人类免疫缺陷病毒HIV－1核酸扩增－荧光定量检测试剂盒

摘要

本发明属诊断试剂技术领域，具体为一种利用多重引物对人免疫缺陷病毒HIV－1进行实时检测的PCR－荧光定量检测试剂盒。该试剂盒包含裂解液、硅胶吸附柱、洗涤液、引物、探针、工作标准品、酶混合物和对照试剂等。其中，引物选自编码HIV基因gag区的保守序列，并采用多重引物组合的方式，探针采用MGB－Taqman探针，工作标准品选用HIV－1gag基因的体外转录RIA的梯度稀释物。本发明试剂盒具有良好的检测灵敏度，可与荧光定PCR仪配合使用，对临床血清或血浆标本中的HIV RNA进行定性和定量检测，也可对抗HIV－1药物的疗效进行检测。

说明书

技术领域

本发明属诊断试剂技术领域，具体涉及一种利用多重引物对人类免疫缺陷病毒HIV-1进行实时检测的PCR-荧光定量检测试剂盒。

背景技术

人类免疫缺陷病毒HIV-1是一个基因序列高度变异的逆转录病毒，目前已知病毒亚型超过11种，我国主要的流行株是A、B、B/C、D和E亚型。而A、E和B、C、D等亚型与其他亚型在通常扩增所采取的gag区基因序列上差异较大，很难找到gag序列完全一致的较长片段。因此普通的PCR检测技术较难扩增出所有的基因亚型，其后果是产生漏检或各种亚型间的定量不准确。

PCR技术诞生于上世纪80年代，最初以PCR扩增+琼脂糖电泳模式应用于核酸诊断，目前常用的是荧光定量PCR技术。荧光定量PCR技术所用探针可分为水解探针和杂交探针两类。水解探针即目前最为广泛的Taqman Probes；杂交探针则主要有分子信标(MolecularBeacons)和基于荧光能量共振转移系统的双杂交探针(FRET Hybridization Probes)等。而RT-PCR扩增则是采取“一步法”的形式，即逆转录与PCR扩增在同一个反应管内依次进行，采用AMV逆转录酶和普通Taq酶组合，在同一反应液中进行逆转录和PCR扩增。

Taqman技术发展于九十年代初期，成熟于1995年，由美国ABI公司提出，其基本原理是在普通的PCR系统中，加入一条与靶片段两引物内的序列互补的荧光标记探针，该探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团，称Taqman探针。当探针完整时，由于淬灭基团的作用，报告基团不能产生荧光，当有靶片段存在时，标记探针与之结合，在PCR过程中，当引物延伸至标记探针结合部位时，由于Taq酶具有5’-3’端核酸外切酶活性，遂将探针5’端的荧光报告基团切下(水解)。由于报告基团与淬灭基团分离，淬灭作用解除，报告基团即可发出荧光信号，其强弱随PCR扩增进程不断加强，并与PCR产物的数量成正比。经特定的荧光分析仪测得荧光信号，可实时动态定量观察PCR扩增的对数期、线性期和平台期的变化。

MGB(Minor Groove Binder)是不同于Taqman探针、杂交探针和分子信标的另一类探针。普通的Taqman探针在5’端标记荧光报告基团(如FAM等)，在3’端标记荧光淬灭基团(如TMARA)，而MGB探针在普通的Taqman探针的3’端再连接一个多肽修饰物，其作用可以大大提高荧光和模板结合的Tm值(平均15bp长的探针可提高18℃)。因此，与普通的Taqman探针相比，可以使探针的长度缩短，报告基团与淬灭基团的位置更近，淬灭效果好，反应液的荧光本底低，分辨率提高；而较短的探针也便于在高度变异的HIV-1gag基因区设计包含各种亚型的荧光探针；较高的Tm值也提高了与非特异性配对间的差异，提高了检测的特异性。

基于TaqMan探针的荧光定量PCR技术是一种定量检测病毒拷贝数的方法。德国ATRUS公司和中国深圳匹基生物工程公司已开发出用上述方法检测相关疾病的试剂盒。但ATRUS公司只是一套PCR扩增和检测试剂组合，没提供相应的标本处理试剂和方案。而匹基公司只是采用RT-PCR两步法进行扩增，且受检标本仅限于血浆。

