用于细菌性脑膜炎的粘膜结合疫苗

摘要

一种用于粘膜给药的组合物，包含以下的两种或多种：(a)一种抗原，其能诱导抗流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的免疫应答；(b)一种抗原，其能诱导抗脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria Meningitidis)的免疫应答；以及(c)一种抗原，其能诱导抗肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的免疫应答。所述结合物可以通过单剂量免疫对抗三种不同原因导致的共同疾病，即细菌性脑膜炎。

说明书

这里被引用的所有文献全文并入以供参考。

发明领域

本申请关于粘膜脑膜炎疫苗，特别是鼻内疫苗。

发明背景

脑膜炎是组织的炎症反应，其可遍及脑部和脊髓。脑膜炎可以是细菌引起的或病毒引起的，细菌性脑膜炎通常更加严重。

细菌性脑膜炎的主要的病原体为脑膜炎奈瑟氏球菌(NeisseriaMeningitidis)(脑膜炎球菌)，但是其他的相关病原体包括肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(肺炎球菌)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)(Hib)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(GBS)。脑膜炎奈瑟氏球菌还能引起脑膜炎球菌败血病，这是感染引起生命危险的主要方面。

防止Hib感染的疫苗已经存在很多年了。在1999-2000年，一种防止血清组C脑膜炎球菌(MenC)的疫苗被引进到一些欧洲国家。2000年，一种脑膜炎球菌疫苗在美国进入常规应用。

对抗这三种病原体的疫苗是基于抗原荚膜多糖的，结合到被用于增强多糖免疫原性的载体蛋白。这些疫苗是通过注射给药的，虽然粘膜给药已经被描述用于小鼠，如参考文献1描述了Hib结合疫苗的鼻内给药，以及参考文献2描述了MenC结合疫苗的鼻内给药(也可参见参考文献3)。疫苗的粘膜给药提供了一种引人注目的方法，可克服对幼儿进行大量注射给药产生的问题。此外，由于多数病原体最初感染在粘膜表面，在感染位点引入粘膜免疫将有利于优化保护性免疫。

基于囊状的疫苗的鼻内和口咽给药对抗血清组B脑膜炎球菌(‘MenB’)也已被人们所描述【如参考文献4】，如鼻内给药百日咳杆菌(B.pertussis)，其表达脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria Meningitidis)铁传递蛋白结合蛋白B【5】。参考文献6描述了鼻内给药肺炎球菌结合疫苗【也可参见参考文献7和8】。

本发明的目标是提供脑膜炎疫苗的粘膜给药的一些改进方案。

发明内容

本发明提供了一种用于粘膜给药的组合物，包含以下的两种或多种：(a)一种抗原，其能诱导抗流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的免疫应答；(b)一种抗原，其能诱导抗脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria Meningitidis)的免疫应答；以及(c)一种抗原，其能诱导抗肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的免疫应答。

将不同抗原进行组合可减少不同药剂的给药数量而达到产生免疫作用、对抗多种病原体的效果。这可视为可注射疫苗的优点，使产生疼痛的注射次数减少，但这对于粘膜疫苗(如鼻内疫苗)来说不很重要，因为其在给药时具有较低的不舒适感。然而，即使对于粘膜给药，组合的抗原组合物也是有优点的，因为患者更愿意接受并且药物的运输/储藏方便。

尽管将多种抗原复合成单一药剂是引入注目的【如参考文献9-12】，但仍然存在一些难点，不同组分一旦结合后会产生相互作用，尤其在液体制剂中【13】。出现的问题包括抗原干扰、抗原竞争【14，15】、抗原降解、抗原决定簇抑制、以及佐剂相容性。混合物的质量控制也更困难。此外，现有的关于组合抗原的认识集中在注射疫苗方面，而并非粘膜疫苗。

尽管存在上述困难，本发明人出乎意料地发现，来自流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria Meningitidis)和/或肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的抗原可以相互组合，用于粘膜给药，其不产生可预见的负面结果。来自这三种微生物的组合抗原也是有优点的，因为它能以单剂量对抗三种不同病因引起的共同疾病，即细菌性脑膜炎。该种类型的组合的脑膜炎疫苗以前曾经报导过【16】，但是未见关于粘膜给药的报导。

