借助通过fac配位作用高效标记M(OH2)3 (CO)3+而用于偶联生物分子的Nε和/或Nα衍生化的、金属和有机保护的L－组氨酸

摘要

本发明涉及新颖的组氨酸衍生物，它可用于标记具有放射性三羰基金属的生物分子。该新的衍生物具有下述组氨酸，所述组氨酸：在Nε上被衍生化，至少在Nα和任选在Nδ上被保护；或在Nα上被衍生化，至少在Nα和任选在Nδ上被保护；或在Nε和Nα上被衍生化，至少在Nα和任选在Nδ上被保护；或在Nε上被衍生化；或在Nα上被衍生化；或在Nε和Nα上被衍生化；或者至少在Nα和任选在Nδ上被保护。

说明书

本发明涉及新颖的组氨酸衍生物，它借助通过fac配位作用标记放射性三羰基金属化物[M(OH₂)₃(CO)₃]⁺，可以与生物分子例如氨基酸、肽等偶联。

利用^99mTc标记生物活性分子对于实现放射性药物而言，属于研究密集型领域。用于放射成像的市售灌注剂必须用被标记的载体补充，这些被标记的载体使得灌注剂能够更加精确地靶向定位于高度表达在癌细胞中的各种不同受体。到目前为止，仅有少数几个化合物进入临床前试验阶段，但是迄今没有发现一个化合物可以在商业上应用。

为此，必须解决诸多化学和生物方面的难题。在化学方面，这种靶载体必须i)用适当的^99mTc螯合剂或者其它放射性核素衍生化，ii)在具有高度比活性(低载体浓度)时可以被标记，并且最后保留有其理化特性以及对相应受体的亲和力。对于一般应用而言，所述标记方法必须可以优先在一步内完成。

根据相关现有文献可以获得很多种不同的步骤，具体针对肽类而言，hynic方法是值得推荐的，但是这种方法在目前尚还缺乏临床许可所需要的具有清楚定义的化合物。

本发明人最近提出了有机金属水合离子[^99mTc(OH₂)₃(CO)₃]⁺的一锅合成方法(Alberto等人，J.Am.Chem.Soc.2001，123，3135)，同时还认为这种络合物片段可以通用于标记各种各样的生物分子尤其是肽。

羰基方法的最大优势在于可以有效利用仅仅取决于配体类型的具有极高比活性的定义明确的络合物。天然存在的二齿配体例如肽链中的N-末端组氨酸可以有效地用[^99mTc(OH₂)₃(CO)₃]⁺标记。在比活性方面，其改进在于通过α-氨基酸引入了末端组氨酸，这使得可以在低配体浓度下进行标记。

然而，这种类型的双功能螯合剂具有相对较高的亲油性，因此其合成是比较困难的。

因此，本发明目的在于提供一种被不同程度地衍生化的组氨酸，这样可以使得通过最少的合成步骤将其引入至任意肽中，而同时具有最高的标记效能。

本发明人预期认为，由于络合物[^99mTc(his)(CO)₃]具有亲油性，因而适合将组氨酸在咪唑环的ε-氮上进行衍生化。进行上述官能化后得到不受影响的具有高度效能的三脚架状配位点，但是同时仍然可以与生物分子中的胺或羧酸偶联。最后，由于[^99mTc(his)(CO)₃]的合成可以由[^99mTcO₄]^-出发一步完成，因而组氨酸还满足了一锅标记法的要求，同时也不对配体产生影响。

因此，本发明涉及组氨酸衍生物，它含有任意一种下述的组氨酸：

a)在N^ε上被衍生化，至少在N^α和任选在N^δ上被保护的；或

b)在N^α上被衍生化，至少在N^α和任选在N^δ上被保护的；或

c)在N^ε和N^α上被衍生化，至少在N^α和任选在N^δ上被保护的；或

d)在N^ε上被衍生化的；或

e)在N^α上被衍生化的；或

f)在N^ε和N^α上被衍生化的；或者

g)至少在N^α和任选在N^δ上被保护的。

所述N^ε和/或N^α用-(CH₂)_n-R衍生化，其中n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选为1、2、3、4或5，R是选自下述的基团：-NH₂、-COOR₁、-OH、-X或-X’-生物分子，其中X’是具有由COOH与NH₂、NH₂与COOH、OH与Ph-OH、或者X与生物分子上的亲电子官能团，特别是S、OH或胺之间发生反应得到的键的偶联部分(coupling block)，其中Ph是生物分子上的磷酸基团，例如磷酸化肽或糖基磷酸酯，其中R₁是H、叔丁基或五氟苯基。X适宜选自卤化物、叠氮化物、拟卤化物、磷酸盐(phosphate)、硫醇、甲硅烷基。

N^ε和N^α之一或两者均可以被生物分子衍生化。它可以是任意的生物分子，尤其是多肽，例如抗体、肽类、氨基酸、糖类、维生素。生物分子的适宜实例是铃蟾素(bombesine)、(α)-MSH肽，例如黑质皮素、octreotate、生长抑素、白细胞介素-8(IL8)、CCK、(β)-发夹环肽、神经降压素、生物素、单克隆抗体，例如定向抗前列腺膜特异性抗原(pmsa)的单克隆抗体。

生物分子可以直接与N^ε和/或N^α偶联，或者N^ε和/或N^α也可以先用式-(CH₂)_n-R的基团衍生化，其中R定义同上。

N^α和N^δ可以用羰基保护，从而形成六员脲环。或者，N^α、N^δ和羧基用三羰基金属保护。

当用-(CH₂)_n-R进行衍生化时，上述两种保护形式尤其有利。在接下来当该基团进一步用生物分子衍生化时，最初的保护可以通过用胺保护基团尤其是Fmoc、Cbz、BOC、Teoc、甲氧羰基、乙氧羰基保护N^α，以及通过酯化保护羧基来替代。

在完成所有的衍生化步骤之后，可以将所得到的组氨酸衍生物脱保护，然后与放射性标记的三羰基金属配位得到标记的生物分子。

放射性标记的三羰基金属合适地选自[^99mTc(OH₂)₃(CO)₃]⁺、[¹⁸⁸Re(OH₂)₃(CO)₃]⁺和[⁹⁷Ru(OH₂)₃(CO)₃]²⁺。

根据本发明另一方面，据发现当N^ε上的-(CH₂)_n-R被衍生为-(CH₂)_n-COO-五氟苯基酯时，非常容易进行生物分子的偶联。上述衍生化导致N^ε上的COOH被活化，从而使得当生物分子自身具有可能竞争偶联的游离羧酸时，可以与生物分子直接结合而不必经过任何修饰。在上述情形中，N^α和羧酸部分被保护。

