采用细菌混合菌群快速检测生物降解材料降解性能

摘要

本发明属于生物环境材料降解性能研究领域。包括：从环境中分离得到各种降解材料的降解菌，并进行分类鉴定，组成混合菌群；自行设计生物降解材料降解过程中二氧化碳释放量的检测装置等。本发明利用混合菌群在特定条件下，通过检测高聚物中有机碳转变为二氧化碳的原理，对各种生物降解材料的降解性能进行检测。该发明设计的反应装置成本低、操作简单、每次检测所需材料少。由于使用混合菌群代替环境接种物，所以实验结果的重复性好，而且，检测时间大大缩短。该发明能广泛应用于各种生物降解材料降解性能的检测，对新型生物降解材料的研制开发和生物降解材料产品的质量检测具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物降解环境材料降解性能检测研究领域

背景技术

传统塑料在自然环境中不能被降解，造成严重的“白色污染”。因此世界各国都对生物降解材料的研制和开发给予高度重视。近年来通过化学合成法或微生物发酵法制备了许多新型生物降解材料，在降解材料研制和生产过程中，降解性的检测至关重要。但是，目前还没有一个方便快捷、重复性强的检测方法，因此迫切需要建立一种切实可行的检测生物降解材料降解性能的方法。

国际上对生物降解材料降解性能的检测方法进行了一些研究，并制订了相应的国际标准。这些标准主要有：受控堆肥条件下材料最终需氧生物分解和崩解能力的测定-采用测定释放二氧化碳方法(ISO14855)；水溶性培养基中材料最终需氧生物分解能力的测定-采用测定密闭呼吸计中需氧量方法(ISO14851)；水溶性培养基中材料最终需氧生物分解能力的测定-采用测定释放二氧化碳方法(ISO14852)；材料在特定微生物作用下潜在生物分解和崩解能力的评价(ISO846)；在定义堆肥化中试条件下塑料材料崩解程度的测定(ISO16929)。目前中国已制定了国家标准，如GB/T 19277-2003、GB/T 19276.1-2003、GB/T 19276.2-2003、GB/T19275-2003等。这些检测方法有待完善之处是测试时间长，而且重复性差，即采用不同环境样品作为种源进行检验获得的结果不同。因此，迫切需要建立重复性强，检测速度快的降解性能检测方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测速度快，而且试验重复性好的采用细菌混合菌群快速检测生物降解材料降解性能的方法；

本发明的另一个目的是提供一种容量大、易操作、节省操作区域面积，可分体的二氧化碳吸收装置。

本发明的第三个目的是提供一种对材料降解速度快，而且实验重复性好的细菌混合菌群。

本发明提出一种采用细菌混合菌群检测生物降解材料降解性能的方法，包括以下步骤：a.从环境中分离得到各种降解材料的降解菌，并研究单一菌株同时降解两种以上材料，选择降解材料共有降解菌，并进行分类鉴定，组成混合菌群；b.按照ISO14852的要求，设计测定生物降解材料好氧降解产生的二氧化碳的检测装置；c.组成混合菌群的降解菌分别经活化、扩大培养后，离心收集菌体，菌体用生理盐水清洗2次，然后将菌体加到含有检测液的生物反应器中；d.检测在30℃好氧条件下进行，检测结束后收集吸收桶中产生的碳酸钡沉淀，计算材料降解过程中产生的二氧化碳；e.材料在检测前及检测后干燥至恒重，计算材料的重量损失率。

所述的测定生物降解材料好氧降解产生的二氧化碳的检测装置，由气体流量控制计1、空气中二氧化碳的吸收桶2、生物反应器3和降解材料产生的二氧化碳的吸收桶5组成，其特征在于：气体流量控制计1、空气中二氧化碳的吸收桶2、生物反应器3和降解材料产生的二氧化碳的吸收桶5依次用胶皮管9连接，生物反应器3外加恒温水浴搅拌装置4；吸收桶2和5顶部有装液口7、底部有底脚10，降解材料产生的二氧化碳的吸收桶5的末尾桶上有出气口6。

所述的测定生物降解材料好氧降解产生的二氧化碳的检测装置，其特征在于：所述的空气中二氧化碳的吸收桶2和降解材料产生的二氧化碳的吸收桶5由2.5-3.5mm厚的有机玻璃制成，每个桶有三个底角10，桶可叠放，通过胶皮管9连接。

所述的测定生物降解材料好氧降解产生的二氧化碳的检测装置，其特征在于：所述的空气中二氧化碳的吸收桶2的叠放个数为3-4个，降解材料产生的二氧化碳的吸收桶5的叠放个数为3-4个。