发明内容

本发明的目的在于提出一种可用于临床血清或血浆标本中的HIV RNA的定性及定量检测，也可用于HIV-1感染的辅助诊断及抗HIV-1药物治疗效果的检测的PCR-荧光定量检测试剂盒。

本发明提出的人类免疫缺陷病毒HIV-1的PCR-荧光定量检测试剂盒，它包含裂解液、硅胶吸附柱、洗涤液、洗脱液、引物、探针、工作标准品、酶混合物和对照试剂，其中，所述裂解液为裂解血清和血浆标本中病毒颗粒的硫氰酸胍溶液，所述洗涤液含乙醇溶液，并含有硫氰酸胍溶液和Tris溶液，所述洗脱液含0.04％NaN₃的无Rnase的灭菌双蒸水，所述引物选自编码HIV基因gag区的保守序列，所述探针为MGB-Taqman探针，所述工作标准品为含HIV-1 gag基因的体外转录RNA的梯度稀释物，所述酶混合物为逆转录酶、DNA扩增酶和dNTP。

本发明的试剂盒中，所述洗涤液包括含硫氰酸胍的洗涤液A，和含Tris的洗涤液B。

本发明的试剂盒中，所述硅胶吸附柱作为核酸纯化柱，采用真空负压抽提方法进行纯化病毒RNA。

本发明采取核酸纯化柱加负压抽提装置的RNA核酸提取方法来处理标本。该技术的原理是利用病毒核酸与其他核酸或蛋白质在不同条件下与硅胶吸附柱结合能力的差异，通过负压抽提组件和乙醇洗涤液将非病毒核酸类杂质去除，再用低盐水或水将仍吸附于硅胶吸附柱上的病毒洗脱下来。该技术原应用于各类科研用分子生物学试剂，现将其应用于本诊断试剂后，一方面避免了传统方法中使用酚氯仿、异丙醇等有毒试剂，另一方面引入机械化操作，减少了人为操作对结果产生的不利影响。所述负压抽提组件可由一个负压形成系统(如真空装置)和一个或若干个与硅胶吸附柱的接口组成，即可使用本硅胶吸附柱纯化系统。

由于HIV病毒亚型众多，基因序列变异复杂，往往难以用一对引物来扩增HIV的所有亚型。因此用一对引物来扩增就会产生漏检或各种亚型间的定量不准确的后果，尤其是A、A/E亚型和B/C、D等其他亚型的基因序列差异较大时，这种技术缺陷会更加明显。因此，本发明的试剂盒中，所述引物和探针序列来自于HIV基因序列的gag区，经过与已知序列的多个HIV毒株进行BLAST比较后，选取保守区域。

经过序列比较，设计出两条上游引物，分别与下游引物配对，其中上游引物primer1与下游引物primer3配对，用于扩增B、C、D亚型；而上游引物primer2与下游引物primer3配对，用于扩增A、E亚型。

引物序列可以选用下列相关组合：

组合A.

primer1(F)：  5’-taa aca tag tgg ggg gac acc a-3’(记为SEQ.ID.NO.1)

primer2(F)：  5’-taa aca cag tgg ggg gac atc a-3’(记为SEQ.ID.NO.2)

primer3(R)：  5’-ttc ctg cta tgt cac ttc ccc t-3’(记为SEQ.ID.NO.3)

组合B.

primer1(F)：  5’-g ggg aca tca agc agc cat gca aat-3’(记为SEQ.ID.NO.4)

primer2(F)：  5’-g ggg aca cca ggc agc aat gca aat-3’(记为SEQ.ID.NO.5)

primer3(R)：  5’-tac tag tag ttc ctg cta tgt cac ttt c-3’(记为SEQ.ID.NO.6)

组合C.