具体地说，本发明涉及具有下述结构式之一的组氨酸衍生物

    

                        R＝NH₂，COOR₁，OH，X，    R＝NH₂，COOR₁，OH，X，X-生物分子

R₂＝H，甲基

                            X′-生物分子                 R₁＝H，叔丁基，Pfp

                        R₁＝H，叔丁基                 R₂＝H，甲基

                        R₂＝H，甲基                   P＝H，Fmoc，Cbz，BOC，Teoc，

                                                             甲氧羰基，乙氧羰基

        

                                R＝H，COOR₁

R＝H，COOR₁

                                R₁＝H，叔丁基             R＝NH₂，COOR₁，OH，X

R₁＝H，叔丁基

                                R₂＝H，甲基               R₁＝H，叔丁基

R₂＝H，甲基

                                P＝H，Fmoc                 R₂＝H，甲基

      

      R＝H，COOR₁                   R＝H,COOR₁

      R₁＝H，叔丁基                  R₁＝H,叔丁基

                                                                          M＝Re，^99mTc，Ru

      R₂＝H，甲基                    P＝H，Fmoc                      R＝NH₂，COOH，OH，X

      P＝H，Fmoc

           

          M＝Re，^99mTc，Ru                                 R₂＝H，甲基

          BM＝生物分子                                           P＝H，Fmoc，Cbz，Teoc

      

                                  R₂＝H，甲基                      R₂＝H，甲基

    M＝Re，^99mTc              BM＝生物分子                         BM＝生物分子

         

                                                        R₂＝H，甲基

     M＝Re，^99mTc                                   P＝H，Fmoc

     BM＝生物分子                                       BM＝生物分子

      

              R₂＝H，甲基                                    R₂＝H，甲基

              P＝H，Fmoc                                      P＝H，Fmoc

              BM＝生物分子

本发明另一方面涉及与上述组氨酸衍生物偶联的生物分子。所述组氨酸可以在生物分子的末端或者内部。或者，N^ε和N^α均可以被生物分子衍生化得到二聚体或者双功能分子。双功能分子的实例是这样的分子，在该生物分子的一侧具有靶向定位功能，例如抗体或者受体的配体，同时该生物分子的另一侧用于毒性反应。其它的组合也属于本发明的一部分。这种双功能分子可用于例如肿瘤的靶向治疗。对肿瘤的靶向定位可以将毒性分子和放射性金属携带至需要治疗的肿瘤周围区域。

适宜的生物分子是铃蟾素(bombesine)、(α)-MSH肽，例如黑质皮素、octreotate、生长抑素、白细胞介素-8(IL8)、CCK、(β)-发夹环肽、神经降压素、生物素、单克隆抗体，例如定向抗前列腺膜特异性抗原(pmsa)的单克隆抗体。

在获得本发明的研究过程中，发现有两种不同的途径可以在N^α、N^δ和-COO保护的组氨酸中的N^ε位上引入乙酰基，从而得到模型化合物N^ε-(CH₂COOH)-组氨酸衍生物9。本发明的化合物例如组氨酸衍生物9可以与生物活性分子例如肽中的氨基偶联。在将上述生物结合完全脱保护之后，组氨酸得到三个配位点，它们可以在平面几何上有效地与[^99mTc(OH₂)₃(CO)₃]⁺或[Re(OH₂)₃(CO)₃]⁺[⁹⁷Ru(OH₂)₃(CO)₃]²⁺配位。

因此，本发明还提供了一种制备本发明的组氨酸衍生物的方法，它包括：

a)提供组氨酸；

b)至少保护N^α和任选的羧基以及N^δ；

c)至少衍生化N^ε和N^α中的一个；和

d)将保护基脱保护。

上述方法可以进一步包括步骤e)标记脱保护后的化合物得到标记化合物。

在上述方法中，N^α和N^δ可以用羰基保护从而形成六员脲环，或者羧基、N^α和N^δ可以与金属尤其是三羰基金属配位。

N^ε和/或N^α的衍生化可以借助-(CH₂)_n-R实现，其中n＝O、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选为1、2、3、4或5，R是选自下述的基团：-NH₂、-COOR₁、-OH、-X或-X’-生物分子，其中X’是具有由COOH与NH₂、NH₂与COOH、OH与Ph-OH、或者X与生物分子上的亲电子官能团，特别是S、OH或胺之间发生反应得到的键的偶联部分，其中Ph是生物分子上的磷酸基团，例如磷酸化肽或糖基磷酸酯，其中R₁是H、叔丁基。或者，N^ε和/或N^α可以直接用生物分子衍生化。

当通过借助脲环完成保护以及在N^a上进行-(CH₂)_n-R衍生化后，可以在引入生物分子之前将环打开。在这种情形下，羧基通过酯化反应保护，N^α用胺保护基团例如Fmoc、Cbz、BOC、Teoc、丁氧羰基、或者乙氧羰基保护。

为了方便衍生化，可以首先将N^ε上的-(CH₂)_n-R衍生化为-(CH₂)_n-COO-五氟苯基酯。

如果上述方法包括标记衍生物的步骤的话，那么适宜用放射性标记的三羰基金属进行标记，尤其是选自[^99mTc(OH₂)₃(CO)₃]⁺、[¹⁸⁸Re(OH₂)₃(CO)₃]⁺和[⁹⁷Ru(OH₂)₃(CO)₃]²⁺的放射性标记的三羰基金属。

因此，通过同时用羰基保护N^α和N^δ形成六员脲，这样可以方便地实现N^ε位上的选择性衍生化。环状脲环用Fm-OH打开后，将苯基丙氨酸作为模型与9通过其伯胺偶联，一步除去所有的保护基团得到苯基丙氨酸的组氨酸衍生物，它可以用^99mTc在10^-5M下标记，并且收率相当高，甚至在10^-6M下收率达到大约50％。在与[Re(CO)₃]⁺的络合物的x-射线结构中发现苯胺与9偶联进一步证实了组氨酸的平面结构。