粘膜给药

本发明的组合物是用于粘膜给药的。

在可用的多种粘膜给药途径中，鼻内途径是最实用的，因为这是容易实现的途径，只需相对简单并早已大量生产的设备即可。另外，鼻内免疫似乎更有效。因而，优选的粘膜给药途径是鼻内途径，并且本发明的组合物优选适于鼻内给药的方式，如鼻内喷雾、鼻内滴剂、凝胶或粉末【如参考文献17和18】。

用于疫苗的粘膜给药的可选途径可以是口、胃、肺、肠、直肠、眼睛、以及阴道途径。

(a)流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)抗原

组合物中流感嗜血杆菌抗原典型的是荚膜糖抗原。从流感嗜血杆菌获得的糖抗原是众所周知的。

较优地，将Hib糖共价结合到载体蛋白以增强其免疫原性，尤其对于小孩。多糖结合物、特别是Hib荚膜多糖的制备已被大量报导【如参考文献19-27等】。本发明可应用任何合适的Hib结合物。

所述结合物的糖结构域可以是一种多糖(如全长多聚核糖磷酸盐(PRP))，但优选水解多糖(如通过酸水解)来生成寡糖(如MW从约1至约5kDa)。如果进行水解，水解产物可根据大小分类，以去除对产生免疫原性来说太短的寡糖。经分离大小适当的寡糖是优选的糖抗原。

优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉或破伤风类毒素。这些是在结合疫苗中常用的。CRM197白喉类毒素是特别优选的【28】。其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白【29】、合成肽【30，31】、热休克蛋白【32，33】、百日咳蛋白【34，35】、流感嗜血杆菌的蛋白D【36】、细胞因子【37】、淋巴因子【37】、激素【37】、生长因子【37】、艰难梭菌(C.Difficile)的毒素A或B【38】、铁吸收蛋白【39】等。也可应用载体蛋白的混合物。

糖结构可以直接或通过一种连接物结合到载体蛋白。直接连接可通过多糖的氧化作用实现，同时伴随着蛋白上氨的还原，如参考文献40和41所描述的。连接基团的连接可以应用任何已知的方法，比如参考文献42和43所描述的。合适的连接物包括羰基、脂肪酸、B-氨基丙酸【44】、硝基苯基乙胺【45】、盐酰卤【46】、配糖键【47】、6-氨基己酸【48】、ADH【49】、C₄至C₁₂结构域【50】等。

在结合前，糖通常被活化或功能化。活化作用可包括如氰化试剂，比如CDAP(如1-氰基-4-二甲氨基-吡啶硼酸四氟【51，52】。其他合适的技术应用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降莰烷、p-硝基苯酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU；还可参见参考文献53的介绍。还原氨化法是一种优选的技术。

一种优选的结合包含通过脂肪酸琥珀二酯【54，55】将Hib糖共价地连接到CRM197上。

本发明的组合物可包含多于一种的Hib抗原。

(b)脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria Meningitidis)抗原

在组合物中脑膜炎奈瑟氏球菌抗原典型的是荚膜糖抗原(如来自血清组A，C，W135或Y)。来自脑膜炎奈瑟氏球菌的糖抗原是已知的。然而，当抗原来自血清组B时，更优选所述抗原是蛋白抗原，这是因为天然的MenB荚膜多糖包含自身抗原。如果要应用来自血清组B的糖抗原，更优选应用经修饰的糖抗原【如参考文献56，57，58】，如经N-丙酰化作用修饰的抗原。来自其他血清组的糖的化学修饰也是可行的。

所述糖优选寡糖，即荚膜多糖的片断。可将多糖进行处理来获得更短的寡糖，这可通过纯化和/或天然多糖分段来处理(如通过温和的酸水解、加热、分级色谱等)。优选的MenC寡糖公开在参考文献59和60中。

所述糖优选可结合到前述载体蛋白的。

本发明的组合物可包含多于一种的脑膜炎抗原。优选包括来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、W135和Y中至少两种(即2，3或4)的荚膜糖抗原【61】。

当一种混合物包含同时来自血清组A和C的荚膜糖时，优选MenA糖：MenC糖的比值(w/w)高于1(如2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，10∶1或更高)。出乎意料的是，当MenA组分的存在超过(质量/剂量)MenC组分时，观察到MenA组分免疫原性的提高。