primer1(F)：  5’-g ggg aca tca agc agc cat gca aat-3’(记为SEQ.ID.NO.4)

primer2(F)：  5’-tag tag ttc ctg cta tgt cac ttc c-3’(记为SEQ.ID.NO.7)

primer3(R)：  5’-ttc ctg cta tgt cac ttc ccc t-3’(记为SEQ.ID.NO.3)；

上述3种组合中，primer1与primer3配对，用于扩增B、C、D亚型，primer2与primer3配对，用于扩增A、E亚型。

上述组合均可对HIV-1 A、B、C、D、E等亚型进行等效率扩增，避免亚型间的漏检。但是，三者组合相比，组合A在检测灵敏度、荧光信噪比性能方面效果更佳。

本发明的试剂盒中，内部参考品P1、P2、P3、P4、P5分别选用HIV-1型病毒的A、B/C、C、D、E亚型(来自美国，经gp41 env序列比较确认)，为明确体现各对引物对不同亚型HIV-1病毒的扩增状况，对上述5份标本分别用primer1/primer3(主要检测B/C亚型)、primer2/primer3(主要检测A亚型)和primer1-primer2/primer3(多重引物)进行扩增，并采用相同的MGB荧光探针进行检测。附图1、2、3、4、5表示了分别与P1(HIV-1A亚型)、P2(HIV-1B/C亚型)、P3(HIV-1C亚型)、P4(HIV-1D亚型)、P5(HIV-1E亚型)的比较，比较结果显示，用primer2/peimer3组合扩增HIV-1的A、D、E亚型结果较好，扩增B/C、C亚型较差，并且P3(HIV-1，C)还漏检；用primer1/primer3组合扩增B/C、D亚型结果较好，扩增C亚型结果一般，扩增A、E亚型较差；而采用primer1-primer2/primer3(多重引物)的组合，扩增上述5份不同的亚型标本的结果比较好。表明采用多重引物组合的方式对检测HIV-1各病毒亚型标本是有效的。

本发明的试剂盒采用多重PCR的方法，即在RT-PCR扩增反应中选用多对引物，针对不同亚型的基因序列分别扩增不同亚型的目的基因，使得反应液能对HIV-1各亚型进行等效扩增。

本发明的试剂盒中，所述MGB-Taqman探针的序列为：5’-FAM-acc atc aat gag gaagc-TAMRA(MGB)-3’，记为SEQ.ID.NO.8。

该技术用于定量检测是基于C_T和模板量的对应关系。荧光信号到达检测阀值的循环数称为样品的C_T值，即扩增曲线和检测阀值线的交叉点。C_T值的大小和样品的起始模板量成对数反比，用同步扩增的定量对照的C_T值和对应已知模板量汇制标准曲线。根据待测标本的C_T值，就可在标准曲线上推算出对应的起始模板量。

本发明的试剂盒的PCR扩增检测采用实时荧光定量PCR技术(参考：DNA/RNA Real-TimeQuantitative PCR-Rev.B Applied Biosystems)，可以实现每一轮循环均可检测一次荧光信号，采用的定量方法是外标准曲线定量方法。该定量方法是计算每个样品的扩增灵敏度指标Ct值，再根据试剂盒定量对照的标准曲线获得定量结果。同时设置了4份不同数量级水平的工作标准品(阳性工作标准品)和一份阴性对照，用于质控试剂盒的操作及定量计算。

本发明的试剂盒以含有0.05％NaN₃的HIV-1 RNA阴性的混合人血清为阴性对照物，以含有不同拷贝数的非传染性HIV-1体外转录RNA为定量对照物。而4份工作标准品为含有HIV基因的RNA体外转录物，预先用RNA稀释液稀释后使其HIV RNA基因拷贝数大致分别在10⁶、10⁵、10⁴、10³copies/ml左右。每批次工作标准品的HIV RNA基因拷贝数存在一定差异，需在制备时定值。本发明的试剂盒的强阳性对照含有约2×10⁶copies/ml的非传染性HIV-1体外转录RNA，弱阳性对照含有约2×10⁴copies/ml的非传染性HIV-1体外转录RNA。