如下述方案所示的第二途径直接将[Re(CO)₃]⁺基团用作保护基团。

这是一个非常少见的实例，其中金属片段被用作有机官能团的保护基。

组氨酸配位作用在一步中保护了N^α、N^δ和-COO，然后用BrCH₂COOH(R)在N^ε上进行烷基化，与苯基丙氨酸偶联，将[Re(CO)₃]⁺氧化脱保护为[ReO₄]^-，得到相应的生物结合物，其中组氨酸通过N^ε上的乙酰胺与苯基丙氨酸进行偶联。

两种方法都可以方便地将组氨酸引入至生物分子中，同时仍然保留了三个配位点。上述方法适用于任意具有侧链胺(pendant amines)的生物分子，这使得可以开发出新的放射性药物或者逆转肽。

因此，当组氨酸与目标分子通过咪唑环上的N^ε相连时，可以在μM浓度水平用[^99mTc(OH₂)₃(CO)₃]⁺高收率地标记生物分子。已经探索出两种制备这类衍生物的简便方法，一种方法使用[Re(CO)₃]⁺核心作为组氨酸中三个官能团的有机金属保护基团。该关键化合物可以与生物分子中的任何氨基偶联，并且可以在水中由[^99mTcO₄]^-一步标记，从而可以进一步开发出新的放射性药物。

衍生化方法的选择取决于待偶联的生物分子。脲环的打开要求酸性pH以及还原条件，而它通常又是在生物分子偶联之前完成的。这种方法适合那些能够耐受上述条件的生物分子，例如维生素。或者，可以将多肽与用金属羰基保护的组氨酸进行偶联。

下述实施例列举了可高效且生物稳定地标记生物分子的各种类型的组氨酸衍生物。

可以在单独的一步中保护N^α和N^δ，余下游离的N^ε供进一步衍生化。在N^α上进行衍生化也是可能的。

R₂＝H，甲基          R＝NH₂，COOR₁，OH，X

                             R₁＝H，叔丁基

                             R₂＝H，甲基

                                (分子1)

左边分子示出了其中N^α和N^δ被保护、余下N^ε供衍生化的组氨酸，其如右手分子所示。在N^ε上衍生化(例如烷基化)得到各种衍生物，它们可以通过侧链官能团(pendant functionality)与生物分子(可以是胺、羧酸酯、卤化物以及其它生物分子)偶联。这种合成类型是现有文献中已知的(R.Jain等人，J.Chem.Soc.，Dalton Trans，1994，2815)。脱保护后，得到可能通过N^α与[M(CO)₃]⁺三脚架状配位的组氨酸衍生物：

R＝NH₂，COOR₁，OH，X

R₁＝H，五氟苯酚

在脱保护之前，分子1可以与任意类型的生物分子偶合。因此R还可以是生物分子。脱保护后再次得到含有三脚架状组氨酸配体的生物分子。该配体在用^99mTc或¹⁸⁸Re标记方面具有最高效能，因而可以允许几乎在n.c.a.水平上标记生物分子。

下面是与模型肽序列偶合的三脚架状(tripodal)组氨酸实例：

                        三脚架状组氨酸

上述合成方法与生物分子标记的联合具有新颖性，并且所产生的高收率也是未曾预料到的。此外根据本发明，此时可以很容易地将具有高能量的羰基配体与生物分子进行偶联。上述类型的衍生物基本上可以与任意的生物分子偶联，同时保留其理化特性不变。按照本发明这种方式偶联的组氨酸是天然配体。

另外，本发明的组氨酸衍生物可用于逆转肽链的方向。正常的肽序列具有例如下述的结构式：

通过利用本发明的组氨酸衍生物使序列逆转，可以得到两个N-末端和二齿的组氨酸配体：

或者，可以得到具有两个C-末端和二齿的组氨酸配体的逆转序列：

组氨酸衍生物还可能包括在序列没有逆转的肽链中，例如在序列中具有二齿组氨酸配体的下述正常序列：

在该情形下，正常肽序列中可能包括二齿的、天然配体。肽链中的这种内含物(inclusion)得到了一种新颖的、目前尚未实现的标记类型。

对结构中的N^α进行修饰得到部分天然的组氨酸。在N^α或N^ε上的衍生化可以按照下述方式有选择地进行：

         

             R＝NH₂，COOR₁，OH，X

             R₁＝H，叔丁基

             R₂＝H，甲基

修饰                                   脱保护

在N^α和N^ε上的衍生化可以同时进行，引入不同的官能团(也包括生物分子)(左)后得到三官能化的组氨酸，脱保护然后得到三官能化的三脚架状组氨酸配体(右)：

        R＝NH₂，COOH，OH，X

        R₁＝NH₂，COOH，OH，X

        R₂＝H，甲基

或者，在R或R₁偶联肽序列可以使得在肽序列中含有三齿组氨酸，该肽序列可以是正常的(下)或逆转的(上)。

                          三脚架状组氨酸

                          三脚架状组氨酸

上述两种手段均还可以通过应用上述高效的强组氨酸配体来标记小分子。这可用于标记例如氨基酸或者其它小分子例如缺氧显象剂。从而使得[Tc(his-R)(CO)₃]络合物具有高度的亲水性，而这对于生物分子通常特别有利。

需要注意的是，本申请中如结构式I-XVIII所示的化合物为通式结构。下面的表1对各通式特征的组合进行了概述。

                         表1

  A  B  C  D  1  II/XIII  IX/X  III/XI  XVIII/XI  III，XI  2  IV/-  np/np  V/XVI  V，XVI  3  VI/-  np/np  VII/XVII  VII，XVII  4  I/XIV  XII/XV  -  组氨酸

1＝在N^ε上衍生化

2＝在N^α上衍生化

3＝在N^ε和N^α上衍生化

4＝未被衍生化

A＝用六员环保护

B＝用三羰基金属保护

C＝用COOH上的酯和N^α上的胺保护基团保护

D＝具有脱保护COOH和来自C栏且用于标记的N^α的通式

黑体＝不具有生物分子的通式

斜体＝具有生物分子的通式

np＝不可能的

申请人特意在本文中公开了根据n值所表达的烷基链长度以及N^α和/或N^ε上的各种取代基R的所有可能的组合。在下面的表2中列出了n和R的所有可能组合。在一些化合物中，下面所列组合中的两个的任一组合是可能的。