气体流量控制计1将空气以50mL/min-100mL/min的流量通入装有氢氧化钠溶液的空气中二氧化碳的吸收桶2，除去空气中的二氧化碳；经吸收桶2无白色沉淀后，无二氧化碳的空气通入生物反应器3中，降解反应在恒温水浴搅拌装置4控制下进行；降解材料降解过程中产生的二氧化碳被吸收桶5中的氢氧化钡溶液吸收。

一种可用于检测生物降解材料降解性能的细菌混合菌群，主要包括

    菌名    菌株 Pseudomonas putida Pseudomonas stutzeri Pseudomonas aurantiaca Acinetobacter calcoaceticus Cellulosimicrobium cellulans Dermacoccus nishinomiyaensis Micrococcus luteus Brevundimonas vesicularis Bacillus amyloliquefaciens Bacillus badius Corynebacterium nitrilophilus Lactococcus lactis Aerococcus urinae Bordetella hinzii Arthrobacter ilicis Cellulomonas cellasea ATCC 11172 ATCC 11607 ATCC 33663 ATCC 14987 ATCC 12830 ATCC 29093 ATCC 9341 ATCC 11426 ATCC 23350 ATCC 14574 ATCC 21419 ATCC 11007 ATCC 51268 ATCC 51730 ATCC 14264 ATCC 487 Acinetobacter lwoffii Cellulomonas fimi Flavobacterium mizutaii Pseudomonas alcaligenes ATCC 15309 ATCC 15724 ATCC 33299 ATCC 14909

利用细菌混合菌群对聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHB/V)、纤维素、聚丁二酸丁二醇酯与聚己二酸丁二醇酯的共聚物(PBSA)、聚碳酸酯(PPC)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)等12种降解材料的降解性能进行检测，检测结果如图4所示。作为试验对照组，又以土壤悬浊液作为接种物，以聚苯乙烯作为参比材料，对6种降解材料的降解性能进行检测，检测结果如图2、图3所示。

本发明的主要优点是：第一，由于采用细菌混合菌群代替环境接种物，因此材料的降解速度大大加快，每次检测时间缩短到1周，而且检测结果的重复性好；第二，该装置能准确地测定降解材料好氧降解产生的二氧化碳，二氧化碳吸收桶具有容量大、易操作、节省操作区域面积等特点。本方法还测定材料在降解前后的重量损失。基于上述两个优点，采用细菌混合菌群作为接种物，并利用根据ISO14852基本原理设计的二氧化碳检测装置，能够适用于各种生物降解材料降解性能的检测。

附图说明

图1.二氧化碳检测装置示意图

其中，1.气体流量控制计  2.空气中二氧化碳的吸收桶  3.生物反应器  4.恒温水浴搅拌装置  5.降解材料产生的二氧化碳的吸收桶  6.出气口  7.装液口  8.橡胶塞  9.胶皮管  10.底脚

图2.各种降解材料的生物分解百分率

图3.各种降解材料的重量损失百分率

图4.以混合菌群作为接种物在矿物盐检测液中各种降解材料的重量保持率

具体实施方式

实施例1.

利用细菌混合菌群对聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHB/V)、纤维素、聚丁二酸丁二醇酯与聚己二酸丁二醇酯的共聚物(PBSA)、聚碳酸酯(PPC)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)等12种材料的降解性能进行检测。

1.试验仪器

1.1生物反应器

本试验使用一个1升的三角瓶作为生物反应器，用橡胶塞堵住瓶口，在橡胶塞上留有2个孔，分别为进气孔和出气孔。连接管路不能泄露出二氧化碳。生物反应器置于具有磁力搅拌功能的恒温水浴装置内，以确保反应过程中温度恒定，并且在整个反应过程中始终搅拌检测液，从而保证矿物盐检测液中的溶解氧能满足好氧降解微生物的需要。

1.2供气系统

本试验使用的空气流量计能准确地控制通入反应器的空气流量在50mL/min-100mL/min。本试验使用浓氢氧化钠溶液来吸收空气中的二氧化碳，使通入反应器中的空气不含二氧化碳。

1.3测定二氧化碳用的分析方法

本试验采用氢氧化钡溶液吸收降解过程中释放的二氧化碳，通过收集产生的碳酸钡沉淀量间接计算二氧化碳的释放量。

1.4二氧化碳吸收桶

由2.5-3.5mm厚的有机玻璃制成。顶部有装液口，检测时盖上胶塞，有进气口(深入至桶底部)和出气口(开口于桶上部)。由于有三个底角，因此三个桶可叠放，通过胶管连接，节约操作区域面积。

