一种适合于普通小球藻高密度高品质培养的培养基组合物

摘要

本发明涉及一种适用于普通小球藻高密度高品质培养的培养基组合物，所述培养基基本上由KNO37～11克/升、葡萄糖25～35克/升以及少量无机盐、微量元素和水组成。本发明的培养基可使普通小球藻达到高密度培养的前提下，藻体品质与异养培养相比有较大幅度提高，培养结束时达到光自养培养时的水平。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种适合用于普通小球藻高密度高品质培养的培养基组合物和高密度高品质培养普通小球藻的方法。

背景技术

人们对小球藻的研究历史较长，其中普通小球藻(Chlorella vulgaris)是研究的较多的一个藻种，也是目前商业化生产普遍采用的藻种之一。

目前，小球藻常用的培养方式有两种：开放式户外大池光自养培养和发酵罐异养培养。开放式户外大池培养是目前商业化大规模生产常用的方法，虽然其成本低，但由于细胞密度低、易污染、占地面积大等缺点，使其发展受到很大限制。异养培养目前基本上处于实验室研发阶段，其虽可较大幅度地提高藻细胞密度，但获得的藻体与光自养培养相比其蛋白质和色素的含量明显下降，即品质降低，不具有光自养培养的普通小球藻的应用价值。Atev.A(1981)异养培养普通小球藻A2(Chlorella vulgaris A2)时发现胞内叶绿素、蛋白质、类胡萝卜素、尼克酸的含量均比光自养生长时要低，胞内氨基酸除赖氨酸和酪氨酸含量高于光自养生长，其它氨基酸含量均低于光自养培养(Atev A.，Manova A.Heterotrophic cultivation of Chlorella vulgaris A2.Dokl.Bolg.Akad.Nauk，(English)1981，34(5)：687～690)。张大兵等(1996)发现从自养模式转化为异养模式时蛋白核小球藻(Chlorella prototuecoides)细胞内叶绿素消失，总蛋白含量减少，仅为光自养培养的1/5(张大兵，吴庆余.小球藻细胞的异养转化.植物生理学通报，1996，32(2)：140～144)。James.C.Ogbonna等(1997)异养培养蛋白核小球藻C-212(Chlorella pyrenoidosa C-212)也证实了类似的实验结果(Ogbonna J.C.，Masui.H.，Tanaka.H.Sequential heterotrophic/autotrophic cultivation-an efficient method ofproducing Chlorella biomass for health food and animal feed.J.Appl.Phycol.1997，9，359～366.)。潘欣等(2002)异养培养椭圆小球藻，也发现蛋白含量减少(潘欣，李建宏，戴传超，等.小球藻异养培养的研究.食品科学，2002，23(4)：28～33)。由上可见，对于小球藻属中常用的三个种(即普通小球藻、蛋白核小球藻、椭圆小球藻)在异养培养时均存在品质下降问题。因此，在实现高密度培养时如何保持其高品质，是小球藻培养技术中一个亟待解决的重要问题。

James.C.Ogbonna等(1997)采用Endo培养基异养-光自养串联培养蛋白核小球藻C-212(Chlorella pyrenoidosa C-212)可使藻体蛋白质和叶绿素含量得到较大幅度的提高(Ogbonna J.C.，Masui.H.，Tanaka.H.Sequential heterotrophic：autotrophiccultivation-an efficient method ofproducing Chlorella biomass for health food and animalfeed.J.Appl.Phycol.1997，9，359～366.)。有关普通小球藻的异养-光自养串联培养文献中未见报道，因此要开展这方面的研究首先必须解决培养基问题。

本发明首先采用文献中报道的蛋白核小球藻异养-光自养串联培养的Endo培养基异养-光自养串联培养普通小球藻，发现该培养基不适合普通小球藻生长及藻体蛋白质和叶绿素的累积；然后采用添加了葡萄糖的普通小球藻常用的Sorokin-Krauss培养基(以下简称SK培养基)(1958)异养-光自养串联培养普通小球藻，发现藻体蛋白质和叶绿素含量并没有明显的提高。这说明利用Endo培养基及添加了葡萄糖的SK培养基均不能实现该藻的高密度高品质培养，因此，有必要解决普通小球藻高密度高品质培养的培养基问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于普通小球藻高密度高品质培养的培养基组合物。该培养基可使普通小球藻达到高密度培养的前提下，藻体品质与异养培养相比有较大幅度提高，培养结束时达到光自养培养时的水平。