当一种混合物包含来自血清组W135和至少一种来自血清组A、C、Y的荚膜糖时，出乎意料地发现，当与来自其他血清组的糖组合给药时，MenW135糖的免疫原性高于单独给药(在相同剂量等)【61】。因而这里MenW135抗原产生的免疫应答能力高于不与其他血清组抗原组合给药时相应量的相同抗原。这种免疫原性提高的测定可以通过将MenW135抗原给药于对照动物，将混合物给药于试验动物，比较产生的抗体的效价，可使用标准的分析法如杀菌效价、放射性免疫测定和ELISA等进行。包含来自血清组W135和其他血清组的增效组合物的疫苗是免疫学上较优的，他们能增强抗W-135的应答和/或降低W135剂量。

当应用来自血清组B的蛋白抗原时，优选应用公开在参考文献62至71中的蛋白的一种。优选的蛋白抗原包含“287”蛋白或其衍生物(如△G287)。

也可应用来自血清组B的外膜囊(OMV)抗原【如72，73】。

本发明的组合物可包含多于一种脑膜炎抗原。

(c)肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原

在组合物中肺炎链球菌抗原典型的是荚膜糖抗原，优选能结合到前述载体蛋白的【如74，75，76】。

优选包含来自多于一种肺炎链球菌血清型的糖，比如，来自23种不同血清型的多糖混合物已被广泛应用，作为结合疫苗具有来自5至11种不同血清型的多糖【77】。比如，PrevNar^TM包含来自7种血清型(4，6B，9V，14，18C，19F和23F)的抗原，每种糖各自通过还原氨化法结合到CRM197。

因而，本发明的组合物可包含多于一种肺炎球菌抗原。

进一步的组分--佐剂

本发明的组合物通常包含一种粘膜佐剂。粘膜佐剂包括但不限于：(A)大肠杆菌(E.coli)热不稳定肠毒素(LT)，或其解毒突变体，如K63或R72突变体【如参考文献78的第5章】；(B)霍乱毒素(CT)，或其解毒突变体【如参考文献78的第5章】；或(C)用生物可降接的和无毒的材料(如多聚(α-羟基酸)、多聚羟基丁酸、聚原酸酯、多聚酸酐、多聚己内酯等)制作的微粒(即直径约100nm至约150μm的颗粒，更优选直径约200nm至约30μm的颗粒，最优选直径约500nm至约10μm的颗粒)；(D)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯【79】；(E)聚氧乙烯山梨糖酯表面活性剂结合辛苯醇醚【80】，或聚氧乙烯烷醚或酯表面活性剂结合至少一种其他非离子的表面活性剂如辛苯醇醚【81】；(F)壳聚糖【如82】；(G)免疫刺激寡核苷酸(如CpG寡核苷酸)；(H)双链RNA；(I)皂角苷【83】；(J)但磷酸脂质体A模拟物，如氨基烷基磷酸氨基葡糖苷衍生物(如RC-529)【84】；或(K)聚磷腈(PCPP)。还存在其他一些粘膜佐剂【如可参见参考文献85的第7章】。

优选的粘膜佐剂是细菌ADP-核糖基化毒素或它们的突变体。比如，霍乱毒素(CT)或大肠杆菌(E.coli)热不稳定肠毒素(LT)是有效的粘膜佐剂，还包括它们的解毒变体【86】。CT和LT是同源的，并且通常是可交换的。

CT和LT的解毒作用可以通过化学或优选地通过遗传学手段进行。合适的例子包括：LT在氨基酸第63位上具有一个赖氨酸残基【LT-K63-参考文献87】，并且LT在氨基酸第72位上具有一个精氨酸残基【LT-R72-参考文献88】。其他合适的突变体包括将LT63位用酪氨酸残基替换【Y63-参考文献89】，不同的突变体公开在参考文献90中，称为D53，K97，K104和S106，及其结合的状况(如LT同时具有D53和K63突变)。

所述组合物可包含生物粘附成分【91，92】，如酯化的透明质酸微球【93】，或在更优选的体现方式中，粘液粘附选自聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖或羧甲基纤维素的交联的衍生物。

本发明的组合物可包含多于一种的粘膜佐剂。

进一步的组分-抗原

来自流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌和肺炎链球菌的抗原是较佳的，因为他们都能引起细菌性脑膜炎。能诱导抗其他微生物的免疫应答的抗原也可包含在本发明的组合物中，如：

--来自幽门螺旋杆菌(Helicobacter Pylori)的抗原，如CagA【94至97】、VacA【98，99】、NAP【100，101，102】、HopX【如103】、HopY【如103】和/或脲酶。

