gtt cca gga tca gcc ccc aaa ctc    144

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu

        35      40      45

ctc atc tat gct tac acc aat cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc    192

Leu Ile Tyr Ala Tyr Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

        50      55      60

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Ser Gly Ser Lys Ser Gly Met Ser Ala Ser Leu Val Ile Gly Gly Leu

        65      70      75      80

cag gct gag gat gag gct gat tat tac tgc cag tcc ttt gac gac agc    288

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Asp Ser

        85      90      95

ctg aat ggt ctt gtc ttc gga cct ggg acc tcg gtc acc gtc ctc    333

Leu Asn Gly Leu Val Phe Gly Pro Gly Thr Ser Val Thr Val Leu

        100     105     110

<210>49

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>49

Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

        5       10      15

Arg Val Thr Ile Ser Sys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Gly

        20      25      30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu

        35      40      45

Leu Ile Tyr Ala Tyr Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

        50      55      60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Met Ser Ala Ser Leu Val Ile Gly Gly Leu

        65      70      75  80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr TyrCys Gln Ser Phe Asp Asp Ser

        85      90      95

Leu Asn Gly Leu Val Phe Gly Pro Gly Thr Ser Val Thr Val Leu

        100     105     110

<210>50

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>50

cag tct gtg ttg acg cag ccg ccc tca gtg tct ggg ggc cca ggg cag  48

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

        5       10      15

agg gtc acc atc tcc tgc act ggg agc cac tcc aac ttc ggg gca ggt    96

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser His Ser Asn Phe Gly Ala Gly

        20      25      30

act gat gtc cat tgg tac caa cac ctt cca gga aca gcc ccc aga ctc  144

Thr Asp Val His Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro arg Leu

        35      40      45

ctc att cat gga gac act cat cgg ccc tcc ggg gtc gct gac cga ttc    192

Leu Ile His Gly Asp Thr His Arg Pro Ser Gly Val Ala Asp Arg Phe

        50      55      60

tct ggc tcc gg tct ggc gcc tca gcc tcc ctg gcc atc act ggg ctc    240

Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

        65      70      75      80

cgg gtt gag gat gag gtc gat tat tac tgt cag tcg tat gac tat ggc 288

Arg Val Leu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Tyr Gly

        85      90      95

ctg aga ggt tgg gtg ttc ggc ggc ggg acc aag ctg acc gtc ctt    333

Leu Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

        100     105     110

<210>51

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>51

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

        5       10  15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser His Ser Asn Phe Gly Ala Gly

            20      25  30

Thr Asp Val His Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Arg Leu

            35      40  45

Leu Ile His Gly Asp Thr His Arg Pro Ser Gly Val Ala Asp Arg Phe

            50      55  60

Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

            65      70  75  80

Arg Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Tyr Gly

            85      90  95

Leu Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100     105     110

<210>52

<211>32l

<212>DNA

<213>人

<400>52

gac atc cag atg acc cag tct cca tct tcc gtg tct gca tct ata gga    48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly

        5       10      15

gac aga gtc acc atc act tgt cgg gcg agt cag ggt att gac aac tgg    96

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp

        20      25      30

tta ggc tgg tat cag cag aaa cct ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg atc    144

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35      40      45

tac gat gca tcc aat ttg gac aca ggg gtc cca tca agg ttc agt gga    192

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

        50      55      60

agt gga tct ggg aca tat ttt act ctc acc atc agt agc ctg caa gct    240

Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

        65      70      75      80

gaa gat ttt gca gtt tat ttc tgt caa cag gct aaa gct ttt cct ccc    288

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro

        85      90      95

act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gac atc aaa             321

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

        100     105

<210>53

<211>107

<212>PRT

<213>人

<400>53

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly

        5       10      15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp

        20      25      30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35      40      45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

        50      55      60

Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

        65      70      75      80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro

        85      90      95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

        100     105

<210>54

<211>13

<212>PRT

<213>人

<400>54

Thr Gly Ser His Ser Asn Phe Gly Ala Gly Thr Asp Val

        5       10

<210>55

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>55

Gly Asp Ser Asn Arg Pro Ser

        5

<210>56

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>56

Gln Ser Tyr Asp Tyr Gly Leu Arg Gly Trp Val

        5       10

<210>57

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>57

Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr Leu Asn

        5       10

<210>58

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>58

Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser

            5

<210>59

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>59

Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Pro Thr

            5

<210>60

<211>14

<212>PRT

<213>人

<400>60

Thr Gly Ser Ser Thr Asp Val Gly Asn Tyr Asn Tyr Ile Ser

        5       10

<210>61

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>61

Asp Val Thr Ser Arg Pro Ser

        5

<210>62

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>62

Asn Ser Tyr Ser Ala Thr Asp Thr Leu Val

        5       10

<210>63

<211>14

<212>PRT

<213>人

<400>63

Thr Gly Gln Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asp Tyr Asp Val His

