一种高效获得多年生黑麦草转基因植株的农杆菌介导转化体系及其应用

摘要

本发明一种高效获得多年生黑麦草转基因植株的农杆菌介导转化体系及其应用，包括以下步骤：通过高频再生体系获得胚性愈伤受体材料；供体菌株的培养；抑菌素浓度的确定；农杆菌转化条件的优化；转化愈伤的筛选培养和植株再生和抗性植株的分子检测。通过优化农杆菌转化时所涉及到的各项影响条件，包括菌液浓度、侵染时间、侵染条件、共培养时间、抑菌素的添加浓度等，提供了一种适用于多年生黑麦草的农杆菌介导转化体系。克服了现有农杆菌介导技术难以应用于禾本科植物遗传转化的缺陷，建立起了以胚性愈伤为受体材料的高效多年生黑麦草农杆菌介导转化体系。

说明书

技术领域：

本发明属于植物基因工程领域或作物生物工程育种领域。具体说，涉及多年生黑麦草的组织培养技术、农杆菌介导转化技术及转化植株的分子检测技术，从而高效的获得多年生黑麦草转基因植株。

背景技术：

草坪草种是世界上第二大交易种子，而我国目前所用草种主要依赖进口，育种工作尤其薄弱。多年生黑麦草是我国南北方广泛应用且适应性很强的草坪草种，成坪速度快，抗病虫和分蘖能力强，常作为建植草坪、长期轮作牧场、永久性牧场的重要草种。但它仍存在耗水量大、不能忍受冷、热、干旱这些气候的极端值，以及萌发和苗期对水分需求较大等不足。由于植物抗逆性本身的复杂性和其数量性状位点连锁关系的复杂性使得利用传统育种方法获得优良的抗性品种十分困难，利用基因工程技术获得适应或抵抗这些不利环境因素的草坪草品种将是解决这些问题快速且有效的方法之一。在提高植物对逆境胁迫的分子育种中，改良或增加一个关键的转录因子可以明显提高植株多方面的抗性能力。

农杆菌介导的植物基因转化系统是目前已知的唯一天然存在的基因交换因子，已广泛应用于植物基因工程研究。根癌农杆菌细胞中有一种特殊的Ti质粒，该质粒的部分DNA片段可整合到宿主植物基因组中，与宿主基因组一起遗传和表达。由于整合进植物基因组的Ti质粒DNA片段携带有生长素、细胞分裂和合成冠瘿碱等基因，从而使被根癌农杆菌侵染过的植物组织产生冠瘿瘤，并大量合成冠瘿碱。冠瘿碱反过来又促进根癌农杆菌的繁殖和Ti质粒的转移，扩大侵染范围。农杆菌介导转化法比起其他转化方法具有以下优点：

a转化频率高，转化效果好，可转移较大的DNA片段；

b转移的外源基因常为单拷贝整合，很少会发生甲基化和基因沉默；

c遗传稳定，并且多数符合孟德尔遗传规律，转基因植株能较好地用做育种的中间材料；

d整合的外源基因有较明确的边界序列，通常是T-DNA左右界序列；

e价格低廉，对实验条件要求不高。

由于单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，曾认为农杆菌介导法不适于禾谷类等单子叶植株遗传转化(Narasimhulu et al.1996)。单子叶植物难于进行农杆菌转化的原因主要有两点：(1)单子叶植物很少或完全不能产生激活Ti质粒Vir区基因的信号分子；(2)单子叶植物转化的靶组织或细胞不能进行有效的细菌粘附，无明显的创伤反应，不能诱导创伤附近的细胞脱分化形成大量感受态细胞，而只是那些再生和整合转化能力强的感受态细胞才能得到转化植株。至今，以多年生黑麦草胚性愈伤组织为受体的农杆菌介导法转化体系尚停留在实验室研究阶段。

发明内容：

本发明一种高效获得多年生黑麦草转基因植株的农杆菌介导转化体系及其应用，目的在于克服现有农杆菌介导技术难以应用于禾本科植物遗传转化的缺陷，通过实验调整菌液浓度、侵染时间、侵染条件、共培养时间、抑菌素的添加浓度，提供一种适用于多年生黑麦草的农杆菌介导转化体系。