--来自肝炎A病毒的抗原，如灭活的病毒【如104，105】。

--来自肝炎B病毒的抗原，如表面和/或核心抗原【如105，106】。

--来自肝炎C病毒的抗原【如107】。

--来自百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的抗原，如来自百日咳博德特氏菌的百日咳全毒素(PT)和细丝状血凝素(FHA)，也可任选地与百日咳杆菌黏附素和/或凝集原2和3相结合【如参考文献108和109】。

--白喉抗原，比如白喉类毒素【如参考文献117的第3章】，如CRM₁₉₇突变体【如83】。

--破伤风抗原，比如破伤风类毒素【如参考文献114的第4章】。

--来自淋病双球菌(N.gonorrhoeae)的抗原【如62至65】。

--来自肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的抗原【如110，111，112，113，114，115，116】。

--来自砂眼衣原菌(Chlamydia trachomatis)的抗原【如117】。

--来自牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis)的抗原【如118】。

--小儿麻痹抗原【如119，129】，比如IPV或OPV。

--狂犬病抗原【如121】，比如冻干的灭活的病毒【如122，RabAvert^TM】。

--麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原【如参考文献123的第9、10、11章】。

--流感抗原【如参考文献123的第19章】，比如血凝素和/或神经氨酸苷酶表面蛋白。

--来自副粘病毒如呼吸融合病毒(RSV【124，125】)和/或副流感病毒(PIV3【126】)的抗原。

--来自卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的抗原【如127】。

--来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌)的抗原【如128，129】。

--来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)的抗原【如129，130，131】。

--来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原【如132】。

所述组合物可包含这些抗原的一种或多种。

当存在结合物时，所述组合物还可包含自由载体蛋白【133】。

优选的，所述组合物不包括全细菌(不管完整的或被裂解的)。

本发明的组合物可包含模拟糖抗原的蛋白，如模拟型【134】或抗个体基因型抗体。它们可取代相应的糖组分或可补充它们。作为举例，所述疫苗可包含MenC【135】或MenA【136】荚膜多糖的肽模拟物，取代所述糖自身。

本发明的组合物可包含核酸，用作“遗传免疫作用”【如137】。所述核酸将编码所述组合物的一种蛋白组分，其可取代相应的蛋白组分(包括前面章节中的那些)，或可补充它们。作为举例，所述疫苗可包含编码破伤风毒素的DNA。

进一步的组分--制剂

本发明的组合物优选包括一种药学上可接受的载体。

“药学上可接受的载体”包括任何载体，所述载体自身不会诱导抗体产物对接受所述组合物的个体产生毒害。合适的载体通常是大的，缓慢转变成大分子如蛋白质、多糖、多聚乳酸、多聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物、海藻糖【138】、脂质聚合体(如油滴或脂质体)、以及灭活病毒颗粒。所述载体对于本领域的普通技术人员是熟悉的。所述疫苗还包括稀释液，比如水、生理盐水、甘油等。另外，也可存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质以及类似物质。载体将与粘膜给药相协调。完整的关于药学可接受赋形剂的讨论可参见雷明顿药物科学。

本发明的组合物优选是无菌的。

本发明的组合物优选是经缓冲的。

本发明的组合物优选是无热原的。

本发明的组合物在包装时，其组分(a)、(b)和/或(c)可混合包装，或这些组分可保持分离，直至向患者给药时再将它们混合。当分离包装时，单个组分可分别制成冻干形式或溶液/悬浮液。在给药时冻于的组分需要重悬(如在缓冲液中)。如佐剂等组分可存在于缓冲液中或存在于冻干材料中。

免疫原性组合物

本发明的组合物优选免疫原性组合物(如疫苗)。基于糖或糖-蛋白质结合物的疫苗的制剂是本领域已知的。

免疫原性组合物包含免疫学有效量的抗原，以及任何其他所需的特定组分。“免疫学有效量”是指给予个体一定的量(单剂量或作为一系列剂量的部分)，所述用量对于治疗或预防是有效的。量的变化取决于给药个体的健康和生理状况、年龄、个体的分类组(如非人灵长类、灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、需要达到的预防程度、疫苗配方、治疗医生对药物状况的评价、以及其他相关因素。预计所述用量在相对宽的范围内将下降，可通过常规试验进行测定。