        5       10

<210>64

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>64

Gly His Asn Asn Arg Pro Ser

        5

<210>65

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>65

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Leu Val

        5       10

<210>66

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>66

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Trp Leu Ala

        5       10

<210>67

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>67

Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ser

        5

<210>68

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>68

Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Pro Thr

        5

<210>69

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>69

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Lys Arg Trp Leu Ala

        5       10

<210>70

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>70

Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser

        5

<210>71

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>71

Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro Thr

        5

<210>72

<211>14

<212>PRT

<213>人

<400>72

Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ala His Tyr Glu Val Gln

        5       10

<210>73

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>73

Gly Asp Thr Asn Arg Pro Ser

        5

<210>74

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>74

Gln Ser Tyr Asp Thr Ser Leu Arg Gly Pro Val

        5       10

<210>75

<211>14

<212>PRT

<213>人

<400>75

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Gly Tyr Asp Val His

        5       10

<210>76

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>76

Ala Tyr Thr Asn Arg Pro Ser

        5

<210>77

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>77

Gln Ser Phe Asp Asp Ser Leu Asn Gly Leu Val

        5       10

<210>78

<211>14

<212>PRT

<213>人

<400>78

Thr Gly Ser His Ser Asn Phe Gly Ala Gly Thr Asp Val His

        5       10

<210>79

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>79

Gly Asp Thr His Arg Pro Ser

        5

<210>80

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>80

Gln Ser Tyr Asp Tyr Gly Leu Arg Gly Trp Val

        5       10

<210>81

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>81

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp Leu Gly

        5       10

<210>82

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>82

Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr

        5

<210>83

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>83

Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro Thr

        5

<210>84

<211>2351

<212>DNA

<213>人

<400>84

ggtaccgag aaagaaccgg ctcccgagtt  ctgggcattt  cgcccggctc gaggtgcagg 59

atg cag agc aag gtg ctg ctg gcc gtc gcc ctg tgg ctc tgc gtg gag    107

Met Gln Ser Lys Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Leu Cys Val Glu