                          表2

  0  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  NH₂  0/NH₂  1/NH₂  2/NH₂  3/NH₂  4/NH₂  5/NH₂  6/NH₂  7/NH₂  8/NH₂  9/NH₂  10/NH₂  COOH  0/  COOH  1/  COOH  2/  COOH  3/  COOH  4/  COOH  5/  COOH  6/  COOH  7/  COOH  8/  COOH  9/  COOH  10/  COOH  OH  0/OH  1/OH  2/OH  3/OH  4/OH  5/OH  6/OH  7/OH  8/OH  9/OH  10/OH  X  0/X  1/X  2/X  3/X  4/X  5/X  6/X  7/X  8/X  9/X  10/X

当生物分子不是直接与组氨酸偶联时，而是当N^ε和/或N^α首先被衍生化时，n和R可能具有下面的组合情况。

                          表3

  0  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  NH₂  0/NH-BM  1/NH-BM  2/NH-BM  3/NH-BM  4/NH-BM  5/NH-BM  6/NH-BM  7/NH-BM  8/NH-BM  9/NH-BM  10/NH-BM  COOH  0/  CO-BM  1/  CO-BM  2/  CO-BM  3/  CO-BM  4/  CO-BM  5/  CO-BM  6/  CO-BM  7/  CO-BM  8/  CO-BM  9/  CO-BM  10/  CO-BM  OH  0/O-BM  1/O-BM  2/O-BM  3/O-BM  4/O-BM  5/O-BM  6/O-BM  7/O-BM  8/O-BM  9/O-BM  10/O-BM  X  0/X’-BM  1/X’-BM  2/X’-BM  3/X’-BM  4/X’-BM  5/X’-BM  6/X’-BM  7/X’-BM  8/X’-BM  9/X’-BM  10/X’-BM

NH-BM表示组氨酸衍生物的N^ε和/或N^α上的NH₂与生物分子上的COOH偶联。在CO-BM中，组氨酸衍生物的N^ε和/或N^α上的COOH与生物分子上的NH₂偶联。O-BM表示组氨酸衍生物的N^ε和/或N^α上的OH与生物分子上的Ph-OH或卤化物通过形成生物分子中的磷酸酯或醚联接基团偶联。X’-BM表示组氨酸衍生物的N^ε和/或N^α上的卤化物、叠氮化物、拟卤化物、磷酸酯、硫醇或甲硅烷基与生物分子上的S、OH或胺偶联。

在下面的实施例中对本发明进行进一步描述，但这并不意味着以任何方式对本发明范围构成限制。这些实施例描述了用于标记生物分子的模型体系。需要注意的是，其它生物分子例如氨基酸和肽按照相同的方式也可以进行标记。实施例部分参考了下面的附图：

图1：3的热椭圆形点图(Ortep plot)，椭圆体按照50％的概率绘制。

图2：6的热椭圆形点图，椭圆体按照50％的概率绘制，示出了不对称单元中两个分子中的一个。

图3：13的热椭圆形点图，椭圆体按照50％的概率绘制，示出了不对称单元中两个分子中的一个。

实施例

实施例1

合成N^α和N^δ保护的脲-组氨酸(方案1)

5-氧代-5，6，7，8-四氢咪唑并[1，5-c]嘧啶-7-羧酸甲酯(分子3)

根据现有文献记载的方法(R.Jain等人.Tetrahedron，1996，52，5363)，对其进行简单变型制备得到上述化合物。向L-组氨酸甲酯(2.73g，11.28mmol)的DMF(80ml)溶液中于室温下加入Im₂CO(1.88g，11.61mmol)。反应混合物加热至70℃，持续6小时，冷却至室温后缓慢倾入到1M NaHCO₃水溶液(250ml)中。水层沉淀析出部分固体，将其用CH₂Cl₂萃取。萃取过程中，沉淀物完全溶解于CH₂Cl₂中。

合并的有机萃取液用Na₂SO₄干燥，减压浓缩，通过快速柱色谱法纯化得到为白色固体的3(1.35g，61％)。R_f＝0.2(EtOAc 100％)；¹H NMR(500MHz，CD₃CN，25℃)：δ＝8.01(s，1H；CH_im)，6.77(s，1H；CH_im)，6.61(br.s，1H；NH)，4.37-4.34(m，1H；CHCO)，3.67(s，3H；OCH₃)，3.25-3.23(m，2H；CH₂CH)；¹³CNMR(500MHz，CD₃CN，25℃)：δ＝172.1，149.2，135.4，126.9，125.9，53.6，53.5，23.7；MS(ESI)：m/z(％)：195.73(100)[M⁺]，167.8(35)，135.8(24)；对C₈H₉N₃O₃(195.18)的元素分析计算值(％)：C 49.23，H 4.62，N 21.54；实测值：C 49.32，H 4.77，N 21.24。

通过由EtOAc缓慢蒸发，得到适合进行x-射线结构分析的结晶。

实施例2

在N^ε上引入羧酸酯官能团(方案1)

2-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-7-甲氧羰基-5-氧代-5，6，7，8-四氢咪唑并[1，5-c]嘧啶-2-鎓；溴化物(分子4)

将溴代乙酸叔丁酯(0.57ml，3.86mmol)加入至3(250mg，1.28mmol)的CH₃CN(25ml)溶液中。反应混合物回流24小时后，冷却至室温并真空浓缩。残余物用Et₂O(2×10ml)和THF(2×5ml)洗涤，真空干燥得到为白色粘性固体4，其在接下来的步骤中直接使用不再纯化。¹H NMR(300MHz，D₂O，20℃)：δ＝9.39(s，1H；CH_im)，7.40(s，1H；CH_im)，5.05(s，2H；CH₂N_im)，4.78-4.61(m，1H；CHCO)，3.63(s，3H；OCH₃)，3.42-3.39(m，2H；CH₂CH)，1.39(s，9H；tBu)；MS(ESI)：m/z(％)：309.40(13)[M⁺-HBr]，253.80(100)[M⁺-HBr-(CH₂＝C(CH₃)₂)]。

实施例3

制备N^ε保护的组氨酸(方案1)

N-[(苄氧基)羰基]-1-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)组氨酸甲酯(分子6)