治疗方法

一旦配制完毕，本发明的组合物可以直接给药于患者，所述患者通常是人，特别是儿童或少年。进一步优选的患者类型是成年妇女，特别是分娩阶段或怀孕的妇女。本发明的组合物特别适于通过母婴途径被动免疫儿童。

组合物中的抗原诱导抗某些细菌的免疫应答。这些免疫应答优选保护性的，即保护患者以后不被细菌感染。因而，尽管本发明的组合物也可应用于治疗用途(在感染后进行治疗)，它们优选应用于预防(即防止感染)。免疫应答优选患者体内含有杀菌抗体的产物的。

本发明提供了一种在患者体内升高免疫应答的方法，包括通过粘膜途径(即鼻内)对患者施用一种本发明的疫苗。免疫应答优选保护性对抗由流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌和/或肺炎链球菌引起的细菌性脑膜炎和/或细菌菌血症。组合物中各抗原性组分优选同时和组合给药。然而，在其他体现方式中，它们可以被分离地给药，可以同时或先后给药。当被分离地给药时，所述组分优选给药于相同的粘膜表面。

本发明还提供了本发明的组合物作为药物的应用。

本发明还提供了以下抗原在制造用于免疫患者的药物中的应用：(a)一种抗原，其能诱导抗流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的免疫应答；(b)一种抗原，其能诱导抗脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria Meningitidis)的免疫应答；以及(c)一种抗原，其能诱导抗肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的免疫应答。

本发明的这些方法和应用可包含一种先发/加强型给药方案。本发明的方法和应用可以是先发剂量再伴随着加强剂量，其中加强剂量可以通过粘膜或肠道外途径给药。同样地，本发明的方法和应用可在已被免疫学先发的患者体内提升加强型应答，其中先发剂量可通过粘膜或肠道外途径给药。加强剂量可包含比先发剂量较少的抗原，如其可使用单抗原。

在先发和/或加强给药时，剂量可以是单剂量或多剂量的，本发明的组合物可以以单位剂量的形式存在。

制造方法

本发明提供了一种用于制造本发明的组合物的方法，包含混合两种或多种以下的抗原：(a)一种抗原，其能诱导抗流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的免疫应答；(b)一种抗原，其能诱导抗脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria Meningitidis)的免疫应答；以及(c)一种抗原，其能诱导抗肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的免疫应答，并且配制混合物用于粘膜给药。

附图的简要说明

图1显示了几何平均数血清IgG抗体抗MenC效价。在X轴上的标记表示所应用的佐剂。每对结果中左边空白柱形表示将单个糖抗原给药后获得的数据，右边阴影柱形表示将组合的糖抗原给药后获得的数据。图1A表示抗MenC应答，图1B表示抗Hib应答。误差条图是标准差在标准误差的范围内。

图2显示了杀菌性抗体抗MenC效价。如在图1中的一样，带阴影柱形的数据表示应用组合的糖抗原的结果。

图3显示了来自洗鼻水的抗MenC IgA效价。如前，带阴影柱形的数据表示应用组合的糖抗原的结果。

实施本发明的方式

组合的Hib/MenC组合物

脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C荚膜寡糖通过分大小的寡糖选择性末端减少活化来制备。相同的方法也可应用于B型流感嗜血杆菌，糖通过一种碳氢化合物间隔团(ChrionSiena，意大利)被结合到蛋白载体CRM197上【139】。结合物被稀释在磷酸缓冲液(PBS)中，与以下物质相组合：(i)突变体大肠杆菌热不稳定肠毒素LTK63或LTR72，(ii)氢氧化铝(Superfos Biosector a/s)或(iii)来自Sigma的霍乱毒素(CT)。用于组合给药时这些制剂在使用前进行混合。

组合物的粘膜给药

同时进行两种同样的给药研究。每组10只6-10周龄的雌BALB/C小鼠单独使用10μg的MenC或Hib、组合使用CT(1μg)或组合使用LT突变体(1μg和10μg)进行鼻内免疫。作为对照，另一组的小鼠使用10μg的MenC或吸附到铝盐的Hib进行IM免疫。所述组合物在同一天制备，小鼠在第0，21和35天被免疫。50μl的组合物被注射到未麻醉小鼠的股部或逐渐灌输入鼻孔。在第49天提取血样以及洗鼻水样品(NW)。