为实现上述目的，本发明提供了一种用于培养普通小球藻的培养基组合物，所述培养基基本上由KNO₃、葡萄糖以及少量无机盐、微量元素和水组成。

在一个较佳的实施方案中，所述微量元素选自H₃BO₃，ZnSO₄·7H₂O，MnCl₂·H₂O，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，CuSO₄·5H₂O，Co(NO₃)₂·6H₂O中的一种或多种。

在一个特别佳的实施方案中，所述培养基基本上由以下成分组成或由以下成分组成：KNO₃7～11克/升、葡萄糖25～35克/升、KH₂PO₄0.6～0.8克/升、Na₂HPO₄·12H₂O1.7～2.0克/升、MgSO₄·7H₂O 0.6～0.8克/升、CaCl₂0.1～0.2克/升、FeSO₄·7H₂O 0.01～0.03克/升；微量元素0.5～2ml，其中微量元素的组成为H₃BO₃ 11～12克/升，ZnSO₄·7H₂O 8.5～9.5克/升，MnCl₂·H₂O 1.4～1.5克/升，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.8～0.9克/升，CuSO₄·5H₂O 1.5～1.6克/升，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.45～0.55克/升；水1000ml。

本发明另一方面涉及上述培养基组合物在用于培养普通小球藻中的用途。

本发明另一方面涉及一种培养普通小球藻的方法，该方法采用异养-光自养串联培养普通小球藻，其特征在于，所述方法采用了本发明所述的培养基组合物。

本发明另一方面涉及一种用上述方法获得的普通小球藻培养物。

本发明另一方面涉及一种含有上述方法获得的普通小球藻培养物的组合物，如保健食品或饲料添加剂等。

本发明还有一个方面涉及用上述方法获得的普通小球藻培养物在制备保健食品或饲料添加剂中的用途。

用本发明公开的培养基组合物来异养-光自养串联培养普通小球藻，一方面可使普通小球藻在较短的培养周期里细胞密度达到高密度培养的水平，另一个更重要的方面在于其可使普通小球藻的品质与异养培养相比有较大幅度提高，达到了光自养培养时的水平，从而实现了普通小球藻高密度高品质的培养。

附图简述

图1显示了用不同的培养基通过异养-光自养串联培养普通小球藻所得到的结果，其中实心标记表示用本发明的培养基进行培养后获得的结果，空心标记表示用作为对照的经略加调整的SK培养基进行培养后获得的结果。

图2显示了用作为对照的Endo培养基进行异养-光自养串联培养普通小球藻所得到的结果。

图3显示了以不同的碳氮比异养-光自养串联培养普通小球藻时的细胞干重。

图4显示了在不同的碳氮比下异养-光自养串联培养普通小球藻时的叶绿素含量和蛋白质含量。

图5显示在5L生物反应器/1L开放式平板光生物反应器串联系统中进行培养的结果。

具体实施方案

采用文献中报道的蛋白核小球藻异养-光自养串联培养的Endo培养基和略加调整后的SK培养基(主要考虑到原始的SK培养基为光自养培养基，不便于普通小球藻异养培养阶段的生长)异养-光自养串联培养普通小球藻，结果发现在Endo培养基中藻细胞密度较低，蛋白质和叶绿素含量也较低，而在SK培养基中藻细胞生长虽较快，但培养结束时的藻体蛋白质和叶绿素含量与异养培养相比并无明显提高。这说明Endo培养基和原始的SK培养基均不适合于以高密度高品质为目的的普通小球藻异养-光自养串联培养。