向粗产物4(390mg)的THF(50ml)溶液中加入DIPEA(0.52ml，3.01mmol)和BnOH(2.1ml，20.08mmol)。回流16小时后，反应溶液冷却至室温，减压浓缩后通过快速柱色谱法纯化得到为白色固体的6(260mg，根据3计算为62％)。R_f＝0.15(CH₂Cl₂/MeOH 45∶1)；¹H NMR(500MHz，CD₃CN，25℃)：δ＝7.39-7.32(m，6H；5×CH_ph，CH_im)，6.78(s，1H；CH_im)，6.66(br.d，J＝7.8Hz，1H；NH)，5.06(s，2H；CH₂-Bn)，4.58(s，2H；CH₂N_im)，4.42(q，J＝2.6Hz，1H；CHCO)，3.62(s，3H；OCH₃)，2.96(t，J＝5.26Hz，2H；CH₂CH)；¹³C NMR(500MHz，CD₃CN，25℃)：δ＝173.2，168.3，157.0，139.1，138.2，137.8，129.5，129.0，128.9，119.2，83.2，67.2，66.9，55.2，52.7，49.3，30.2，28.2；MS(ESI)：m/z(％)：417.53(100)[M⁺]；对C₂₁H₂₇N₃O₆(417.48)的元素分析计算值(％)：C 60.43，H6.47，N 10.07；实测值：C 60.43，H 6.57，N 9.97。

通过由1-己烷的EtOAc溶液蒸发扩散，得到适合进行x-射线结构分析的结晶。

实施例4

制备具有脱保护官能团并且与生物分子偶联的组氨酸化合物(方案2)

N-[(苄氧基)羰基]-1-{2-[(1-乙氧羰基-2-苯乙基)氨基]-2-氧代乙基}组氨酸甲酯(分子10a)

将6(140mg，0.34mmol)的CH₂Cl₂/TFA(2∶2ml)溶液在室温下搅拌2.5小时。减压除去溶剂后继续真空干燥。残余物即粗化合物8溶解于CH₂Cl₂(10ml)中，通过逐滴加入Et₃N进行中和。向反应混合物中加入BOP(148mg，0.34mmol)和Et₃N(46μl，0.34mmol)。45分钟后，通过注射器缓慢加入苯丙氨酸乙酯(84.6mg，0.37mmol)和Et₃N(51μl，0.37mmol)的CH₂Cl₂(10ml)溶液。将反应混合物在室温下搅拌至少2.5天。将溶液用CH₂Cl₂(30ml)稀释，用1NHCl溶液(20ml)、1N NaHCO₃(20ml)、盐水(20ml)萃取。有机层用Na₂SO₄干燥，减压浓缩后通过快速色谱法纯化，得到为无色油状物的10a(162mg，90％)。R_f＝0.2(CH₂Cl₂/MeOH 40∶1)；¹H NMR(500MHz，CD₃CN，25℃)：δ＝7.37-7.28(m，9H；2×4H-CH_ph，CH_im)，7.16(d，J＝8.23Hz，2H；2×CH_ph)，6.77(br.d，J＝7.65Hz，1H；NH)，6.69-6.66(m，2H；CH_im，NH)，5.05(s，2H；CH₂-Bn)，4.61(dt，J＝7.86Hz，1H；CH-Phe)，4.52(s，2H；CH₂N_im)，4.43-4.41(m，1H；CHCO)，4.11(q，J＝7.15Hz，2H；CH₂CH₃)，3.62(s，3H；OCH₃)，3.10(dd，J＝8.19Hz，1H；CH₂-Phe)，2.99-2.93(m，3H；CH₂-Phe，CH₂CH)，2.57(s，N-CH₃)，1.18(t，J＝7.13Hz，3H；CH₃)；¹³C NMR(500MHz，CD₃CN，25℃)：δ＝173.3，172.0，167.8，157.0，139.1，138.3，138.2，137.8，130.4，129.5，129.4，129.0，128.9，127.9，118.9，67.2，62.2，55.2，54.8，52.8，49.9，38.0，30.3，14.5；MS(ESI)：M/z(％)：537.53(100)[M⁺+H]；对C₂₈H₃₂N₄O₇+0.5[N(CH₃)₂]₃P＝O+0.5H₂O(634.5)的元素分析计算值(％)：C 58.63，H 6.62，N 12.14；实测值：C 58.98，H 6.89，N12.48。

                           方案2

                           方案1

实施例5

在[Re(CO)³]⁺保护的组氨酸的N^ε上引入官能团(方案3)

Re络合物(16a)

向络合物14(25mg，0.059mmol)和Cs₂CO₃(20.4mg，0.065mmol)的乙腈(25ml)溶液中加入溴代乙酸乙酯(29.5mg，0.176mmol)的乙腈(5ml)溶液。反应混合物在35℃下加热1.5小时。向混合物中加入冰醋酸中和。标准后处理后，粗产物通过硅胶色谱法纯化得到络合物16a(30mg，90％)。R_f＝0.15(EtOAc/EtOH 5∶1)；¹H NMR(300MHz，CD₃CN，20℃)：δ＝7.95(s，1H；CH_im)，6.92(s，1H；CH_im)，4.78(s，2H；CH₂N_im)，4.23-4.16(q，J＝7.1Hz，2H；CH₂CH₃)，3.91-3.87(m，1H；CHCO)，3.21-2.98(q，2H；CH₂CH)，1.28-1.23(t，J＝7.5Hz，3H；CH₃)；¹³C NMR(300MHz，CD₃CN，20℃)：δ＝199.5，197.8，197.8，181.8，168.8，143.4，135.7，120.9，63.0，52.6，49.4，28.7，14.4；MS(ESI)：m/z(％)：511.8(100)[M⁺+H]，1020.7(55)[2M⁺]；对C₁₅H₁₈N₃O₇Re(510.5)的元素分析计算值(％)：C 30.59，H 2.76，N 8.23；实测值：C 30.84，H 3.0，N 8.06。

Re络合物(16b)

参照化合物16a制备。向化合物14(25mg，0.059mmol)和Cs₂CO₃(20.4mg，0.065mmol)的乙腈(25ml)溶液中加入溴代乙酸叔丁酯(34.5mg，0.176mmol)。反应混合物在35℃下搅拌1.5小时。反应混合物过滤后，真空干燥并通过硅胶色谱法纯化(EtOAc/EtOH 5∶1)得到络合物16b(29mg，90％)。¹HNMR(300MHz，CD₃CN，20℃)δ＝7.93(s，1H；CH_im)，6.90(s，CH_im)，4.65(s，2H；CH₂N_im)，3.94-3.25(m，1H；CHCO)，3.27-3.23(q，2H；CH₂CH)，1.45(s，9H；tBu)；¹³C NMR(CD₃CN)δ＝181.3，167.3，143.1，135.2，120.6，83.8，52.3，49.7，28.5，28.0，27.8；MS(ESI)：m/z(％)：539.9(100)[M⁺]，1076.8(50)；对C₁₅H₁₈N₃O₇Re(538.5)的元素分析计算值(％)：C 33.43，H 3.34，N 7.80；实测值：C 33.30，H 3.85，N 7.68。