为了评价当两者混合时结合物的免疫原性是否被削弱，还进行了第三种研究，将两种疫苗同时给药于相同的小鼠组，使用与前述相同的剂量和给药方案。

对组合物的免疫应答

对MenC结合物产生应答的抗体通过ELISA来测定，应用前述但经变更的步骤【140】。简言之，ELISA板用己二酸二酰肼-衍化的MenC糖包被，4℃过夜。使用羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物来获得特异性抗体。测试样品和内部对照的MenCIgG抗体效价被表示为相应的血清稀释度，OD＝1.0。每种血清样品一式两份进行分析，平均值被用于计算几何平均数，标准差在标准误差内。抗Hib PRP的抗体的测定与MenC ELISA类似，但是ELISA板用BSA结合PRP(PRP-BSA)包被。效价以OD₄₅₀表示，血清稀释度1∶50。

使用生物发光试验(BIA)分析洗鼻水的IgA抗MenC【141】。简要地，使用同样的试剂和包被步骤来测定血清IgG抗MenC。然后，加入生物素化的羊抗鼠IgA作为第一抗体。效价表示在平均背景上，在至少两个标准差截止值上计算log RLU数据，推断出的对数稀释度值。

如前所述在混合血清中测定了补体介导的抗MenC细菌的杀菌活性【140】。通过计算血清稀释度来测定效价，在1小时孵育后CFU数量数量显示有50％的降低。

图1A显示了几何平均数的抗MenC的血清IgG抗体效价，MenC单独(空白柱形)或与Hib抗原组合(阴影柱形)。通过与LT突变体组合应用得出的血清抗体应答明显高于应用单个抗原得出的结果。在低剂量时，LTR72显示了比LTK63更高的免疫佐剂作用。最值得注意地，在进行鼻内免疫诱导的抗体应答时，与LT突变体组合使用获得的结果和与应用野生型CT结合使用获得的结果是相当的，也与应用铝盐辅佐的疫苗肌肉注射诱导的抗体应答相当。重要地，第二种结合的糖抗原的添加不会影响对任一抗原的抗体应答。

图1B显示了几何平均数的抗Hib PRP糖的血清IgG抗体效价。与用于MenC时一样，与LT突变体组合使用产生的抗体应答高于单独使用该抗原。同时，LTR72显示更好的免疫佐剂作用。在用LT突变体鼻内免疫取和铝盐辅佐的疫苗肌肉注射的小鼠中，产生了相当的效价。并且，比较MenC与Hib结合引起的抗Hib应答和Hib单独免疫引起的应答，发现两种糖结合疫苗进行鼻内免疫后没有产生竞争迹象。

由LT突变体鼻内免疫引起的杀菌抗体的水平与ELISA血清IgG应答密切相关，也与由CT引起的应答或与铝盐吸附的疫苗肌肉注射的结果相当(图2)。

使用MenC和LT突变体鼻内免疫后的洗鼻水样品，与缺失佐剂的鼻内免疫后的样品相比，显示更高的IgA效价(图3)。如预料的一样，肌肉免疫产生非常低的IgA效价。

结论

对抗脑膜炎奈瑟氏球菌和流感嗜血杆菌的有效的血清抗体应答可以由鼻内免疫来诱导，使用结合疫苗并结合使用粘膜佐剂。而且，对于MenC抗原，由鼻内免疫诱导的抗体具有有效的杀菌活性，这可与保护性免疫相关联【142】。并且，鼻腔中的IgA应答仅在使用动物鼻内给药途径时才产生。诱导分泌免疫是重要的，因为上呼吸道是一些病原体的入口，所述病原体包括脑膜炎奈瑟氏球菌和流感嗜血杆菌。

基于获自结合疫苗(单独和组合给药)的抗体效价，以及测定对抗MenC的杀菌活性，两种疫苗组合并与粘膜佐剂共同给药对抗MenC或Hib的抗体不产生负面影响。因而结果表明，鼻内免疫是一条有效的免疫途径，用于多糖-蛋白结合疫苗与粘膜佐剂如LT突变体的组合给药。

相同剂量的LT突变体足以显著增强同时给药的结合疫苗的免疫原性。这是特别重要的，因为它能降低佐剂的用量以及降低潜在的中毒危险。重要地，已存在的抗LTK63突变体的免疫不会影响该突变体作为佐剂用于第二抗原的能力【2】。此外，通过将疫苗加入到生物粘附递送系统中，粘膜给药疫苗的潜能将进一步增强【91】。

总之，将多糖-蛋白结合疫苗与LT突变体组合用于鼻内免疫是一种有效的用于儿科的粘膜免疫途径。 

可以理解，本发明仅通过上述实施例加以描述，有时可以进行适当的变更，这些变更也包括在本发明的范围和意愿中。

参考文献(这些参考文献的内容以完整的方式引用在这里)

[1]Bergquist等，(1998)APMIS 106：800-806.