本发明者以SK培养基为基础，通过在其中添加Na₂HPO₄·12H₂O、改变其中碳氮比(C/N)、选择特定的碳源和氮源、以及调整培养基中其它营养成分的浓度，获得了适用于普通小球藻异养-光自养串联培养的培养基，使用该培养基可实现普通小球藻的高密度高品质培养。

在本文中，所述藻体的品质指标为单位藻体蛋白质和叶绿素含量。所述藻体的生物量指标为单位培养液中藻体干重。本领域技术人员能够采用常规技术对所述单位藻体蛋白质、叶绿素含量和进行测定。具体而言，蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法(宁正祥.食品成分分析手册[M].北京：中国轻工业出版社，1998，76～78.)。叶绿素含量测定采用甲醇提取比色法(Ogbonna J.C.，Masui.H.，Tanaka.H.Sequential heterotrophic：autotrophic cultivation-an efficient method ofproducing Chlorella biomass for health foodand animal feed.J.Appl.Phycol.1997，9，359～366.)。藻体干重测量时取培养过程中某一时刻的培养液V(ml)，7200r/min离心10min，将离心后的藻体用去离子水洗涤3次，转移至称量瓶(W1(g))中在80℃烘箱中烘干至恒重W2(g)。藻体干重C_X可根据下式计算：C_X(g/L)＝(W2-W1)/V/1000。

本发明首先提供了一种用于培养普通小球藻的培养基组合物，所述培养基基本上由KNO₃、葡萄糖以及少量无机盐、微量元素和水组成。在所述技术方案中，所述微量元素宜选自H₃BO₃，ZnSO₄·7H₂O，MnCl₂·H₂O，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，CuSO₄·5H₂O，Co(NO₃)₂·6H₂O中的一种或多种或全部。

本文所用的术语“基本上由……组成”表示本发明的组合物中除了含有主要组分KNO₃、葡萄糖以及少量无机盐、微量元素和水外，还可包含一些对于组合物的基本特性或新的特性(即可维持普通小球藻在较短的培养周期里细胞密度达到高密度培养的水平，同时叶绿素和蛋白质水平与常规异养培养相比有较大幅度提高)没有实质上影响的组分。本文所用的术语“由……组成”表示本发明的组合物由所指出的具体组分组成，没有其他组分，但是可以带有含量在通常范围内的杂质。

在该培养基中，培养基的各组分可在一定范围内变化而不会对普通小球藻细胞密度和品质有很大影响。因此，这些组分的用量不应受实施例的严格限制。如本领域技术人员所熟知的，培养基中还应加入少量无机盐，例如硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁和磷酸盐等，以及少量微量元素如Mn、Zn、B、I、M、Cu、Co等。在本发明中，较佳的微量元素组分宜选自H₃BO₃，ZnSO₄·7H₂O，MnCl₂·H₂O，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，CuSO₄·5H₂O，Co(NO₃)₂·6H₂O中的一种或多种。无机盐和微量元素的用量可根据常规知识确定。

作为氮源的KNO₃的范围为7.0～11.0克/升，作为碳源和能源的葡萄糖可在25～35克/升之间。具体而言，KNO₃的浓度可为7-10克/升，7-9克/升或大约8克/升。葡萄糖的浓度可为26-34克/升、27-33克/升、28-32克/升、29-31克/升或大约30克/升。KH₂PO₄的浓度可为0.65-0.75克/升或大约0.7克/升。Na₂HPO₄·12H₂O的浓度可为1.75-1.95克/升、1.8-1.9克/升、1.83-1.85克/升或大约1.84克/升。MgSO₄·7H₂O的浓度可为0.65-0.75克/升或大约0.7克/升。CaCl₂的浓度可为0.13-0.18克/升，0.14-0.15克/升，或大约0.142克/升。FeSO₄·7H₂O的浓度可为0.015-0.025克/升或大约0.02克/升。