Re络合物15

为了水解酯基，将化合物16a(30mg，0.057mmol)在甲醇(5mL)和LiOH(0.5M，2ml)的溶液中于室温下搅拌过夜，将化合物16b(15mg，0.028mmol)在二氯甲烷(2ml)和三氟乙酸(2ml)的溶液中于室温下搅拌2小时。粗产物通过柱色谱法纯化(EtOH/THF/AcOH 10∶1∶0.1)得到络合物15(分别为95％和90％)。

实施例6

将生物分子与[Re(CO)₃]⁺保护的组氨酸中的羧酸酯基团偶联并除去[Re(CO)₃]⁺保护基团(方案4)

Re络合物17

向络合物15(8mg，0.02mmol)的CH₂Cl₂/DMF(3∶0.2ml)混合溶液中于室温下加入BOP(7.4mg，0.02mmol)和Et₃N(2μl，0.02mmol)。30分钟后，向该络合物溶液中通过注射器滴加苯丙氨酸乙酯(4mg，0.02mmol)和Et₃N(2μl，0.02mmol)的CH₂Cl₂(2ml)溶液。反应混合物搅拌过夜。反应溶液真空浓缩。残余物用二乙醚处理(2×5ml)。白色固体溶解于THF(10ml)中，过滤除去不溶性固体。滤液真空浓缩得到络合物17的乙酯(75％)。¹H NMR(500MHz，CD₃CN，25℃)：δ＝7.8(s，1H；CH_im)，7.34-7.21(m，5H；CH_ph)，6.8(s，1H；CH_im)，4.63-4.59(m，1H；CHCO)，4.53(d，2H；CH₂N_im)，4.08(q，2H；CH₂CH₃)，3.92-3.88(m，1H；CH-His)，3.18-3.10(2×dd，2H；CH₂-His，CH₂-Phe)，3.05-2.96(2×dd，2H；CH₂-His，CH₂-Phe)，1.17(t，3H；CH₃)；¹³C NMR(500MHz，CD₃CN，25℃)：δ＝198.1，196.6，196.5，180.4，170.8，165.5，142.0，136.7，134.3，129.4，128.4，126.8，124.9，120.3，119.6，61.2，54.1，51.4，49.2，37.2，27.7，13.4；IR(KBr)：v＝2020，1886，1733，1636cm^-1；MS(ESI)：m/z(％)：659(100)[M⁺+H]；对C₂₂H₂₄N₄O₈Re(658.6)的元素分析计算值(％)：C 40.12，H 3.67，N 8.51；实测值：C 39.31，H 3.83，N 8.25。

通过将上述络合物在0.5M LiOH和MeOH(1∶2)的混合溶液中于室温下按照上述方法搅拌过夜来水解，得到定量的络合物17。

由络合物17和15出发，铼的氧化反应的一般步骤

将化合物17或15(5mM的H₂O溶液，500μl)和酸(HCl、TFA、或乙酸)溶液(1.0、0.1或0.01M的H₂O溶液，70μl)加入至小瓶中，该小瓶密封后用氮气脱气(10分钟)。向脱气后的小瓶中加入H₂O₂(0.43、0.86或1.29M的H₂O溶液，60μl)，然后试样在50℃下加热。反应混合物通过在250nm下的HPLC监测，于第4、8、24和48小时在HPLC上注入反应混合物(10μL)或者直到在谱图中不再看到铼络合物。反应条件的效力通过确定在高铼酸盐形成过程中铼络合物的峰面积比例而计算得到。当不再观察到铼络合物时，反应混合物用二氧化镁处理除去反应混合物中残余的H₂O₂，然后用Wattman 0.2μm过滤器过滤得到溶液形式的未配合配体，在^99mTc标记中使用。

                               方案3

                               方案4

实施例7

制备具有N^ε侧链(pendant)-NH₂基团的组氨酸(方案5)

3-{1-[3-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-丙基]-1H-咪唑-4-基}-2-(3-三甲基硅烷基-丙酰氨基)-丙酸甲酯(分子18)

将3(196mg；1.0mmol)和N-Fmoc-3-碘丙胺(1.22g；3.0mmol)在MeCN(40ml)中的混合物加热回流4.5天。当通过TLC检测不到脲衍生物即化合物3时，反应混合物真空浓缩，得到白色固体。将该固体物质再次溶解于MeCN(40ml)和2-三甲基硅烷基乙醇(355mg；3.0mmol)中，加入dipea(259mg；2.0mmol)。所得到的混合物在室温、于N₂下搅拌16小时。真空除去溶剂，然后通过柱色谱法纯化(硅胶；EtOAc)。得到收率：316mg(53％两步)，泡沫状无色固体。实测值：C，62.1；H，6.2；N，9.5；对C₃₁H₄₀N₄O₆Si的计算值：C，62.8；H，6.8；N 9.5；v_max(KBr)/cm^-1 3329br NH，1730s，1698vs C＝O；δ_H(300.8MHz；CD₃CN)7.82(2H，伪(pseudo)-d，2×ArH)，7.64(2H，伪-d，2×ArH)，7.38(3H，m，2×ArH+N₂CH_His)，7.32(2H，伪-t，2×ArH)，6.79(1H，s，CH_His)，6.55(1H，d，J 7.5，NH)，5.68(1H，br s，NH)，4.35(3H，重叠m，OCH₂-Fmoc+C_αH)，4.22(1H，t，J 6.6，OCH₂CH-Fmoc)，4.07(2H，m，CH₂)，3.87(2H，m，CH₂)，3.60(3H，s，OCH₃)，2.99(2H，m，CH₂)，2.90(2H，m，C_βH₂)，1.85(2H，m，CH₂)，0.93(2H，m，CH₂)，0.01(s，9H，Si-(CH₃)₃).δ_C(CD₃CN；75.47MHz)173.7(C＝O_酯)，157.7，157.6(2×C＝O_酰胺)，145.5，142.2(2×ArC_q)，138.4(C_His)，128.9，128.3(2×ArCH)，126.4(C_His)，121.2，118.6(2×ArCH)，118.1(C_His)，66.9，63.7，55.3，52.7，48.3，44.9，38.6，32.1，30.1，18.3，1.4(Si(CH₃)₃)；m/z(ESI-pos.，MeOH)343，371，533，593[M+H]⁺。