[2]Ugozzoli等，(2001)J.Infect.Dis.183：351-354.

[3]Wenzel等，(1973)J.Infect Dis，128：31-40.

[4]Katial等，(2002)Infect.Immun.70：702-707

[5]Coppens等，(2001)Infect.Immun.69：5440-5446.

[6]国际专利申请WO00/53221.

[7]Yamamoto等，(1998)J.Immunol.161：4115-4121.

[8]Wu等，(1997)J.Infect.Dis.175：839-

[9]Corbel(1994)Biologicals 22：353-360.

[10]Rappuoli等，European Commission COST/STD Initiative，Report of Expert PanelVIII

[11]Pichichero(2000)Pediatr Clin North Am 47：407-426.

[12]国际专利申请WO02/00249.

[13]Corbel(1994)Dev.Biol.Stand.87：113-124.

[14]Eskola等，(1995)，“与分离的注射相比，两种剂量的结合的DTPa-Hib结合疫苗给药后，Hib抗体的应答”，第35届关于抗菌剂和化疗交流科学会议的摘要书，旧金山，17-20 Sep.1995。

[15]Schmitt等，(2001)Pediatr Infect Dis J 20：767-774.

[16]美国专利6,251,401.

[17]Almeida & Alpar(1996)J.Drug Targeting 3：455-467.

[18]Agarwal & Mishra(1999)Indian J Exp Biol 37：6-16.

[19]Lindberg(1999)Vaccine 17 Suppl 2：S28-36.

[20]Buttery & Moxon(2000)J R Coll Physicians Lond 34：163-168.

[21]Ahmad & Chapnick(1999)Infect Dis Clin North Am 13：113-33，vii.

[22]Goldblatt(1998)J.Med.Microbiol.47：563-567.

[23]欧洲专利0 477 508，

[24]美国专利5,306,492.

[25]WO98/42721.

[26]Dick等，in Conjugate Vaccines(Cruse等编)Karger，Basel，1989，10：48-114.

[27]Hermanson Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego CA(1996).

[28]Research Disclosure，453077(Jan 2002)

[29]EP-A-0372501

[30]EP-A-0378881

[31]EP-A-0427347

[32]WO93/17712

[33]WO94/03208

[34]WO98/58668

[35]EP-A-0471177

[36]WO00/56360

[37]WO91/01146

[38]WO00/61761

[39]WO01/72337

[40]美国专利4,761,283

[41]美国专利4,356,170

[42]美国专利4,882,317

[43]美国专利,695,624

[44]WO00/10599

[45]Gever等，，Med.Microbiol.Immunol，165：171-288(1979).

[46]美国专利4,057,685.

[47]美国专利4,673,574；4,761,283；4,808,700.

[48]美国专利4,459,286.

[49]美国专利4,965,338

[50]美国专利4,663,160.

[51]Lees等，(1996)Vaccine 14：190-198.

[52]WO95/08348.

[53]国际专利申请WO98/42721.

[54]Kanra等，(1999)The Turkish Journal of Paediatrics 42：421-427.

[55]Ravenscrosft等，(2000)Dev Biol(Basel)103：35-47.

[56]美国专利4,727,136.

[57]美国专利5,811,102.

[58]Jennings(1998)Adv Exp Med Biol 228：495-550.

[59]Costantino等，(1992)Vaccine 10：691-698.

[60]Costantino等，(1999)Vaccine 17：1251-1263/

[61]英国专利申请0115176.0.

[62]WO99/24578

[63]WO99/36544

[64]WO99/57280

[65]WO00/22430

[66]Tettelin等，(2000)Science 287：1809-1815

[67]Pizza等，(2000)Science 287：1816-1820

[68]WO00/66741

[69]WO00/71725

[70]WO01/64922

[71]WO01/64920

[72]WO01/52885

[73]Bakke等，(2001)Infect Immun 69(8)：5010-5015.

[74]Watson(2000)Pediatr Infect Dis J 19：331-332.

[75]Rubin(2000)Pediatr Clin North Am 47：269-285，v.

[76]Jedrzejas(2001)Microbiol Mol Biol Rev 65：187-207.