对于微量元素，一个较佳的实施方案是在培养基组合物中加入0.5～2ml具有以下组成的微量元素母液：H₃BO₃ 11～12克/升，ZnSO₄·7H₂O 8.5～9.5克/升，MnCl₂·H₂O1.4～1.5克/升，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.8～0.9克/升，CuSO₄·5H₂O 1.5～1.6g，Co(NO₃)₂·6H₂O0.45～0.55克/升。该微量元素母液可在配制本发明培养基组合物之前预先配制。微量元素母液的加入量可以为0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8和2毫升。

在一个尤其佳的实施方案中，本发明的培养基组合物宜由以下成分组成：KNO₃7～11克/升、葡萄糖25～35克/升、KH₂PO₄ 0.6～0.8克/升、Na₂HPO₄·12H₂O 1.7～2.0克/升、MgSO₄·7H₂O 0.6～0.8克/升、CaCl₂ 0.1～0.2克/升、FeSO₄·7H₂O 0.01～0.03克/升；微量元素0.5～2ml，其中微量元素的组成为H₃BO₃ 11～12克/升，ZnSO₄·7H₂O8.5～9.5克/升，MnCl₂·H₂O 1.4～1.5克/升，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.8～0.9克/升，CuSO₄5H₂O1.5～1.6克/升，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.45～0.55克/升；水1000ml。

在配制成培养基组合物后，根据需要调节所述培养基的pH，例如调节为6.0～7.0(较佳为6.2-6.5)，并在115-120℃下灭菌15～20分钟。

本发明另一方面涉及一种培养普通小球藻的方法，该方法采用异养-光自养串联培养普通小球藻，所述方法采用上述培养基组合物。

普通小球藻的异养-光自养串联培养在摇瓶或生物反应器中进行。在摇瓶或生物反应器中进行异养培养，待培养液中有机碳源葡萄糖消耗完后，将其转入可光照的摇瓶或平板式光生物反应器中进行光自养培养。培养过程中采用不同的培养基或培养容器进行培养时，由于普通小球藻在不同的培养基或培养容器中生长速率存在差异性导致培养液中有机碳源葡萄糖消耗完的时间长短不一致，因此转入光自养培养的具体时间也不一致。在一个较佳的实施方案中，异养培养条件为接种量8-12％(较佳为10％)，温度为28-32℃(较佳为29-31℃，更佳为30℃)；光自养培养条件为：温度为28-32℃(较佳为29-31℃，更佳为30℃)，外部光强7-10klx(较佳为8klx)。

因此，本发明另一方面还涉及将本发明的培养基组合物用于培养普通小球藻中的用途。

用本发明的方法不仅能够使普通小球藻在较短的培养周期里细胞密度达到高密度培养的水平，另一个更重要的方面在于其可使普通小球藻的品质与异养培养相比有较大幅度提高，达到了光自养培养时的水平，从而实现了普通小球藻高密度高品质的培养。因此，本发明获得的普通小球藻培养物能够用于制备保健食品、饲料添加剂等诸多应用。

以下将通过实施例对本发明的有关内容作进一步的说明。除非另有所述，培养基中各组分含量均用克/升(g/l)表示。本发明所采用的普通小球藻购自中科院武汉水生生物研究所。

实施例1

在250ml摇瓶中加入100ml如下所示的培养基，接种浓度为0.62g/L，异养培养(装液量100mL，温度30℃，摇床转速150r/min)48小时，结果测得细胞密度()最大为13.17g/L，随后进行光自养培养(外部光强8klx)，培养结束时(96h)藻体蛋白质()和叶绿素()含量达到最高，分别为49.75％和30.17mg/gDcw(见图1)。

KNO₃：9.25            葡萄糖：30

KH₂PO₄：0.7         Na₂HPO₄·12H₂O：1.84

MgSO₄·7H₂O：0.7   CaCl₂：0.142

FeSO₄·7H₂O：0.02

微量元素：1ml；微量元素配方(g/L)：H₃BO₃ 11.42       ZnSO₄·7H₂O 8.82

                                  MnCl₂·H₂O 1.42  (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.8707

                                  CuSO₄·5H₂O 1.57 Co(NO₃)₂·6H₂O 0.49

水：1000ml

采用与实施例1相同的方法，采用如下所示Endo培养基培养普通小球藻，最大细胞密度()仅为4.68g/L，经过光照培养后藻体蛋白质(○)和叶绿素()含量与异养培养相比无明显变化，仅分别为23.34％和12.35mg/gDcw(细胞干重)(见图2)。