3-[1-(3-氨基-丙基)-1H-咪唑-4-基]-2-(3-三甲基硅烷基-丙酰氨基)-丙酸甲酯(分子19)

将化合物18(255mg；0.43mmol)溶解于1/1 DMF/NEt₂混合物(8ml)中。混合物在室温下搅拌1小时后，真空除去溶剂。通过制备性HPLC(C-18ec柱；TFA缓冲液)纯化得到为无色泡沫状固体的化合物19的三氟乙酸盐。收率：190mg(91％)。

δ_H(300.08MHz；CD₃CN)8.59(1H，s，N₂CH_His)，7.95(3H，br，NH₃⁺)，7.26(1H，s，CH_His)，6.56(1H，d，J 8.4Hz，NH)，4.43(1H，m，C_αH)，4.24(2H，t，J 6.9Hz，CH₂)，4.05(2H，m，CH₂)，3.68(3H，s，OCH₃)，3.22(1H，m，C_βH)，3.06(1H，m，C_βH)，2.95(2H，t，J 6.9，CH₂)，2.21(2H，m，CH₂)，0.89(2H，m，CH₂)，0.00(9H，s，Si-(CH₃)₃)；δ_C(75.47MHz；CD₃CN)：172.7(C＝O_酯)，162.2(q，J_C，F 34.6，CF₃)，157.7(C＝O_酰胺)，135.9，132.4，120.7(3×C_His)，64.0，54.6，53.2，47.0，37.3，28.6，27.6，18.2(OCH₃，C_α，C_β+5×CH₂)，1.5(Si-(CH₃)₃)；m/z(ESI-pos.；MeOH)：343.1，370.8([M+H]⁺，C₁₆H₃₀N₄O₄Si理论值371.2)762[2M+Na]⁺。

实施例8

生物分子与组氨酸衍生物中的氨基偶联(方案5)

a)生物素：将D-(+)-生物素(35mg；0.14mmol)溶解于4/1(v/v)的DMF/NEt₃(2.5ml)混合物中。向该混合物中加入化合物19(91mg；0.19mmol)的DMF(2ml)溶液，再加入TBTU(46mg；0.14mmol)。混合物在室温下搅拌45分钟后，真空蒸发至干。将残余物吸收到2M NaHCO₃(20ml)中，用CH₂Cl₂(3×20ml)萃取。合并的有机层用0.5M HCl(20ml)、H₂O(20ml)和盐水(2×20ml)洗涤。除去溶剂后，得到为无色泡沫状固体的化合物20。收率：67mg(78％；相对于生物素而言)。

δ_H(300.08MHz；CD₃OD)7.60(1H，s，N₂CH_His)，6.95(1H，s，CH_His)，4.48(1H，m)，4.41(1H，m)，4.29(1H，m)，4.09(2H，m)，3.98(2H，m)，3.69(3H，s，OCH₃)，3.16(3H，重叠-m，CH₂+H)，2.95-2.78(5H，重叠-m，2×CH₂+H)，2.70(1H，m)，2.19(2H，m，CH₂)，1.93(2H，m，CH₂)，1.63(4H，m，2×CH₂)，1.43(2H，m，CH₂)，0.94(2H，m，CH₂)，0.01(9H，s，Si-(CH₃)₃；δ_C(75.47MHz；CD₃OD)：176.4，174.3(C＝O_酯+N₂C＝O)，166.3，158.9(C＝O_酰胺)，138.5，138.3，118.7(ArC_His)，64.2，64.4，61.7，57.1，55.7，52.8，45.7，41.1，37.4，36.8，31.9，31.1，29.8，29.5，26.8，18.6(10×CH₂，Cα，Cβ，OCH₃，3×CH)，1.5(Si-(CH₃)₃；m/z(FAB⁺；NBA)597.2898(M⁺，C₂₆H₄₅N₆O₆SiS理论值597.2891)。

b)脑啡肽：向纯化后的化合物19(39mg；0.08mmol)和被保护的脑啡肽(85mg；0.08mmol)的DMF(1.5ml)和NEt₃(0.5ml)溶液中加入TBTU(25mg；0.08mmol)。混合物在室温下搅拌45分钟，真空浓缩至干。化合物通过HPLC纯化(操作1：C8-柱；50mM TRIS缓冲液；操作2：C8-柱；TFA缓冲液)。收率：42mg(49％)的化合物21，为玻璃状固体。

δ_H(500.25MHz；CD₃OD)8.77(1H，s，N₂CH_His)，7.43(1H，s，CH_His)，7.28(4H，m，4×ArH)，7.20(1H，m，ArH)，7.12(2H，伪-d，2×ArH)，6.90(2H，伪-d，2×ArH)，4.52(1H，m，C_αH)，4.49(1H，m，C_αH)，4.22-4.09(7H，重叠m，2×C_αH+2×CH₂)，3.85(2H，m，CH₂-Gly)，3.78(2H，m，CH₂-Gly)，3.73(3H，s，OCH₃)，3.25-3.02(9H，重叠m，2×CH₂+3×C_βH)，2.84(1H，m，C_βH)，2.04(1H，m，CH₂-CH₂-CH₂)，1.71(1H，m，C_γH-Leu)，1，56(2H，m，C_βH₂)，1.36(9H，s，OC(CH₃)₃)，1.28(9H，s，OC(CH₃)₃)，0.94(3H，d，J 6.3，Leu-CH₃)，0.89(3H，d，J6.3，Leu-CH₃)；δ_C(90.5MHz；CD₃OD)175.5，175.1，174.2 172.9，172.6，158.7，158.2(C＝O，)，155.4，138.3，136.4，133.6，130.9，130.2，129.6，128.0，125.2，121.2(全部ArC)，81.0，79.6(C_q)，64.5，58.0，57.5，54.4，53.2，47.6，44.1，41.0，38.1，38.0，36.3，30.8，29.2，28.7，28.2，25.9，23.5，21.7，18.6，-1.5(CH，CH₂和CH₃；)；m/z(FAB⁺；NBA)1064.5789([M+H]⁺，C₅₃H₈₂N₉O₁₂Si理论指1064.5852)

                           方案5

实施例9

向N^ε和N^α偶联两个官能基团(方案6)