由于PCR扩增易受多种因素影响而扩增失败，使试剂盒使用人员得出检测标本为阴性的错误结论。为避免试剂盒使用人员得出上述错误判断，本发明的试剂盒的最优组成中使用内参照扩增质控系统。即在裂解液中加入特定序列的内参照RNA，与标本共同经过裂解、纯化、扩增、检测各步骤。所述内参照RNA为一个克隆有HIV引物互补序列的体外转录RNA片断，其序列为SEQ.ID.NO.11。

SEQ.ID.NO.9的下划线部分为HIV引物的互补序列，内能照与待测标本在一个反应体系中同步进行扩增检测，检测内参照扩增产物的荧光探针标记HEX荧光，检测信号可以和检测HIV的FAM荧光基团相区别，HIV检测为阴性时，若内参照为阳性，说明反应体系中的PCR扩增反应正常进行，HIV阴性检测结果可信，若内参照亦为阴性，说明反应体系中的PCR扩增反应收到抑制，HIV阴性检测结果不可信，需要复测。采用这种内参照的质控方法可以有效避免PCR扩增检测中的假阴性检测结果。

本发明的试剂盒中，所述工作标准品中的含HIV-1gag基因的体外转录RNA的制备方法，包括如下步骤：

1)用正向引物IF2：3’-gct ttc agc cca gaa gta a-5’和反向引物IR2：3’-gatagg tgg att atg tgt c-5’进行RT-PCR扩增HIV RNA阳性标本，获得282bp的扩增产物：

2)扩增产物克隆到pGEM-T vector(Promega Cat.A3600)载体中，构建HIV-1阳性对照质粒：

3)HIV-1阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5a中，命名为pTIPC菌株，储存于-70℃；

4)纯化去除DNA，并鉴定RNA。

本发明试剂盒与BioMerieux公司的NASBA试剂盒平行检测101份包括HIV-1B‘、B、C、B‘/C、E亚型在内的HIV-1 RNA阳性标本，初测符合率97.1％，复测符合率99.0％，相关方程LOG(本发明试剂盒)＝0.88LOG(NASBA)+0.58，r＝0.80，P＜0.001，两者结果呈显著正相关，除个别样品外，定量检测差值均在1个LOG以内。

本试剂盒具有良好的检测灵敏度，对HIV-1B、B‘、C、D亚型检出率100％，对E亚型检出率94％。经临床单位复核，本产品的最低检测限度达到160copies/ml。对一般人群标本，本产品特异性达100％，对HBV和HCV感染标本无假阳性。

本发明的试剂盒对整个实验过程包括抽提、反转录反应及PCR扩增进行全程监控，同时利用抽提工作标准品(RNA)来避免用阳性血清作为质检品的风险并提高实际质检品的准确性。

本发明的试剂盒需配合荧光定量PCR仪使用，推荐使用瑞士Roche公司的Lightcycler型PCR仪。

附图说明

采用不同引物组合扩增不同亚型的比较：

图1、与P1(HIV-1A亚型)的比较；

图2、与P2(HIV-1B/C亚型)的比较

图3、与P3(HIV-1C亚型)的比较；

图4、与P4(HIV-1D亚型)的比较

图5、与P5(HIV-1E亚型)的比较

图中，A：Primer1、Primer2/Primer3

      B：Primer2/Primer3

      C：Primer1/Primer3

具体实施方式

实施例1HIV核酸RNA的提取

样品的预处理对于PCR扩增的影响较大，考虑到检测的敏感性和临床操作的实用性，选择核酸纯化柱与真空负压装置配套的核酸柱抽提方法提取血清或血浆标本中的核酸RNA，其核酸提纯原理、步骤如下：

(1)采用含硫氰酸胍的裂解液将标本中的各种蛋白及核酸酶变性，同时将HIV病毒颗粒中的HIV RNA释放出来，助沉剂确保微量的RNA沉淀下来；

(2)经70℃反应10分钟，去抑制剂将反应液中可能引起RT-PCR扩增受抑制的杂蛋白消化掉；

(3)将消化后的反应液加到核酸提取柱上，经负压抽取，反应液中HIV RNA吸附到核酸提取膜(硅胶膜)上，其余反应液穿过硅胶膜，流入废液缸中；

(4)经两遍洗涤，洗掉硅胶膜上残留的杂质；

(5)高速离心去除膜内残留的乙醇(乙醇会影响RT-PCR扩增)；

(6)将低盐的洗脱液加到硅胶膜上，中速离心，将吸附到膜上的HIV RNA洗脱到收集管中，洗脱下来的收集液就是纯净的HIV RNA溶液，可作为模板，用于随后的RT-PCR扩增、检测。