[77]Zielen等，(2000)Infect.Immun.68：1435-1440.

[78]Del Giudice等，(1998)Molecular Aspects of Medicine，vol.19，number 1.

[79]国际专利申请WO99/52549..

[80]国际专利申请WO01/21207.

[81]国际专利申请WO01/21152.

[82]国际专利申请WO99/27960.

[83]国际专利申请WO00/62800.

[84]Johnson等，(1999)Bioorg Med Chem Lett9：2273-2278.

[85]疫苗设计：亚基和佐剂途径，Powell & Newman，Plenum Press 1995(ISBN0-306-44867-X).

[86]Del Guidice等，(1998)Molecular Aspects of Medicine 19：1-70.

[87]WO93/13202

[88]WO98/18298

[89]Park等，(2000)Exp.Mol.Med.32：72-8.

[90]Fontana等，(1995)Infect.Immun.63：2356-2360.

[91]国际专利申请WO00/50078.

[92]国际专利申请WO99/62546.

[93]Singh等，(2001)J.Cont，Rele.70：267-276.

[94]Covacci & Rappuoli(2000)J.Exp.Med.19：587-592.

[95]WO93/18150.

[96]Covacci等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5791-5795.

[97]Tummuru等，(1994)Infect.Immun.61：1799-1809.

[98]Marchetti等，(1998)Vaccine 16：33-37.

[99]Telford等，(1994)J.Exp.Med.179：1653-1658.

[100]Evans等，(1995)Gene 153：123-127.

[101]WO96/01272 & WO96/01273，especially SEQ ID NO：6.

[102]WO97/25429.

[103]WO98/04702.

[104]Bell(2000)Pediatr Infect Dis J 19：1187-1188.

[105]Iwarson(1995)APMIS 103：321-326.

[106]Gerlich等，(1990)Vaccine 8 Suppl：S63-68 & 79-80.

[107]Hsu等，(1999)Clin Liver Dis 3：901-915.

[108]Gustafsson等，(1996)N.Engl.J.Med.334：349-355.

[109]Rappuoli等，(1991)TIBTECH 9：232-238.

[110]WO02/02606.

[111]Kalman等，(1999)Nature Genetics 21：385-389.

[112]Read等，(2000)Nucleic Acids Res 28：1397-406.

[113]Shirai等，(2000)J.Infect.Dis 181(Suppl 3)：S524-S527.

[114]国际专利中请WO99/27105.

[115]国际专利申请WO00/27994.

[116]国际专利申请WO00/37494.

[117]国际专利申请WO99/28475.

[118]Ross等，(2001)Vaccine 19：4135-4142.

[119]Sutter等，(2000)Pediatr Clin North Am 47：287-308.

[120]Zimmerman & Spann(1999)Am Fam Physician 59：113-118，125-126.

[121]Dreesen(1997)Vaccine 15 Suppl：S2-6.

[122]MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1998 Jan 16；47(1)：12，19.

[123]Vaccines(1988)，Plotkin & Mortimer编.ISBN 0-7216-1946-0.

[124]Anderson(2000)Vaccine 19 Suppl 1：S59-65.

[125]Kahn(2000)Curr Opin Pediatr 12：257-252.

[126]Crowe(1995)Vaccine 13：415-421.

[127]McMichael(2000)Vaccine 19 Suppl 1：S101-107.

[128]Schuchat(1999)Lancet 353(9146)：51-6.

[129]国际专利申请PCT/GB01/04789.

[130]Dale(1999)Infect Dis Clin North Am 13：227-43，viii.

[131]Ferretti等，(2001)PNAS USA 98：4658-4663.

[132]Kuroda等，(2001)Lancet 357(9264)：1225-1240；同时参见1218-1219页.

[133]WO96/40242

[134]Charalambous & Feavers(2001)J Med Microbiol 50：937-939.

[135]Westerink(2001)Int Rev Immunol 20：251-261.

[136]Grothaus等，(2000)Vaccine 18：1253-1263.

[137]Donnelly等，(1997)Annu Rev Immunol 15：617-648.

[138]WO00/56365

[139]Constatino等，(1992)Vaccine 10：691-698.

[140]Dan等，(1998)Clin.Diagn.Lab.Immunol.5：479-485.

[141]Ugozzoli等，(1998)Immunology 93：563-571.

[142]Goldschneider等，(1969)J Exp Med.129：1367-1384.