2，6-双-叔丁氧羰基甲基-7-甲氧羰基-5-氧代-5，6，7，8-四氢-咪唑并[1，5-c]嘧啶-2-鎓；溴化物(分子22)

将NaH 13mg(0.307mmol)在0℃下悬浮于无水DMF(2ml)中。缓慢逐滴加入化合物360mg(0.307mmol)的DMF(1ml)溶液。反应混合物在0℃下搅拌30分钟，在室温下搅拌1小时直到不再有气体逸出。反应溶液再次冷却至0℃。通过注射器在冷冻条件下极慢地加入溴代乙酸叔丁酯0.07ml(0.461mmol)。溶液在0℃下搅拌30分钟，然后再在室温下搅拌至少2小时。当通过TLC监测不到化合物3时，逐滴加入更多的溴代乙酸叔丁酯0.14ml(0.921mmol)。反应混合物加热至70℃过夜。反应通过TLC监测。加热15小时后，溶液冷却至室温并真空浓缩。粗残余物用二乙醚处理两次，除去过量的溴化物，真空干燥。该粗化合物22在接下来的步骤中直接使用不再纯化。MS(ESI)：m/z：424.56[M-Br]⁺

2-[叔丁氧羰基甲基-(9H-芴-9-基-甲氧羰基)-氨基]-3-(1-叔丁氧羰基甲基-1H-咪唑-4-基)-丙酸甲酯(分子23)

将粗化合物22在室温下溶解于乙腈(10ml)中，加入Fm-OH 181mg(0.921mmol)和DIPEA 0.08ml(0.461mmol)。在室温下搅拌24小时后，反应溶液通过加入1N HCl溶液中和，减压浓缩。残余物溶解于CH₂Cl₂中，用水萃取1次，1N HCl溶液萃取1次。有机层用Na₂SO₄干燥，真空浓缩，并通过快速柱色谱法纯化，得到化合物23(收率：40-50％，根据化合物3计算)。

                         方案6

实施例10

制备活化的组氨酸衍生物

将2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-(1-五氟苯氧羰基甲基-1H-咪唑-4-基)丙酸甲酯(分子24)：化合物9(0.198mmol)溶解于THF(3ml)中，加入吡啶中和溶液至pH6-7。加入吡啶0.03ml(0.396mmol)后，再通过注射器在室温下极慢地滴加三氟乙酸五氟苯基酯(TFA-Pfp)111mg(0.396mmol)的THF(2ml)溶液。混合物在室温下搅拌19小时后，溶液真空浓缩。粗残余物溶解于二氯甲烷中，用0.5N HCl萃取1次、用0.5N Na₂CO₃萃取1次、再用盐水萃取1次。有机层用Na₂SO₄干燥，真空浓缩并通过快速柱色谱法纯化得到化合物24。(收率：55％)；MS(ESI)：m/z：615.78[M+H]⁺

实施例11

组氨酸衍生物到肽的一般偶联步骤

偶联：化合物9或24用于偶联反应。将一种配体(通常是0.02-0.08mmol)溶解于DMF中，加入碱Et₃N或DIPEA(0.03-0.1mmol)。对于化合物9，加入BOP或TBTU(通常是0.025-0.09mmol)作为偶联试剂，使配体的羧酸基团在室温下活化30分钟。随后，通过注射器加入肽(通常是0.01-0.02mmol)的DMF溶液，例如(β)-发夹环肽、RGD、或铃蟾素(bombesin)。对于化合物24而言，不加偶联试剂，在加入碱之后立即加入肽溶液。当肽具有游离羧酸基团例如Phe-Gly-OH、Gly-Pro-OH、胃泌激素(结构中有7个游离COOH)、或TOCA-OH时，化合物24更加适合。根据肽的情况，将反应混合物搅拌2-18小时。反应通过HPLC监测。当通过HPLC不再监测到肽时，反应溶液真空浓缩。粗残余物通过制备性HPLC纯化，产物用MS证实。

脱保护：将组氨酸配位肽(通常是0.003-0.006mmol)在室温下溶解于哌啶(1ml)中。搅拌30-40分钟后，反应混合物倾入冰冷的水(3ml)中。过滤除去白色固体呋文，用水(1ml)漂洗。水溶液真空浓缩得到为油状物的白色固体，该Fmoc和甲酯脱保护的产物直接用于标记，不再进一步纯化。

标记：将配位物(conjugate)溶液(10^-3或10^-4M的水或磷酸盐缓冲液(pH7.4)，100μl)加入至小瓶中。然后向小瓶中加[^99mTc(CO)₃(H₂O)₃]⁺(900μl)溶液(总浓度：10^-4或10^-5M)。溶液在90℃下加热30分钟至1小时。通常在浓度为10^-4M下、30分钟内完成定量标记，在浓度为10^-5M下、30分钟内标记20-50％。对于(β)-发夹环肽而言，其配位物显示出甚至在浓度为10^-5M下、30分钟也能完成定量标记。

实施例12

一般标记步骤

将由有机合成或者通过铼氧化途径得到的配体溶液(10^-3或10^-4M的水溶液，100μl)加入至小瓶中，然后密封并用氮气流脱气10分钟。向小瓶中通过注射器加入[^99mTc(CO)₃(H₂O)₃]⁺溶液(900μl)，小瓶加热至70-90℃持续30分钟后得到相应的[^99mTc(CO)₃]⁺络合物，[(5)^99mTc(CO)₃]和[(11)^99mTc(CO)₃]，通过具有放射线探测的HPLC证实产率相当高。所有的结果如表4所示。

                          表4

  方法  配体编号  浓度(M)  温度(℃)  时间(分钟)  收率(％)     两步标记  5  5  5  11  11  11  11  10^-4  10^-5  10^-6   10^-4  5×10^-5  10^-5  10^-6  70  70  70   90  90  90  90  30  30  30   30  30  30  30  定量  91^[a]  20^[b]   定量^[c]  定量  定量^[d]  41^[e]   一锅法标记  11  11  11  10^-4  5×10^-5  10^-5  90  90  90  20  20  20  94  96  34^[e]

[a]：在1小时内完成定量标记。氧化得到的配体5在75℃下、30分钟后收率为85％。

[b]：在1.5小时后标记收率达到64％。

[c]：氧化得到的配体11在90℃、30分钟后显示出收率为88％。

[d]：氧化得到的配体11在90℃、30分钟后显示出收率为73％。

[e]：在1.5小时后标记收率不超过65％。