1.5分析天平

使用的分析天平精度为±0.001g，用于试验中各种物质的称量。

1.6碳酸钡沉淀的收集方法

本试验用滤纸过滤所产生的沉淀，烘干后称重，通过换算得出所产生二氧化碳的量。

1.7酸度计

调节检测液(矿物盐溶液)的pH值。

2.程序

2.1检测液的配制

检测液的成分是：

KH₂PO₄                          0.85000g

K₂HPO₄                          2.17500g

Na₂HPO₄·2H₂O                  3.34000g

NH₄Cl                             0.05000g

MgSO₄·7H₂O                      0.22500g

FeCl₃·6H₂O                      0.00025g

CaCl₂·2H₂O                      0.03640g

蒸馏水                              1000ml

pH                                  7.40

配制好检测液，用稀氢氧化钠或稀盐酸调整pH值到7.40。

2.2吸收溶液的配制

a.氢氧化钠溶液：每组反应至少需要两个滤过瓶，每个瓶中放500ml浓度为10mol/L的氢氧化钠溶液，以除去通入反应器的空气中的二氧化碳。

b.氢氧化钡溶液：每组反应至少需要三个吸收瓶，每个瓶中放300ml浓度为0.0125mol/L的氢氧化钡溶液，以吸收降解过程中产生的二氧化碳。

2.3确定通入反应器的空气不含二氧化碳

在空气通入反应器之前，先经过装有500ml的0.0125mol/L的氢氧化钡溶液的指示桶，根据是否有白色沉淀产生，判断空气中有无二氧化碳，确保通入反应器的空气绝对不含二氧化碳。

2.4试验材料的前处理

采用溶液浇注磨具(聚四氟乙烯)法制取各种降解材料膜，材料膜的厚度为0.05-0.10mm。制好的膜需放置2周后方可使用。试验前，材料膜被真空干燥1周。称取适量的材料，放入反应器后，使总有机碳(TOC)含量在100mg/L-2000mg/L。

2.5接种

a.环境接种物：按照标准方法从环境中采集土壤样品，并制成土壤悬浊液接种于反应器中，接种量为5％。

b.混合菌群：组成混合菌群的降解菌分别在LB培养基中于30℃活化、扩大培养，离心收集菌体，采用生理盐水清洗两次，将菌体接种至含有检测液和已放入材料膜的生物反应器。

表1.混合菌群的组成

    菌名    菌株 Pseudomonas putida Pseudomonas stutzeri Pseudomonas aurantiaca Acinetobacter calcoaceticus Cellulosimicrobium cellulans Dermacoccus nishinomiyaensis Micrococcus luteus Brevundimonas vesicularis Bacillus amyloliquefaciens Bacillus badius Corynebacterium nitrilophilus Lactococcus lactis Aerococcus urinae Bordetella hinzii Arthrobacter ilicis Cellulomonas cellasea Acinetobacter lwoffii Cellulomonas fimi Flavobacterium mizutaii  ATCC 11172  ATCC 11607  ATCC 33663  ATCC 14987  ATCC 12830  ATCC 29093  ATCC 9341  ATCC 11426  ATCC 23350  ATCC 14574  ATCC 21419  ATCC 11007  ATCC 51268  ATCC 51730  ATCC 14264  ATCC 487  ATCC 15309  ATCC 15724  ATCC 33299 Pseudomonas alcaligenes  ATCC 14909

2.6确定检测的时间

检测液是无碳源的矿物盐溶液，检测材料是唯一的碳源。混合菌群能以被检测材料作为碳源，进行生长繁殖，因此混合菌群的繁殖与材料降解之间有正相关性。为了确定最佳检测时间，在检测期间通过测定检测液在660nm的吸光值来判断菌体浓度，在菌体浓度开始呈下降趋势前，终止反应。在整个检测过程中，应保证二氧化碳吸收桶中含有未反应的氢氧化钡溶液。

2.7降解性能的检测

反应结束后，取出试验材料先用75％酒精浸泡1小时，以终止微生物的作用；然后用酒精擦拭材料表面的附着物，再用蒸馏水冲洗干净，室温干燥；真空干燥1周后，称重。

收集吸收桶中产生的碳酸钡沉淀，干燥至恒重，称重。

2.8检测指标

生物分解率：每克材料降解实际释放二氧化碳量与理论释放二氧化碳量之比。

重量损失率：材料降解前后的重量损失与降解前重量之比。

3.试验结果

        表2.各种降解材料的生物分解百分率

    材料PHBV Cellulose PBSA PPC PBS PVA生物分解百分率(％)50.38  29.69 22.66 20.1811.88 2.31

表3.各种降解材料的重量损失百分率

    材料PHBV Cellulose PBSA PPC PBS PVA重量损失百分率(％)65.87  18.87 14.40 13.33 12.62 2.5

反应结束后，计算材料的生物分解率和重量损失率，二者完全吻合，即材料的生物分解率越大，其重量损失率越大。检测结果证明该发明能够适用于多种生物降解材料降解性能的检测。用混合菌群作为接种物，降解材料的降解速度明显加快，能够在很短的时间内检测降解材料的降解性能。