附图说明：

附图1转入DREB的多年生黑麦草爱神特(Accent)再生苗；附图2转入DREB的多年生黑麦草爱神特再生苗生根；附图3转入DREB的多年生黑麦草爱神特转基因植株；附图4转入DREB的多年生黑麦草爱神特转基因植株根系；附图5gus基因瞬时表达；附图6gus基因稳定表达；附图7DREB基因PCR扩增结果(1-7为转化植株，8为阴性对照，9为阳性对照，10为marker)；附图8DREB基因Southern杂交结果(1-6为转化植株，7为阳性对照，8为阳性对照，9为marker)。

具体实施方式：

受体材料准备：以多年生黑麦草成熟胚为外植体诱导愈伤组织，愈伤诱导和继代培养基均为MS+4-6mg/L2，4-D+0.2-0.3mg/L 6-BA+0.1g/L水解酪蛋白。用Parafilm封闭培养皿，25℃暗培养。挑取年龄2-3个月的胚性愈伤组织预培养3d待侵染。

抑菌素浓度的确定：农杆菌菌株LBA4404在含不同浓度抑菌素的YEP液体培养基中，28℃200-220rmp暗培养，测菌液OD₆₀₀值。待农杆菌生长至对数生长期，用1/2MS培养液稀释菌液，使OD₆₀₀值为0.5-0.8，侵染愈伤组织10-15min，侵染过程中不断震荡，使农杆菌与愈伤充分接触。取出植物材料，用滤纸吸干残留的菌液，转入含有不同浓度抑菌素的愈伤诱导培养基中。25℃暗培养。每天进行污染情况的纪录。

供体菌株培养：从平板上挑取单菌落，接种到附加抗生素的细菌液体培养基中。28℃，200-220rmp恒温摇床上培养至OD₆₀₀为0.8-1.0，稀释到0.1左右进行转化，同时加入100μmol/L乙酰丁香酮(AS)。

侵染：将菌液倒入盛有胚性愈伤组织的无菌培养皿中，轻轻摇晃使菌液与愈伤组织充分接触，抽真空浸泡10min。将侵染后的愈伤置于底层铺有若干灭菌滤纸的培养皿中，上层再次覆盖小块滤纸，并用镊子轻施压力，使愈伤上多余的菌液能够被充分的吸干。再将愈伤组织转入上层铺有一到两层灭菌滤纸的含有100μmol/L AS愈伤诱导培养基上，避免粘有菌液的愈伤与培养基的直接接触，在不含抑菌素的培养基上避免了农杆菌的过度繁殖。25℃暗培养，共培养4d。用500mg/L头胞霉素(cef)的无菌水洗涤部分愈伤，进行gus化学组织染色，经酒精脱色观察基因的瞬时表达

选择培养：将经共培养的外植体转移倒含有300mg/Lcef和50mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基上，25℃暗培养20d。将存活的愈伤转入到含有250mg/Lcef和50mg/L潮霉素的分化培养基(分化培养基是指MS+0.1-0.2mg/L 6-BA+0.4-0.6mg/L NAA+0.3-0.5mg/L ZT+6.4mg/L Cu²⁺；)上，挑取部分愈伤组织进行gus基因化学组织染色。将长出的小芽转入到不含筛选剂的分化培养基中待小苗长到3-4片叶时转入生根培养基(生根培养基是指MS+0.4mg/L NAA+0.1mg/L ZT)中，壮苗生根。

抗性植株的移栽：将根叶完全的壮苗室温下炼苗3d后，清洗掉基部的培养基，直接栽入到花盆(基质为沙∶土∶草炭＝1∶1∶1)中，自然光下生长。

实施例：

实施例1

农杆菌介导法将DREB1A基因转入多年生黑麦草中获得抗旱、耐盐碱的转基因植株

受体材料的获得：以多年生黑麦草爱神特成熟胚为外植体诱导愈伤组织，愈伤诱导和继代培养基均为MS+6mg/L 2，4-D+0.2mg/L 6-BA+0.1g/L水解酪蛋白。25℃暗培养。挑取培养了2-3个月的胚性愈伤组织预培养3d待侵染。