具体抽提步骤如下：

取100μl样品加入100μl混有助沉剂的裂解液和20μl去抑制剂，70℃反应10分钟，加入110μl无水乙醇，将全部液体移入负压装置上的核酸纯化柱内，开启负压，抽干柱内液体，分别用500μl洗涤液A、B各洗一次，然后14000rpm离心1分钟去除残留洗液。最终用50μl洗脱液洗脱，取洗脱下来的HIV RNA核酸模板用于随后的RT-PCR反应。

实施例2 多重PCR技术

本试剂盒的RT-PCR扩增则采用“一步法”的形式，即逆转录与PCR扩增在同一个反应管内依次进行，采用AMV逆转录酶和普通Taq酶组合，在同一个反应液中进行逆转录和PCR扩增。此RT-PCR扩增模式配合实时荧光检测模式，就可以避免扩增途中进行加盖、加样等操作，真正做到闭管检测，能有效避免扩增产物的污染。根据引物的退火温度等数据的分析结果，指定了试剂盒在Roche公司的LightCycler PCR扩增仪上运行时的温度循环。

PCR扩增产物的检测采用Taqman探针的实时荧光检测模式，在PCR扩增的目的基因内设计、合成一条标记FAM荧光基团的MGB-Taqman探针，加入到RT-PCR反应液中，进行实时荧光检测。

依据上述RT-PCR模式，确定在Roche公司的LightCycler扩增仪上的反应体积为20μl(10μl反应液+10μl核酸模板)，而考虑到试剂盒的稳定性，将AMV逆转录酶、Taq酶和荧光探针与PCR反应液分开存放，使用时再混合。由此确定试剂盒中的RT-PCR扩增检测试剂三个主要组成部分之间的混合比例。

实施例3 试剂盒各组分的配制与组装

试剂盒包括标本处理单元和核酸扩增定量检测单元。

标本处理单元采用硫氰酸胍裂解病毒后负压柱纯化的方法，要求配合负压抽提组件使用。其组成包括：

1.裂解液：    6M GTC(硫氰酸胍)，  1M Tris；

2.硅胶吸附柱；

3.洗涤液A：   6M GTC(硫氰酸胍)，  1M Tris；

4.洗涤液B：   1M NaCL，         1M Tris；

5.助沉剂；

6.去抑制剂；

7.洗脱液：    10％NaN₃，        DEPC纯化水。

核酸扩增定量检测单元采用荧光定量PCR原理，要求配合荧光定量PCR仪使用。其组成包括：

1.PCR反应液：DEPC纯化水，10×Buffer，25mMdNTP，50μM primer(F)(序列

5’-taa aca tag tgg ggg gac acc a-3’(SEQ.ID.NO.1)，5’-taa acatag tgg ggg gac  acc a-3’(SEQ.ID.NO.2)，50μM primer(R)(序列5’-ttc ctg cta tgt cac ttc ccc t-3’(SEQ.ID.NO.3))，50％甘油，100mMDTT，25mM MgCL2，PCR增强剂，保护剂I；

2.酶混合物：40μ/μl Rnasin，10μ/μl AMV，5μ/μl TaqE，1μg/μlBSA，保护剂II，Storage Buffer B；

3.探针：50μM Taqman探针(序列5’-FAM-acc atc aat gag gaagc-TAMRA(MGB)-3’(SEQ.ID.NO.8))，DEPC纯化水；

4.阴性对照：10％NaN₃，阴性血清；

5.定量对照：经稀释得到的拷贝数分别为2×106拷贝/ml、2×104拷贝/ml的非传染性体外转录RNA。

实施例4 工作标准品的配制

(1)包含试剂盒HIV-1目的基因的较大片段的扩增

在试剂盒设计的目的基因(151bp)外侧设计一对引物(IF2/IR2)，该对引物能扩增包含试剂盒检测目的基因的较大片段(282bp)，此片段可用来制备包含Hiv-1目的基因的体外转录物。序列为：