葡萄糖：28g/L            尿素：4.8g/L

KH₂PO₄：1.2g/L        MgSO₄.7H₂O：1.2g/L

CaCl₂0.08g/L           柠檬酸三钠：0.2g/L

Fe-EDTA溶液：0.64mL      A5溶液：3.2mL

其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO₄·7H₂O25g/L和EDTA33.5g/L；A5溶液配方：H₃BO₃ 2.86g/L，MnCl₂.4H₂O 1.81g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.222g/L，CuSO₄·5H₂O 0.07g/L，Na₂MoO₄ 0.021g/L。

采用与实施例1相同的方法，采用如下所示的略加调整后的SK培养基培养普通小球藻，培养60小时细胞密度()达到最高仅为5.61g/L，经过36h光照培养后藻体蛋白质(○)和叶绿素()含量分别仅为29.30％和17.88mg/gDcw。(见图1)。

KNO₃：2               葡萄糖：15

KH₂PO₄：1.25

MgSO₄·7H₂O：1.0   CaCl₂：0.083

FeSO₄·7H₂O：0.049

微量元素：1ml微量元素配方(g/L)：H₃BO₃ 11.42       ZnSO₄·7H₂O 8.82

                                MnCl₂·H₂O 1.42  (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.8707

                                CuSO₄·5H₂O 1.57 Co(NO₃)₂·6H₂O 0.49

水：1000ml

根据上述结果可以得知，通过单单改变异养-光自养串联培养所用的培养基，可以使普通小球藻的细胞密度、蛋白质和叶绿素含量均达到较高的水平。

实施例2

在250ml摇瓶中加入100ml如下所示的培养基，其中KNO₃的初始浓度分别为3，5，7，9，11g/L，接种浓度为0.60g/L，培养82小时(其中异养培养45小时，其中装液量100mL，温度30℃，摇床转速150r/min；光自养培养37小时，外部光强8klx)。结果测得KNO₃7～9g/L时(以C/N比计算为10.20～13.12)细胞密度最大为12.0g/L左右(见图3)，藻体蛋白质和叶绿素含量也达到最高，分别在50.0％和32.0mg/gDcw左右(见图4)。

KNO₃：3、5、7、9、11  葡萄糖：30

KH₂PO₄：0.7         Na₂HPO₄·12H₂O：1.84

MgSO₄·7H₂O：0.7   CaCl₂：0.142

FeSO₄·7H₂O：0.02

微量元素：1ml

微量元素配方(g/L)：H₃BO₃ 11.42          ZnSO₄·7H₂O 8.82

                   MnCl₂·H₂O 1.42     (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.8707

                   CuSO₄·5H₂O 1.57    Co(NO₃)₂·6H₂O 0.49

水：1000ml

实施例3

在5L生物反应器/1L开放式平板光生物反应器串联系统中加入如下所示的培养基，装液量75％，接种浓度为0.60g/L，培养65小时(其中5L生物反应器中培养34小时，1L开放式平板光生物反应器中培养31小时)。结果测得培养34小时时细胞密度()达到最大为15.36g/L，培养65小时时藻体蛋白质(○)和叶绿素()含量分别达到最高，分别为54.78％和31.23mg/gDcw(见图5)。

KNO3：9.25         葡萄糖：30

KH₂PO₄：0.7      Na₂HPO₄·12H₂O：1.84

MgSO₄·7H₂O：0.7CaCl₂：0.142

FeSO₄·7H₂O：0.02

微量元素：1ml

微量元素配方(g/L)：H₃BO₃11.42        ZnSO₄·7H₂O 8.82

                   MnCl₂·H₂O 1.42  (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.8707

                   CuSO₄·5H₂O 1.57 Co(NO₃)₂·6H₂O 0.49

水：1000ml

尽管上面已经描述了本发明的具体例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。