菌素浓度的确定：农杆菌菌株LBA4404在含不同浓度抑菌素头胞霉素的YEP液体培养基中，28℃220rmp暗培养，测菌液OD₆₀₀值(表1)。头胞霉素在250mg/L以上基本能够抑制住农杆菌LBA4404的生长。待农杆菌生长至对数生长期，用1/2MS培养液稀释菌液，使OD₆₀₀值为0.5-0.8，侵染愈伤组织10-15min，侵染过程中不断震荡，使农杆菌与愈伤充分接触。取出植物材料，用滤纸吸干残留的菌液，转入含有不同浓度抑菌素的愈伤诱导培养基中。25℃暗培养。每天纪录污染情况(表2)。头胞霉素在300mg/L以上能够完全抑致住农杆菌的污染。

表1  头孢霉素对农杆菌LBA4404生长的影响

  cef  mg/L               OD₆₀₀值  平均值  I  II  III  0  30  50  80  100  150  200  250  300  350  400  2.013  1.245  0.947  0.781  0.427  0.39  0.183  0.065  0.035  0.025  0.016  1.982  1.375  0.929  0.603  0.497  0.438  0.092  0.029  0.02  0.034  0.019  1.873  1.508  0.899  0.716  0.348  0.402  0.11  0.052  0.035  0.041  0.024  1.956  1.376  0.925  0.700  0.424  0.410  0.128  0.049  0.030  0.033  0.020

供体菌株培养：从平板上挑取单菌落，接种到附加附加100mg/L卡那霉素和125mg/L链霉素的细菌液体培养基中。28℃220rmp恒温摇床上培养至OD₆₀₀为0.8-1.0，分别稀释到表3所示的四个浓度进行转化，同时加入100μmol/L乙酰丁香酮(AS)。

表2  头胞霉素筛选结果

  头胞霉素  mg/L  出现污染的天数  d  污染率  ％  0  100  200  250  300  350  400  2  9  11  15  0  0  0  100  89.48  38.7  8.3  0  0  0

表3  菌液浓度与侵染时间8项处理

侵染：分别将不同浓度的菌液倒入盛有胚性愈伤组织的无菌培养皿中，轻轻摇晃使菌液与愈伤充分接触，并且分别抽真空浸泡10或20min，形成表3所示的8项处理。取出愈伤置于无菌滤纸上吸去多余的菌液，用镊子覆盖无菌滤纸在愈伤上面尽量吸干净菌液，将愈伤转入铺有一层灭菌滤纸的含有100μmol/L AS愈伤诱导培养基上，25℃暗培养，分别共培养2、3、4d。用500mg/L头胞霉素(cef)的无菌水洗涤部分愈伤，进行gus化学组织染色，经酒精脱色观察gus基因的瞬时表达率(表4)。处理1在共培养4d时的gus显色比率最高，可以达到85％，因此OD₆₀₀稀释到0.1左右，侵染时间为10min，共培养4d为农杆菌侵染的最佳组合。

表4  8项处理不同共培养时间的gus显色比率

选择培养：将经共培养的外植体转移倒含有300mg/Lcef和50mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基上，25℃暗培养20d。将存活的愈伤转入到含有250mg/Lcef和50mg/L潮霉素的分化培养基上，挑取部分愈伤组织进行gusA化学组织染色。处理1和处理7gus基因的瞬时显色比率较高，也只有这两项处理在经过选择筛选后有抗性苗长出。将长出的小苗转入到不含筛选剂的分化培养基中待小苗长到3-4片叶时转入生根培养基(生根培养基是指MS+0.4mg/L NAA+0.1mg/L ZT)中，壮苗生根。

抗性植株的移栽：将根叶完全的壮苗室温下炼苗3d后，清洗掉基部的培养基，直接栽入到花盆(基质为沙∶土∶草炭＝1∶1∶1)中，自然光下生长。

转化植株的分子检测：提取抗性植株DNA进行PCR检测，DREB1A引物序列为：

引物F：5’＞AAA GGA TCC TTA CCC GGG TTC TGA TCA ATG AAC TCA TTT TCT G＜3’，

引物R：5’＞AAA GGT ACC AAT CCC GGG GTT TTA ATA ACT CCA TAA CGA TAC G＜3’取PCR阳性植株的DNA进行Southern印迹杂交鉴定，以目的基因的PCR产物做探针。共检测抗性植株10株，其中阳性植株8株，转化效率80％。