IF2：3’-gct ttc agc cca gaa gta a-5’(SEQ.ID.NO.9)

IR2：3’-gat agg tgg att atg tgt c-5’(SEQ.ID.NO.10)

用正向引物IF2：3’-gct ttc agc cca gaa gta a-5’和反向引物IR2：3’-gatagg tgg att atg tgt c-5’进行RT-PCR扩增HIV RNA阳性标本，获得282bp的扩增产物。

(2)扩增产物克隆

将扩增产物克隆到pGEM-T vector(Promega Cat.A3600)载体中，构建HIV-1阳性对照质粒。

(3)体外转录

将得到的HIV-1阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5a中，命名为pTIPC菌株，贮存于-70℃。取该菌株含1％Amp的LBA培养液大量培养后，用Promega公司的质粒抽提试剂盒(Wizard plus Maxipreps DNA Purification System)制备大量质粒。经酶切鉴定(Apal+Sacl双酶切)，2％Agarose电泳见到约350bp的目的片段。将上述制备得到的大量质粒用Promega公司的内切酶Sal切成线形质粒，用胶回收试剂盒将酶切产物进行纯化。纯化后的线形质粒用Promega公司的Riboprobe Combination System(使用T7 RNA聚合酶)将之转录为RNA。

(4)纯化去除DNA

用Dnase处理上述得到的HIV-1体外转录RNA，消化其中残余的DNA模板。然后用QIAGEN公司的Rnase Mini Kit进一步纯化得到的转录物RNA。纯化得到的RNA经紫外分光光度计测定，OD260/OD280＝1.95。

(5)RNA鉴定

A.RNA电泳

经1.4％琼脂糖凝胶甲醛电泳鉴定出含目的RNA条带

B.RT-PCR扩增及DNA去除的鉴定用引物对HIV体外转录RNA进行RT-PCR扩增，将纯化后的RNA按照1∶10⁴、1∶10⁵、1∶10⁶倍数稀释，第一组先进行反转录后，再在LightCycler上扩增，第二组则直接与第一组同时进行荧光PCR，检测结果显示纯化后的RNA中已检测不到DNA的存在。

根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的利用核酸扩增(PCR)定量检测人类免疫缺陷病毒(HIV)拷贝数的试剂盒进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不是构成对本发明的限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生理上相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明的相关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。

                         序列表

SEQ.ID.NO.1：5’-taa aca cag tgg ggg gac atc a-3’。

SEQ.ID.NO.2：5’-taa aca tag tgg ggg gac acc a-3’。

SEQ.ID.NO.3：5’-ttc ctg cta tgt cac ttc ccc t-3’。

SEQ.ID.NO.4：5’-g ggg aca tca agc agc cat gca aat-3’。

SEQ.ID.NO.5：5’-g ggg aca cca ggc agc aat gca aat-3’。

SEQ.ID.NO.6：5’-tac tag tag ttc ctg cta tgt cac ttt c-3’。

SEQ.ID.NO.7：5’-g ggg aca tca agc agc cat gca aat-3’。

SEQ.ID.NO.8：5’-FAM-acc atc aat gag gaa gc-TAMRA(MGB)-3’。

SEQ.ID.NO.9：3’-gct ttc agc cca gaa gta a-5’。

SEQ.ID.NO.10：3’-gat agg tgg att atg tgt c-5’。

SEQ.ID.NO.11：

TAAACACAGTGGGGGGACATCATTCTATTCGAGATCTCCTCGACAC

CGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTT

CACCTCACCATACAGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAG

TTGATGAATCTGGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGACCCAGC

ATCCAGGGAATTAGTAGTCAGCTATGTCAATGTTAATATGGGCCTAAA

AATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAG

AGAAACTGTTCTTGATATTTGGTATCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACT

CCTCCAGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCG

GAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAAGG

GGAAGTGACATAGCAGGAA