        5       10      15

acc cgg gcc gcc tct gtg ggt ttg cct agt gtt tct ctt gat ctg ccc    155

Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro

        20      25      30

agg ctc agc ata caa aaa gac ata ctt aca att aag gct aat aca act    203

Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr

        35      40      45

ctt caa att act tgc agg gga cag agg gac ttg gac tgg ctt tgg ccc    251

Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro

        50      55      60

aat aat cag agt ggc agt gag caa agg gtg gag gtg act gag tgc agc    299

Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser

        65      70      75      80

gat ggc ctc ttc tgt aag aca ctc aca att cca aaa gtg atc gga aat    347

Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn

        85      90      95

gac act gga gcc tac aag tgc ttc tac cgg gaa act gac ttg gcc tcg    395

Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser

        100     105     110

gtc att tat gtc tat gtt caa gat tac aga tct cca ttt att gct tct    443

Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser

        115     120     125

gtt agt gac caa cat gga gtc gtg tac att act gag aac aaa aac aaa    491

Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys

        130     135     140

act gtg gtg att cca tgt ctc ggg tcc att tca aat ctc aac gtg tca    539

Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser

        145     150     155     160

ctt tgt gca aga tac cca gaa aag aga ttt gtt cct gat ggt aac aga    587

Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg

        165     170     175

att tcc tgg gac agc aag aag ggc ttt act att ccc agc tac atg atc    635

Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile

        180     185     190

agc tat gct ggc atg gtc ttc tgt gaa gca aaa att aat gat gaa agt    683

Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser

        195     200     205

tac cag tct att atg tac ata gtt gtc gtt gta ggg tat agg att tat    731

Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr

        210     215     220

gat gtg gtt ctg agt ccg tct cat gga att gaa cta tct gtt gga gaa    779

Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu

        225     230     235     240

aag ctt gtc tta aat tgt aca gca aga act gaa cta aat gtg ggg att    827

Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile

        245     250     255

gac ttc aac tgg gaa tac cct tct tcg aag cat cag cat aag aaa ctt    875

Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gin His Lys Lys Leu

        260     265     270

gta aac cga gac cta aaa acc cag tct ggg agt gag atg aag aaa ttt    923

Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe

        275     280     285

ttg agc acc tta act ata gat ggt gta acc cgg agt gac caa gga ttg    971

Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu

        290     295     300

tac acc tgt gca gca tcc agt ggg ctg atg acc aag aag aac agc aca    1019

Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr

        305     310     315     320

ttt gtc agg gtc cat gaa aaa cct ttt gtt gct ttt gga agt ggc atg    1067

Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met

        325     330     335

gaa tct ctg gtg gaa gcc acg gtg ggg gag cgt gtc aga atc cct gcg    1115

Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala

        340     345     350

aag tac ctt ggt tac cca ccc cca gaa ata aaa tgg tat aaa aat gga    1163

Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly

        355     360     365

ata ccc ctt gag tcc aat cac aca att aaa gcg ggg cat gta ctg acg    1211

Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr

        370     375     380

att atg gaa gtg agt gaa aga gac aca gga aat tac act gtc atc ctt    1259

Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu

        385     390     395     400

acc aat ccc att tca aag gag aag cag agc cat gtg gtc tct ctg gtt    1307

Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val

        405     410     415

gtg tat gtc cca ccc cag att ggt gag aaa tct cta atc tct cct gtg    1355

Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val

        420     425     430

gat tcc tac cag tac ggc acc act caa acg ctg aca tgt acg gtc tat    1403

Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr

        435     440     445

gcc att cct ccc ccg cat cac atc cac tgg tat tgg cag ttg gag gaa    1451

Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu

        450     455     460

gag tgc gcc aac gag ccc agc cat gct gtc tca gtg aca aac cca tac    1499

Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser His Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr

        465     470     475     480

cct tgt gaa gaa tgg aga agt gtg gag gac ttc cag gga gga aat aaa    1547

Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys

        485     490     495

att gaa gtt aat aaa aat caa ttt gct cta att gaa gga aaa aac aaa    1595

Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys

        500     505     510

act gta agt acc ctt gtt atc caa gcg gca aat gtg tcea gct ttg tac 1643

Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr

        515     520     525

aaa tgt gaa gcg gtc aac aaa gtc ggg aga gga gag agg gtg atc tcc    1691

Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser

        530     535     540

ttc cac gtg acc agg ggt cct gaa att act ttg caa cct gac atg cag    1739

Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln

        545     550     555     560

ccc act gag cag gag agc gtg tct ttg tgg tgc act gca gac aga tct    1787

Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser

        565     570     575

acg ttt gag aac ctc aca tgg tac aag ctt ggc cca cag cct ctg cca    1835

Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro

        580     585     590

atc cat gtg gga gag ttg ccc aca cct gtt tgc aag aac ttg gat act    1883

Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr

        595     600     605

ctt tgg aaa ttg aat gcc acc atg ttc tct aat agc aca aat gac att    1931

Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile

        610     615     620

ttg atc atg gag ctt aag aat gca tcc ttg cag gac caa gga gac tat    1979

Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr

        625     630     635     640

gtc tgc ctt gct caa gac agg aag acc aag aaa aga cat tgc gtg gtc    2027

Val Cys Leu Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val

        645     650     655

agg cag ctc aca gtc cta gag cgt gtg gca ccc acg atc aca gga aac    2075

Arg Gln Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr Gly Asn

        660     665     670

ctg gaa aat cag acg aca agt att ggg gaa agc atc gaa gtc tca tgc    2123

Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys

        675     680     685

acg gca tct ggg aat ccc cct cca cag atc atg tgg tat aaa gat aat    2171

Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn

        690     695     700

gag acc ctt gta gaa gac tca ggc att gta ttg aag gat ggg aac cgg    2219

Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg

        705     710     715     720

aac ctc act atc cgc aga gtg agg aag gag gac gaa ggc ctc tac acc    2267

Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr

        725     730     735

tgc cag gca tgc agt gtt ctt ggc tgt gca aaa gtg gag gca ttt ttc    2315

Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe

        740     745     750

ata ata gaa ggt gcc cag gaa aag acg aac ttg gaa     2351

Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu

        755     760

<210>85

<211>764

<212>PRT

<213>人

<400>85

Met Gln Ser Lys Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Leu Cys Val Glu

        5       10      15

Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro

        20      25      30

Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr

        35      40      45

Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro

        50      55      60

Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser

        65      70      75      80

Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn

        85      90      95

Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser

        100     105     110

Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser

        115     120     125

Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys

        130     135     140

Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser

        145     150     155 160

Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg

        165     170     175

Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile

        180     185     190

Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser

        195     200     205

Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr

        210     215     220

Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu

        225     230     235     240

Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile

        245     250     255

Asp Phe Asn Trp Glu Thr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu

        260     265     270

Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe

        275     280     285

Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu

        290     295     300

Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr

        305     310     315 320

Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met

        325     330     335

Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala

        340     345     350

Lys Try Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Tyr Tyr Lys Asn Gly

        355     360     365

Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr

        370     375     380

Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu

        385     390     395     400

Thr Am Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val

        405     410     415

Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val

        420     425     430

Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr

        435     440     445

Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu

        450     455         460

Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser His Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr

        465     470     475     480

Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys

        485     490     495

Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Ieu Ile Glu Gly Lys Asn Lys

        500     505     510

Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr

        515     520     525

Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser

        530     535     540

Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln

        545     550     555     560

Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser

        565     570     575

Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro

        580     585     590

Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr

        595     600     605

Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile

        610     615     620

Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr

        625     630     635     640

Val Cys Leu Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val

        645     650     655

Arg Gln Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr Gly Asn

        660     665     670

Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys

        675     680     685

Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn

        690     695     700

Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg

        705     710     715     720

Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr

        725     730     735

Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe

        740     745     750

Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu

        755     760